Тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразин как мультимодальный агент фотодинамической терапии Российский патент 2019 года по МПК C07D487/22 A61K31/409 

Предлагаемая группа изобретений относится к области биомедицины, к мультимодальным противораковым препаратам для персонализированной медицины, касается в частности тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианоорфиразина (pzI) и его применения в качестве мультимодального агента фотодинамической терапии злокачественных новообразований, а именно в качестве фотосенсибилизатора и одновременно в качестве оптического сенсора внутриклеточной вязкости.

Флуоресцентные тетрапиррольные макроциклы, к которым относится заявляемое соединение, занимают центральное место в современной биоорганической химии, поскольку эти красители обладают свойством вначале избирательно накапливаться в ткани опухоли, а затем под действием света с подходящей длиной волны продуцировать активные формы кислорода, в частности, синглетный кислород, которые вызывают гибель клеток. Эта концепция лежит в основе фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний.

К настоящему времени описан обширный ряд тетрапиррольных фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ) на основе хлоринов, порфиринов, фталоцианинов и некоторых других тетрапирролов. В последнее время показано, что порфиразины также перспективны в качестве агентов ФДТ, так как хорошо накапливаются в клетках и обладают высокой фотоцитотоксичностью [Е.R. Trivedi, A.S. Harney, М.В. Olive, I. Podgorski, K. Moin, В. F. Sloane, A. G.M. Barrett, Т.J. Meade, and В.M. Hoffman. Chiral porphyrazine near-IR optical imaging agent exhibiting preferential tumor accumulation // PNAS. - 2010. - V. 107. - №4. - Р 1284-1288].

Известно, что в процессе фотоиндуцированной гибели клетки [M. Kuimova, S. Butchway, A. Parker, H. Anderson, P. Ogiby Nature Chemistry, 1, 2009, 69-73] наблюдается значительное увеличение внутриклеточной вязкости. Вязкость является важным параметром, определяющим скорость диффузии и, следовательно, скорость бимолекулярных реакций, протекающих в живой клетке. Изменение локальной вязкости в биологических системах может привести к серьезным дисфункциям в поведении живых клеток и даже их смерти. Таким образом, разработка препаратов, обладающих свойствами высокочувствительных неинвазивных сенсоров внутриклеточной вязкости, является актуальной проблемой. Для агента ФДТ наличие таких свойств означает важную дополнительную модальность, открывающую новый персонализированный терапевтический подход к лечению онкологических заболеваний. Такой подход позволяет осуществлять мониторинг функционального состояния клеток опухоли по изменению внутриклеточной вязкости в реальном времени в процессе фотодинамического воздействия [Izquierdo М.А., Lermontova S.A., Grigoryev I.S., Shilyagina N.Y., Balalaeva I.V., Klapshina L.G., Kuimova M.K. J. Mater. Chem. (B). 2015, 3. 1089-1102].

Известно, что для некоторых флуоресцентных красителей наблюдается различная степень свободы внутримолекулярного движения фрагментов светоизлучающей молекулы в зависимости от вязкости окружающей среды [М.A. Haidekker, Е.A. Theodorakis. J. of Biol. Eng. - 2010 - V. 4. - P. 1-14.; G. Hoffmann // J. Phys Chem. - 1971. - V. 75. - Р. 63-76].

Высоковязкие среды затрудняют внутримолекулярное движение (вращение или скручивание вокруг отдельных химических связей) и связанную с этим диссипацию энергии возбужденного состояния. Это приводит к сильному возрастанию интенсивности флуоресценции. Поскольку зависимость параметров флуоресценции (квантового выхода и времени жизни) от вязкости среды может быть описана простыми математическими уравнениями (1, 2), такие соединения могут быть использованы в качестве зондов локальной вязкости.

где φ - квантовый выход, η - вязкость, z и α - константы, k_r - константа скорости излучательного перехода.

Такие красители обозначаются в научной литературе термином «флуоресцентные молекулярные роторы» [ G. Hoffmann. J. Phys Chem. 1971. V. 75. Р. 63-76]. Установлено, что значение α, определяющее тангенс угла наклона прямых зависимости квантового выхода от локальной вязкости в логарифмическом выражении для красителей типа молекулярных роторов меняется в интервале 0.3-0.6 [Kuimova, М.K., Chimia, 2012, vol. 66, p. 159.]

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению является порфиразин, а именно тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразин (pzII), принятый за ближайший аналог (прототип).

Тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразин (pzII) по прототипу является не только сенсибилизатором фотодинамического воздействия на раковые клетки, но и высокочувствительным оптическим сенсором внутриклеточной вязкости, позволяющим проводить ее количественную оценку в различные моменты процесса фотодинамической терапии. Возможность осуществления контроля функционального состояния опухолевой ткани в режиме реального времени открывает новые возможности для персонализированной противораковой медицины.

Однако, прототип не лишен недостатков. В частности, для него существует проблема повышения фотоцитотоксичности и понижения темновой цитотоксичности. Этим недостатком обусловлено низкое значение потенциального терапевтического индекса данного препарата для ФДТ, который показывает широту безопасного использования лекарственного средства и представляет собой отношение токсичной дозы в темновых условиях к эффективной лечебной дозе при облучении.

В задачу изобретения положено создание тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина (pzI) как мультимодального агента фотодинамической терапии злокачественных новообразований, а именно в качестве фотосенсибилизатора и одновременно в качестве оптического сенсора внутриклеточной вязкости.

Критерием успешности достижения поставленной цели явилось улучшение ниже перечисленных характеристик полученного тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина (pzI) по сравнению с прототипом:

- существенное понижение выживаемости клеточных культур, инкубированных в присутствии тетра(арил)тетрацианопорфиразина, при облучении светом (уменьшение ингибирующей концентрации тетра(арил)тетрацианопорфиразина (IC₅₀(light));

- возрастание отношения IC₅₀(dark)/IC₅₀(light), характеризующего потенциальный терапевтический индекс препарата для ФДТ, который показывает широту безопасного использования лекарственного средства и представляет собой отношение токсичной дозы в темновых условиях к эффективной лечебной дозе при облучении;

- заметный сдвиг максимума поглощения в длинноволновую область.

Техническим результатом от использования изобретения является суммарное повышение фотодинамической активности макроцикла при сохранении высокой вязкостной чувствительности параметров флуоресценции, необходимой для использования их в качестве потенциального неинвазивного оптического сенсора внутриклеточной вязкости.

Поставленная задача была достигнута тем, что в периферийное обрамление макроцикла были введены бензотиофеновые группы.

На фиг. 1 представлена общая формула тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (pzII) по прототипу и полученного тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина (pzI), где R - заместитель, R=C₈H₅S (I, бензотиофен-2-ил),

На фиг. 2 представлена схема синтеза тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина (pzI)I в виде свободного основания.

На фиг. 3 представлены график зависимости квантового выхода флуоресценции тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина (pzI) от вязкости растворителя (спиртово-глицериновые смеси).

На фиг. 4 представлен график зависимости жизнеспособности клеток А431 от концентрации в среде тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина (pzI)

В таблице 1 представлены результаты анализа полученного тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина (pzI).

В таблице 2 представлены характеристики тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (pzII) и полученного тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина (pzI) как потенциальных фотосенсибилизаторов ФДТ.

В таблице 3 представлены значения коэффициента α в уравнении Ферстера-Хоффмана, характеризующего чувствительность квантового выхода красной флуоресценции, тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина (pzII) и полученного тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина (pzI) от вязкости среды.

Полученный тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразин (pzI) имеет формулу:

где R - заместитель, R=C₈H₅S (бензотиофен-2-ил)

Пример 1

Синтез предлагаемого тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина (pzI) осуществляют следующим образом.

В качестве структурных единиц для темплатной сборки тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина используют бензотиофен-2-ил-1,1,2-трицианоэтилены, которые, в свою очередь, синтезируют в три стадии из альдегида (фиг. 2 стадия а-с). К бензотиофен-2-карбальдегиду, растворенного в этиловом спирте (100 мл), добавляли малонодинитрил в мольном соотношении 1:1 и 2 капли пиперидина (фиг. 2 стадия а,). Реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой (4×80 мл) и высушивали при комнатной температуре и пониженном давлении. Полученный 2-(бензотиофен-2-ил)-1,1-дицианэтилен растворяли в этиловом спирте (150 мл), добавляли KCN в двукратном мольном избытке, предварительно растворенного в 80 мл воды (фиг. 2 стадия b,). Реакционную смесь перемешивали, охлаждая колбу ледяной баней. В реакционную смесь добавили 240 мл воды и перемешивали в течение 45 мин. при комнатной температуре. Далее добавили 6 мл 37% HCl. После этого реакционную смесь охлаждали. Выпавший осадок отфильтровывали, тщательно промывали водой и высушивали при комнатной температуре и пониженном давлении. К полученному 2-(бензотиофен-2-ил)-1,1,2-трицианэтану, растворенному в диэтиловом эфире (100 мл) добавляли N-хлорсукцинимид в мольном соотношении 1:1,5 (фиг. 2 стадия с,). Через час добавляли воду (150 мл), выпадает осадок. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Продукт возгоняли при пониженном давлении.

Тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразинат иттербия (фиг. 2 стадия d,). В вакууме растворяли 2-(бензотиофен-2-ил)-1,1,2-трицианоэтилен (ArTCE) в предварительно дегазированном THF. Далее небольшими порциями добавляли полученный раствор к бис-инденильному π-комплексу иттербия(II) [(С₉Н₇)₂Yb(ТГФ)₂)] в THF (ArTCE:(C₉H₇)₂Yb(ТГФ)₂) в мольном соотношении 1:5). Через 1 сут раствор фильтровали в вакууме. Для удаления из смеси не вступившего в реакцию соединения и его комплекса полученный раствор промывали предварительно дегазированным толуолом до исчезновения окраски. Выделенный продукт кипятили в толуоле на воздухе в течение 24 ч. Нерастворившийся осадок отделяли и сушили при пониженном давлении.

Тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразинат иттербия растворяют в 2 мл трифторуксусной кислоте и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. для удаления металла (фиг. 2 стадия е,). Далее добавили воды ~30 мл, наблюдали выпадение темно-синего осадка, отцентрифугировали, тщательно промыли водой до нейтральной среды. Очистку продукта проводят с помощью колоночной хроматографии (силикагель 60, 40-60 μm, элюент THF).

Спектральные характеристики полученного соединения приведены в таблице 1.

ИК спектры полученных соединений в виде суспензий в вазелиновом масле регистрировали на ИК Фурье-спектрометре ФСМ 1201. Спектры поглощения в УФ и видимой области снимали на спектрометре Perkin Elmer Lambda 25. Спектры ЯМР 1Н записывали на приборе Bruker Avance II+[400 (1Н), 100 (13С), 375 МГц (19F)] при 25°С. Исследования флуоресценции в стационарном режиме были проведены на спектрометре Perkin Elmer LS 55 в диапазоне длин волн 300-800 нм. Масс-спектры (MALDI TOF) снимали на масс-спектрометре Bruker Micro flex LT.

Пример 2.

Фотоиндуцированная и темновая цитотоксичности тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина в системе in vitro.

Полученный тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразин (pzI) демонстрирует отчетливо выраженную фотоцитотоксичность в отношении опухолевых клеток А431 на длине волны облучения 635 нм.

Концентрации раствора pzI варьировались от 0,1 до 100 мкМ. Время инкубации до светового воздействия составляло 4 часа. Исследование световой активности проводилось с использованием светодиодного излучателя для получения равномерного светового потока в стандартных 96-луночных планшетах. Доза облучения составляла 20 Дж/см² при плотности мощности 20 мВт/см² [Н.Ю. Шилягина, В.И. Плеханов, И.В. Шкунов, П.А. Шилягин, Л.В. Дубасова, А.А. Брилкина, Е.А. Соколова, И.В. Турчин, И.В. Балалаева. Современные технологии медицине. 2014, Т. 6, №2, С. 15-24].

Жизнеспособность клеточной культуры оценивали через 24 часа после облучения с помощью микротитрационного теста для анализа метаболической активности (МТТ-тест), позволяющего определить ингибирующую концентрацию IC₅₀, т.е. концентрацию соединения, вызывающую снижение роста культуры клеток на 50% (или их гибель). Величины IC₅₀ приведены в таблице 2.

Как показывают данные исследования фотоиндуцированной и темновой цитоксичности (таблица 2) полученное порфиразиновое свободное основание является потенциальными сенсибилизаторами ФДТ, поскольку фотоцитоксичность существенно превышает цитоксичность в отсутствие облучения светом. При этом, как видно из данных таблицы 2, полученный порфиразин показал улучшение свойств нового соединения как потенциальных фотосенсибилизаторов процесса ФДТ по сравнению с выбранным прототипом (тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразином (pzII), по крайней мере, по одному критерию из указанных выше.

Оценка эффективности фотодинамического воздействия полученного тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина (pzI) на раковые клетки показала более высокую, чем для прототипа, фотоцитотоксичность. С этим связан наблюдаемый для порфиразина pzI более высокий (4.8 раз больший, чем для pz2) терапевтический индекс.

Кроме того, для тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина pzI наблюдается значительный сдвиг максимума полосы поглощения в длинноволновую область спектра (609 нм), использование которой обеспечивает более высокую прозрачность биоткани, что, в свою очередь, повышает эффективность фотодинамического воздействия.

Таким образом, полученный тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразин (pzI) демонстрирует существенное увеличение фотоцитотоксичности, а, следовательно, повышение эффективности в качестве потенциального фотосенсибилизатора ФДТ по сравнению с тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразином (pzII)

Пример 3.

Тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразин pzI как флуоресцентный молекулярный ротор: зависимости квантового выхода красной флуоресценции от вязкости среды в этанольно-глицериновых смесях.

Тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразин (pzI) растворяли в 3 мл смеси этанол/глицерин (концентрация порфиразина 1*10^-5 моль/л). Состав смесей с известной вязкостью [Abdullah S. Alkindi, Yahya М. Al-Wahaibi, and Ann H. Muggeridge. Journal of Chemical & Engineering Data, Vol. 53, No. 12, 2008] варьировался от 40 до 100% глицерина. Интенсивность красной флуоресценции измеряли с помощью спектрофлуориметра (Perkin Elmer LS 55) при температуре 23°С.

Квантовый выход определяли относительно перхлората крезила фиолетового.

По полученным данным в логарифмических координатах для полученного тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина pzI строили зависимость квантового выхода от вязкости среды. Данные измерений представлены на рисунке 3 и в таблице 3.

Характер зависимости квантового выхода от вязкости среды для полученного тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина pzI полностью соответствует уравнению (1) Ферстера-Хоффмана, а значения α в этом уравнении находятся в интервале 0.46-0.66, что позволяет отнести полученный краситель к ряду флуоресцентных молекулярных роторов, т.е. потенциальных сенсоров локальной вязкости.

Таким образом, как показано в Примерах 2 и 3, предлагаемый в данной заявке фотосенсибилизатор ФДТ на основе полученного тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразина pzI, сохраняя характерный для прототипа высокий потенциал использования в качестве чувствительного сенсора внутриклеточной вязкости, является значительно более перспективным агентом ФДТ, поскольку (1) его спектр поглощения сдвинут область большей оптической прозрачности биоткани; (2) он обладает значительно более высокой фотоцитоксичностью и (3) потенциальным терапевтическим индексом (в 4.8 раз), чем прототип.

Изобретение относится к тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразину, имеющему формулу:

в которой R=C₈H₅S (бензотиофен-2-ил), как мультимодальному агенту фотодинамической терапии злокачественных новообразований, а именно, как фотосенсибилизатору и одновременно оптическому сенсору внутриклеточной вязкости. Технический результат: получено новое соединение с высокой фотодинамической активностью и высокой вязкостной чувствительностью параметров его флуоресценции, необходимой для использования его в качестве потенциального неинвазивного оптического сенсора внутриклеточной вязкости. 4 ил., 3 табл., 3 пр.

Тетра(бензотиофен-2-ил)тетрацианопорфиразин, имеющий формулу:

где R=C₈H₅S (бензотиофен-2-ил),

как мультимодальный агент фотодинамической терапии злокачественных новообразований, а именно как фотосенсибилизатор и одновременно оптический сенсор внутриклеточной вязкости.