Тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразин как мультифункциональный агент терапии злокачественных новообразований Российский патент 2020 года по МПК C07D487/22 A61K31/409 A61P43/00 A61P35/00 

Предлагаемая группа изобретений относится к области биомедицины, к мультифункциональным противораковым препаратам для персонализированной медицины, касается в частности тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина и его применения в качестве мультифункционального агента фотодинамической терапии злокачественных новообразований, а именно в качестве фотосенсибилизатора и одновременно в качестве оптического сенсора внутриклеточной вязкости.

Флуоресцентные тетрапиррольные макроциклы, к которым относится заявляемое соединение, занимают центральное место в современной биоорганической химии, поскольку эти красители обладают свойством вначале избирательно накапливаться в ткани опухоли, а затем под действием света с подходящей длиной волны продуцировать активные формы кислорода, в частности, синглетный кислород, которые вызывают гибель клеток. Эта концепция лежит в основе фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний.

К настоящему времени описан обширный ряд тетрапиррольных фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ) на основе хлоринов, порфиринов, фталоцианинов и некоторых других тетрапирролов. В последнее время показано, что порфиразины также перспективны в качестве агентов ФДТ, так как хорошо накапливаются в клетках и обладают высокой фотоцитотоксичностью [Е. R. Trivedi, A. S. Harney, М. В. Olive, I. Podgorski, К. Moin, В. F. Sloane, A. G.M. Barrett, Т. J. Meade, and В. M. Hoffman. Chiral porphyrazine near-IR optical imaging agent exhibiting preferential tumor accumulation // PNAS. - 2010. - V. 107. - № 4. - Р1284-1288].

Известно, что в процессе фотоиндуцированной гибели клетки [M. Kuimova, S. Butchway, A. Parker, H. Anderson, P. Ogiby Nature Chemistry, 1, 2009, 69-73] наблюдается значительное увеличение внутриклеточной вязкости. Вязкость является важным параметром, определяющим скорость диффузии и, следовательно, скорость бимолекулярных реакций, протекающих в живой клетке. Изменение локальной вязкости в биологических системах может привести к серьезным дисфункциям в поведении живых клеток и даже их смерти. Таким образом, разработка препаратов, обладающих свойствами высокочувствительных неинвазивных сенсоров внутриклеточной вязкости, является актуальной проблемой. Для агента ФДТ наличие таких свойств означает важную дополнительную модальность, открывающую новый персонализированный терапевтический подход к лечению онкологических заболеваний. Такой подход позволяет осуществлять мониторинг функционального состояния клеток опухоли по изменению внутриклеточной вязкости в реальном времени в процессе фотодинамического воздействия [Izquierdo М.А., Vysniauskas A., Lermontova S.A., Grigoryev I.S., Shilyagina N.Y., Balalaeva I.V., Klapshina L.G., Kuimova M.K. J. Mater. Chem. (B). 2015, 3. 1089-1102].

Известно, что для некоторых флуоресцентных красителей наблюдается различная степень свободы внутримолекулярного движения фрагментов светоизлучающей молекулы в зависимости от вязкости окружающей среды [М. A. Haidekker, Е. A. Theodorakis. J. of Biol. Eng. - 2010 - V. 4. - P. 1-14.; G. Hoffmann // J. Phys Chem. - 1971. - V. 75. - Р. 63-76].

Высоковязкие среды затрудняют внутримолекулярное движение (вращение или скручивание вокруг отдельных химических связей) и связанную с этим диссипацию энергии возбужденного состояния. Это приводит к сильному возрастанию интенсивности флуоресценции. Поскольку зависимость параметров флуоресценции (квантового выхода и времени жизни) от вязкости среды может быть описана простыми математическими уравнениями (1, 2), такие соединения могут быть использованы в качестве зондов локальной вязкости.

где φ - квантовый выход, η - вязкость, z и α - константы, k_r - константа скорости излучательного перехода.

Такие красители обозначаются в научной литературе термином «флуоресцентные молекулярные роторы» [ G. Hoffmann. J. Phys Chem. 1971. V. 75. P. 63-76]. Установлено, что значение α, определяющее тангенс угла наклона прямых зависимости квантового выхода от локальной вязкости в логарифмическом выражении для красителей типа молекулярных роторов меняется в интервале 0.3-0.6 [Kuimova, М.K., Chimia, 2012, vol. 66, p. 159.]

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению является порфиразин, а именно тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразин, принятый за ближайший аналог (прототип).

Тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразин по прототипу является не только сенсибилизатором фотодинамического воздействия на раковые клетки, но и высокочувствительным оптическим сенсором внутриклеточной вязкости, позволяющим проводить ее количественную оценку в различные моменты процесса фотодинамической терапии. Возможность осуществления контроля функционального состояния опухолевой ткани в режиме реального времени открывает новые возможности для персонализированной противораковой медицины.

Однако, прототип не лишен недостатков. В частности, для него существует проблема достижения более низкой темновой цитотоксичности. Именно этим недостатком обусловлено относительно низкое значение потенциального терапевтического индекса данного препарата для ФДТ, который показывает широту безопасного использования лекарственного средства и представляет собой отношение токсичной дозы в темновых условиях к эффективной лечебной дозе при облучении.

Нами был синтезирован новый тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразин, на основе которого был создан мультифункциональный агент терапии злокачественных новообразований, а именно высокоэффективный фотосенсибилизатор для ФДТ и, одновременно, оптический сенсор внутриклеточной вязкости.

Критерием успешности достижения поставленной цели явилось улучшение ниже перечисленных характеристик полученного тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина (pzI) по сравнению с прототипом:

- существенное понижение выживаемости клеточных культур, инкубированных в присутствии тетра(арил)тетрацианопорфиразина, при облучении светом (уменьшение ингибирующей концентрации тетра(арил)тетрацианопорфиразина (IC₅₀(light));

- возрастание отношения IC₅₀(dark)/IC₅₀(light), характеризующего потенциальный терапевтический индекс препарата для ФДТ, который показывает широту безопасного использования лекарственного средства и представляет собой отношение токсичной дозы в темновых условиях к эффективной лечебной дозе при облучении;

- заметный сдвиг максимума поглощения в длинноволновую область.

Техническим результатом от использования изобретения является суммарное повышение фотодинамической активности макроцикла при сохранении высокой вязкостной чувствительности параметров флуоресценции, необходимой для использования их в качестве потенциального неинвазивного оптического сенсора внутриклеточной вязкости.

На фиг. 1 представлена общая формула тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина по прототипу и полученного тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина I, где R - заместитель,

R= C₁₆H₉ (I, пирен-1-ил),

На фиг. 2 представлена схема синтеза тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина I в виде свободного основания.

На фиг. 3 представлены график зависимости квантового выхода флуоресценции тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина от вязкости растворителя (спиртово-глицериновые смеси),

На фиг. 4 представлен график зависимости жизнеспособности клеток А431 от концентрации в среде тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина

В таблице 1 представлены результаты анализа полученного тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина I.

В таблице 2 представлены характеристики тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина и полученного тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина как потенциальных фотосенсибилизаторов ФДТ.

В таблице 3 представлены значения коэффициента α в уравнении характеризующего чувствительность квантового выхода красной флуоресценции, тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразина и полученного тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина от вязкости среды.

Полученный тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразин имеет формулу:

где R - заместитель, R=С₁₆Н₉ (пирен-1-ил)

При R=С₁₆Н₉ (пирен-1-ил) представляет собой тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразин.

Пример 1

Синтез предлагаемого тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина осуществляют следующим образом.

В качестве структурных единиц для темплатной сборки тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина используют 2-(пирен-1 -ил)-1,1,2-трицианоэтилен, которые, в свою очередь, синтезируют в три стадии из альдегида (фиг. 2 стадия а-с). К пирен-1-карбальдегиду, растворенного в этиловом спирте (100 мл), добавляли малонодинитрил в мольном соотношении 1:1 и 2 капли пиперидина (фиг. 2 стадия а,). Реакционную смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой (4×80 мл) и высушивали при комнатной температуре и пониженном давлении. Полученный 2-(пирен-1-ил)-1,1-дицианэтилен растворяли в этиловом спирте (150 мл), добавляли KCN в двукратном мольном избытке, предварительно растворенного в 80 мл воды (фиг. 2 стадия b,). Реакционную смесь перемешивали, охлаждая колбу ледяной баней. В реакционную смесь добавили 240 мл воды и перемешивали в течение 45 мин. при комнатной температуре. Далее добавили 6 мл 37 % HCl. После этого реакционную смесь охлаждали. Выпавший осадок отфильтровывали, тщательно промывали водой и высушивали при комнатной температуре и пониженном давлении. К полученному 2-(пирен-1-ил)-1,1,2-трицианэтану, растворенному в диэтиловом эфире (100 мл) добавляли N-хлорсукцинимид в мольном соотношении 1:1,5 (фиг. 2 стадия с,). Через час добавляли воду (150 мл), выпадает осадок. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Продукт возгоняли при пониженном давлении.

Тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразинат иттербия (фиг. 2 стадия d,). В вакууме растворяли 2-(пирен-1-ил)-1,1,2-трицианоэтилен (ArTCE) в предварительно дегазированном THF. Далее небольшими порциями добавляли полученный раствор к бис-инденильному π-комплексу иттербия(II) [(С₉Н₇)₂Yb(ТГФ)₂)] в THF (ArTCE:(С₉Н₇)₂Yb(ТГФ)₂) в мольном соотношении 1:5). Через 1 сут раствор фильтровали в вакууме. Для удаления из смеси не вступившего в реакцию соединения и его комплекса полученный раствор промывали предварительно дегазированным толуолом до исчезновения окраски. Выделенный продукт кипятили в толуоле на воздухе в течение 24 ч. Нерастворившийся осадок отделяли и сушили при пониженном давлении.

Тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразинат иттербия растворяют в 2 мл трифторуксусной кислоте и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. для удаления металла (фиг. 2 стадия е,). Далее добавили воды ~30 мл, наблюдали выпадение темно-синего осадка, отцентрифугировали, тщательно промыли водой до нейтральной среды. Очистку продукта проводят с помощью колоночной хроматографии (силикагель 60, 40-60 μm, элюент THF).

Спектральные характеристики полученного соединения приведены в таблице 1.

ИК спектры полученных соединений в виде суспензий в вазелиновом масле регистрировали на ИК Фурье-спектрометре ФСМ 1201. Спектры поглощения в УФ и видимой области снимали на спектрометре Perkin Elmer Lambda 25. Спектры ЯМР 1Н записывали на приборе «Bruker Avance DPX-200» [200 (¹Н), 200 (¹³С)] при 25°С. Исследования флуоресценции в стационарном режиме были проведены на спектрометре Perkin Elmer LS 55 в диапазоне длин волн 300-800 нм. Масс-спектры (MALDI TOF) снимали на масс-спектрометре Bruker Microflex LT.

Пример 2.

Фотоиндуцированная и темновая цитотоксичности тетра(пирен-1-ип)тетрацианопорфиразина в системе in vitro.

Полученный тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразин I демонстрирует отчетливо выраженную фотоцитотоксичность в отношении опухолевых клеток А431 на длине волны облучения 635 нм.

Концентрации раствора тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина I варьировались от 0,1 до 100 мкМ. Время инкубации до светового воздействия составляло 4 часа. Исследование световой активности проводилось с использованием светодиодного излучателя для получения равномерного светового потока в стандартных 96-луночных планшетах. Доза облучения составляла 20 Дж/см² при плотности мощности 20 мВт/см² [Н.Ю. Шилягина, В.И. Плеханов, И.В. Шкунов, П.А. Шилягин, Л.В. Дубасова, А.А. Брилкина, Е.А. Соколова, И.В. Турчин, И.В. Балалаева. Современные технологии медицине. 2014, Т. 6, № 2, С. 15-24].

Жизнеспособность клеточной культуры оценивали через 24 часа после облучения с помощью микротитрационного теста для анализа метаболической активности (МТТ-тест), позволяющего определить ингибирующую концентрацию IC₅₀, т.е. концентрацию соединения, вызывающую снижение роста культуры клеток на 50% (или их гибель). Величины IC₅₀ приведены в таблице 2.

Как показывают данные исследования фотоиндуцированной и темновой цитоксичности (таблица 2) полученное порфиразиновое свободное основание является потенциальными сенсибилизаторами ФДТ, поскольку фотоцитоксичность существенно превышает цитоксичность в отсутствие облучения светом. При этом, как видно из данных таблицы 2, полученный порфиразин показал улучшение свойств нового соединения как потенциальных фотосенсибилизаторов процесса ФДТ по сравнению с выбранным прототипом (тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразином, II), по крайней мере, по одному критерию из указанных выше.

Оценка эффективности фотодинамического воздействия полученного тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина на раковые клетки демонстрирует существенное уменьшение нежелательной темновой цитоксичности макроцикла. Это означает, что допустимая концентрация порфиразина в темноте существенно возрастает по сравнению с II, что значительно уменьшает нежелательные побочные эффекты в здоровых тканях, не подвергающихся фотодинамическому воздействию. С этим связан наблюдаемый высокий терапевтический индекс порфиразина I.

Кроме того, для тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина наблюдается максимальный сдвиг максимума полосы поглощения в длинноволновую область спектра (630 нм), характеризующуюся большей прозрачностью биоткани.

Полученный тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразин демонстрирует заметное повышение эффективности в качестве потенциальных фотосенсибилизаторов ФДТ по сравнению с тетра(4-фторфенил)тетрацианопорфиразином II и высокую чувствительность параметров флуоресценции к локальной вязкости область.

Пример 2.

Тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразин I как флуоресцентный молекулярный ротор: зависимости квантового выхода красной флуоресценции от вязкости среды в этанольно-глицериновых смесях.

Тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразин растворяли в 3 мл смеси этанол/глицерин (концентрация порфиразина 1*10^-5 моль/л). Состав смесей с известной вязкостью [Abdullah S. Alkindi, Yahya М. Al-Wahaibi, and Ann H. Muggeridge. Journal of Chemical & Engineering Data, Vol. 53, No. 12, 2008] варьировался от 40 до 100 % глицерина. Интенсивность красной флуоресценции измеряли с помощью спектрофлуориметра (Perkin Elmer LS 55) при температуре 23°С.

Квантовый выход определяли относительно перхлората крезила фиолетового.

По полученным данным в логарифмических координатах для полученного тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина I строили зависимость квантового выхода от вязкости среды. Данные измерений представлены на рисунке 3 и в таблице 3.

Характер зависимости квантового выхода от вязкости среды для полученного тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина полностью соответствует уравнению (1) а значения α в этом уравнении находятся в интервале 0.46-0.66, что позволяет отнести полученный краситель к ряду флуоресцентных молекулярных роторов, т.е. потенциальных сенсоров локальной вязкости.

Таким образом, предлагаемые в данной заявке фотосенсибилизатор ФДТ на основе полученного тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразина сохраняет высокую вязкостную чувствительность красной флуоресценции, характерную для прототипа (II).

Изобретение относится к тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразину, представленному структурной формулой, где R=C₁₆H₉ (пирен-1-ил). Технический результат – получено новое соединение, которое может найти свое применение в медицине в качестве мультифункционального агента фотодинамической терапии злокачественных новообразований, а именно в качестве фотосенсибилизатора и одновременно в качестве оптического сенсора внутриклеточной вязкости. 4 ил., 3 табл., 2 пр.

Тетра(пирен-1-ил)тетрацианопорфиразин формулы:

где R=C₁₆H₉ (пирен-1-ил),

как мультифункциональный агент терапии злокачественных новообразований, а именно высокоэффективный фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии и одновременно оптический сенсор внутриклеточной вязкости.