КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТОРНЫМ, ВАЗОДИЛАТИРУЮЩИМ И АНГИОПРОТЕКТОРНЫМ ЭФФЕКТОМ Российский патент 2012 года по МПК A61K31/198 A61K31/155 A61K9/22 A61P9/00 A61P15/10 

Изобретение относится к области фармацевтики, медицины, нутрицевтики и представляет собой композицию, обладающую комплексным воздействием на эндотелий кровеносных сосудов.

Впервые о самостоятельной роли сосудистого эндотелия в регуляции сосудистого тонуса было заявлено в статье Furchgott и Zawadzki, опубликованной в журнале «Nature» в 1980 г.

Последующие исследования доказали, что эндотелий - это не только покров, действующий как пассивный барьер между кровью и тканями, а является настоящим регулятором кровотока и тканевого гомеостаза. По этой причине был выдвинут постулат, что эндотелий сосудов является самой крупной и важной эндокринной железой в организме.

Известным фактом является, что эндотелий сосудов - это активная метаболическая система. Эта система функционирует или может функционировать как отдельный рецепторно-эффекторный орган, который имеет способности реагировать на физические или химические раздражители с выделением соответствующих биологически активных веществ, с помощью чего поддерживается вазомоторный баланс и сосудисто-тканевый гомеостаз (Гомазков О.А., 2000; Pacher P., 2007, Esper R.J., 2006, Luscher T.F., 1997). Эндотелий, как сейчас выяснилось, активно участвует в модуляции сосудистого тонуса, секретирует разнообразные вазоактивные вещества, одним из которых и весьма значимым оказался оксид азота (NO). Оксид азота (NO) - активная субстанция, высвобождаемая эндотелиальными клетками во время катаболизма L-аргинина при активном участии NO-синтазы, являющаяся наиболее мощным из известных в настоящее время вазодилататоров (Граник В.Г., 2004; Покровский В.И., 2005; Forstermaim U.T., 2006; Rabelink T.J., 2006).

Эндотелиальная дисфункция - основное звено и критическая точка в развитии сердечно-сосудистых заболеваний

Механизм участия эндотелия в возникновении и развитии различных патологических состояний многогранен и связан не только с регуляцией сосудистого тонуса, но и с участием в процессе атерогенеза, тромбообразования, защиты целостности сосудистой стенки и т.д.

В упрощенном виде можно выделить три основных стимула, вызывающих "гормональную" реакцию эндотелиальной клетки:

1) изменение скорости кровотока (увеличение напряжения сдвига);

2) тромбоцитарные медиаторы (серотонин, АДФ, тромбин);

3) циркулирующие и/или "внутристеночные" нейрогормоны (катехоламины, вазопрессин, ацетилхолин, эндотелин, брадикинин, гистамин и др.).

В норме, в ответ на эти стимулы, клетки эндотелия реагируют усилением синтеза веществ, вызывающих расслабление гладкомышечных клеток сосудистой стенки, и в первую очередь, оксида азота (NO), эндотелийзависимого фактора гиперполяризации [Coleman, H.A. TareM., Parkmgton H.C. Endothelialpotassiumchannels, endothelium-dependenthyperpolarizationandtheregulationofvasculartoneinhealthanddisease / H.A.Coleman, Т.Mare, Н.С.Parkington // Clin. Exp.Pharmacol. Physiol. - 2004. - V.31. - №9. P.641-649.].

Основные функции сосудистого эндотелия

1. Высвобождение вазоактивных агентов (оксид азота (NO), эндотелиальный гипераполяризующий фактор релаксации (ЭГФР), эндотелин, ангиотензин I-AI (и, возможно, ангиотензин II-AII), простациклин, тромбоксан)

2. Препятствие коагуляции (свертыванию крови) и участие в фибринолизисе (тромборезистентная поверхность эндотелия (одинаковый заряд поверхности эндотелия) и тромбоцитов препятствует "прилипанию" - адгезии - тромбоцитов к стенке сосуда, образование простациклина и NO - естественных дезагрегантов, образование t-PA (тканевого активатора плазминогена), экспрессия на поверхности клеток эндотелия тромбомодулина - белка, способного связывать тромбин, и гепариноподобных гликозаминогликанов)

3. Иммунные функции (представление антигенов иммунокомпетентным клеткам, секреция интерлейкина-I (стимулятора Т-лимфоцитов))

4. Ферментативная активность (экспрессия на поверхности эндотелиальных клеток ангиотензинпревращающего фермента - АПФ (конверсия AI в AII))

5. Участие в регуляции роста гладкомышечных клеток (ГМК) (секреция эндотелиального фактора роста (ЭФР), секреция гепариноподобных ингибиторов роста)

6. Защита гладкомышечных клеток от вазоконстрикторных влияний, обусловленных: гипоксией, гемодинамической перегрузкой, возрастными изменениями, свободнорадикальным повреждением, дислипопротеинемией (гиперхолестеринемией), действием цитокинов, гипергомоцистеинемией, гипергликемией, гипертензией, эндогенные интоксикации (почечная, печеночная недостаточности, панкреатит и др.), экзогенные интоксикации (курение) и др.

В таблице 1 представлены основные эндотелиальные факторы, регулирующие сосудистый тонус.

Таблица 1 Основные эндотелиальные вазоконстрикторные и вазодилатирующие факторы Эндотелиальные факторы, регулирующие сосудистый тонус Факторы эндотелиального происхождения, потенцирующие вазоконстрикцию вазодилатирующие вазоконстрикторные     - Простациклин - Эндотелин-1 - Адгезивные молекулы - Гиперполяризующий - Ангиотензин II - Сосудистый фактор фактор релаксации - Простагландин F2α проницаемости - Оксид азота - Тромбоксан А2 - Е-селектин - Эндотелиальный - Свободные радикалы - Р-селектин натрийуретический пептид - Свободные жирные кислоты - Фактор Виллебранда     - Тромбомодулин     - Цитокины

При длительном воздействии различных повреждающих факторов происходит постепенное истощение и извращение компенсаторной вазодилатирующей способности эндотелия, и преимущественным ответом эндотелиальных клеток на обычные стимулы становятся вазоконстрикция и пролиферация.

Таким образом, эндотелиальная функция может быть определена как баланс противоположно действующих начал - релаксирующих и констрикторных факторов, антикоагулянтных и прокоагулянтных факторов, факторов роста и их ингибиторов, а эндотелиальная дисфункция - нарушение равновесия указанных противоположно действующих начал, нарушающих гемоваскулярный гемостаз. В последнее время сложилось более узкое представление об эндотелиальной дисфункции как о состоянии эндотелия, при котором имеется недостаточная продукция оксида азота [53, 54, 55].

Патофизиологические этапы развития ЭД представляются многообразным комплексом соединяющихся и взаимообусловленных механизмов. Однако среди них есть наиболее распространенные, играющие ключевую роль в развитии данной патологии.

Поскольку оксид азота (NO) участвует в самых различных биорегуляторных эффектах сосудистого процесса, то снижение его уровня в эндотелиальных клетках (ЭК), в силу различных факторов, оказывает существенные изменения их функций и системы кровообращения в целом. Нарушения выражаются (Shiffrin E.L., 2001; Egashira K., 2002; Feletou M., 2006; Cooke J.P., 2003, Endemann D.H., 2004, Зотова И.В., 2000; Марков Х.М., 2005):

- уменьшение эффективности эндотелийзависимых вазодилататоров и, как следствие, повышение вазоконстрикторных влияний,

- повышение АД,

- нарушения локальной, региональной и системной гемодинамики, нарушение сердечной деятельности,

- увеличение выработки адгезивных веществ в эндотелии, что ведет к агрегации тромбоцитов, прилипание их и лейкоцитов к сосудистой стенке,

- пролиферация и/или миграция гладкомышечных клеток с образованием неоинтимы,

- синтез внеклеточного матрикса и др.

Исследования последних лет убедительно показали, что в различных комбинациях отмеченные нарушения, составляющие дисфункцию эндотелия в целом, имеют место при многих сердечно-сосудистых заболеваниях (артериальная гипертония, атеросклероз, ИБС, сердечная недостаточность, нарушения кровообращения в почках, легких, головном мозге, конечностях, кишечнике (Белоусов Ю.Б., 2000; Маколкин В.И., 2004; Боровков Н.Н., 2005; CookeJ.P., 2003; LandmesserU., 2004), а также их факторах риска (гиперхолестеринемия, курение табака, сахарный диабет, резистентность к инсулину, ожирение, гипокинезия, старение организма, наследственная отягощенность) (Шестакова М.В., 2001; Бувальцев В.И., 2002; Петрищев Н.Н., 2003; Верткин А.А., 2005; Мазуров В.И., 2006; BonettiP.O., 2003; BarbatoJ.E., 2004; SpiekerL.E., 2006; GiannottiG., 2007).

Эндотелиальные клетки могут предстать и в роли первоочередного этиологического фактора и органа-мишени при развитии сердечно-сосудистых изменений, связанных со снижением уровня эстрогенов (Тюренков И.Н., 2006; KrugE., 2002; ModenaM.G. 2002; TaddeiS., 2006). Патогенетические механизмы постменопаузального повышения АД являются достаточно запутанными и многофакторными. Они гораздо более сложные, чем просто влияние сниженного уровня эстрадиола в крови. Но очевидно, что один из них связан с нарушением эндотелийзависимой вазодилатации, вызванной снижением биодоступности NО (Карпов Ю.А., 2001; Hinojosa-LabordeC., 2004; ZanchettiA., 2005; RosanoG.M., 2007; CoylewrightM., 2008). Это может быть обусловлено повышением активности ренина плазмы, стимуляцией окислительного стресса, увеличением сольчувствительности, ожирением, повышением симпатического тонуса (MajmudarN.G., 2000; SimonT., 2000; DubeyR.K., 2002; ScuteriA., 2003; TeerlinkT., 2003; ThompsonL.P., 2005; MillerV.M., 2007). Поэтому коррекция эндотелиальной дисфункции в постменопаузальном периоде считается одним из важных аспектов терапии для восстановления баланса регуляции сосудистого тонуса, гемостаза, иммунного ответа, предупреждения миграции клеток крови в сосудистую стенку, уменьшения синтеза факторов воспаления, укрепления барьерных функций эндотелия (Сметник В.П., 2001; Ольбинская Л.И., 2001; Herrington D.M., 1999; Diamanti-KadarakisE., 2001; HarmanS.M., 2005; Min-kinM.J., 2007).

В плазме крови уровень L-аргинина оказывается сниженным при многих болезнях сердечно-сосудистой системы и их факторах риска. Показано, что пероральное и парентеральное введение L-аргинина в организм больных с этими заболеваниями восстанавливает сниженный у них уровень L-аргинина, NO и функции эндотелия, давая соответствующий терапевтический эффект (Степанов Ю.С., 2005; Марков Х.М., 2005, PiattiP., 2003; PiattiP., 2000; HambrechtR., 2000; LinK.Y., 2002; TousoulisD. 2007; Bode-BogerS.M., 2003). Это позволяет считать, что дефицит NO и дисфункция сосудистого эндотелия у таких больных могут быть обусловлены в той или иной степени недостатком L-аргинина в качестве субстрата для eNOS (SchlaichM.P., 2004; NakamuraK., 2003; KawanoH., 2002; BreedersM.A., 2002; PemowJ., 2003; GomikH.L., 2004).

В последнее время в исследованиях причин развития и прогрессирования сердечно-сосудитых заболеваний обращено внимание к асимметричному диметиларгинину (АДМА), названного новым маркером и фактором риска развития и прогрессирования эндотелиальной дисфункции и атеросклероза (BogerR-.Н., 1998, 2004; ZoccaliC., 2001; AchanV., 2003; KielsteinJ., 2003).

На основе экспериментальных данных, имеется предположение, что ферментная активность синтазы окиси азота регулируется соотношением концентраций эндогенного L-аргинина и ассиметричного диметиларгинина (т.н. ADMA), который является эндогенным ингибитором. Физиологическое равновесие поддерживается так, что при наличии обычных уровней L-аргинина повышение уровня ADMA ведет к относительному дефициту L-аргинина, что сказывается на оптимальной активности синтазы окиси азота. Так как ADMA является конкурентным ингибитором синтазы окиси азота, его ингибирующее действие может быть преодолено повышением концентрации ферментного субстрата (L-аргинина) (LuT.M., 2003; BögerR.H., 2005; 2004, 2007). Поэтому дополнительное введение L-аргинина может помочь в восстановлении физиологического состояния синтеза оксида азота путем нормализации соотношения «L-аргинин/АDМА». Кроме этого, эстрогены регулируют метаболизм и освобождение асимметричного диметиларгинина (ADMA) - эндогенного ингибитора NO-синтазы (TeerlinkT., 2003; PostM.S., 2003). Исследования HoldenD.P. etal. (2003) продемонстрировали снижение уровня циркулирующего ADMA после эстрогензаместительной терапии у постменопазуальных женщин, кроме того, эстрогены снижают освобождение ADMA из эндотелиальных клеток и стимулируют активность фермента диметиларгининдиметиламиногидролазы, метаболизирующего ADMA в опытах in vivo.

Следующим важным фактором, способствующим повышению ADMA у женщин в постменопаузе, является повышение сольчувствительности и, как следствие, артериального давления, что дополнительно усугубляет развитие эндотелиальной дисфункции, выражающееся в снижении эндотелийзависимой вазодилатации (ScuteriA., 2003).

Участие L-аргинина в метаболизме оксида азота (NO) и NO-синтазы при нарушении функции сосудистого эндотелия

Оксид азота синтезируется в эндотелии (изоформами фермента NO-синтазы: 2 из них конституитивные - эндотелиальной и нейрональной и 1 индуцибельной), как результат реакции аминокислоты L-аргинина, при участии молекулярного кислорода. Катализатор-фермент NO-синтаза. Реакцию можно изобразить следующим схемой: L-аргинин+O2 →L-цитруллин+NO. NO синтезируется. В регуляции сердечно-сосудистой системы осуществляет конститутивная эндотелиальная NO-синтаза (eNOS). Образование оксида азота осуществляется поэтапно с промежуточным образованием N-гидрокси-L-аргинина (NHA. [73, 103, 309] (Рис.1).

Обратное превращение L-аргинина из L-цитруллина регулируется аргининсукцинатсинтазой и аргининсукцинатлиазой [Glucocorticoids regulate inducible nitricoxidesynthase by inhibiting tetrahydrobiopterinsynthesis and L-arginine transport / W.W.Simmons, D. Ungureanu-Longrois, G.K.Smith et al. // J. Biol. Chem. - 1996. - V.271. - P.23928-23937, Glucocorticoids mediate the enhanced expression of intestinal type II arginase and argininosuccinatelyase in postweaning pigs / N.E.Flynn, C.J.Meininger, K.Kelly et al. // J. Nutr. -- 1999. - V.129. - P.799-803.].

К переносчикам L-аргинина относятся такие мессенджеры, как САТ-1 и CAT-2 - ферменты-транспортеры катионных аминокислот [Guoyao, W.U., Arginine metabolism: nitric oxide and beyond / W.U.Guoyao, S.M.Morris // Biochem. J. - 1998. - V.336. - P.1-17., Glucocorticoids regulate inducible nitric oxide synthase by inhibiting tetrahydrobiopterin synthesis and L-arginine transport / W.W.Simmons, D.Ungureanu-Longrois, G.K.Smith et al. // J. Biol. Chem. - 1996. - V.271. - P.23928-23937]. B числе других аминокислот, L-аргинин участвует в синтезе белка. Неполимеризованный L-аргинин учувствует в инкретировании гормонов, таких как инсулин, соматотропин, пролактин, глюкагон. Аргиназа (2 изоформы) и NO-синтаза/NOS (3 изоформы), аргининдекарбоксилаза, а также другие ферменты участвуют в превращении L-аргинина.

Продуктами метаболизма L-аргинина, кроме NO, являются мочевина, креатин, L-орнитин, L-цитруллин, L-пролин и др. [Guoyao, W.U., Arginine metabolism: nitric oxide and beyond / W.U.Guoyao, S.M.Morris // Biochem. J. - 1998. - V.336. - P.1-17.]. Имеется вероятность иного, т.н. независимого пути от NO-синтаза /NOS, образование оксида азота (NO) за счет реакции между аргинином и перекисью водорода [Antineutrophil cytoplasm antibody-induced neutrophil nitric oxide production is nitric oxide synthase-independent / W.Y.Tse, J.Williams, A.Pall et al. // Kidney Int. - 2001. - V.59. - P.593-600.].

Эндотелиальная NO-синтетаза (eNOS) локализована в кавеолах (так называются лакунообразные микроучастки эндотелиальных клеток плазматической мембраны 50-1000 нм), где она ассоциирована с кавеолином. Связанное состояние eNOS пoзвoляeт резко снижать активность фермента [Michel, Т. Nitric oxide synthases: which, where, how and why. / T.Michel, O.Feron // J. Clin. Invest. - 1997. - V. - 100. - P.2146-2152., Griffits, P.W. Nitric oxide synthases: properties and catalytic mechanism / P.W.Griffits, D.J.Stuehr // Ann. Rev. Physiol. - 1995. - V.57. - P.707-736.]. Отмечены 5 основных факторов, влияющих на скорость NOS-зависимого синтеза NO, одним из них является концентрация L-аргинина внутри клеток, синтезирующих NO. Этот фактор посттрансляционный [Покровский, В.И. Оксид азота, его физиологические и патофизиологические свойства / В.И. Покровский, Н.А. Виноградов // Терапевтическийй архив. - 2005. - №1. - С.82-87].

Имеются данные, которые демонстрируют способность L-аргинина сепаратно избегать процесса разрушения, нарушения функции (расщепления, «uncoupling) в работе NOS, возникающей эндотелиальной дисфункции при патофизиологических факторах различной этиологии: повышение количества эндогенных ингибиторов eNOS в плазме, окисленных ЛПНП, окислительной активности NADPH и др. [Inducible nitric-oxide synthase generates superoxide from the reductase domain / Y.Xia, L.J.Roman, B.S.S.Masters, J.L.Zweier // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol 273. - P.22635-22639., Pravastatin attenuates cardiovascular inflammatory and proliferative changes in a rat model of chronic inhibition of nitric oxide synthesis by its cholesterol-lowering independent actions. Egashira K, Ni W, Inoue S, Kataoka C, Kitamoto S, Koyanagi M, et al. Hypertens Res 2000; 23: 353-358., Xia, Y. Inducible nitric-oxide synthase generates superoxide from the reductase domain. / Y.Xia, L.J.Roman, B.S.Masters, J.L.Zweier // J. Biol. Chem. - 1998. - V.273. - P.22635-22639.].

Оксид азота, после его образования, выделяется из клеток эндотелия и диффундирует в расположенные глубже миоциты стенок сосудов. Воздействуя на миоциты сосудов, оксид азота (NO) активирует гуанилатциклазу, что приводит к повышению содержания 3,5-циклического гуанозинмонофосфата, эти процессы провоцируют снижение концентрации кальция и в результате наступает релаксация гладкомышечных клеток и вазодилатация [Cavelin, caveolaeand endothelium cell function. / Frank P.O., Woodman S.E., Park D.S., Lisanii M.P. // ArteriosclerThrombVaseBiol 2003;23:1161-1168., Зотова, И.В. Синтез оксида азота и развитие атеросклероза / И.В.Зотова, Д.А.Затейщиков, Б.А.Сидоренко // Кардиология. - 2000. - №4. - С.58-67, Luscher T.F., Endothelial control of vascular tone and growth // Clin. Exp.Hypertens. - №12. - 1990.-. P.897-902, Luscher T.F., Endothelium - derived vasoactive factors and regulation of vascular tone in human blood vessels // Lung. - V.168. - 1990. - P.27-34].

Важно отметить, что эндотелиальные факторы релаксации дополнительно вызывают системные эффекты, которые профилактируют патологические процессы тромбообразования и предупреждают повреждения сосудистой стенки. Это блокирование агрегации тромбоцитов, окисления липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), экспрессии молекул адгезии, адгезии моноцитов и тромбоцитов к стенке сосуда и т.д. [BarbatoJ.E., TzengE.Nitricoxideandarterialdisease.J VascSurg 2004; 40:187-193., An association between plasma asymmetric dimethylarginine and membrane fluidity of erythrocytes in hypertensive and normotensive men: an electron paramagnetic resonance investigation. Am J Hypertens, 2005 Sep; 18 (9 Pt 1):1243-8].

В свете сказанного, становится важным присутствие оксида азота (NO) в миокарде. NO повышает диастолическую растяжимость левого желудочка, этот процесс играет значительную роль при развитии гипертрофии сердца. Оксид азота является одним из факторов регуляции инотропного и хронотропного β1-адренергических эффектов [Марков Х.М., Надирашвили С.А. О регуляции деятельности сердца системой L-аргинин-оксид азота. Пат физиол экс-пер тер 2003; 4:9-11., Марков Х.М., Надирашвили С.А. Возрастные особенности коронарных эффектов оксида азота. Рос.педиат.журн 2004; 4:17-21].

Эндогенные факторы дефицита NO и, как следствие, дисфункция эндотелия

Замедление экспрессии и активности эндогенной NO синтетазы (eNOS), как правило, сопряжено с дисфункцией эндотелия. Первым в ряду факторов, приводящих к этому, являются эндогенные ингибиторы eNOS, например АДМА [Association tanalysis of СА repeat polymorphism of the endothelial nitric synthase gene to essential hypertension in Japanese. NakaymaT., Soma J., Takahashi J. el al. Clin Genet 1997; 51:26-30., Endogenous nitric oxide synthase inhibitor: a novel marker of atherosclerosis. Miyazaki H, Matsuoka H, Cooke JP, Usui M, Ueda S, Okuda S, Circulation 99: 1141-1146, 1999, Asymmetric dimethylarginine (ADMA): a novel risk factor for endothelial dysfunction: its role in hypercholesterolemia. Boger R.H., Bode-Boger S.M., SzubaA. et al. Circulation 1998;98:1842- 1847., Cooke J.P. Does ADMA cause endothelial dysfunction. Arterio-sclerThromb Vase Biol 2002; 20:2032-2045.].

Асимметричный диметиларгинин (АДМА)

Активность eNOS, образование NO и функции сосудистого эндотелия - все это взаимосвязанная система, которая зависит от содержания эндогенных ингибиторов eNOS. Одними из селективных ингибиторов этого фермента являются NG-диметил-аргинин (несимметричный диметиларгинин, АДМА) и NG-мономентил-L-аргинин (NMMA) [Endogenous nitric oxide synthase inhibitor: a novel marker of atherosclerosis. Miyazaki PI, Matsuoka H, Cooke JP, Usui M, Ueda S, Okuda S, Circulation 99: 1141-1146, 1999, Asymmetric dimethylarginine (ADMA): a novel risk factor for endothelial dysfunction: its role in hypercholesterolemia. Boger R.H., Bode-Boger S.M., SzubaA. et al. Circulation 1998; 98:1842-1847., Cooke J.P. Does ADMA cause endothelial dysfunction. Arterio-sclerThromb Vase Biol 2002; 20:2032-2045.]. В плазме крови содержание АДМА в 10 раз превышает уровень NMMA, вследствие этого АДМА и привлекает внимание к себе.

Установлены два типа ферментов, которые метилируют L-аргинин: протеин-аргинин-метилтрансфераза (PRMT-1), катализирующий образование АДМА и NMMA, и PRMT-2, образующий симметричный диметиларгинин (СДМА) [TaniyamaY., Griendling K.K. Reactive oxygen species in the vasculature: molecular and cellular mechanisms.// Hypertension. - 2003. - Vol.42, N 6. - P.1075-1081.]. Последний является стереоизомером АДМА, но не оказывает влияния на eNOS.

Различные виды клеток обладают способностью вырабатывать АДМА, в том числе ЭК человека [Metabolism of methylarginines by human vasculature; implication for the regulation of nitric oxide synthesis. Mac Allister R.J., Pickling S.A., Whilley G.S. et al. Br J Pharmacol 1994; 112:43-48.].

АДМА выводится с мочой, но главным путем его метаболизма является разрушение диметиларгинин-диметиламиногидролазой (DDAH), которая гидролизирует АДМА до образования диметиламина и L-цитруллина [Regulation ofendothelin-1 release from human endothelial cells by sex steroids and angiotensin-II. Pearson LJ, Yandle TG, Nicholls MG, Evans JJ. Peptides. 2008 Jun; 29(6): 1057-61. Epub 2008 Feb 13.]. Локализация DDAH и eNOS свидетельствует о том, что концентрация метиларгинина активно и специфично регулируется в клетках, генерирующих NO.

Было показано, что концентрация АДМА в плазме в пределах 2-10 мкмоль/л существенно тормозит NOS в изолированных кровеносных сосудах человека, в культивированных макрофагах и ЭК, уменьшая образование NO. Введение АДМА животным вызывает повышение среднего АД и сосудистого сопротивления в почках, кишечнике, конечностях. В соответствии с этим, у чувствительных к соли крыс с артериальной гипертензией (линии Dahl) было обнаружено увеличение экспрессии АДМА [Asymmetric dimethylarginine, and endogenous nitric oxide inhibitor in experimental hypertension. Matsuoka H., Itoh S., Kimoto M. et al. Hypertension 1997; 29:Pt 2:242-247]. Аналогичное явление имеет место и у людей с зависимой от потребления соли гипертонией: высокосолевая диета повышает АД и уровень АДМА в плазме крови, снижая экскрецию с мочой метаболитов NO; низкосолевая диета устраняет эти нарушения [Stuhlinger M.C., Abbasi F., Chit J.W. Relationship between insulin resistance and an endogenous nitric oxide synthase inhibitor. JAMA 2002; 287:11:1420-1426.]. Такие же изменения АДМА и образования NO, а также снижение активности DDAH (фермента, разрушающего АДМА) обнаружены и у больных эссенциальной [Reduced uterine perfusion pressure during pregnancy in the rat is associated with increases in arterial pressure and changes in renal nitric oxide. Alexander, В.Т., Kassab, S.E., Miller, M.Т., Abram, S.R., Reckelhoff, J.F., Bennett, W.A. & Granger, J.P. (2001) Hypertension 37:1191-1195.] и легочной [Cooke J.P.A novel mechanism for pulmunary arterial hypcrtensioni. Circulation 2003; 108:1420-1421., 277] гипертонией.

Значительное повышение уровня АДМА наблюдается при атеросклерозе [Asymmetric dimethylarginine plasma concentrations differ in patients with end-stage renal disease: Relationship to treatment method and atherosclerotic disease. Kielstein JT, Boger RH, Bode-Boger SM, Schaffer J, Barbey M, Koch KM, Frolich JC:J Am SocNephrol 10: 594-600, 1999, Nilsson I, Shibuya M, Wennstrom S. Differential activation of vascular genes by hypoxia in primary endothelial cells. Exp Cell Res. 2004 Oct 1; 299(2):476-85.]. Это повышение концентрации АДМА является причиной, наблюдаемой при атеросклерозе дисфункции эндотелия, о чем свидетельствует, в частности, снижение эндотелийзависимой вазодилатации при данной болезни [Asymmetric dimethylarginine (ADMA): a novel risk factor for endothelial dysfunction: its role in hypercholesterolemia. Boger R.H., Bode-Boger S.M., SzubaA. et al. Circulation 1998; 98:1842-1847.]. В данных условиях уровень АДМА в плазме крови лучше коррелирует с дисфункцией эндотелия, чем холестерин ЛИП. Показано также, что торможение eNOS под влиянием АДМА вызывает оксидативный стресс в ЭК и повышает экспрессию редокс-чувствительных генов, которые кодируют адгезивные молекулы эндотелия в такой же степени, как это имеет место на ранней стадии атеросклероза [Asymmetric dimethylarginine (ADMA): an over risk factor for endothelial dysfunction: itsroleinhypercholesterolemia. Boger RH, Bode-Boger SM, Szuba A, et al. Circulation 1998; 98:1842-1847., Boger R.IL, Bode-Boger S.M. Is asymmetric dimethylarginine anevcl marker of atherosclerosis. Circulation 2000; 101:160-162.].

Уровень ADMA обратно пропорционален степени эндотелийзависимой вазодилатации у лиц с гиперхолестеринемией на фоне введения L-аргинина - конкурентного субстрата eNOS для ADMA, нормализующего эндотелиальную функцию [Asymmetric dimethylarginine, blood pressure and renal perfusion in elderly subjects. Kielstein J., Bode-BogerT., Frolich J.C. et al. Circulation 2003; 107:1891-1895.]. Внутривенное введение ADMA снижает частоту сердечных сокращений, сердечный выброс и повышает артериальное давление [Asymmetric dimethylarginine causes hypertension and cardiac dysfunction in humans and is actively metabolized by dimethylargininedimethylaminohydrolase. Achan V., Broadhead M, Malaki M, Whitley G, Leiper J, MacAllister R, Vallance P: Arterioscler Thromb Vase Biol 23: 1455-1459, 2003]. Повышенный интерес, появившийся к ADMA в последнее время, связан не столько с элиминацией сколько с образованием данной эндогенной субстанции. ADMA образуется при участии фермента протеин-аргинин метилтрасферазы-1, количество которого увеличивается при длительно существующей гемодинамической перегрузке проводящих артерий (высоким напряжением сдвига), что соответственно приводит к увеличению количеств ADMA [Effect of shear stress on asymmetric dimethylarginine release from vascular endothelial cells. Osanai T, Saitoh M, Sasaki S, Tomita H, Matsunaga T, Okumura K: Hypertension 42: 985-990, 2003]. Также это наблюдается при гиперхолестеринемии [Asymmetric dimethylarginine (ADMA): a novel risk factor for endothelial dysfunction: its role in hypercholesterolemia. Boger R.H., Bode-Boger S.M., SzubaA. et al. Circulation 1998; 98:1842-1847.], у пожилых лиц с артериальной гипертензией [Asymmetric dimethylarginine, blood pressure and renal perfusion in elderly subjects. Kielstein J., Bode-BogerT., Frolich J.C. et al. Circulation 2003; 107:1891-1895.], т.е. наблюдается корреляция плазменного содержания ADMA с уровнем АД и возрастом [Endogenous nitric oxide synthase inhibitor: a novel marker of atherosclerosis. Miyazaki H, Matsuoka H, Cooke JP, Usui M, Ueda S, Okuda S, Circulation 99: 1141-1146,

1999].

Поскольку повышение концентрации АДМА выявляется не только при выраженной недостаточности почек (в 10 раз!), но и задолго до этого (на фоне нормального функционирования почек), причина наблюдаемого повышения уровня АДМА должна быть связана не со снижением его экскреции, а главным образом с уменьшением его разрушения под влиянием DDAH [Характеристика биохимических маркеров функции сосудистого эндотелия: разработка модельной системы с применением клеточных культур / В.А.Метельская, Н.Г.Гуманова, О.А.Литинская и др. // Вопр. биол. медицины и фарм. химии. - 2004. - №2. - С.34-39.]. Этот фермент обнаружен в ЭК почечных сосудов (в том числе на уровне клубочков), а также в канальциевых клетках. Полагают, что при поражении последних у больных с заболеваниями почек уровень DDAH снижается, что ведет к увеличению содержания АДМА, снижению уровня NO и дисфункции сосудистого эндотелия [Asymmetrical dimethylarginine (ADMA) in critically ill patients: High plasma ADMA concentration is an independent risk factor ofICU mortality. Nijveldt RJ, Teerlink T, Van Der Hoven B, Siroen MP, Kuik DJ, Rauwerda JA, Van Leeuwen PA: ClinNutr 22: 23-30, 2003, Pieper G.M. Review of alterations in endothelial nitric oxide production in diabetes. Hypertension 1998; 31:1047-1060.]. Добавление 4124 W (ингибитора DDAH) к среде инкубации изолированного сосудистого сегмента вызывало его сокращение, а L-аргинин устранял этот эффект [Cooke J.P. Does ADMA cause endothelial dysfunction. Arterioscler Thromb Vase Biol 2002; 20:2032-2045.].

Повышение уровня АДМА или снижение DDAH, сопровожающиеся дисфункцией сосудистого эндотелия, установлены также при сахарном диабете [Impaired nitric oxide synthase pathway in diabetes mellitus: role of asymmetric dimethylarginine dimethylaminohydrolase. Lin K.Y., Ito A., Asagami T. et.al. Circulation 2002; 106:987-992.], резистентности к инсулину [Remillard CV, Yuan JX. Cardiac L-arginine transport: the CAT is back. J Physiol. 2007 May 1; 580 (Pt.3):699-700.], аллоксановой гипергликемии [Hypercholesterolemia enhances tromboembolism in Arterioles but Not Venules: complete reversal by L-arginine. Breeders M.A. W., Tangelder G.J., SlaafD. W. et al. Arterioscler Thromb Vase Biol 2002; 22:680-685.], беременности и преэклампсии [Plasma concentration of asymmetrical dimethylarginine and mortality in patients with end-stage renal disease: A prospective study. Zoccali C, Bode-Boger S, Mallamaci F, Benedetto F, Tripepi G, Malatino L, Cataliotti A, Bellanuova I, Fermo I, Frolich J, Boger R: Lancet 358: 2113-2117, 2001], гиперхолестеринемии [Asymmetric dimethylarginine (ADMA): a novel risk factor for endothelial dysfunction: its role in hypercholesterolemia. Boger R.H., Bode-Boger S.M., SzubaA. et al. Circulation 1998; 98:1842-1847.], гипергомоцистеинемии [259], сердечной недостаточности [124, 339], ишемических болезнях периферических сосудов [141, Asymmetric dimethylarginine, blood pressure and renal perfusion in elderly subjects. Kielstein J., Bode-BogerT., Frolich J.C. et al. Circulation 2003; 107:1891-1895.], гипертиреоидизме [Plasma concentration of asymmetric dimethylarginine, a natural inhibitor of nitric oxide synthase, in normal pregnancy and preeclampsia. Holden D., Pickling S., Wliitley G., Nussey S. Am J ObstctGynecol 1998; 178:551-556.9], ожирении [Stoleru, L. Effect of D-nebivolol and L-nebivolol on left ventricular systolic and diastolic function: comparison with DL-nebivolol and atenolol / L.Stoleru, W.Wijns, C.van Eyil // J. Cardiovasc. Pharmacol. - 1993. - №22. - P.183-190.], курении табака [L-arginine normalizes coronary vasomolion in long-term smokers. Campisi R., Sudhir K., Sievers R.F. el al. Circulation 1999; 99:491-497.], старении [Asymmetric dimethylarginine, blood pressure and renal perfusion in elderly subjects. Kielstein J., Bode-BogerT., Frolich J.C. et al. Circulation 2003; 107:1891-1895.].

Также существует проблема, как реактивная форма кислорода. Избыточная продукция реактивных форм кислорода, т.н. оксидантный стресс, преодолевает защитную функцию антиоксидантных механизмов клетки. Т.о. оксидантный стресс становится сильным патогенным фактором, подвергая окислению и нарушая функции таких биологических макромолекул, как ДНК, белки, углеводы, липиды [Glembotski С.С.Endoplasmic Reticulum Stress in the Heart Circ. Res., November 9, 2007; 101(10): 975-984, Tentolouris С, Tousoulis D, Stefanadis C. L-arginine "paradox" in coronary atherosclerosis. Circulation. 2004 Aug 17; 110(7):e71, TouyzRM. Oxidative stress and vascular damage in hypertension. Curr Hypertens Rep.2000 Feb; 2(1):98-105.].

Избыток реактивных форм кислорода, таких как супероксид-анион, гидроксильныи радикал, гидроперекисный радикал, перекись водорода, вызывает и другие изменения функций эндотелия сосудов: торможение эндотелийзависимой вазодилатации, увеличение синтеза адгезивных молекул, прилипание и проникновение моноцитов в сосудистую стенку, привлечение провоспалительных белков и клеток; повышение агрегации тромбоцитов и тромбообразования, активности апоптоза и др., т.е. повышенное образование реактивных форм кислорода при сосудистых нарушениях [Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н.]. Свободнорадикальные процессы при заболеваниях сердечно-сосудистой системы сопровождаются выраженной дисфункцией сосудистого эндотелия. [Кардиология 2000; 7:48-61, CookeJ.P. Flow, NO andatherogenesis. PNAS 2003; 100:3:768-770., Ferdinandy P, Schuiz R. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite in myocardial ischaemia-reperfusion injury and preconditioning. Br J Pharmacol. 2003 Feb; 138(4):532-43. Review., 545, Ganz P, VitaJA. Testing endothelial vasomotor function: nitric oxide, a multipotent molecule. Circulation. 2003 Oct 28; 108(17):2049-53., Tschudi M.R., Luscher T.F. Nitric oxide: the endogenous nitrate in the cardiovascular system // Herz. - 1996. - V.21. - P.50-60., Tentolouris C, Tousoulis D, Stefanadis C. L-arginine "paradox" in coronary atherosclerosis. Circulation. 2004 Aug 17; 110(7):e71]. Реактивные формы кислорода, в частности супероксид-анион - О^2-, обладают способностью тормозить экспрессию и снижать активность eNOS, а также связывать и инактивировать NO, уменьшать его содержание в клетке. Изменение физиологического баланса между NO и О² в сторону второго может приводить к образованию высокотоксичного пероксинитрита (ONOO^-), который повреждает мембрану и ДНК клетки, вызывает мутации, апоптоз, способствует развитию воспалительных процессов и иных патологических изменений [Ferdinandy P, Schuiz R. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite in myocardial ischaemia-reperfusion injury and preconditioning. Br J Pharmacol. 2003 Feb; 138(4):532-43. Review.].

При экспериментальном моделировании артериальной гипертензии у животных увеличение реактивных форм кислорода приводит к эндотелиальной дисфункции, что подтверждается улучшением эндотелийзависимой релаксации при применении антиоксидантов [ChenX, Antioxidant effects of vitamins C and E are associated with altered activation of vascular NADPH oxidase and superoxide dismutase in stroke-prone SHR. Touyz R M, Park J B, Schiffrin E L: Hypertension 38: 606-611, 2001].

В клинической практике имеются доказательства, что избыток свободных радикалов кислорода у пациентов с гипертензией приводит к снижению выработки NO и находится в прямой корреляционной связи со степенью снижения эндотелийзависимой вазодилатации и проявлениями сердечно-сосудистых заболеваний [Endothelial dysfunction, oxidative stress, and risk of cardiovascular events in patients with coronary artery disease. Heitzer T, Schlinzig T, Krohn K, Meinertz T, Munzel Т Circulation 104: 2673-2678, 2001, Oxygen radicals as second messengers for expression of the monocyte chemoattractant protein, JE/MCP-1, and the monocyte colony-stimulating factor, CSF-1, in response to tumor necrosis factor- and immunoglobulin G: evidence for involvement of reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)-dependent oxidase. Satriano JA, Shuldiner M, Hora K, Xing Y, ShanZ, SchlondorffD. J Clin Invest. 1993; 92:1564-1571].

В моделях хронической почечной недостаточности показано, что усиленная продукция реактивных форм кислорода приводит к снижению биодоступности NO и проявлениям эндотелиальной дисфункции, корригируемой предварительной терапией антиоксидантами [Endothelial dysfunction and hypertensionin 5/6 nephrectomized rats are mediated by vascular superoxide. Hasdan G, Benchetrit S, Rashid G, et al. Kidney Int 61: 586-590, 2002, Enhanced nitric oxide inactivation and protein nitration by reactive oxygen species in renal insufficiency. Vaziri N D, Ni Z, Oveisi F, Liang K, Pandian R: Hypertension 39: 135-141, 2002].

В моделях диабета 2 типа избыточное образование свободных радикалов кислорода также приводит к эндотелиальной дисфункции [FrisbeeJC, SteppDW:ImpairedNO-dependent dilation of skeletal muscle arterioles in hypertensive diabetic obese Zuckerrats. Am J Physiol Heart Circ Physiol 281: H1304-H1311, 2001, Vascular oxidative stress and endothelial dysfunction in patients with chronic heart failure: Role of xanthine-oxidase and extracellular superoxide dismutase. Landmesser U, Spiekermann S, Dikalov S, Tatge H, Wilke R, Kohler C, Harrison DG, Homig B, Drexler H: Circulation 106: 3073-3078, 2002]. Очевидно, как следует из экспериментальных данных, реактивные формы кислорода вовлечены в процесс усугубления эндотелиального повреждения, ведущего к запрограммированной гибели клеток или апоптозу, или же к «аноикису», в форме апоптоза, характеризующемуся отщеплением эндотелиальных клеток [Vascular oxidative stress and endothelial dysfunction in patients with chronic heart failure: Role of xanthine-oxidase and extracellular superoxide dismutase. Landmesser U, Spiekermann S, Dikalov S, Tatge H, Wilke R, Kohler C, Harrison DG, Hornig B, Drexler H: Circulation 106: 3073-3078, 2002]. «Аноикис» - это конкретный механизм, вызванный утратой взаимодействий клеточной матрицы. Его роль в развитии сердечно-сосудистых заболеваний не ясна в полной мере. Было показано, что эйкозапентаноевая кислота (полиненасыщенная жирная кислота, содержащаяся в рыбьем жире) защищает клетки эндотелия от «аноикиса» [Eicosapentaenoic acid protects endothelial cells against anoikis through restoration of cFLIP. Suzuki T, Fukuo K, Suhara T. Et al. Hypertension 42: 342-348, 2003], что в свою очередь, может способствовать проявлению антиатерогенного и кардиопротективного эффектов рыбьего жира.

В течение последних лет огромное внимание уделяется L-аргинину как источнику NO. Существует множество работ, доказывающих неоспоримую роль L-аргинина в продукции главного вазодилатирующего фактора [Durante, W., Arginase: acritical regulator of nitrite oxide synthesis and vascular function / W.Durante, F.R.Jonson, R.A.Jonson // Clin. Exp.Pharmacol. Physiol. - 2007. - №34. - P.906-911., Morris JR, S.M. Recent advances in arginine metabolism: roles and regulation of the arginases / S.M.Morris JR // British Journal of Pharmacology. - 2009. - №157. - P.922-930].

Известна пищевая добавка (Патент США 6548087), включающая L-аргинин, женьшень, витамин РР, дегидроэпиандростерон и цинк, используемая для профилактики сексуальной дисфункции и улучшения микроциркуляции крови.

Известна пищевая диетическая добавка (Патент США 6544563), включающая L-аргинин, женьшень, гинкго билоба, антиоксидантные витамины А, С, Е, витамины группы В и минеральные вещества, способствующая повышению сопротивляемости организма человека, улучшению сексуальной функции, функции сердечно-сосудистой системы и функций высшей нервной деятельности.

Известно применение L-аргинина и лизина для повышения уровня эндотелиального NO для ингибирования развития атеросклероза, рестеноза или тромбоза в васкулярной системе (патент США 5945452). Валин и лизин являются известными конкурентными ингибиторами аргиназы, однако при их применении возможно цитотоксическое действие.

Известна комбинация аргинина с амлодипином или индапамидом (Малыхин, Виталий Алексеевич. Исследование эндотелиопротективных свойств L-аргинина и его комбинаций с амлодипином и индапамидом. Автореферат диссертация, 2009, Курск). Отмечается, что очевидно, положительное фармакодинамическое взаимодействие сочетанного применения L-аргинина с антигипертензивными препаратами связано с их разными точками приложения действия. А также высказывается предположение, что при длительном применении аргинина возможно антистрессовое действие. Однако длительное применение может привести к побочным эффектам.

В качестве ближайшего аналога может быть указана комбинация L-аргинина и ингибитора аргиназы для лечения нарушений, связанных с пониженной биодоступностью оксида азота (WO 2004073623). В данном решении обсуждается проблема улучшения биодоступности аргинина комбинированием с любыми ингибиторами аргиназы. При этом отмечается, что комбинирование позволяет не использовать большие дозы аргинина, однако концентрация аргинина в плазме остается низкой даже в присутствии ингибитора аргиназы. Для повышения биодоступности предлагается ввести также магний. Основные испытания касаются лечения астмы, и не обсуждается собственно эндотелинпротективное действие комбинации.

Задача, решаемая изобретением, заключается в предоставлении композиции, обладающей повышенным эффектом, антистрессовым свойством в отношении эндотелия сосудов, вазодилатирующим и ангиопротекторным действием, в том числе при применении для коррекции нарушений эректильной дисфункции.

Сущность изобретения заключается в том, что заявляемая композиция выполняется в виде твердой лекарственной формы, покрытой ретардирующей оболочкой, содержит в своем составе ингредиенты, обеспечивающие его ангиопротекторные свойства - это L-аргинин в виде L-аргинина гидрохлорида или L-цитруллин и ингибитор аргиназы, выбранный из L-норвалина (2-аминопентановая кислота, α-аминовалериановая кислота) и nor-NOHA (N-гидрокси-нор-L-аргинин, N(omega)-hydroxy-nor-L-arginine) и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества.

Новизна изобретения заключается в ранее не известном применении перечисленных компонентов, способствующих нормализации функций эндотелия сосудов в организме человека, в виде фиксированной дозированной композиции для перорального приема.

При совместном применении L-аргинина или L-цитруллина и ингибитора аргиназы проявляется более выраженный эффект L-аргинина на сосуды биологического организма, в частности млекопитающего. Ингибиторы аргиназы способствуют улучшенной биодоступности аргинина, но не все из них могут использоваться для длительного применения и для повышения стресс-защитного эффекта. Поэтому для целей данного изобретения используются L-норвалин и nor-NOHA.

L-аргинин, являясь метаболическим источником оксида азота в организме, улучшает функциональное состояние эндотелиальных клеток сосудов и иммунокомпетентных клеток, что особенно важно при эндотелиальной дисфункции или неадекватности иммунного ответа.

При том учитывается, что L-аргинин в чистом виде не рекомендуется беременным и кормящим женщинам, лицам с онкологическими заболеваниями и с диагнозом шизофрения. L-аргинин в больших дозах также может вызвать или обострить вспышку герпеса.

Активные компоненты используют в следующих терапевтически эффективных количествах в мг:

L-аргинина гидрохлорид или L-   цитруллин, мг 50-2000 Ингибитор аргиназы, мг 10-700

Лекарственные формы ретард - формы, обеспечивающие медленное высвобождение лекарственного активного начала. Для получения лекарственных форм ретард обычно используют физические и химические методы. К физическим относятся методы покрытия оболочкой кристаллических частиц, гранул, таблеток, капсул; смешивание ЛВ с веществами, замедляющими всасывание, биотрансформацию и выделение; использование нерастворимых основ (матриц) и др. Основными химическими методами являются адсорбция на ионитах и образование комплексов. В зависимости от технологии получения различают лекарственные формы ретард двух принципиальных типов - резервуарного и матричного. Формы резервуарного типа представляют собой ядро, содержащее ЛВ, и полимерную (мембранную) оболочку, которой определяется скорость высвобождения. Резервуаром может быть единичная лекарственная форма (таблетка, капсула) или лекарственная микроформа, множество которых образует конечную форму (пеллеты, микрокапсулы и др.). Формы ретард матричного типа содержат полимерную матрицу, в которой распределено ЛВ, и часто имеют вид обычной таблетки.

Для целей настоящего изобретения используют оболочку, обеспечивающую ретаридрованное высвобождение.

Наиболее предпочтительно, чтобы содержание фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ составляло до 30% от общей массы препарата. Этими веществами могут быть выбранные из группы вещества: микрокристаллическая целлюлоза или лактоза, крахмал, повидон, кальция стеарат, тальк, аэросил, этилцеллюлоза или их смесь в любых комбинациях и соотношениях, не ухудшающие его биологическое действие на организм. Предпочтительно композиция выполнена в виде таблетированной и/или капсулированной форм препарата и содержит вспомогательные вещества в следующих количествах, мг:

Микрокристаллическая целлюлоза   или лактоза 80-100 Аэросил 35-50 Тальк 110-150 Повидон 40-50 Кальция стеарат 20-50

Полученная форма покрывается оболочкой, обеспечивающей ретард-действие (замедленное высвобождение).

В качестве оболочки могут быть использованы композиции на основе поливинилового спирта, талька, полиэтиленгликоля, титана диоксида, приемлемых красителей или в виде готовой смеси марки «Opadry II».

Оболочка также придает стабильность композиции в ходе хранения и улучшает ее внешний вид и органолептические свойства.

Композиция может дополнительно содержать янтарную кислоту и/или ее фармацевтически приемлемые соли, например аммониевую, калиевую, натриевую и подобные, в количестве 10-500 мг. Выполняя каталитическую функцию по отношению к циклу Кребса, янтарная кислота снижает в крови концентрацию других интермедиатов данного цикла - лактата, пирувата и цитрата, продуцируемых на ранних стадиях гипоксии. Антигипоксическое действие янтарной кислоты обусловлено ее влиянием на транспорт медиаторных аминокислот, а также увеличением содержания в мозге ГАМК. Янтарная кислота не оказывая влияния на артериальное давление и показатели работы сердца. Однако введение «универсального метаболита» в состав композиции усиливает ее защитную функцию.

Изучены биологические свойства композиции.

Пример 1

Целью исследования было изучение эндотелиальных эффектов комбинации ингибитора аргиназы (в качестве этого взят L-норвалин) и донора оксида азота (NO) L-аргинина при моделировании, т.н. L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Материалы и методы

Животные - белые крысы, самцы линии Wistar, масса 250-300 г. Сформированы группы животных (n=10): 1) интактные; 2) введение N-нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME); 3) введение комбинации L-норвалина в дозе 10 мг/кг и L-аргинина в дозе 70 мг/кг.

При моделировании эндотелиальной дисфункции вводили блокатор эндотелиальной NO-синтазы N-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME), который применялся внутрибрюшинно ежедневно один раз в сутки, в дозе 25 мг/кг. Комбинация ингибитора аргиназы L-норвалина и донора оксида азота (NO) L-аргинина вводилась ежедневно внутрижелудочно в дозах 10 мг/кг и 70 мг/кг соответственно в течение 7 суток. Болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. На 8 день от начала эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей. Показатели гемодинамики - систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД), частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно. Проводились функциональные пробы: эндотелийзависимая вазодилатация (ЭЗВ) измерялась внутривенным введением ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг; эндотелийнезависимая вазодилатация (ЭНЗВ) - вводили внутривенно нитропруссид натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг.

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованного вещества изменений параметров определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±m) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием T-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивались как достоверные при р<0,05. Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Office.

Полученные результаты

В течение экспериментов установлено, что блокада NO-синтазы, вызванная семидневным введением L-NAME, приводила к артериальной гипертензии средние значения: САД - 191,3±7,1 мм рт.ст., ДАД - 146,0±4,2 мм рт.ст., СрАД - 159,4±3,9 мм рт.ст. Применение L-норвалина и L-аргинина, в комбинации, блокировало выраженное повышение АД (таблица 2). У группы животных, получавших комбинацию L-норвалина и L-аргинина по схеме в течение 7 дней, эндотелийнезависимая вазодилатация (ЭНВД) оценивалась посредством функциональной пробы с введением нитропруссида (НП) в дозе 30 мкг/кг и характеризовалась снижением САД до 87,2±4,1 мм рт.ст., ДАД до 37,3±1,8 мм рт.ст.

При проведении эндотелийзависимая вазодилатация ЭЗВД после введения ацетилхолина АХ показатели гемодинамики также оказались сниженными по сравнению с группой животных, получавших L-NAME.

Таблица 2 Влияние сочетанного применения L-норвалина и L-аргинина на показатели гемодинамики при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции (М±m) Группы животных Функциональные пробы САД, мм рт.ст. ДАД, мм рт.ст. ЧСС, уд. в мин Интактные Исходные 136,4±4,1 99,9±3,8 417,0±8,1 ЭЗВ с АХ 82,5±3,9 39,4±3,4 415,1±12,4 ЭНЗВ с НП 82,3±2,9 41,8±4,4 416,2±9,1 Получавшие L-NAME (25 мг/кг) Исходные 191,3±7,1* 146,0±4,2* 429,3±10,3 ЭЗВ с АХ 111,2±4,8* 83,2±5,8* 424,0±12,9 ЭНЗВ с НП 89,2±3,9 52,5±3,8 423,0±12,5 L-NAME (25 мг/кг)+комбинация L-норвалина (10 мг/кг)+L-аргинина (70 мг/кг) Исходные 136,4±4,7** 109,6±2,9** 374,2±8,2 ЭЗВ с АХ 86,6±2,4** 43,7±4,8** 341,6±10,9 ЭНЗВ с НП 87,2±4,1** 37,3±1,8* 343,1±11 Примечание * - р<0,05 - в сравнении с группой интактных животных; ** - р<0,05 - в сравнении с группой. САД - систолическое артериальное давление, ДАД - диастолическое артериальное давление, S - площадь над кривой восстановления артериального давления при проведении фармакологических проб.

Для того чтобы объективно оценить степень коррекции эндотелиальной дисфункции, возникающей при моделировании дефицита оксида азота введением L-NAME, в ходе экспериментов применялся специальный коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) [Покровский, М.В. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте / М.В.Покровский, В.И.Кочкаров, Т.Г.Покровская и др. // Кубанский научно-медицинский вестник. Краснодар, 2006. №10. С.72-77.]. Он характеризует степень эндотелиальной дисфункции и отражает соотношение площади над реакцией восстановления АД в ответ на введение нитропруссида натрия (НП) к площади над реакцией восстановления АД в ответ на введение ацетилхолина (АХ) (Рис.2).

У каждого животного в каждой группе рассчитывался коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД). В группе интактных животных коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) составлял 1,1±0,1.

Выводы

1. Моделирование дефицита оксида азота (NO) путем введения блокатора эндотелиальной NO-синтетазы (NOS), N-нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME) внутрибрюшинно ежедневно в дозе 25 мг/кг в течение 7 суток приводило к развитию артериальной гипертензии, которая реализовывалась через дисфункцию эндотелия.

2. Развитие эндотелиальной дисфункции (ЭД) в опытной модели выражается в резком увеличении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в сравнении с интактной группой.

3. Комбинированное применение L-аргинина в средней дозе 25 мг/кг и L-норвалина в средней дозе 10 мг/кг оказывает эндотелиопротективное действие за счет повышения концентрации внутриклеточного L-аргинина и увеличения биодоступности оксида азота (NO), что характеризуется снижением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) и к его значениям, близким в интактной группе.

Заявляемую биологически активную композицию получают смешиванием активных агентов.

Также в качестве другого ингибитора аргиназы было взято вещество nor-NOHA, представляющее собой селективный ингибитор аргиназы II.

Пример 2

Целью исследования было изучение эндотелио- и кардиопротекторных эффектов комбинаций ингибиторов аргиназы (неселективного - L-норвалина и селективного, аргиназы II - nor-NOHA N(omega)-hydroxy-nor-L-arginine) и донора оксида азота (NO) L-аргинина при моделировании, т.н. L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Материалы и методы

Животные - белые крысы, самцы линии Wistar, масса 250-300 г. Сформированы группы животных (n=10):

1) интактные;

2) введение N-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME);

3) L-NAME+L-норвалина в дозе 10 мг/кг (ретард);

4) L-NAME+L-аргинин в дозе 70 мг/кг (ретард);

5) L-NAME+L-норвалина в дозе 10 мг/кг+L-аргинин в дозе 70 мг/кг (ретард);

6) L-NAME+L-норвалина в дозе 100 мг/кг;

7) L-NAME+L-аргинин в дозе 200 мг/кг;

8) L-NAME+L-норвалина в дозе 100 мг/кг+L-аргинин в дозе 200 мг/кг;

9) L-NAME+nor-NOHA в дозе 1 мг/кг;

10) L-NAME+nor-NOHA в дозе 1 мг/кг+L-аргинин в дозе 200 мг/кг.

При моделировании эндотелиальной дисфункции вводили блокатор эндотелиальной NOS N-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME), который применялся внутрибрюшинно ежедневно один раз в сутки, в дозе 25 мг/кг. Комбинация неселективного ингибитора аргиназы L-норвалина, селективного ингибитора аргиназы II nor-NOHA и донора оксида азота (NO) L-аргинина вводилась ежедневно внутрижелудочно в течение 7 суток.

На 8 день от начала эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей. Показатели гемодинамики - систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД), частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно. Проводились функциональные пробы: эндотелийзависимая вазодилатация (ЭЗВ) измерялась внутривенным введением ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг; эндотелий независимая вазодилатация (ЭНЗВ) - вводили внутривенно нитропруссид натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг. Для оценки экдотелиальной дисфункции по результатам сосудистых проб на ацетилхолин и нитропруссид рассчитывали коэффициент эндотелиальной дисфункциип (КЭД) (Покровский, М.В. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте / М.В.Покровский, В.И.Кочкаров, Т.Г.Покровская и др. // Кубанский научно-медицинский вестник. Краснодар, 2006. №10. С.72-77.)

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованного вещества изменений параметров определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±m) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием T-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивались как достоверные при р<0,05. Статистические расчеты проводились с использованием программы MicrosoftOffice.

Полученные результаты

Обнаружено, что блокада NO-синтазы, вызванная семидневным введением L-NAME, приводила к выраженной артериальной гипертензии, средние значения: САД -191,3±7,1, ДАД - 146,0±4,2 мм рт.ст., и увеличению коэффициента эндотелиальной дисфункции в 5 раз (табл.3).

Таблица 3 Влияние ретардной формы фиксированной комбиниции L-аргинина (70 мг/кг) и L-норвалина (10 мг/кг) на показатели артериального давления и коэффициента эндотелиальной дисфункции при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота у крыс (М±м, n=10) Группы животных САД, мм рт.ст. ДАД, мм рт.ст. КЭД, у.е. Интактные 136,4±4,1 99,9±3,8 1,1±0,1 Получавшие L-NAME (25 мг/кг) 7 дней 191,3±6,7* 146,0±3,9* 5,4±0,06* Получавшие L-NAME+L-аргинин (70 мг/кг) 177,6±9,6* 140,1±6,4*# 2,9±0,1*# Получавшие L-NAME+L-норвалин (10 мг/кг) 186,4±13,1* 156,8±10,0* 3,5±0,05^*# Получавшие L-NAME+L-норвалин (10 мг/кг)+L-аргинин (70 мг/кг) 136,4±4,7# 109,6±2,9# 2,2±0,1# Примечание: САД - систолическое артериальное давление, ДАД - диастолическое артериальное давление, ЧСС - частота сердечных сокращений, * - достоверное различие с группой интактных животных (р<0,05); # - достоверность различий с группой контрольных животных с L-NAME-индуцированной патологией.

Применение L-аргинина и L-норвалина в виде ретардной формы приводило к существенному снижению КЭД соответственно 2,9±0,1 и 3,5±0,05 у.е. Значения АД несмотря на снижение КЭД не достигали заданных значений и были существенно выше, чем у интактных животных (табл.3).

Исследование влияния больших доз L-аргинина (200 мг/кг) и L норвалина (100 мг/кг) и их комбинации в виде непролонгированной лекарственной формы также обнаружила значительное усиление эффекта, однако дальнейшего статистически значимого снижения КЭД и АД не наблюдалось (табл.4).

Таблица 4 Влияние фиксированной комбинации L-аргинина (200 мг/кг) и L-норвалина(100 мг/кг) на показатели артериального давления и коэффициента эндотелиальной дисфункции при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота у крыс (М±м, n=10) Группы животных САД, мм рт.ст. ДАД, мм рт.ст. КЭД, у.е. Интактные 136,4±4,1 99,9±3,8 1,1±0,1 Получавшие L-NAME (25 мг/кг) 7 дней 191,3±6,7* 146,0±3,9* 5,4±0,06* Получавшие L-NAME+L-аргинин (200 мг/кг) 177,6±9,6* 140,1±6,4*# 2,5±0,1*# Получавшие L-NAME+L-норвалин (100 мг/кг) 186,4±13,1* 156,8±10,0* 3,5±0,5* Получавшие L-NAME+L-норвалин (100 мг/кг)+L-аргинин (200 мг/кг) 148,3±9,0# 105,5±4,8# 2,0±0,1# Примечание: САД - систолическое артериальное давление, ДАД - диастолическое артериальное давление, ЧСС - частота сердечных сокращений, * - достоверное различие с группой интактных животных (р<0,05); # - достоверность различий с группой контрольных животных с L-NAME-индуцированной патологией.

Фиксированная комбинация 1-аргинина 70 мг/кг и селективного ингибитора аргиназы II nor-NONA 1 мг/кг также проявляла аддитивное действие в отношении коэффициента эндотелиальной дисфукции и значений АД, однако в целом не достигало эффективности комбинации аргинин норвалин (табл.5).

Таблица 5 Влияние фиксированной комбинации L-аргинина (70 мг/кг) и nor-NOHA (N(omega)-hydroxy-nor-L-arginine) (1 мг/кг) на показатели артериального давления и коэффициента эндотелиальной дисфункции при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота у крыс (М±м, n=10) Группы животных САД, мм рт.ст. ДАД, мм рт.ст. КЭД, у.е. Интактные 136,4±4,1 99,9±3,8 1,1±0,1 Получавшие L-NAME (25 мг/кг) 7 дней 191,3±6,7* 146,0±3,9* 5,4±0,06* Получавшие L-NAME+L-аргинин (70 мг/кг) 183,6±4,7* 148,2±6,4* 3,4±0,1* Получавшие L-NAME+nor-NOHA (1 мг/кг) 178,3±9,4* 144,7±9,3* 3,6±0,3* Получавшие L-NAME+nor-NOHA (1 мг/кг)+L-аргинин (200 мг/кг) 150,3±7,9* 125,1±7,8 2,9±0,1# Примечание: САД - систолическое артериальное давление, ДАД - диастолическое артериальное давление, ЧСС - частота сердечных сокращений, * - достоверное различие с группой интактных животных (р<0,05); # - достоверность различий с группой контрольных животных с L-NAME-индупированной патологией.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об эффективности комбинированного применения донатора NO -L-аргинина и ингибиторов аргиназы - L-норвалина и nor-NONA для коррекции L-NAME-индупированной эндотелиальной дисфункции, выражающейся в снижении КЭД и артериального давления. Наиболее эффективной оказалась комбинация L-аргинина 70 мг/кг и L-норвалина 10 мг/кг в виде ретардной формы с профилем высвобождения 12 часов. Указанная дозировка с учетом межвидового пересчета доз от крысы к человеку (по формуле Улановой, Руководство по доклиническим исследованиям под ред. Хабриева Р.У., 2006) соответствует 500 мг L-аргинина и 70 мг L-норвалина, что может быть достигнуто в виде ретардной таблетки, покрытой оболочкой, содержащей соответственно 250 и 35 мг при приеме 2 раза в сутки.

Сущность изобретения поясняется также примерами фармацевтических композиций.

Пример 3

Компоненты смешивают в следующих количествах:

L-аргинина гидрохлорид, мг 1000 Ингибитор аргиназы (L-норвалин), мг 700

Компоненты перемешивают в смесителе с добавлением, в случае необходимости, фармакологически приемлемых вспомогательных веществ, обеспечивая равномерное распределение компонентов, и подают для формирования для заполнения капсул и покрывают их оболчкой «Opadry II»..

Пример 4

Компоненты смешивают в следующих количествах:

L-аргинина гидрохлорид, мг 100 Ингибитор аргиназы (L-норвалин), мг 300

Вспомогательные вещества, мг:

лактоза 100 Аэросил 40 Тальк 110 Повидон 50 Кальция стеарат 20

Ингредиенты и вспомогательные вещества перемешивают в смесителе, обеспечивая равномерное распределение компонентов, таблетируют, покрывают оболочкой «Opadry II» и фасуют в контурную ячейковую упаковку или соответствующую упаковку в виде банок.

Необходимо отметить, что для проверки предположения была взята небольшая группа животных (n=3), т.е. статистически не значимая, которым L-аргинин заменили на цитруллин в дозировке от 100 мг. Было отмечено, что абсолютные значения были несколько ниже, чем композиция с L-аргинином, и в то же время отмечался эффект коррекции искусственного дефицита оксида азота.

Пример 5

Капсула, заполненная гранулами, покрытая оболочкой «Opadry II», содержащая в мг:

L-цитруллин 250 L-норвалин 500 Янтарная кислота 150 Аэросил 50 Повидон 50 Кальция стеарат 40

Изобретение расширяет возможность аминокислоты L-аргинин или аминокислоты L-Цитруллин в качестве биологически активного вещества, повышающего устойчивость эндотелия к внутрисосудистому стрессу и нормализующего функции сердечно-сосудистой и половых систем в профилактике и комплексной терапии заболеваний пациентов.

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и касается композиции, обладающей комплексным воздействием на эндотелий кровеносных сосудов. Композиция включает L-аргинин или L-цитруллин и ингибитор аргиназы в твердой лекарственной форме. Композиция обладает эндотелиопротективным, вазодилатирующим и ангиопротекторным эффектом. Синергетический эффект обеспечивается комбинированием донаторов NO и ингибиторов аргиназы в виде ретардированной формы. 6 з.п. ф-лы, 5 пр., 5 табл., 2 ил.

1. Композиция, обладающая эндотелиопротекторным, вазодилатирующим и ангиопротекторным эффектом, характеризующаяся тем, что она представляет собой твердую лекарственную форму, покрытую оболочкой для ретаридрованного высвобождения, содержит в качестве активных ингредиентов L-аргинин гидрохлорид или L-цитруллин и ингибитор аргиназы, выбранный из L-норвалина и nor-NONA при следующем содержании, мг:
L-аргинина гидрохлорид или L-цитруллин 50-2000 ингибитор аргиназы 10-700

и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества.

2. Композиция по п.1, характеризующаяся тем, что она содержит фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества до 30% от общей массы композиции.

3. Композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что ингибитором аргиназы является L-норвалин.

4. Композиция по п.3, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества выбраны из группы: целлюлоза микрокристаллическая, лактоза, крахмал, повидон, стеарат кальция, тальк, аэросил, этилцеллюлоза или их смесей.

5. Композиция по п.4, отличающаяся тем, что она выполнена в виде таблетированной и/или капсулированной форм препарата, и содержит вспомогательные вещества в следующих количествах, мг:
микрокристаллическая целлюлоза или лактоза 80-100 аэросил 35-50 тальк 110-150 повидон 40-50 кальция стеарат 20-50

6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в композицию вводят янтарную кислоту и/или ее фармацевтически приемлемые соли в количестве 10-500 мг.

7. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что композицию применяют для коррекции нарушений эректильной дисфункции.