СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ДИФФУЗНОГО ПОРАЖЕНИЯ МИОКАРДА Российский патент 2012 года по МПК A61M5/00 A61K35/28 A61P41/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности сердечно-сосудистой хирургии, и может быть использовано для лечения диффузного поражения миокарда (кардиомиопатии).

Кардиомиопатия - это группа заболеваний, при которых в первую очередь страдает мышца сердца и которые проявляются нарушением функции сердечной мышцы.

Известны три вида кардиомиопатии: дилатационная, гипертрофическая, рестриктивная. У них разные клинические проявления, разный прогноз, но они имеют общие признаки, позволяющие их объединить под общим названием.

Известны попытки лечения заболевания с использованием медикаментозных средств.

В патенте США 4939224 обсуждаются различные биологические активности VIP, в том числе расслабление гладкой мускулатуры, индукция вазодилятации, стимуляция интерстициальной секреции воды и электролитов, нейрорегуляция, стимуляция выработки сока поджелудочной железы и ингибирование секреции желудочной кислоты. Однако существуют пагубные побочные эффекты, включающие в себя гипотензию, тахикардию и гиперемию.

Известен способ хирургического лечения кардиомиопатии (патент на изобретение РФ №2253373, A61B 17/00), согласно которому у больных с гипертрофической необструктивной кардиомиопатией иссекают зону максимальной гипертрофии; иссечение выполняют соответственно уровню максимального выпячивания межжелудочковой перегородки (МЖП) в полость левого желудочка из полости правого желудочка. Иссекают атипичные трабекулы между МЖП и передней стенкой правого желудочка.

Известен способ прогнозирования осложнений и летального исхода у больных с сердечной недостаточностью (Ольбинская Л.И., Соломахина Н.И., Каплунова В.Ю; М. - 2002 / Патент на изобретение РФ №2191544), свидетельствующий о тяжести рассматриваемого заболевания.

Известен способ лечения диффузно пораженного миокарда посредством интракоронарного введения клеток (мононуклеарной фракции костного мозга, гладкомышечных, мезенхимальных и др.), как индукторов репаративной регенерации миокарда (Suzuki K., Murtuza B., Suzuki N. Circulation. 2001; 104 (suppl 1): 1-213-1-217; Stamm C., Westphal B., Kleine H. Lancet. 2003; 361, Issue 9351: 45-46; Волковская И.В. Возможности клеточных технологий при лечении сердечной недостаточности. Автореф…к.м.н. М., 2006. - 26 с.). Однако авторы, как правило, ограничиваются оценкой конечного результата - сократимости миокарда, - упуская попытку поиска путей доставки в миокард максимального числа клеток.

Эффективность лечения патологии миокарда определяется в том числе количеством вводимых мононуклеарных клеток костного мозга (Крылов А.П. и др. Цитокины и аутологичные мононуклеарные клетки костного мозга в процессах восстановительной регенерации при инфаркте миокарда, реферат, Кардиоваскулярная терапия и профилактика, 2007, №5, стр.79-84).

В качестве прототипа мы выбрали описанный Suzuki N. еt al., 2001, способ введения клеток в диффузно пораженный миокард крыс через устья коронарных артерий с помощью специальных катетеров. Автор показал, что лечебный эффект может быть достигнут путем введения максимального числа клеток. В то же время он показал, что гибель животных наступает после введения 10 млн клеток.

Цель изобретения - повысить безопасность и эффективность данной терапии.

Цель достигается тем, что 10 млн клеток мононуклеарной фракции костного мозга вводят в область пораженного миокарда комбинированным способом - внутрикоронарно-внутримиокардиальным; половину клеточного продукта - 5 млн клеток - вводят путем пункции аорты между устьем коронарных артерий и местом ее кратковременного пережатия в восходящем участке до отхождения общей сонной артерии; вторую половину клеточного продукта (5 млн клеток) вводят двумя инъекциями по 2,5 млн клеток в каждой в верхушку и боковую стенку миокарда левого желудочка.

В табл.1 представлено распределение экспериментальных животных по группам.

В табл.2 представлена динамика содержания меченных 99м-Тс-ГМПАО клеток в тканях поврежденного миокарда после начала терапии.

В табл.3 представлены физиологические показатели сердечной деятельности в контрольной и опытной группах.

Способ реализуется следующим образом.

Диффузное поражение миокарда было смодулировано по методике, предложенной Сузуки (Suzuki K., Murtuza B., Suzuki N. Circulation. 2001; 104 (suppl 1): 1-213-1-217), предложившим использовать рубомицин при высоких концентрациях в качестве индуктора гибели кардиомиоцитов.

У самки породы крыс Вистар массой 250 г из питомника «Рапполово» АМН с предварительно смоделированным диффузным поражением миокарда под общим наркозом выделена аорта. Через стенку аорты между устьем коронарных артерий и местом ее кратковременного пережатия в восходящем участке перед отхождением общей сонной артерии введено путем пункции 5 млн клеток. 2,5 млн клеток введено в верхушку миокарда; 2,5 млн клеток введено в боковую стенку миокарда левого желудочка.

Данный способ клеточной терапии диффузного поражения миокарда, судя по доступной нам литературе, предложен впервые и обладает рядом достоинств.

Во-первых, он безопасен. Летальных исходов в течение 30 дней наблюдения после трансплантации 10 млн клеток не было.

Во-вторых, он позволяет ввести в диффузно пораженный миокард 10 млн клеток, то есть абсолютно летальную дозу при чисто внутрикоронарном введении.

В-третьих, выход из миокарда клеток, введенных данным методом, достоверно ниже по сравнению с его составляющими: чисто внутрикоронарным и внутримиокардиальным введениями, исходя из проведенных нами сравнительных исследований с трансплантацией меченных технецием клеток.

В-четвертых, увеличение фракции выброса, ударного объема сердца, диастолического размера левого желудочка и сниженного систолического размера достоверно лучше у животных-реципиентов клеток, доставленных комбинированным путем, чем посредством внутрикоронарного или внутримиокардиального.

Клеточная терапия имеет ряд преимуществ перед гено- и пептидной терапией. Во-первых, своей физиологичностью, ибо только клетка обладает уникальным сбалансированным уровнем генной экспрессии и оптимальным для очага альтерации уровнем секреции факторов роста. Во-вторых, отсутствием при аутологичной трансплантации риска иммунных реакций, нередких при введении генных конструкций и рекомбинантных факторов роста (Берсенев А.В. Клеточная трансплантология: История, современное состояние и перспективы. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2005; 1: 49-56).

Известна клеточная терапия критической ишемии мононуклеарной фракцией аутологичного костного мозга, как наиболее часто используемого клеточного материала (Tateishi-Yuyama Е. et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomized trial. Lancet. 2002; 360: 427-35; Teiji O. Treatment for limb ulcer with severe icshtmia: therapeutic angiogenesis by autologous transplantation of bone-marrow. Wound Repair Regen. 2004; 12). Она также не лишена недостатков. Наравне с положительными результатами описаны отрицательные (усиление болей) результаты или отсутствие динамики (Tateishi-Yuyama Е. et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomized trial. Lancet. 2002; 360: 427-35; Teiji О. Treatment for limb ulcer with severe icshtmia: therapeutic angiogenesis by autologous transplantation of bone-marrow. Wound Repair Regen. 2004; 12).

Мы предположили, что отсутствие в ряде случаев эффекта клеточной терапии ишемии предопределено методом доставки клеточного материала. Как правило, клетки доставляются посредством множественных (не менее 40) инъекций в ишемизированные мышцы. Столь избирательный метод введения клеток может таить в себе два эффекта, ограничивающих его эффективность. Во-первых, ограничение артериогенеза, инициируемого моноцитами вне зоны ишемии (Simons М., Ware A. Therapeutic angiogenesis in cardiovascular disease. Nat. Rev. Drug Disc. 2003: 11(2); 863-72). Во-вторых, ограничение VEGF зависимой пролиферации эндотелиоцитов и трансплантированных их предшественников (обеспечивающих ангио- и васкулоенез), детерминированной рН среды и концентрацией фактора роста, определяемой состоянием мышечных клеток (очага), его секретирующих. Мы провели сравнительную оценку разных методов доставки клеток с целью повышения эффективности клеточной терапии.

Материал и методы исследования

Животные в зависимости от метода введения клеток были разделены на три подгруппы (табл.1). Крысам первой подгруппы клетки вводили внутримышечно (10 инъекций × 20 мкл), второй - внутриартериально (в центральный конец лигирозанной артерии, 200 мкл), третьей - внутримышечно (5 инъекций × 20 мкл) и внутриартериально (100 мкл). Животных контрольной группы подвергали аналогичным вмешательствам, исключая введение клеток. Им вводили забуференный 0,95% раствор натрия хлорида методами и в объемах, аналогичных таковым в опытной группе.

В динамике (10, 20, 30 сутки) после трансплантации клеток (введения 0,9% раствора натрия хлорида) у 4 животных каждой подгруппы опытной и контрольной групп проводили ангиографию для визуализации кровотока в поврежденном участке и после забоя забирали подвергшуюся воздействию ткань для гистологического исследования удельной площади микроциркуляторного русла в ее мышцах.

Результаты собственных исследований

Динамический анализ состояния удельной площади микроциркуляторного русла животных контрольной и опытной групп позволяет отметить два принципиальных факта. Первый - это отсутствие динамики избранного показателя у всех животных контрольной группы. Второй - достоверное увеличение площади микроциркуляторного русла у крыс опытной группы, то есть получивших клеточную терапию (табл.1).

Принципиально отметить, что эффект клеточной терапии, как по скорости его развития, так и конечному результату, зависит от метода введения клеток. В этом контексте заслуживает внимания комбинированный метод доставки клеточного материала. Он выгодно отличается от обычно предпочитаемого чисто внутримышечного введения клеток, прежде всего, что принципиально важно, по скорости нарастания площади микроциркуляторного русла, не уступая по конечному результату и даже несколько превышая таковой в сравниваемой подгруппе животных.

Результаты наблюдений свидетельствуют о том, что экспериментальная ишемия не способна индуцировать ангиогенез в ближайшие 30 суток после ее моделирования. Трансплантация клеток мононуклеарной фракции инициирует ангиогенез, способствуя увеличению площади микроциркуляторного русла в ишемизированном участке мышечной ткани в 2,5-3,5 раза. Скорость нарастания микроциркуляторного русла и конечный эффект трансплантации клеток зависят от метода доставки клеточного материала. Оптимальным вариантом доставки клеток, как по критерию скорости ангиогенеза, так и его конечному уровню, является комбинированный метод введения клеток. Он объединяет в себе выгодные стороны внутримышечной и внутриартериальной доставки клеточного продукта. Его «внутримышечная» составляющая обеспечивает, очевидно, формирование относительно местных долговременных очагов ангиогенеза, а «внутриартериальная» - региональных малоклеточных, быстросозревающих.

Для доказательства возможности промышленного использования способа были проведены наблюдения динамики содержания меченных 99м-Тс-ГМПАО клеток в тканях поврежденного миокарда после начала терапии.

Полученные результаты представлены в таблице 2.

Визуализация клеток, меченных технецием и трансплантированных в миокард разными путями, показывает не только их максимальное накопление при комбинированном введении в первый час после трансплантации, но и минимальный выход из миокарда в первые 20 часов по сравнению с интракардиальным и интракоронарным способами доставки клеток. Последнее обстоятельство, очевидно, и объясняет максимальное нарастание фракции выброса и иных показателей функции сердца в группе животных, получивших клетки комбинированным способом.

Минимальные потери трансплантированных комбинированным способом клеток, видимо, объясняются миграцией в миокард той части клеток, трансплантированных интракоронарно, которая на первом этапе фиксировалась на высоком эндотелии посткапиллярных венул, а на втором этапе по градиенту хемоаттрактант SDF-1 (stromal differention factor), создаваемому клетками, введенными в миокард, мигрировала в него.

Данные таблицы 3 свидетельствуют о восстановлении функции поврежденного миокарда. Заметно улучшилась фракция выброса миокарда, повысились ударный объем, конечный диастолический и систолический размер, фракция ускорения.

Все сказанное позволяет констатировать достаточную эффективность предлагаемого способа в терапии диффузного поражения миокарда.

  Таблица 1 Группы животных (и число в группе) Подгруппы животных и число в подгруппе внутримышечное введение внутриартериальное введение комбинированное введение Контрольная (36) 12 12 12 Опытная (36) 12 12 12 р<0,05

Таблица 2 Группы по путям Содержание меченных 99м-Тс-ГМПАО клеток введения Через 1 час Через 20 часов Δ Интракардиально 0,0872±0,01 0,0635±0,01 0,0237± Интракоронарно 0,0809±0,01 0,0642±0,01 0,0167± Комбинированно 0,0925±0,01 0,0787±0,01 0,0138± р<0,05

Таблица 3 Группы и подгруппы животных Показатели Фракция выброса Ударный объем (мл) Конечный диастолический размер (см) Конечный систолический размер (см) Фракция укорочения, % Частота сердечных сокращений Контрольная 44±4 0,1± 0,46±0,02 0,37±0,01 18,6±2 465±10 Опытные   Интракард. введение 65±3 0,2± 0,55±0,03 0,34±0,02 30±2 493±8 Интракорнарное введение 62±3 0,15± 0,49±0,01 0,34±0,01 29±1 480±9 Комбинир. введение 71,5±4 0,3± 0,55±0,02 0,35±0,01 35±2 490±10 р<0,05

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и кардиохирургии, и может быть использовано при лечении диффузного поражения миокарда. Для этого осуществляют забор клеток мононуклеарной фракции костного мозга в количестве 10 миллионов клеток. При этом 5 миллионов клеток вводят путем пункции аорты между устьем коронарных артерий и местом ее кратковременного пережатия в восходящем участке до отхождения общей сонной артерии. Оставшиеся 5 миллионов клеток вводят посредством двух инъекций. Первые 2,5 миллиона клеток вводят в верхушку миокарда левого желудочка, а вторые 2,5 миллиона клеток в боковую стенку миокарда левого желудочка. Способ позволяет обеспечить восстановление функции поврежденного миокарда за счет увеличения площади микроциркуляторного русла в ишемизированном участке мышечной ткани вследствие формирования местных долговременных очагов ангиогенеза в результате максимального накопления клеток в первый час после трансплантации и минимального выхода их из миокарда в первые 20 часов при их комбинированном введении. 3 табл.

Способ лечения диффузного поражения миокарда путем введения 10 млн клеток мононуклеарной фракции костного мозга, отличающийся тем, что клетки мононуклеарной фракции костного мозга вводят комбинированным способом - внутрикоронарно-внутримиокардиальным; половину клеточного продукта - 5 млн клеток - вводят путем пункции аорты между устьем коронарных артерий и местом ее кратковременного пережатия в восходящем участке до отхождения общей сонной артерии; вторую половину клеточного продукта (5 млн клеток) вводят двумя инъекциями по 2,5 млн клеток в каждой - в верхушку и боковую стенку миокарда левого желудочка.