ПЕПТИДЫ RUMC, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2012 года по МПК C07K9/00 C07K14/195 C12N15/31 C12N1/21 A23L1/54 

Изобретение относится к пептидам RumC1, RumC2 и RumC3, обладающим антимикробной активностью, а также к генам, кодирующим эти пептиды и выделенным из Ruminococcus gnavus E1.

Некоторые бактериальные штаммы обладают способностью выделять вещества, обладающие бактериостатическим или бактерицидным действием в отношении своих конкурентов. Эти антимикробные вещества могут обладать органической природой, например органические кислоты или перекись водорода (Ross et al., Int. J. Food Microbiol. 79, 3-16, 2002), или пептидной природой. Также различают ферментативно синтезированные антимикробные пептиды, которые образуют класс антибиотиков (Mootz et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 543-551, 1997; Keating et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 598-606, 1999), и продуцируемые в рибосомах пептиды, которые образуют класс бактериоцинов (Jacob et al., Ann. Inst. Pasteur (Paris) 84, 222-224, 1953).

В отношении бактериоцинов существует растущий интерес в исследовательской и промышленной области; они могут представлять собой альтернативу применению антибиотиков, в особенности в животноводстве (Luchansky, Antonie Van Leeuwenhoek 76, 335, 1999; O'Sullivan et al., Biochimie 84, 593-604, 2002).

В последние годы разработано множество гетерологических систем экспрессии этих бактериоцинов. В частности, Morriset et al. (Morisset et al., Appl. Environ. Microbiol., 70, 4672-4680, 2004) проводили экспрессию вариантов мезентрицина Y105, представляющего собой бактериоцин класса IIa, продуцируемый Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Y105, в Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum DSM20484. Аналогично, Flynn et al. (Microbiol., 148, 973-984, 2002) осуществляли экспрессию АВР-118, представляющего собой бактериоцин класса IIb, исходно продуцируемый Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC118, в хозяевах Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis и Bacillus cereus.

Дополнительно осуществляли несколько тестов экспрессии бактериоцинов в бактерии Escherichia coli (McCormick et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 4757-4766, 1998; Garneau et al., Appl. Environ. Microbiol., 69, 1352-1358, 2003; Biet et al., Microbiol., 144, 2845-2854, 1998; Miller et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 14-20, 1998; Richard et al., J. Bacteriol., 186, 4276-4284, 2004; Kloche et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 67:532-538, 2005), дрожжах Saccharomyces cerevisiae (Schoeman et al., Yeast, 15, 647-656, 1999; Van Reenen et al., Int. J. Food Microbiol., 81, 29-40, 2003) и в молочнокислых бактериях (Rodriguez et al., Int. J. Food Microbiol., 80, 101-116, 2003).

Таким образом, осуществили множество исследований с целью идентификации новых бактериоцинов и продукции этих бактериоцинов.

Пищеварительная экосистема образована распространенной и очень сложной микрофлорой, включающей комбинацию бактерий, дрожжей и архей. Эти микроорганизмы являются по существу анаэробными, и в основном среди них обнаруживают бактерии родов Bacteroides, Eubacterium, Clostridium, Ruminococcus, Bifidobacterium и Fusobacterium (Suau et al., Appl. Environ. Microbiol. 65, 4799-4807, 1999). Микрофлора оказывает значительное влияние на здоровье хозяина. Она, в частности, вовлечена в токсификацию и детоксикацию метаболических соединений, поступающих с пищей (Hughes and Rowland Microbial Ecology Health Disease 2, 179-185, 2000). Она также способна модулировать экспрессию функций энтероцитов (Bry et al., Science 273, 1380-1383, 1996; Hooper et al., Science 291, 881-884, 2001). Наконец, она играет фундаментальную роль в защите хозяина от инвазии потенциально патогенных экзогенных бактерий (Ducluzeau et al., Microbial Ecology and Intestinal Infections, 1988; Fons et al., Microbial Ecology in Health and Disease 2, 240-246, 2000).

К известным кишечным патогенам относится Clostridium perfringens, представляющий собой строго анаэробную грамположительную бактерию, которая способна образовывать споры, и которая широко распространена в окружающей среде. Этот патоген может происходить из пищи, но также может быть представлен в низкой концентрации в кишечнике, и может начинать пролиферировать и секретировать токсины под действием стресса. Штаммы Clostridium perfringens классифицируются на пять токсинотипов в зависимости от токсинов, которые они продуцируют (Petit et al., Trends Microbiol. 7, 104-110, 1999). Штаммы С.perfringens типа А и ответственны за желудочно-кишечные заболевания у человека. В 1997 году в Соединенных Штатах Америки зарегистрировано более чем 245000 случаев инфицирования С.perfringens. Это привело к госпитализации 41 человека, семь из которых умерли (Mead et al., Emerg. Infect. Dis. 5, 607-625, 1999). Штаммы С.perfringens типа А и С могут представлять собой соответственно причину некротического энтерита у свиней и домашней птицы. У домашней птицы некротический энтерит представляет собой быстро развивающуюся острую патологию, смертность от которой достигает 1-2% в сутки. Помимо ее влияния на самочувствие животных эта патология может, таким образом, оказывать ощутимое экономическое воздействие. До 1999 года это заболевание удовлетворительно контролировали путем применения антибиотиков в качестве факторов роста. Тем не менее, Евросоюз запретил их использование в корме для животных по причине появления резистентных бактерий, следствием чего явилось уменьшение эффективности антибиотиков у человека. В результате этого запрета некротический энтерит, вызванный Clostridium perfringens у свиней и домашней птицы, больше не контролируется в Европе. Количество случаев, о которых сообщают в Réseau National d'Observations Epidémiologiques en Aviculture (RNOEA) (AFSSA Ploufragan), значительно увеличилось в 1999 и 2000 годах (Valancony, Bulletin desGTV 12, 9-12, 2001).

Таким образом, в настоящее время поиск альтернативных решений для контроля и лечения этого заболевания приобретает первостепенную важность.

Ruminococcus gnavus представляет собой строго анаэробную бактерию, относящуюся к семейству Lachnospiraceae в порядке Clostridiales. Dabard et al. (Appl. Environ. Microbiol., 67, 4111-4118, 2001) продемонстрировали, что штамм Ruminococcus gnavus E1, выделенный из доминирующей флоры у человека, способен продуцировать антимикробное вещество, известное как руминококцин А или RumA, которое накапливается в культуральном супернатанте. Он представляет собой бактериоцин, относящийся к семейству лантибиотиков, обладающих активностью против различных штаммов патогенного Clostridium sp. Gomez et al. (J. Bacteriol., 184, 18-28, 2002) продемонстрировал, что экспрессия генов, вовлеченных в биосинтез руминококцина А, индуцируется в присутствии трипсина. Те же самые авторы также продемонстрировали, что некоторые пищеварительные ферменты могут ингибировать индукцию продукции RumA.

Таким образом, авторы изобретения заинтересовались другими бактериоцинами.

Настоящее изобретение относится к пептидам RumC1, RumC2 и RumC3, обладающим антибактериальной активностью против Clostridium perfringens, и также к генам, кодирующим эти пептиды.

Описание последовательностей

SEQ ID No.1: Консервативная пептидная последовательность пептидов RumC Ruminococcus gnavus E1

SEQ ID No.2: Пептидная последовательность пептидов RumC Ruminococcus gnavus E1, экспериментально определенная при помощи способа деградации по Эдману.

SEQ ID No.3: Пептидная последовательность пептидов RumC Ruminococcus gnavus E1, экспериментально определенная при помощи способа деградации по Эдману.

SEQ ID No.4: Пептидная последовательность пептида RumC1 Ruminococcus gnavus E1, выведенная из SEQ ID No.7

SEQ ID No.5: Пептидная последовательность пептида RumC2 Ruminococcus gnavus E1, выведенная из SEQ ID No.8

SEQ ID No.6: Пептидная последовательность пептида RumC3 Ruminococcus gnavus E1, выведенная из SEQ ID No.9

SEQ ID No.7: Нуклеотидная последовательность гена rumC1 Ruminococcus gnavus E1

SEQ ID No.8: Нуклеотидная последовательность гена rumC2 Ruminococcus gnavus E1

SEQ ID No.9: Нуклеотидная последовательность гена rumC3 Ruminococcus gnavus E1

SEQ ID No.10, 11 и 12: Экспериментально определенные пептидные последовательности

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к пептиду, обладающему антимикробной активностью, отличающемуся тем, что он включает пептид, выбранный из следующих пептидов: пептид, имеющий последовательность SEQ ID No.1, пептид, включающий пептид, имеющий по меньшей мере 80% идентичность с полипептидом SEQ ID No.1, пептид, имеющий последовательность SEQ ID No.2, и пептид, включающий пептид, имеющий по меньшей мере 80% идентичность с полипептидом SEQ ID No.2. В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения этот пептид также включает пептидную последовательность SEQ ID No.3. В соответствии с еще одним воплощением настоящего изобретения этот пептид включает пептид, выбранный из пептидов, имеющих последовательность SEQ ID No.4, 5 или 6.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему антимикробную активность, отличающемуся тем, что он включает полинуклеотид, выбранный из любого полинуклеотида, имеющего последовательности SEQ ID No.7, 8 или 9, к полинуклеотиду, который гибридизуется с любым полинуклеотидом, имеющим последовательности SEQ ID No.7, 8 или 9, и к полинуклеотиду, кодирующему полипептид, определенный выше.

Настоящее изобретение также относится к экспрессионной кассете, отличающейся тем, что она включает в направлении транскрипции промотор, который является функциональным в организме хозяина, полинуклеотид, определенный выше, и терминаторную последовательность в том же самом организме хозяина.

Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему полинуклеотид, определенный выше, и/или экспрессионную кассету, определенную выше.

Настоящее изобретение также относится к организму-хозяину, трансформированному полинуклеотидом, определенным выше, экспрессионной кассетой, определенной выше, и/или вектором, определенным выше.

Настоящее изобретение относится к штамму Ruminococcus gnavus, депонированному в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris) 19 декабря 2006 года под номером CNCM 1-3705, а также к не модифицированному генетически бактериальному штамму в выделенной форме, который продуцирует пептид, определенный выше.

Настоящее изобретение относится к белковой смеси или ферментационному суслу, которое может быть получено при помощи организма хозяина или штамма, определенного выше.

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей пептид, определенный выше, организм хозяина, определенный выше, штамм, определенный выше, ферментационное сусло организма хозяина, определенное выше, или ферментационное сусло штамма, определенное выше. В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения композиция находится в жидкой форме или порошкоообразной форме.

Настоящее изобретение также относится к пищевой добавке, содержащей пептид, определенный выше, организму хозяина, определенному выше, штамму, определенному выше, ферментационному суслу организма хозяина, определенному выше, или ферментационному суслу, определенному выше. В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения добавка находится в жидкой форме или порошкообразной форме.

Настоящее изобретение также относится к корму для животных, отличающемуся тем, что он включает пищевое основание для животных и пищевую добавку, определенную выше.

Настоящее изобретение также относится к применению определенного выше пептида, определенного выше организма хозяина, определенного выше штамма, определенного выше ферментационного сусла организма хозяина или определенного выше ферментационного сусла штамма для приготовления лекарственного средства, пищевой добавки или корма для животных. В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения это лекарственное средство или его пищевая добавка предназначены для профилактики или лечения некротического энтерита у домашней птицы или свиней. В соответствии с еще одним воплощением настоящего изобретения это лекарственное средство или эта пищевая добавка предназначены для профилактики или лечения желудочно-кишечных заболеваний у человека.

Наконец, настоящее изобретение также относится к нетерапевтическому применению определенного выше пептида для лечения животных. В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения пептид получают из штамма, эндогенного для животного, или из штамма, экзогенного для животного. В соответствии с еще одним воплощением настоящего изобретения пептид получают из штамма, эндогенного для животного, и стимулируют продукцию пептида указанным эндогенным штаммом. В соответствии с еще одним воплощением настоящего изобретения пептид получают из штамма, эндогенного для животного, и стимулируют рост указанного эндогенного штамма.

Пептиды.

Таким образом, настоящее изобретение относится к пептидам, обладающим антимикробной активностью. Предпочтительно эти пептиды выделяют из Ruminococcus gnavus, например из мутантного штамма Ruminococcus gnavus. В качестве примера, эти пептиды могут выделять из штамма Ruminococcus gnavus, депонированного в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris) 19 декабря 2006 года под номером CNCM 1-3705, т.е. штамма LEM9-17.

Термин "антимикробная активность" обозначает способность ингибировать рост или развитие бактерий-мишеней или способность убивать бактерии-мишени. Способы измерения антимикробной активности известны специалистам в данной области техники. Антимикробная активность продемонстрирована в настоящем изобретении путем тестирования активности в отношении штамма Clostridium perfringens CpA, выращиваемого на агаровой среде. Образец, содержащий один из пептидов по изобретению, помещают в лунки, сформированные в агаровой среде. Антимикробная активность является показанной, когда вокруг лунки образуется ореол ингибирования.

Пептидные последовательности пептидов RumC1, RumC2 и RumC3 Ruminococcus gnavus E1 представлены соответственно последовательностями SEQ ID No.4, SEQ ID No.5 и SEQ ID No.6. Эти последовательности происходят соответственно от нуклеотидных последовательностей генов rumC1, rumC2 и rumC3, представленных, соответственно, последовательностями SEQ ID No.7, SEQ ID No.8 и SEQ ID No.9.

Изобретение также относится к фрагментам этих пептидов RumC1, RumC2 и RumC3 Ruminococcus gnavus E1, обладающим антимикробной активностью. Термин "пептидный фрагмент" обозначает пептид, содержащий часть, а не весь пептид, от которого он происходит. Таким образом, изобретение относится к пептидам, имеющим последовательности SEQ ID No.1, SEQ ID No.2 и SEQ ID No.3.

Эти фрагменты сохраняют свою антимикробную активность. Таким образом, изобретение относится к биологически активным фрагментам. Термин "биологически активный фрагмент" обозначает фрагмент полипептида, который сохраняет функцию полипептида, от которого он происходит.

Изобретение также относится к пептидам, обладающим антимикробной активностью, которые имеют, по меньшей мере, 80%, 90%, 95%, 98% и предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичных аминокислот с любыми пептидами, имеющими последовательности SEQ ID No.1, 2 или 3.

Способы получения пептидов последовательностей SEQ ID No.1, SEQ ID No.2 и SEQ ID No.3 известны специалистам в данной области техники.

Пептиды RumC секретируются (или высвобождаются) бактериями во внеклеточную среду. Возможно, чтобы любые из пептидов, имеющих последовательности SEQ ID No.4, 5 и/или 6, включали сигнальный пептид с заданным количеством аминокислот. В этом случае изобретение также относится к зрелому пептиду, полученному после отщепления сигнального пептида. В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения изобретение относится к пептидам, последовательности которых располагаются между позицией 20 и позицией 63 в последовательностях SEQ ID No.4, 5 и 6.

В еще одном воплощении потенциальный сигнальный пептид в составе пептида SEQ ID No.4, 5 или 6 может быть замещен гетерологичным сигнальным пептидом для осуществления экспрессии и секреции этого пептида гетерологичным организмом-хозяином.

Объектом изобретения также является пептид, обладающий антимикробной активностью, который обладает, по меньшей мере, 80% идентичностью с SEQ ID No.4, 5 или 6. В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения этот пептид выделяют из штамма Ruminococcus gnavus. В соответствии с еще одним воплощением настоящего изобретения этот пептид выделяют из других штаммов Ruminococcus или других бактерий. Альтернативно, этот пептид могут получать путем химического синтеза.

Одним из объектов изобретения является пептид, в котором по меньшей мере, 90%, 95%, 98% и, предпочтительно, по меньшей мере 99% аминокислот идентичны любому из пептидов, обладающих последовательностями SEQ ID No.4, 5 или 6.

Термин "идентичные аминокислоты" обозначает аминокислоты, которые являются постоянными или неизменными для двух последовательностей. Эти пептиды могут иметь делецию, вставку или замену, по меньшей мере, одной аминокислоты по сравнению с пептидами, представленными последовательностями SEQ ID No.4, 5 или 6. Аминокислоты, модифицированные после транскрипции, например путем дегидратации, образования моносульфидных мостиков, лантионин и т.д. рассматривают как аминокислоты, которые являются неизменными в двух последовательностях.

Объектом изобретения также являются пептиды, имеющие, по меньшей мере, 80%, 90%, 95%, 98% и предпочтительно, по меньшей мере, 99% сходства с любыми пептидами, имеющими последовательности SEQ ID No.4, 5 или 6.

Термин "сходство" обозначает степень похожести между белковыми последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот. Эти пептиды могут иметь делецию, вставку или замену, по меньшей мере, одной аминокислоты по сравнению с пептидами, представленными последовательностями SEQ ID No.4, 5 или 6. Количественно оцениваемая степень сходства между двумя последовательностями основана на проценте идентичности и/или консервативных замен в последовательности.

Способы измерения и идентификации степени идентичности и степени близости между полипептидами известны специалистам в данной области техники. Осуществляют совмещение последовательностей, например, при помощи Vector NTi 9.1.0, представляющей собой программу для совмещения AlignX (алгоритм Clustal W) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com) или с использованием средства CLUSTAW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).

Пептиды по изобретению могут выделять или очищать из своей естественной среды. Пептиды могут получать при помощи различных способов. Эти способы представляют собой, в особенности, очистку из естественных источников, таких как бактерии, которые в природе экспрессируют эти пептиды, продукцию рекомбинантных пептидов подходящими клетками хозяевами и их последующую очистку, продукцию при помощи химического синтеза или, наконец, комбинацию этих различных подходов. Таким образом, пептиды, имеющие последовательности SEQ ID No.1-6 по настоящему изобретению, могут выделять из штамма Ruminococcus gnavus, депонированного в CNCM 19 декабря 2006 года под номером CNCM I-3705. В еще одном воплощении пептиды по настоящему изобретению выделяют из рекомбинантных организмов хозяев, экспрессирующих пептид RumC по изобретению или фрагмент пептида RumC, обладающий антимикробной активностью.

Объект изобретения также представляют собой слитые белки, рекомбинантные белки или химерные белки, включающие пептиды по изобретению.

Пептиды по изобретению могут выделять из слепокишечного содержимого моноксенных крыс, несущих штамм Ruminococcus gnavus E1, и из мутантного штамма Ruminococcus gnavus, более конкретно штамма Ruminococcus gnavus, депонированного в CNCM 19 декабря 2006 года под номером CNCM 1-3705. Эти пептиды обладают антимикробной активностью, продемонстрированной при помощи теста активности в отношении Clostridium perfringens.

Масс-спектрометрия дает возможность определить приблизительную молекулярную массу пептида RumC по изобретению. Молекулярная масса составляет от 4000 до 4600 Да и более конкретно от 4100 до 4500 Да.

В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения пептид подходит для пищевого или фармацевтического применения, например для применения в кормлении животных.

Термин "пептид, подходящий для пищевого или фармацевтического применения", обозначает пептид, характеристики которого являются такими, что он подходит для кормления или фармацевтического применения. Характеристики, важные для пищевого или фармацевтического применения, в частности, представляют собой pH, который может выдерживать пептид. В частности, pH пищеварительной системы человека и животного является кислым, и, таким образом, важно, чтобы пептид был устойчив к этому значению pH. Еще одна важная для пищевого применения характеристика представляет собой температуру, при которой антимикробное вещество является активным. В частности, переработка антимикробного вещества в лекарственное средство, пищевую добавку или корм для животных, например, включает обработку при температуре выше комнатной температуры. Активность используемых антимикробных веществ, таким образом, должна быть стабильна при условиях способа, в особенности при температурных условиях.

В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения пептид или смесь пептидов по изобретению обладает антимикробной активностью при нейтральном значении pH и сохраняет свою антимикробную активность при кислом pH, например ниже 7, и предпочтительно ниже 4,4.

В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения пептид или смесь пептидов по изобретению обладает антимикробной активностью при 37°C и сохраняет эту активность при температурах ниже и выше комнатной температуры, например выше 50°C.

Изобретение также относится к пептиду, обладающему антимикробной активностью, выделенному из содержимого слепой кишки моноксенных крыс или из мутантного штамма Ruminococcus gnavus, обладающему активностью против штаммов Clostridium perfringens, имеющему молекулярную массу от 4000 до 4600 Да, что определяют при помощи масс-спектрометрии, и устойчивому к pH меньше чем или равному 7. В соответствии с одним из воплощений пептид включает последовательность SEQ ID No.1 и/или последовательность SEQ ID No.2. В соответствии с еще одним аспектом изобретения он также включает пептид, имеющий последовательность SEQ ID No.3. Предпочтительно пептид включает пептид, выбранный из любого из пептидов, имеющих последовательность SEQ ID No.4, 5 или 6.

Изобретение также относится к пептиду, обладающему антимикробной активностью, который может быть получен из мутантного штамма Ruminococcus gnavus, например штамма Ruminococcus gnavus, депонированного в CNCM 19 декабря 2006 года под номером CNCM I-3705. В соответствии с одним из воплощений пептид обладает антимикробной активностью в отношении штаммов Clostridium perfringens. В соответствии с еще одним аспектом пептид имеет молекулярную массу от 4000 до 4600 Да и предпочтительно от 4100 до 4500 Да, что определяют при помощи масс-спектрометрии. В соответствии с еще одним аспектом пептид обладает антимикробной активностью при нейтральном pH, и сохраняет свою антимикробную активность при кислом pH, например меньше 7, и предпочтительно ниже 4,4. В соответствии с одним из воплощений пептид включает последовательность SEQ ID No.1 и/или последовательность SEQ ID No.2. В соответствии с еще одним аспектом изобретения он также включает пептид, имеющий последовательность SEQ ID No.3. Предпочтительно пептид включает пептид, выбранный из любого из пептидов, имеющих последовательности SEQ ID No.4, 5 или 6.

Изобретение также относится к пептиду, обладающему антимикробным потенциалом, выделенному из содержимого слепой кишки моноксенных крыс, соответствующему хроматограмме на Фиг.4А, полученной при 214 нм при помощи обратно-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии), обладающему активностью в отношении различных штаммов Clostridium perfringens, в частности типу токсина А.

Полинуклеотиды.

Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим антимикробную активность. Предпочтительно эти полинуклеотиды кодируют антимикробную активность в отношении Ruminococcus.

В соответствии с настоящим изобретением термин "полинуклеотид" обозначает одноцепочечную полинуклеотидную цепь или комплементарную ей цепь, которая может быть цепью ДНК или РНК, или двухцепочечную нуклеотидную цепь, которая может представлять собой комплементарную или геномную ДНК. Предпочтительно полинуклеотиды по изобретению представляют собой ДНК, в частности двухцепочечную ДНК. Термин "полинуклеотид" также обозначает модифицированные полинуклеотиды.

Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут выделять или очищать из естественной среды. Полинуклеотиды по настоящему изобретению также могут получать путем химического синтеза или при помощи стандартных способов молекулярной биологии, описанных Sambrook, Fristsch и Maniatis в их книге, озаглавленной "Molecular cloning: a laboratory manual", издание: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Изобретение относится к полинуклеотиду, соответствующему любой из последовательностей SEQ ID No.7, 8 или 9. Изобретение также относится к полинуклеотиду, который гибридизуется с полинуклеотидом, соответствующим любой из последовательностей SEQ ID No.7, 8 или 9. Изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему пептид, обладающий определенной выше антимикробной активностью.

Изобретение также относится к полинуклеотиду, который имеет, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% и предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичность с полинуклеотидом, соответствующим любой из последовательностей SEQ ID No.7, 8 или 9. Этот полинуклеотид кодирует антимикробную активность. В соответствии с одним из воплощений полинуклеотид кодирует антимикробную активность в отношении штаммов Clostridium perfringens.

Термин "идентичные нуклеотиды" обозначает нуклеотиды, которые являются постоянными или неизменными между двумя последовательностями. Этот полинуклеотид может иметь делецию, вставку или замену, по меньшей мере, одного нуклеотида по сравнению с референсным полинуклеотидом.

Изобретение также относится к полинуклеотиду, который имеет, по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% и предпочтительно по меньшей мере 99% сходство с полинуклеотидом в соответствии с любой из последовательностей SEQ ID No.7, 8 или 9. Этот полинуклеотид кодирует антимикробную активность. В соответствии с одним из воплощений полинуклеотид кодирует антимикробную активность в отношении штаммов Clostridium perfringens.

Термин "сходство" обозначает меру близости между белковыми последовательностями или последовательностями нуклеиновой кислоты. Этот полинуклеотид может иметь делецию, вставку или замену, по меньшей мере, одного нуклеотида по сравнению с референсным полинуклеотидом. Степень сходства между двумя последовательностями, оцениваемая по шкале, основана на проценте идентичности и/или консервативных замен в последовательности.

Способы измерения и идентификации степени идентичности и степени сходства между последовательностями нуклеиновой кислоты известны специалистам в данной области техники. Осуществляют совмещение последовательностей, например, при помощи Vector NTi 9.1.0, программы совмещения AlignX (алгоритм Clustal W) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com) или с использованием средства CLUSTAW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).

Изобретение также относится к полинуклеотидам, способным избирательно гибридизоваться с полинуклеотидом в соответствии с любой из последовательностей SEQ ID No.7, 8 или 9. Предпочтительно селективную гибридизацию осуществляют в умеренно жестких условиях и предпочтительно в очень жестких условиях. В соответствии с изобретением термин "последовательность, способная селективно гибридизоваться" обозначает последовательности, которые гибридизуются с референсной последовательностью в степени, значительно превосходящей фоновый уровень. Уровень сигнала, сформированного путем взаимодействия между последовательностью, способной избирательно гибридизоваться, и референсными последовательностями, как правило, в 10 раз и предпочтительно в 100 раз более сильный по сравнению с взаимодействием с другими последовательностями ДНК, которые формируют фоновый уровень. Условия более строгой гибридизации, которые дают возможность для избирательной гибридизации, известны специалистам в данной области техники. Как правило, температура гибридизации и промывки, по меньшей мере, на 5°C ниже Tm (температура плавления) референсной последовательности при данном pH и для заданной ионной силы. Как правило, температура гибридизации составляет, по меньшей мере, 30°C для полинуклеотида из 15-50 нуклеотидов и, по меньшей мере, 60°C для полинуклеотида из более чем 50 нуклеотидов. В качестве примера гибридизацию осуществляют в следующем буфере: 6Х SSC (хлорид натрия + цитрат натрия), 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), 0,02% PVP (поливинилпирролидон), 0,02% Ficoll, 0,02% BSA (бычий сывороточный альбумин), 500 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Промывку осуществляли, например, последовательно при низкой жесткости в 2Х SSC, 0,1% буфере SDS (додецилсульфат натрия), при умеренной жесткости в 0,5Х SSC, 0,1% буфере SDS и при высокой жесткости в 0,1Х SSC, 0,1% буфере SDS. Безусловно, гибридизацию можно осуществлять в соответствии с другими общими способами, известными специалистам в области техники (см., в частности, Sambrook, Fristsch и Maniatis в их книге, озаглавленной "Molecular cloning: a laboratory manual", edition: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Предпочтительно полинуклеотиды, которые избирательно гибридизуются с референсным полинуклеотидом, сохраняют функцию референсной последовательности. В данном случае полинуклеотиды, которые избирательно гибридизуются с полинуклеотидом в соответствии с любой из последовательностей SEQ ID No.7, 8 или 9, кодируют антимикробную активность.

Изобретение относится, в общем, к полинуклеотидам, кодирующим пептиды по изобретению. Учитывая вырожденность генетического кода, различные полинуклеотиды могут кодировать один и тот же полипептид.

Экспрессионные кассеты.

В соответствии с одним из воплощений изобретения полинуклеотид, кодирующий пептид по изобретению, встраивают в экспрессионную кассету с использованием способов клонирования, хорошо известных специалистам в данной области техники. Эта экспрессионная кассета включает элементы, необходимые для транскрипции и трансляции кодирующих последовательностей для полипептидов по изобретению.

Предпочтительно эта экспрессионная кассета включает как элементы, требующиеся для продукции пептида в клетке-хозяине, так и элементы, необходимые для регуляции этой экспрессии.

Эти экспрессионные кассеты включают в направлении транскрипции:

- промотор, который является функциональным в организме хозяина;

- полинуклеотид по изобретению;

- терминаторную последовательность, которая является функциональной в том же самом организме хозяина.

В экспрессионных кассетах по изобретению могут использовать любой тип промоторной последовательности. Выбор промотора зависит в особенности от организма хозяина, выбранного для экспрессии интересующего гена. Некоторые промоторы дают возможность конститутивной экспрессии, тогда как другие промоторы, с другой стороны, являются индуцируемыми.

Среди функциональных промоторов в грибах следует, в особенности, упомянуть глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу Aspergillus nidulans (Roberts et al., Current Genet. 15, 177-180, 1989).

Среди функциональных промоторов в бактериях следует упомянуть в особенности промоторы РНК полимеразы бактериофага Т7 (Studier et al., Methods in Enzymology, 185, 60-89, 1990).

Среди функциональных промоторов дрожжей следует упомянуть промотор гена GAL1 (Elledge et al., Proc. Natl Acad. Sciences, USA. 88, 1731-1735, 1991) или промоторы Gal4 и ADH S. cerevisiae. Все эти промоторы описаны в литературе и хорошо известны специалистам в данной области техники.

Для экспрессии в Penicillium funiculosum выбирают, например, экспрессионные кассеты, включающие промотор гистона Н4В, промотор протеазы аспарагиновой кислоты или промотор csl13 (WO 00/68401).

Для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris выбирают, например, экспрессионные кассеты, содержащие индуцируемый метанолом промотор АОХ1 (Tschopp et al., Biotechnology, 5, 1305-1308, 1987) или сильный конститутивный промотор GAP (Waterham et al., Gene 186, 37-44, 1997).

Для экспрессии в Schizosaccharomyces pombe выбирают, например, экспрессионные кассеты, содержащие регулирующий промотор Nmt1, репрессированный тиамином, и активируемый в отсутствие тиамина (Maundrell, J. Biol. Chem. 265, 10857-10864, 1989).

Экспрессионные кассеты по настоящему изобретению также могут включать любую другую последовательность, необходимую для экспрессии полипептидов или полинуклеотидов, например регуляторные элементы или сигнальные последовательности, дающие возможность секреции полипептидов, продуцируемых организмом хозяина. В частности, можно применять любую регуляторную последовательность, которая дает возможность увеличения уровня экспрессии кодирующей последовательности, встроенной в экспрессионную кассету. В соответствии с изобретением ее, в частности, можно использовать в комбинации с промоторной регулирующей последовательностью или другими регулирующими последовательностями, которые расположены между промотором и кодирующей последовательностью, такими как активаторы транскрипции ("энхансеры").

Дополнительно, экспрессионные кассеты по настоящему изобретению могут включать любую другую последовательность, необходимую для секреции полипептидов, продуцируемых организмом хозяина, такую как сигнальная последовательность. Для секреции в Pichia pastoris можно, например, использовать последовательность α фактора в качестве сигнала секреции.

В экспрессионных кассетах по изобретению может быть использовано широкое разнообразие терминаторных последовательностей, причем эти последовательности дают возможность терминации транскрипции и полиаденилирования мРНК. Может быть использована любая терминаторная последовательность, функциональная в выбранном организме хозяина.

Для экспрессии в Penicillium funiculosum выбирают, например, экспрессионные кассеты, содержащие терминатор гистона Н4.В, терминатор протеазы аспарагиновой кислоты или терминатор csl13 (WO 00/68401).

Объектом настоящего изобретения также является полинуклеотид, содержащий экспрессионную кассету по изобретению; предпочтительно экспрессионные кассеты по настоящему изобретению встроены в вектор.

Векторы.

Настоящее изобретение также относится к клонирующим или экспрессионным векторам для трансформации организма хозяина, содержащим, по меньшей мере, один полинуклеотид или экспрессионную кассету по настоящему изобретению. Этот вектор может, в частности, соответствовать плазмиде, космиде, бактериофагу или вирусу, куда встроен полинуклеотид или экспрессионная кассета по изобретению. Способы конструирования этих векторов и встраивания полинуклеотида по изобретению в эти векторы известны специалистам в данной области техники. В общем, может быть использован любой вектор, способный к самоподдержанию, или к саморепликации, или распространению в клетке-хозяине для того, чтобы в особенности вызывать экспрессию полинуклеотида или пептида. Специалист в данной области техники выбирает подходящие векторы в зависимости от трансформируемого организма хозяина и в зависимости от используемого способа трансформации.

Векторы по настоящему изобретению используются, в частности, для трансформации организма-хозяина с целью репликации вектора и/или экспрессии пептида по изобретению в организме-хозяине.

Изобретение также относится к способу получения пептида по изобретению, включающему следующие стадии:

- организм хозяина трансформируют экспрессионным вектором, содержащим экспрессионную кассету по изобретению и/или полинуклеотид по изобретению,

- выделяют пептиды, продуцируемые организмом-хозяином.

Организмы-хозяева.

Объектом настоящего изобретения также является способ трансформации организма хозяина путем интеграции в указанный организм-хозяин, по меньшей мере, одного полинуклеотида, по меньшей мере, одной экспрессионной кассеты или, по меньшей мере, одного вектора по изобретению. Полинуклеотид может быть интегрирован в геном организма-хозяина или может стабильно реплицироваться в организме-хозяине. Способы трансформации организмов-хозяев известны специалистам в данной области техники и широко описаны в литературе.

Настоящее изобретение также относится к организму-хозяину, трансформированному полинуклеотидом, экспрессионной кассетой или вектором по изобретению.

В соответствии с изобретением термин "организм-хозяин", в частности, обозначает любой высший или низший одноклеточный или многоклеточный организм, выбранный, в частности, из бактерий, дрожжей и грибов. В частности, термин "организм-хозяин" обозначает нечеловеческий организм. Предпочтительно дрожжи выбирают, например, из Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica и Schwanniomyces occidentalis. Грибы выбирают, например, из Aspergillus, Trichoderma и Penicilliums, предпочтительно из Penicillium funiculosum, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachii и Trichoderma koningii. В одном из воплощений изобретения организм-хозяин представляет собой штамм Penicillium funiculosum, в котором имеет место экспрессия или сверхэкспрессия пептида по изобретению. В еще одном воплощении организм хозяин представляет собой штамм Debaromyces castellii, в котором имеет место экспрессия или сверхэкспрессия пептида по изобретению. В еще одном воплощении организм хозяин представляет собой штамм Ruminococcus gnavus, в котором имеет место экспрессия или сверхэкспрессия пептида по изобретению.

Способы конструирования векторов для трансформации организмов-хозяев и для экспрессии гетерологических белков в этих организмах широко описаны в литературе, в особенности Sambrook, Fristsch и Maniatis в книге, озаглавленной "Molecular cloning: a laboratory manual", издание: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 или Ausubel et al. в книге, озаглавленной "Current Protocols in Molecular Biology", издание: Greene Publishing Associates, Inc., и John Wiley and Sons, NY, 1992.

Штаммы.

Новый штамм Ruminococcus gnavus депонирован в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris) 19 декабря 2006 года под номером CNCM I-3705. CNCM представляет собой международный компетентный орган по депонированию, в соответствии со ст.7 Будапештского договора.

Новый штамм получен путем случайного мутагенеза штамма R. gnavus L14. Этот штамм представляет собой спонтанный мутант R. gnavus E1, который утратил способность продуцировать RumA in vitro, но который все еще синтезирует RumC in vivo. Для мутагенеза использовали сильный алкилирующий агент N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NG). При использовании рекомбинантных способов с использованием ДНК или РНК иного происхождения не достигали генетической модификации.

Культуральная среда штамма LEM 9-17 предпочтительно представляет собой BHI, дополненную дрожжевым экстрактом и гемином (BHI-YH).

Белковая смесь, ферментационное сусло.

Изобретение также относится к способу получения пептида, обладающего антимикробной активностью, по изобретению, где указанный способ включает следующие стадии:

а) выращивание штамма Ruminococcus gnavus или трансформированного организма хозяина по изобретению в условиях, которые вызывают экспрессию пептида, и

б) выделение культурального супернатанта, содержащего пептид.

Отделение пептида от культурального супернатанта могут осуществлять с помощью заряда, размера и/или гидрофобной природы. Специалисту в данной области известны различные способы разделения в зависимости от заряда, размера и/или гидрофобной природы различных составляющих среды.

Этот культуральный супернатант или ферментационное сусло затем могут концентрировать или лиофилизировать для формирования пищевой добавки или корма для животных. Этот способ может включать дополнительные стадии очистки антимикробного вещества от культурального супернатанта.

Если организм-хозяин не секретирует антимикробное вещество в культуральную среду, может быть необходима дополнительная стадия клеточного лизиса и очистки клеточного лизата.

Пептиды по изобретению также могут быть получены из содержимого слепой кишки моноксенных крыс.

Композиция.

Композиции по изобретению содержат пептид по изобретению, организм-хозяин по изобретению, штамм по изобретению, ферментационное сусло организма-хозяина по изобретению или ферментационное сусло штамма по изобретению. Композиции находятся в жидкой форме или порошкообразной форме, Эти композиции содержат различные ингредиенты.

Жидкие композиции могут содержать, например, еще один антимикробный агент, например сорбиновую кислоту или соль сорбиновой кислоты, бензойную кислоту или соль бензойной кислоты, или фумаровую кислоту или соль фумаровой кислоты. Композиции по изобретению также могут содержать сорбит. Сорбит представляет собой стабилизатор и агент, используемый в изготовлении препарата. Композиции по изобретению также могут содержать антифризы, например этиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль и 1,2-пропандиол.

Композиции в порошкообразной форме содержат носитель. Этот носитель может быть выбран из пшеничной муки, крахмала, мальтодекстрина, сернокислого кальция и сердцевин кукурузного початка.

Композиции по изобретению обладают антимикробной активностью. Они представляют собой альтернативу применению антибиотиков. Они могут быть использованы, например, при разведении животных или в качестве лекарственных средств для человека.

Композиции по настоящему изобретению содержат, по меньшей мере, один пептид по изобретению, но они также могут содержать другие вещества, например витамины, другие активные вещества, аминокислоты или неорганические соли.

Композиции по изобретению обеспечивают возможность, например, профилактики или лечения некротического энтерита у свиней или домашней птицы и профилактики или лечения желудочно-кишечных заболеваний у человека.

Композиции по изобретению, например, добавляют в корм для животных или, например, комбинируют с пищевым основанием. Таким образом, настоящее изобретение также относится к корму для животных, содержащему композицию по изобретению. Этот корм обычно находится в форме муки или гранул, в которые включены композиции, обладающие антимикробной активностью. Объектом настоящего изобретения также является корм для животных, содержащий пептид по изобретению, организм-хозяин по изобретению или ферментационное сусло/культуральный супернатант организма-хозяина по изобретению.

Термин "корм" обозначает что-либо, что может служить в качестве корма для животных. Термин "пищевое основание" обозначает что-либо, что составляет существенную долю пищевого рациона животного, составленное, например, путем смешивания зерновых, белков и жиров животного и/или растительного происхождения. Обычно такие пищевые основания включают, например, кукурузу, пшеницу, горох и сою. Эти пищевые основания адаптированы для потребностей различных видов животных, для которых они предназначены. Они могут представлять собой, например домашнюю птицу (курицы-несушки, бройлерные цыплята, индюшки и утки) или свиней (растущие свиньи в заключительной стадии откорма или поросята).

Применение пептидов.

Настоящее изобретение также относится к применению пептида по изобретению, организма-хозяина по изобретению, штамма по изобретению, ферментационного сусла организма-хозяина по изобретению или ферментационного сусла штамма по изобретению для изготовления лекарственного средства.

Настоящее изобретение также относится к применению пептида по изобретению, организма-хозяина по изобретению, штамма по изобретению, ферментационного сусла организма-хозяина по изобретению или ферментационного сусла штамма по изобретению в качестве пищевой добавки или, в комбинации с другими соединениями, в качестве корма для животных.

В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения это лекарственное средство или эта пищевая добавка предназначены для профилактики или лечения некротического энтерита у свиней или домашней птицы.

В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения это лекарственное средство или эта пищевая добавка предназначены для профилактики или лечения желудочно-кишечных заболеваний у человека.

Описание графических материалов

Фиг.1: хроматограмма, полученная путем молекулярного скрининга на Sephadex G-75 растворимой фракции, содержащейся в 10 г содержимого слепой кишки моноксенных крыс, несущих штамм R. gnavus E1; на оси x обозначен элюируемый объем в мл; на оси y обозначена абсорбция при 280 нм; затененная площадь соответствует фракциям, активным в отношении С. perfringens (фракции с 325 по 358).

Фиг.2А: хроматограмма, полученная путем молекулярного скрининга стандартных белков на Sephadex G-75; на оси x обозначен элюируемый объем в мл; на оси y обозначена абсорбция при 280 нм; а: альбумин 67 кДа; b: овальбумин 43 кДа; с: химотрипсин 25 кДа; d: рибонуклеаза А 13,7 кДа.

Фиг.2В: калибровочная логарифмическая кривая (MM)=f(Ve), полученная из хроматограмм на фиг.2А; на оси x обозначен элюируемый объем в мл; на оси y обозначен логарифм молекулярной массы.

Фиг.3: хроматограмма, полученная при помощи ВЭЖХ на катионообменной колонке активной фракции GF; на оси y, левая сторона, обозначена абсорбция при 214 нм; на оси y, правая сторона, обозначена концентрация NaCl в М; на оси x обозначено время в минутах.

Фиг.4А: хроматограмма, полученная при помощи обратно-фазовой ВЭЖХ активной фракции СМ; на оси y, левая сторона, обозначена абсорбция при 214 нм; на оси y, правая сторона, обозначен процент ацетонитрильного элюента; на оси x обозначено время в минутах.

Фиг.4В и 4С: масс-спектр фракций, полученных в результате обратно-фазовой ВЭЖХ; на оси x обозначено отношение масса/заряд; на оси у обозначена интенсивность сигнала.

Фиг.5: схема протокола очистки RumC из содержимого слепой кишки моноксенных крыс, несущих штамм R. gnavus E1.

Фиг.6: хроматограмма, полученная при помощи ЖХБР (жидкостной хроматографии быстрого разрешения) на катионообменной смоле обессоленной фракции SN 9-17; на оси x обозначено время в минутах; на оси у обозначена абсорбция при 214 нм

а: абсорбция при 214 нм

b: концентрация NaCl

с: проводимость

d: скорость потока в мл/минута.

Фиг.7: масс-спектры различных фракций во время очистки RumC; на оси x обозначено отношение масса/заряд; на оси y обозначена интенсивность сигнала.

Фиг.7А: SN 9-17.

Фиг.7В: активная фракция СМ.

Фиг.7С: R 10 кДа.

Фиг.8: масс-спектр фракции GF 47-50; на оси x обозначено отношение масса/заряд; на оси y обозначена интенсивность сигнала.

Фиг.9: схема протокола очистки RumC из мутантного штамма LEM 9-17.

Примеры

Материалы и методы

1. Бактериальные штаммы и культуральные среды.

Штамм Ruminococcus gnavus E1, который продуцирует RumC, выделяли из доминирующей фекальной микробиоты здорового взрослого человека (Dabard et al., Appl. Environ. Microbiol., 67, 4111-4118, 2001). Штамм R. gnavus L14 представляет собой спонтанный мутант R. gnavus E1, утративший способность продуцировать RumA in vitro, но сохранивший способность синтезировать RumC in vivo.

Штамм Ruminococcus gnavus, депонированный в CNCM 19 декабря 2006 года под номером CNCM 1-3705, получен в результате случайного мутагенеза штамма L14. Он способен продуцировать RumC in vitro на дополненной трипсином агаровой среде (500 мкг/мл; но не в жидкой среде). Он представляет собой штамм LEM 9-17.

Штамм, используемый в качестве мишени для тестов активности, представляет собой штамм Clostridium perfringens CpA (Dabard et al., Appl. Environ. Microbiol., 67, 4111-4118, 2001).

Эти четыре штамма выращивают анаэробно в камере типа "Freter" в контролируемой атмосфере (85% N₂, 10% H₂, 5% CO₂). Их инкубируют при 37°C в среде BHI, дополненной дрожжевым экстрактом и гемином (BHI-YH).

Жидкий BHI-YH: 37 г/л BHI (Brain Heart Infusion, Difco Laboratories)

5 г/л дрожжевого экстракта (Yeast Extract, Fluka)

5 мг/л гемина (Hemin, Sigma)

агар BHI-YH: то же + 15 г/л агара (ВАСТО™ агар, Difco Laboratories).

2. Тесты на антимикробную активность с использованием жидкого образца.

Для осуществления теста на антимикробную активность с использованием жидкого образца от 10⁴ до 10⁵ клеток С. perfringens CpA высевают на агаровой среде. Через 30 минут при комнатной температуре в агаре с использованием пастеровской пипетки делают лунки диаметром 6 мм. Образцы объемом менее 100 мкл затем помещают в лунки и чашки инкубируют в течение 16-24 часов при 37°C. Если образец содержит антимикробное вещество, направленное против С. perfringens CpA, рост бактерий ингибируется, что приводит к образованию "ореола ингибирования" вокруг лунки.

Тесты на активность также могут осуществлять путем непосредственного помещения 10 мкл тестируемого образца на агар, предварительно инкубированный с C. perfringens.

3. Тест на антимикробную активность с использованием колоний. которые растут в агаровой среде.

После выращивания в течение 24 часов на агаровой среде, дополненной или иным образом содержащей 50 мкг/мл трипсина, штамм, потенциально продуцирующий антимикробное вещество, покрывают "мягкой" агаровой средой (содержащей 7,5 г агар/л), содержащей штамм-мишень. Этот мягкий агар готовят путем немедленного смешивания 5 мл переохлажденной агаровой среды с 5 мл жидкой среды, содержащей от 10⁴ до 10⁵ клеток штамма-мишени. Чашки Петри затем повторно инкубируют в течение 16-24 часов при 37°C. Ореол ингибирования обнаружен вокруг колоний, продуцирующих антимикробное вещество.

4. Удаление клеточного дебриса и пищевых остатков из содержимого слепой кишки.

10 г содержимого слепой кишки разводят в 30 мл PBS (NaCl 137 мМ, KCl 2,68 мМ, Na₂HPO₄ 8,1 мМ, KH₂PO₄ 1,47 мМ, pH 7,4) и затем центрифугируют при 10000×g и при 4°C в течение 15 минут. Осадок, содержащий клеточный дебрис и пищевые остатки, удаляют.

5. Модули для фильтрования путем центрифугирования.

Они представляют собой фильтровальные мембраны для разделения белков на две фракции в зависимости от их молекулярной массы после центрифугирования. Эти системы также могут быть использованы для концентрирования или обессоливания образцов.

Продукты этого типа предлагают несколько производителей. В большинстве случаев мембраны готовят из регенерированной целлюлозы, но они также могут быть сделаны из полиэфирсульфона. Выбор системы осуществляют в зависимости от объема образцов, которые обрабатывают, и порога отсечения мембран (Таблица 1). Эти фильтрующие модули использовали в соответствии с указаниями, приведенными производителем для выбора типа ротора и скорости центрифугирования. Однако время центрифугирования изменяли в зависимости от вязкости образца.

Таблица 1 Характеристики фильтрующих модулей, используемых в процессе тестов очистки RumC Название Тип мембраны Порог отсечения Максимальный объем Amicon^® Ultra-15 PL-5* Регенерированная целлюлоза 5 кДа 20 мл Microcon^® YM-10* Регенерированная целлюлоза 10 кДа 0,5 мл Microcon^® YM-3* Регенерированная целлюлоза 3 кДа 0,5 мл Vivaspin 500-5000MWCO** Полиэфирсульфон 5 кДа 0,6 мл Vivaspin 500-3000 MWCO** Полиэфирсульфон 3 кДа 0,6 мл * продукт под товарным знаком Millipore; ** продукт под товарным знаком Sartorius.

6. Молекулярный скрининг на Sephadex G-75.

Молекулярный скрининг супернатанта содержимого слепой кишки осуществляют на колонке Sephadex G-75 (2,4×187 см). Образец (объем которого составляет приблизительно 2% от объема колонки) наносили на колонку, элюирование осуществляли при 4°C при скорости потока 1 мл/минуту с использованием PBS, и собирали 600 2-мл фракций. Хроматограмму получали путем считывания абсорбции при 280 нм для каждой фракции.

7. Молекулярный скрининг с помощью ЖХБР.

Молекулярный скрининг активной фракции СМ осуществляют с помощью системы ЖХБР. Образец наносят на колонку HiLoad 26/60 Superdex 30 pg (GE Healthcare). Элюирование осуществляют при скорости потока 2,5 мл/минута с помощью PBS. Элюируемый белковый материал обнаруживают путем измерения вариации в абсорбции при 280 нм. Фракции, соответствующие 2 минутам элюирования, собирают автоматически.

8. ВЭЖХ на катионообменной колонке СМ.

Катионообменную ВЭЖХ осуществляют на Waters 600S Controller, оборудованном помповым инжектором Waters 616. Образец (0,5 мл) наносят на полупрепаративную колонку CM-3SW Spherogel от TSK. Элюирование осуществляют при pH 5 в 20 мМ буфере с ацетатом натрия при скорости потока 0,8 мл/минута, с использованием градиента концентрации NaCl от 0 до 1М. В течение первых 20 минут элюирование осуществляют в изократическом режиме без NaCl, и затем с линейным градиентом концентрации NaCl от 0 до 0,5 М в течение 30 минут. Элюирование затем продолжают в течение 5 минут в изократических условиях, затем осуществляют резкий переход на концентрацию NaCl 1 М в течение 1 минуты, а затем продолжают в течение 15 минут в изократических условиях и, наконец, возвращаются к исходным условиям. Элюируемый белковый материал обнаруживают путем измерения поглощения при 280 или 214 нм с использованием переключаемого детектора абсорбции Waters 486. Фракции собирают автоматически и затем обессоливают с использованием системы Amicon® Ultra PL-5.

9. ЖХБР на катионообменной колонке.

Катионообменную хроматографию осуществляют на ЖХБР. Образец наносят на колонку Hi-Prep 16/10 CM FF (GE Healthcare). Элюирование осуществляют при pH 5 в 20 мМ буфере с ацетатом натрия с использованием градиента концентрации NaCl от 0 до 0,4 М. Элюирование осуществляют в течение 50 минут в изократическом режиме без NaCl при скорости потока 2 мл/минута. Элюирование затем продолжают при скорости потока 5 мл/минута с линейным градиентом концентрации NaCl от 0 до 0,4 М в течение 40 минут. Элюируемый белковый материал обнаруживают путем измерения изменения абсорбции при 280 нм. 1 мл фракции собирают автоматически и затем обессоливают на картриджах Sep-Pak® C18.

10. Обратно-фазовая ВЭЖХ.

Обратно-фазовую ВЭЖХ осуществляют в модуле Alliance Waters 1690 Separations Module. Образец (100 мкл), предварительно подкисленный 0,1% трифторуксусной кислотой (TFA), наносят на аналитическую колонку Vydac 218ТР52 250х2. Элюирование осуществляют при постоянной скорости потока (0,5 мл/минута). После элюирования в течение 10 минут в изократическом режиме с 15% ацетонитрилом применяют линейный градиент от 15% до 30% ацетонитрила в течение 60 минут. Затем осуществляют резкий переход на 70% ацетонитрил в течение 1 минуты и элюирование продолжают в течение 19 минут в изократических условиях, а затем возвращают на исходные условия. Элюируемый белковый материал обнаруживают путем измерения изменения абсорбции при 214 нм с использованием детектора на основе фотодиодной матрицы Waters 996. Автоматически собирают фракции 0,5 мл. Ацетонитрил выпаривают с использованием концентратора Speed Vac Concentrator (Savant).

11. Массовая спектрометрия.

Анализы путем масс-спектрометрии осуществляют в Timone proteomic plateau (School of Pharmacy, Marseilles, France).

Масс-спектры типа MALDI (масс-спектры, полученные при спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы) получены на спектрометре Ettan Maldi-Tof Pro (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) в линейном режиме положительных ионов с отложенной экстракцией. Образцы подвергают сокристаллизации с 5 мг/мл раствором α-циано-4-гидроксикоричной кислоты на подложке для МАЛДИ при помощи метода высушивания капли. Спектры регистрируют с усилительным потенциалом 20 кВ и мощностью лазера, установленной на минимальный уровень для достижения хорошего сигнала. Калибровку спектров осуществляют во внешнем режиме путем регистрации для стандартной смеси пептидов с известными массами (Pepmix4, Laserbiolabs, Nice, France).

Для некоторых образцов, которые сложно кристаллизуются, осуществляют сокристаллизацию с использованием раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты.

12. Секвенирование по Эдману.

Этот способ основан на реакции свободой концевой аминогруппы белка с фенилизотиоцианатом (C₆H₅N=С=S). Это циклическое соединение осуществляет нуклеофильную атаку в основной среде на первый аминокислотный остаток белка. Фенилтиокарбамильное (РТС) производное пептида затем отщепляют путем гидролиза. Получают анилинотиазолинон (ATZ) первой аминокислоты и белок без этой первой аминокислоты. ATZ-аминокислоту затем превращают в фенилтиогидантоин-(РТН) аминокислоту.

Последовательно получаемые РТН-аминокислоты разделяют и идентифицируют при помощи ОФ-ВЭЖХ путем измерения абсорбции при 280 нм и сопоставления времен элюирования.

Цикл реакций могут повторять, что приводит к получению белковой последовательности.

13. Случайный мутагенез.

Культуру 14 мл штамма L14, инкубируемого в течение 24 часов при 37°C, разделяют на семь 2 мл пробирок, и пробирки затем центрифугируют при 5800×g в течение 10 минут. Клеточные осадки дважды промывают 2 мл 0,1 М циторатного буфера (лимонная кислота 21 мг/мл, NaOH 8,8 мг/мл, pH 5,5) и затем суспендируют в цитратном буфере, содержащем увеличивающиеся концентрации N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина (NG), представляющего собой сильный мутаген.

Таблица 2 Объемы растворов, используемых при обессоливании на Sep-Pak Пробирки 1 (Т₀) 2 3 4 5 6 7 [NG] конечная в мкг/мл 0 25 50 100 200 400 1000

Пробирки затем инкубируют в течение 30 минут при 37°C, а затем центрифугируют в течение 10 минут при 5800×g. Осадки промывают 0,1 М фосфатным буфером (KH₂PO₄ 13,6 мг/мл, NaOH 2,32 мг/мл, pH 7) и затем суспендируют в жидкой среде BHI-YH.

14. Обессоливание на картриджах Sep-Pak^® C18 (Waters).

В зависимости от модели эти колонки находятся в форме шприцов, в которые введена фаза, или миниколонок, фиксированных на конце шприца. Поток буферов обеспечивается перистальтическим насосом. На первой стадии колонку уравновешивают путем пропускания H₂O и затем CH₃CN, и, наконец, Н₂О, содержащей 0,05% TFA (три фторуксусная кислота). Затем наносят образец, предварительно подкисленный 0,05% TFA. Элюирование осуществляют в три стадии путем последовательного добавления H₂O - 0,05% TFA, 40% CH₃CN - 0,05% TFA и CH₃CN - 0,05% TFA.

Таким образом, собирают три фракции: фракцию, соответствующую белку, не удерживающемуся в колонке, и солям (фракция NR), фракцию, содержащую белок, разведенный 40% CH₃CN (фракция 40% ACN), и фракцию, содержащую белок, разведенный 100% CH₃CN (фракция 100% ACN). Растворитель выпаривают с использованием концентратора Speed Vac или роторного испарителя в зависимости от объема.

Таблица 3 указывает на объемы каждого раствора, используемого для обессоливания фракций, полученных после очистки RumC (смотри Результаты и обсуждение). Эти объемы зависят от объема фазы Sep-Pak.

15. Тест температурной устойчивости.

Аликвоты фракции, содержащей RumC, нагревают, каждый до различной температуры, с использованием нагревающего блока в течение 5 или 15 минут, и затем хранят при 4°C. Их затем подвергают тестированию на антимикробную активность.

16. Тест устойчивости к pH.

Аликвоты фракции, содержащей RumC, разбавляют приблизительно в десять раз в желаемом буфере. После 10 минут при комнатной температуре каждый раствор наносят в фильтрующий модуль Vivaspin 500 3 кДа и затем центрифугируют в соответствии с указаниями производителя. Буфер добавляют к фракции, удерживаемой Vivaspin 500, и фильтрующий модуль затем повторно центрифугируют. Объем каждой фракции, удерживаемой Vivaspin 500 3 кДа, т.е. содержащей RumC, доводят буфером до соответствующего исходного объема. Различные фракции затем хранят при 4°C, а затем подвергают тестированию на антимикробную активность.

Фильтры Vivaspin 500 3 кДа не выдерживают значения pH больше 9. Таким образом, тестировали только буферы с кислым или нейтральным pH.

Состав является следующим:

буфер pH 2: 50 мМ KCl - 13 мМ HCl

буфер pH 4,4: 0,2 М pH 4,4 раствор ацетата натрия

буфер pH 7: 50 мМ KH₂PO₄ - 39 мМ NaOH.

Результаты и обсуждение

1. Очистка RumC из содержимого слепой кишки

Хотя штамм Ruminococcus gnavus E1 возможно культивировать, продукции RumC in vitro в тестируемых культуральных условиях не происходит. Для очистки RumC, таким образом, необходимо работать, используя содержимое слепой кишки моноксенных крыс, несущих штамм Е1, или создавать мутантный штамм R. gnavus, способный продуцировать RumC in vitro (см. раздел 2).

1.1. Разведение содержимого слепой кишки моноксенных крыс.

Первая стадия состоит из разведения содержимого слепой кишки PBS (физиологическим раствором, забуференным фосфатом).

1.2. Удаление клеточного дебриса.

Во время второй стадии очистки бактерии, клеточный дебрис и пищевые остатки удаляют путем центрифугирования содержимого слепой кишки.

1.3. Концентрирование

Раствор затем концентрируют на системе Amicon® Ultra-15 PL-5, a затем наносят на колонку для молекулярного скрининга.

1.4. Тест на антимикробную активность.

Все полученные фракции тестировали на штамме С. perfringens CpA, что подтвердило присутствие вещества, имеющего активность против С. perfringens, в содержимом слепой кишки моноксенных крыс.

Отрицательный контроль выполняли на содержимом слепой кишки аксенных крыс (без микроорганизмов). Не обнаружено никакой активности против С. perfringens. Вещество против С. perfringens представлено в содержимом слепой кишки моноксенных крыс, и, таким образом, действительно является специфичным в отношении R. gnavus E1.

Затем за каждым тестом очистки следовали тесты на активность против С. perfringens. На первой стадии исследовали только присутствие или отсутствие активности, следя за тем, чтобы отрицательные результаты не были связаны с порогом чувствительности способа. Количественные тесты осуществляли на второй стадии, когда утвердили определенный протокол определения.

1.5. Молекулярный скрининг на колонке Sephadex G-75.

Молекулярный скрининг осуществляли на колонке Sephadex G-75 (2,4×187 см). Элюирование контролировали путем считывания абсорбции при 280 нм для каждой из 600 собранных 2-мл фракций.

Тесты на антимикробную активность осуществляли на фракциях, предварительно концентрированных с использованием Microcon^® YM-3.

Фракции 325-358 оказались активными против С. perfringens, и их объединяли с образованием новой активной фракции GF (затемненная площадь на Фиг.1).

Контроль, проводимый на содержимом слепой кишки аксенных крыс, привел к профилю элюирования, сравнимому с профилем, полученным на содержимом слепой кишки моноксенных крыс, но никакой активности против С. perfringens не обнаружили.

1.6. Оценка размера RumC.

Для оценки размера RumC, присутствующего в активной фракции GF, стандартные белки с известными молекулярными массами наносили на ту же самую колонку Sephadex G-75, и измеряли соответствующие элюируемые объемы (Фиг.2А). Затем строили калибровочную кривую, определяющую пропорциональность между логарифмом молекулярной массы (log (MM)) вещества и элюируемым объемом (Ve) (Фиг.2В). При среднем элюируемом объеме 683 мл антимикробное вещество не попадает в диапазон выбранных стандартных белков, но экстраполяция его молекулярной массы может составлять по оценкам приблизительно 5200 Да.

1.7. Хроматография на катионообменной смоле.

С использованием активной фракции GF осуществляли катионообменную хроматографию на колонке с карбоксиметилом (CM) - Spherogel™ с помощью системы ВЭЖХ. Элюирование осуществляли в градиенте концентрации NaCl при pH 5 и контролировали при 214 нм (Фиг.3).

Активность обнаружена между 32 и 38 минутами (активная в СМ фракция), что соответствует концентрации NaCl от 0,2 до 0,3 М. Этот способ дает возможность устранения из фракции не удерживающихся примесей, в особенности всех желтых пигментов.

Анализ активной фракции СМ путем масс-спектрометрии продемонстрировал, что она содержит единственный пептид с массой приблизительно 4200 Да (результат не представлен).

Эту фракцию подвергали N-концевому секвенированию. Таким образом, определили первые 11 аминокислот: AGVIX(N/S)GTXAV (SEQ ID No.10). Эта последовательность не демонстрирует какой-либо значительной гомологии с известными белками.

Секвенирование также выявило две минорные последовательности.

1.8. Обратно-фазовая ВЭЖХ.

Получены различные пики абсорбции при 214 нм.

Активность выявлена в двух фракциях, обозначенных как а (или "двойной пик") и b (или "единичный пик") (Фиг.4А). Анализ этих двух фракций путем масс-спектрометрии выявил присутствие трех основных пептидов, соответствующие молекулярные массы которых составляют от 4230 до 4460 Да (Фиг.4В и 4С).

Очистку RumC из содержимого слепой кишки вновь осуществляли с использованием трех хроматографий, т.е. молекулярного скрининга, катионообменной хроматографий и обратно-фазовой хроматографии. Полученные профили элюирования сравнимы с профилями для первых тестов. Таким образом, способ очистки RumC является воспроизводимым и, следовательно, может применяться,

Схема, обобщающая очистку RumC из содержимого слепой кишки, представлена на Фиг.5.

1.9. Выходы и коэффициенты очистки.

Как принято, количество условных единиц активности (УЕА), присутствующих в растворе, определяют как обратную величину от последнего активного разведения. Таким образом, тест на активность против С. perfringens осуществляли на серийных разведениях (двухкратных) каждой активной фракции, полученной после очистки.

Коэффициент очистки определяют путем сравнения удельной активности, выраженной как УЕА/мг белка для каждой фракции. Оценку количества белка в различных фракциях проводили путем измерения их абсорбции при 280 нм с использованием коэффициента массовой экстинкции Е^0,1%, равного 1,8.

В Таблице 4 приведены выходы активности и коэффициенты очистки для стадий протокола очистки RumC из содержимого слепой кишки моноксенных крыс.

1.10. Определение пептидной последовательности

Хотя молекулярные массы продуктов, представленные во фракциях "двойной пик" и "единичный пик" различны, секвенирование по Эдману делает возможным выявить одну основную N-концевую последовательность: AGXIXSGSVAV (SEQ ID No.3).

В двух рассмотренных фракциях также выявлена минорная последовательность из 17 остатков: AGPAYXVGYXGNNGAVT (SEQ ID No.2).

2. Создание мутантного штамма путем случайного мутагенеза.

Используемый способ представлял собой продукт случайного мутагенеза штамма R. gnavus L14. Этот штамм представляет собой спонтанный мутант R. gnavus E1, который утратил способность продуцировать RumA in vitro, но сохранил способность продуцировать RumC in vivo. Этот штамм подвергали воздействию мощного алкилирующего агента, представляющего собой N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NG).

Таким образом, аликвоты той же самой культуры штамма L14 подвергали воздействию растущих концентраций NG (от 0 до 1000 мкг/мл). После обработки различные клеточные суспензии разбавляли и затем наносили на чашки Петри. Подсчет колоний после выращивания дает возможность оценки концентрации живых клеток в различных суспензиях.

Путем сравнения с концентрацией в контроле (пробирка 1, без обработки NG) может быть определен уровень смертности в случае каждой обработки. Выяснилось, что обработка NG была эффективной: уровни смертности составляют от 50% до 99% и увеличиваются с концентрацией.

Для того, чтобы обнаружить интересующий(ие) мутант(ы), почти 860 колоний, случайно отобранных из клонов, которые выживали после различных обработок, переклонировали на дополненную трипсином агаровую среду и затем подвергали тесту на активность против С. perfringens.

Обнаружено, что 83 клона являются потенциальными продуцентами вещества, активного против С. perfringens, на агаровой среде в присутствии трипсина.

Среди них для более тщательной характеристики отобраны 20.

На первой стадии мутации поражающие клоны при помощи ПЦР (полимеразной цепной реакции) проверяли для того, чтобы убедиться в том, что они не восстанавливают хромосомную организацию в rumA.

20 отобранных клонов затем подвергали тестам на активность против Clostridium perfringens на агаровой среде и в жидкой среде, в присутствии или в отсутствие трипсина.

На дополненной трипсином агаровой среде ореолы ингибирования присутствуют приблизительно вокруг семи из двадцати тестированных клонов.

При этом на агаровой среде без трипсина ни один из клонов не продуцировал какое-либо вещество, активное против С. perfringens: таким образом, трипсин всегда является важным для синтеза бактериоцина.

Ни одно из веществ, имеющих активность против С. perfringens, не продуцируется клонами, выращенными в жидкой среде, даже в присутствии трипсина.

3. Очистка с использованием мутантного штамма.

Тесты продукции и очистки осуществляли на одном из семи продуцирующих клонов, мутант 9-17.

Тесты осуществляли на мягком агаре с различными концентрациями клеток и трипсина. После выращивания мутанта агар растирали и затем центрифугировали для получения супернатанта (SN 9-17). Этот супернатант затем тестировали на активность против С. perfringens и обнаружили, что он является активным. Анализ путем масс-спектрометрии осуществляли на этом активном супернатанте (Фиг.7А).

3.1. Хроматография на катионообменной смоле с использованием системы ЖХБР.

Перед осуществлением ионообменной хроматографии образец нуждается в обессоливании.

Первые тесты продемонстрировали, что обессоливание SN 9-17 на Amicon является недостаточным. Таким образом, обессоливание образца на Sep-Pak следует рассматривать как предварительную стадию очистки.

Элюирование белков с Sep-Pak осуществляют при помощи 40% раствора ацетонитрила. После выпаривания на роторном испарителе раствор уравновешивают при значении pH 5 путем его разведения в 20 мМ буфере ацетата натрия с pH 5. Из 65 мл SN 9-17 получают 50 мл обессоленных SN 9-17, уравновешенных при значении pH 5, и наносят на карбоксиметилсефарозную катионообменную колонку.

Осуществляют прогон с градиентом концентрации от 0 до 0,4 М NaCl в течение 40 минут. Активность против С. perfringens обнаруживают во фракциях, элюируемых с 0,2-0,3 М NaCl, хотя в этих фракциях представлено очень мало белкового материала, если руководствоваться изменением абсорбции при 280 нм (Фиг.6). Это уже обнаруживали во время очистки RumC из содержимого слепой кишки. Активные фракции объединяли и затем обессоливали и концентрировали на Sep-Pak. Анализ этой фракции при помощи масс-спектрометрии ("активная фракция СМ") подтверждает значительное улучшение очистки, обеспечиваемое катионообменной хроматографией, и демонстрирует, что все примеси имеют молекулярную массу меньше чем 2500 Да (Фиг.7В).

3.2. Молекулярный скрининг фракции СМ.

Молекулярный скрининг активной фракции СМ осуществляли при помощи системы ЖХБР на колонке, дающей возможность разделения пептидов, имеющих массу меньше чем 10 кДа. Элюирование контролируют путем считывания изменения абсорбции при 280 нм; количество белкового материала является небольшим, и разделение оказалось неудовлетворительным (не представлено). Тем не менее, собранные фракции тестировали на активность против С. perfringens. После скрининга было обнаружено только 5% активности. Таким образом, этот способ не подходит для очистки. С другой стороны, активную фракцию ("GF 47-50") анализировали при помощи масс-спектрометрии, и оказалось, что она является по существу чистым пептидом с массой 4235 Да (Фиг.8).

3.3. Фильтрование фракции СМ.

Еще одну попытку удалить примеси из активной фракции СМ предприняли с использованием фильтрующих модулей. Поскольку RumC задерживается фильтрами 5 кДа (несмотря на то, что они имеют несколько меньшую молекулярную массу), первый тест осуществили с помощью фильтрования с использованием фильтрующего модуля Vivaspin 500, порог отсечения для которого составляет 5 кДа. К сожалению, примеси также удерживаются фильтром, хотя их молекулярные массы составляют менее 2,5 кДа. Конкретно, анализ при помощи масс-спектрометрии не выявил какого-либо улучшения очистки (результаты не представлены). Таким образом, предприняли второй тест с использованием фильтрующего модуля Microcon, порог отсечения которого составляет 10 кДа. А именно, ранее было обнаружено, что RumC, несмотря на свою молекулярную массу, может быть задержан фильтрами 10 кДа ("R фракция 10 кДа"). Анализ при помощи масс-спектрометрии подтвердил предшествующие результаты и дал возможность продемонстрировать, что значительная доля примесей в неудерживающейся фракции удалялась (Фиг.7С).

3.4. Обратно-фазовая хроматография фракции R 10 кДа в системе ВЭЖХ.

Фракцию R 10 кДа, содержащую три пика RumC (4235 Да, 4324 Да и 4456 Да) затем подвергали обратно-фазовой ВЭЖХ. Скорость потока и условия градиента идентичны условиям, разработанным для очистки of RumC из содержимого слепой кишки, и полученный результат является сопоставимым: две различные фракции, представляющие собой фракцию "двойного пика" и фракцию "единичного пика", проявляют активность против С. perfringens.

3.5. Выходы и коэффициент очистки.

Для оценки протокола очистки осуществляли количественные тесты на активность с использованием двухкратных серийных разведении каждой активной фракции. Затем рассчитывали количество условных единиц активности (УЕА), содержащихся в каждой фракции, и устанавливали выход очистки (Таблица 5). Значительную потерю активного вещества обнаруживали на стадиях обессоливания культурального супернатанта, катионообменной хроматографии, а затем еще одного обессоливания. Весьма вероятно, что потеря происходит на стадии катионообменной хроматографии, но это не ставит под сомнение пригодность протокола.

Таблица 5 Выходы для очистки RumC из культурального супернатанта мутанта 9-17 Фракция V (мл) анти-СрА А. (УЕА) Выход SN 9-17 125 1453 100% Активная СМ ~3 300 21% Двойной пик 0,42 140   Единичный пик 0,42 140 19%   V: общий объем фракции в мл анти-СрА А. (активность против С. perfringens): общее количество единиц активности, содержащихся во фракции, в УЕА Выход = 100 × анти-СрА А._{тестируемая} фракция/анти-CpA A._SN9-17; выраженные в %

Другой важный критерий для оценки протокола очистки представляет собой демонстрацию улучшения очистки, обеспечиваемой на каждой стадии. Коэффициент очистки определяют путем сравнения удельных активностей (УЕА/мг белка) на каждой стадии, но для осуществления этого масса белка, содержащегося в каждой фракции, должна быть измерена. Контроль очистки осуществляли при помощи масс-спектрометрии ввиду чувствительности этого способа, делая возможным избегать "потребления" слишком большого количества биологического материала. Хотя этот способ не является количественным, улучшение очистки продемонстрировано весьма очевидно.

3.6. Масс-спектрометрия.

Фракции "двойной пик" и "единичный пик" анализировали при помощи масс-спектрометрии. Полученные результаты идентичны полученным для фракций в результате очистки с использованием содержимого слепой кишки: фракция "двойной пик" содержит пептиды 4324 Да и 4456 Да, тогда как фракция "единичный пик" содержит пептид 4235 Да.

3.7. Секвенирование.

Далее эти фракции секвенировали.

Для фракции "единичный пик" полученная последовательность идентична уже определенной последовательности: AGXIXSGSVAV (SEQ ID No.3). На пятом цикле появляется минорная последовательность: AGPAY (SEQ ID No.11).

Для фракции "двойной пик" были обнаружены небольшие отличия: AGXVXSGSTAV (SEQ ID No.12). Минорная последовательность идентична: AGPAY (SEQ ID No.11).

Схема, обобщающая очистку RumC из мутантного штамма, представлена на Фиг.9.

Получение очищенного RumC в значительной степени упрощено.

4. Характеристика пептидов RumC.

4.1. Антимикробная активность в отношении различных штаммов.

Антимикробную активность RumC тестировали в отношении различных грам+ и грам- патогенных штаммов с использованием на первой стадии концентрированного супернатанта содержимого слепой кишки моноксенных крыс для штамма R. gnavus E1 (SN CCE1). Затем осуществляли другие тесты с двумя очищенными фракциями против штаммов, чувствительных к SN CCE1. Результаты представлены в Таблице 6.

Таблица 6 Результаты тестов активности RumC против различных патогенных штаммов   Антимикробная активность (размер ореола ингибирования)   Фракция
Тестируемый штамм SN CCE1 Двойной пик Единичный пик Грам- Clostridium perfringens CpA +(2 мм) +(1 мм) +(1 мм)   Closfridium perfringens S40 +(2 мм) +(1 мм) +(1 мм) Clostridium sporogenes CIP 79-3 - н.о. н.о. Clostridium acetobutylicum BL75-41 - н.о. н.о. Bacillus cereus TZ 415 +(2 мм) +(5 мм) +(3 мм) Bacillus cereus K 1231 - н.о. н.о. Bacillus cereus Z 421 - н.о. н.о. Listeria monocytogenes EGDE +(1 мм) +(1 мм) +(1 мм) Listeria monocytogenes Scott A - н.о. н.о. Listeria inocula CIP 80-12 +(1 мм) - - Грам- Salmonella enteridis CIP 82-17 +(5 мм) - - Campylobacter jejuni - н.о. н.о.

Все тестируемые штаммы Clostridium perfringens чувствительны к пептиду RumC.

4.2. Антимикробная эффективность в отношении С. perfringens

Антимикробную эффективность RumC также определяли путем оценки минимальной ингибирующей концентрации для каждой очищенной фракции RumC "in vivo" и сравнения ее с концентрацией метронидазола, представляющего собой референсный антибиотик, используемый против С. perfringens.

Для выполнения этого готовили двойные серийные разведения фракций "двойной пик" и "единичный пик" (разведения до 1/512). Тесты активности против С. perfringens проводили с использованием этих различных разведений и также растворов метронидазола с различными концентрациями (результаты не представлены). По результатам этого теста минимальная ингибирующая концентрация для метронидазола составила 25 мкг/мл. Этот результат согласуется с результатами, ранее полученными Dabard et al. (Dabard et al., Appl. Environ. Microbiol, 67, 4111-4118, 2001).

В отношении фракций "двойной пик" и "единичный пик" активны только концентрированные растворы (разведение 1). Хотя концентрация этих растворов точно не известна, при помощи секвенирования по Эдману можно оценить, что она находится на уровне приблизительно 40 мкг/мл.

Таким образом, антимикробная эффективность RumC в отношении С. perfringens сравнима с эффективностью в отношении метронидазола.

4.3. Устойчивость к температуре.

Первые предварительные тесты устойчивости RumC к нагреванию осуществляли путем инкубации одного и того же количества пептида в течение 15 минут при различных температурах. Обработка в течение 15 минут при 75°C не влияла на активность двух фракций RumC "in vivo" (фракции "двойной пик" и "единичный пик"). Однако при 100°C пептид полностью инактивировался в течение 15 минут.

Полностью эти тесты осуществляли с использованием образцов RumC, очищенных из культурального супернатанта штамма 9-17. Время инкубации при различных температурах составляло 5 минут. Время инкубации при 100°C составляло 15 минут.

Первая тестируемая температура составляла 80°C. Первый тест проводили с активной фракцией СМ, представляющей собой предварительно очищенную фракцию, содержащую три пептида.

В отличие от фракций "двойной пик" и "единичный пик" активная фракция СМ выдерживает обработку в течение 15 минут при 100°C.

Затем тестировали фракцию GF 47-50. Эта чистая фракция, содержащая только пептид 4235 Да, чувствительна к обработке в течение 15 минут при 100°C. Она также чувствительна к обработке в течение 5 минут при 90°C (Таблица 7).

Таблица 7 Сводная таблица тестов устойчивости к температуре Условия инкубации "in vivo" RumC "in vitro" RumC Температура Время Двойной пик Единичный пик Активная фракция CM GF 47-50 50°C 15 мин У У / / 75°C 15 мин У У / / 80°C 5 мин / / У / 85°C 5 мин / / У / 90°C 5 мин / / У ч 95°C 5 мин / / У / 100°C 15 мин ч ч У ч У = устойчивый; ч = чувствительный; / = не тестировали

4.4. Устойчивость к pH.

Устойчивость к pH пептидов, представленных в активной фракции СМ, также тестировали при pH 2, pH 4,4 и pH 7,

Обнаруженная при pH 2 активность сравнима с активностью, обнаруженной при pH 7. После инкубации в течение 24 часов при 4°C при pH 2 не обнаружили никакой утраты активности.

Таким образом, пептиды по настоящему изобретению устойчивы к кислому pH и особенно подходят для применения в кормлении животных или в области лекарственных средств.

Изобретение раскрывает пептиды RumC1, RumC2 и RumC3, обладающие антимикробной активностью, в частности, в отношении Clostridium perfringens, имеющие молекулярную массу от 4000 до 4600 Да и выделенные из мутантного штамма Ruminococcus gnavus, депонированного под номером CNCM I-3705. В изобретении описаны полинуклеотиды, кодирующие указанные пептиды, экспрессионная кассета, включающая промотор, указанный полинуклеотид и терминаторную последовательность, а также клонирующий и экспрессионный вектора на основе полинуклеотида. Описан организм-хозяин, экспрессирующий указанные пептиды, композиция, обладающая антимикробной активностью в отношении Clostridium perfringens и содержащая пептид, организм-хозяин или штамм CNCM 1-3705, и корм для животных, представляющий пищевое основание и композицию. Использование изобретения позволит изготавливать лекарственное средство для профилактики и лечения заболеваний, в частности некротического энтерита у свиней или домашней птицы, и желудочно-кишечных заболеваний у человека. 10 н. и 6 з.п. ф-лы, 9 ил., 7 табл.

1. Пептид, обладающий антимикробной активностью в отношении Clostridium perfiingens, включающий пептид, выбранный из следующих пептидов:
- пептид, имеющий последовательность SEQ ID No.1,
- пептид, включающий пептид, обладающий, по меньшей мере, 80% идентичностью с полипептидом SEQ ID No.1,
- пептид, имеющий последовательность SEQ ID No.2,
- пептид, включающий пептид, обладающий, по меньшей мере, 80% идентичностью с полипептидом SEQ ID No.2.

2. Пептид по п.1, дополнительно включающий пептид, имеющий последовательность SEQ ID No.3.

3. Пептид по п.1, включающий пептид, выбранный из пептидов, имеющих последовательность SEQ ID No.4, 5 или 6.

4. Пептид по любому из пп.1-3, имеющий молекулярную массу от 4000 до 4600 Да, определяемую при помощи масс-спектрометрии.

5. Пептид по п.1, выделенный из мутантного штамма Ruminococcus gnavus.

6. Пептид по п.5, выделенный из штамма Ruminococcus gnavus, депонированного в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) под номером CNCM 1-3705.

7. Полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из пп.1-6, включающий полинуклеотид, выбранный из:
- полинуклеотида, соответствующего любой из последовательностей SEQ ID No.7, 8 или 9,
- полинуклеотида, который гибридизуется с полинуклеотидом, соответствующим любой из последовательностей SEQ ID No.7, 8 или 9.

8. Экспрессионная кассета, включающая в направлении транскрипции:
- промотор, который является функциональным в организме хозяина,
- полинуклеотид по п.7 и
- терминаторную последовательность, которая является функциональной в том же самом организме хозяина.

9. Клонирующий вектор, включающий полинуклеотид по п.7 или экспрессионную кассету по п.8.

10. Экспрессионный вектор, включающий полинуклеотид по п.7 или экспрессионную кассету по п.8.

11. Организм-хозяин для экспрессии пептида по п.1, трансформированный полинуклеотидом по п.7, экспрессионной кассетой по п.8 или вектором по п.9 или 10.

12. Штамм Ruminococcus gnavus, депонированный в CNCM (Collection Nationale de Cultures de MIcroorganismes) под номером CNCM I-3705, продуцирующий пептид по любому из пп.1-6.

13. Композиция, обладающая антимикробной активностью в отношении Clostridium perfringens, содержащая пептид по любому из пп.1-6, организм хозяина по п.11 или штамм по п.12.

14. Композиция по п.13, которая находится в жидкой форме или порошкообразной форме.

15. Корм для животных, отличающийся тем, что он включает пищевое основание для животных и композицию по п.13.

16. Применение пептида по любому из пп.1-6, организма хозяина по п.11 или штамма по п.12 для изготовления лекарственного средства для профилактики или лечения заболеваний, выбранных из некротического энтерита у свиней или домашней птицы и желудочно-кишечных заболеваний у человека, или корма для животных.