СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ КОЖИ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики Т-клеточных злокачественных лимфом кожи (Т-ЗЛК) (до 90% из числа которых представлены грибовидным микозом) и хронических доброкачественных дерматозов (в особенности аллергического и пролиферативного генеза).

Наиболее часто в практике приходится дифференцировать грибовидный микоз (ГМ) и атопический дерматит в его диффузной форме, хроническую экзему и псориаз, иногда клинически мало различимые, что является важной задачей специалиста [1; 2].

Наиболее сложной является такая дифференциальная диагностика на ранних стадиях развития ГМ, когда большинство клинических признаков не позволяют с достоверностью верифицировать ГМ, следовательно, назначить специфическую терапию для предотвращения дальнейшего развития заболевания и возможного летального исхода [3; 4; 5].

Диагностический процесс при ГМ предусматривает ряд логически связанных этапов, сочетающих анализ анамнеза и клинических проявлений заболевания, данных морфологических, иммуногистохимических, иммуноцитохимических, молекулярно-биологических и генетических исследований, фиксирующих наличие злокачественной лимфоидной (клональной) пролиферации в коже.

По мнению многих исследователей, первые этапы диагностики - клинический и морфологический - наиболее доступны и воспроизводимы в практической деятельности специалистов и именно они позволяют заподозрить у больного ГМ или другую форму злокачественной Т-клеточной лимфомы кожи и обосновать целесообразность повторных биопсий кожи и дальнейшее применение высокоинформативных и дорогостоящих лабораторно-инструментальных исследований для окончательной верификации диагноза [6; 7]. В то же время иммуногистохимические исследования (иммунофенотипирование кожи) считаются «золотым стандартом» диагностики ГМ, на что указывают клинические рекомендации европейских стран и России [1; 7; 8; 9]. Однако иммунофенотипирование кожи является приоритетом учреждений онкологического и гематологического профиля, не всегда доступно в практике и имеет высокую стоимость, достигающую 2-3 тыс. рублей за исследование.

При анализе гистологических срезов в светооптическом микроскопе одним из важных диагностических критериев, отличающих доброкачественные хронические дерматозы от ГМ, является описательная характеристика самого лимфоидного инфильтрата в дерме (плотность, расположение); свойства формирующих его лимфоцитов и их ядер: размеры, форма, плотность хроматина и др. [10; 11; 12, 13]. Рутинное гистологическое описание образца кожи подчас носит субъективный характер, зависит от особенностей эксперта, с позиций современной доказательной медицины не убедительно.

Для объективизации оценки патоморфологических проявлений заболевания по гистологическим образцам разработаны системы количественной морфометрии клеток, в том числе компьютеризированной, где квалификация, метрический, численный подход позволяют изучить явление наиболее глубоко, полностью исключая субъективизм исследователя [14].

В целях совершенствования и стандартизации морфометрических методов позднее была использована компьютерная (автоматизированная) морфометрия при помощи анализаторов (Image Analyzer IBAS 2000, Zeiss Kontron, IAS-Munich, Khoral Research, Albuquerque, NM, DANAOS, SSIMP), а также телевизионная морфоденситометрия.

В дифференциальной диагностике заболеваний кожи наиболее близким по существу является способ диагностики Т-клеточных лимфом кожи [15] путем цитологического анализа взятого у больного в качестве биологического материала мазка крови, дальнейшего его фиксирования, рибонуклеазной обработки, окрашивания галлоцианин хромовыми квасцами, микроденситометрии интерфазного хроматина лимфоцитов. На основании полученных параметров (OD₄) оптической плотности эухроматина, FORM_P форм-фактор ядра, IOD₂ интегральной плотности гетерохроматина, FREA площади ядра рассчитывают показатель DF-0,14379.OD4+0,00003.1OD₂+10,4952.FORM_P+0,001.AREP11,1241 и при отрицательном значении этого показателя диагностируют Т-клеточную лимфому кожи.

Данный способ диагностики позволяет проводить исследования лимфоцитов периферической крови с целью выявления отличий в характеристиках интерфазного хроматина, локализующегося в ядрах клеток, а также отдельных параметров самих ядер (площадь ядра, периметр ядра).

Недостатками указанного способа являются:

- концепция исследования лимфоцитов периферической крови для поиска диагностических признаков крайне уязвима, поскольку патологические лимфоциты преимущественно находятся в пораженном органе - в коже, а в периферической крови циркулируют в крайне незначительных количествах, в особенности при ранних стадиях Т-ЗЛК как при эритродермических, так и при классических формах ГМ [15, 16; 17];

- доказательность метода указанной диагностики снижается вследствие того, что неизвестно, какое число клеток для каждого субъекта из категорий больных и здоровых лиц было исследовано для проведения расчета формулы параметра DF с использованием линейного дискриминантного анализа;

- как следствие из предыдущего замечания - неясно, какое количество клеток крови пациента необходимо изучить методикой морфоденситометрии, чтобы реально рассчитать диагностический показатель (DF);

- неясны метрологические характеристики показателя морфоденситометрии и площади ядер, указаны лишь «условные единицы», тогда как площадь ядра должна быть представлена в метрических единицах, что обеспечивает точность и сравнимость измерений.

Задачей изобретения является разработка способа дифференциальной диагностики грибовидного микоза и воспалительных хронических, доброкачественных заболеваний кожи.

Технический результат заключается в повышении достоверности, эффективности, экономичности и воспроизводимости.

Технический результат достигается тем, что в способе дифференциальной диагностики заболеваний кожи диагностики, включающем анализ взятого у больного биологического материала из очага поражения, определение планиметрических характеристик ядер лимфоцитов, их оценку и выставление диагноза на их основании, анализ проводят путем компьютерной морфометрии. В качестве биологического материала используют ядра лимфоцитов дермы в гистологическом срезе кожи, дополнительно определяют удельную плотность ядер лимфоцитов на единицу площади имиджа среза, периметр и усредненный диаметр ядра, фактор формы. При удельной средней плотности ядер лимфоцитов на единицу площади более 0,0141±0,0016 (ДИ 0,01301; 0,01932), средней площади ядер более 13,661±0,0802 (ДИ 12,912; 14,9934), среднем периметре ядер более 15,05±0,089 (ДИ 14,5178; 17,2189), среднем диаметре Фере более 4,59±0,014 (ДИ 4,48790; 4,9745), среднем значении фактора формы менее 0,8452±0,005 (ДИ 0,8311; 0,8423) диагностируют грибовидный микоз, а при отсутствии у диагностируемого больного указанных векторов изменений параметров и присутствии статистически значимых различий <0,05 по сравнению с цифровыми значениями параметров грибовидного микоза диагностируют хронический доброкачественный дерматоз.

Сущность изобретения состоит в автоматизированной компьютерной морфометрии ядер лимфоцитов дермы в гистологическом срезе кожи больного, подозрительного на наличие ГМ, последующем сравнении полученных данных с обучающей выборкой. При совпадении вектора изменений показателей и отсутствии статистически значимых отличий от параметров, определенных для ГМ в обучающей выборке, делается вывод о наличии у больного ГМ и, следовательно, отсутствии у пациента хронического доброкачественного дерматоза (ХДД).

Использование в качестве биологического материала ядер лимфоцитов дермы в гистологическом срезе кожи позволяет устанавливать диагноз ГМ или отвергать его при изучении пораженной ткани - кожи, что делает способ патогенетически ориентированным и высокодостоверным.

Дополнительное определение удельной плотности ядер лимфоцитов на единицу площади имиджа среза, периметра и усредненного диаметра ядра, а также фактора формы позволяет с высокой точностью устанавливать диагноз ГМ или отвергать его на основании компьютеризированной автоматической морфометрии ядер дермальных лимфоцитов, проводимой при анализе гистологических препаратов кожи, без дополнительных эксцизий кожи (повторных биопсий), без дополнительных заборов крови из вены и пальца, в течение короткого периода времени, поскольку видеокомпьютерный комплекс и программа SIAMS-Photolab снабжены автоматизированными опциями оценки указанных параметров ядер и генерацией отчетов, в том числе со статистической обработкой по установлению достоверности различий, общее время исследования - до 1 часа.

Числовые значения планиметрических характеристик ядер лимфоцитов дермы установлены экспериментально и обеспечивают высокую достоверность, эффективность, экономичность и воспроизводимость заявляемого решения.

Из анализа научно-технической и патентной литературы заявляемой совокупности признаков, на основании дифференциальной диагностики ГМ с использованием компьютеризированной морфометрической оценки параметров ядер дермальных лимфоцитов (морфометрических показателей (УПЯ, S, Р, DF, Ff)) в образце кожи, взятом непосредственно из очага поражения, позволяющих дифференцировать лимфоциты в коже у больных ХДД и ГМ, нами не выявлено, что позволяет сделать выводы о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение осуществляется следующим образом.

Этапность разработки способа дифференциальной диагностики

Использован аппаратный видеокомпьютерный комплекс, состоящий из светооптического микроскопа Leuka, снабженного системой видеоввода изображений, персонального компьютера, оснащенного компьютерной программой SIAMS-Photolab (Программное решение «Анализатор фрагментов микроструктуры твердых тел». Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ №2007614623 от 2 ноября 2007 г.; Свидетельство об утверждении типа средства измерений RU.C.31.005.A №36493 от 10.10.2009 г.).

Указанной методикой компьютеризированной морфометрии исследовано 46 гистологических образцов кожи, в том числе 5 от здоровых лиц (проанализировано 595 клеток), 15 от больных ХДД (1972 клетки), 26 образцов кожи больных ГМ (2687 клеток).

Изучены удельная плотность частиц (ядер лимфоцитов) на единицу измерения (мкм²), геометрические характеристики размера, формы ядер; проведена интегральная оценка полученных характеристик, вычислены М±m и доверительные интервалы (ДИ), и по средним величинам проведенных измерений в образце и группах исследованных больных. Метрологическое обеспечение процедуры измерений заключается в калибровке масштаба системы: съемка горизонтально и вертикально расположенного объект-микрометра и установка действительной величины одного пикселя в микронах, при расхождении в измерении действительного участка линейки размером 100 мкм <0,5 мкм.

Автоматизированно определялись:

- удельная плотность ядер лимфоцитов на 1 мкм² (УПЯ),

- площадь ядер в мкм² (S),

- периметр ядер в мкм (P),

- стандартный фактор формы (Ff) - отношение периметра, эквивалентного по площади круга, к периметру частицы,

- средний диаметр Фере (DF) - усредненный диаметр частицы, не имеющей формы круга.

Установлены параметры указанных показателей для кожи здоровых лиц, выделены векторные направления изменений параметров у больных с ХДД и ГМ в сравнении со здоровыми лицами и между собой, показано, что наиболее значимые различия между исследованными группами образцов существуют в следующих параметрах, представленных в таблицах 1 и 2.

Таблица 1 Достоверные различия морфометрических показателей и векторная направленность отклонений в клинических параллелях у больных ГМ и ХДД Параллели УПЯ S P DF Ff Здоровые и ХДД +↑ +↓ +↑ +↑ +↓ ХДД и ГМ +↑ +↑ +↑ +↑ +↓ ↑↓ - векторная направленность отклонений при сравнении между группами + - наличие статистически достоверных различий показателей

Таблица 2 Данные морфометрических исследований ядер дермальных лимфоцитов у здоровых лиц, больных с ХДД и ГМ (М±m; ДИ) Показатель Здоровые Больные ХДД Больные ГМ Удельная плотность ядер (УПЯ) 0,0045±0,003 0,0120±0,005* 0,0141±0,0016**,*** (0,0026; 0,0049) (0,009; 0,007) (0,01301; 0,01932) Площадь (S) 13,1900±0,011 11,6889±0,0582* 13,661±0,0802*** (12,278; 13,0011) (9,879; 12,3455) (12,912; 14,9934) Периметр (Р) 12,870±0,09 13,833±0,074* 15,05±0,089**,*** (11,321; 12,978) (12,278; 14,1712) (14,5178; 17,2189) Средний диаметр Фере (DF) 4,4120±0,0230 4,5254±0,0177* 4,59±0,014**,*** (3,9790; 4,5738) (4,0322; 4,6583) (4,48790; 4,9745) Фактор формы (Ff) 0,8780±0,0050 0,8699±0,0063* 0,8452±0,005**,*** (0,8600; 0,8837) (0,8455; 0,8707) (0,8311; 0,8423) * - достоверность различий между показателями у здоровых и больных с ХДД (р<0,05) ** - достоверность различий между показателями у здоровых и больных ГМ (р<0,05) *** - достоверность различий между показателями у больных ХДД и ГМ (р<0,05).

Таким образом, анализ обучающей выборки показал наличие достоверно отличительных морфометрических показателей (УПЯ, S, Р, DF, Ff), позволяющих дифференцировать лимфоциты в коже у больных ХДД и ГМ, что послужило обоснованием применить данное морфометрическое исследование в качестве диагностического.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Проводится эксцизионная биопсия кожи на участке с выраженными клиническими проявлениями дерматоза.

2. По стандартной методике изготовляются парафинированные блоки и стекла со срезами кожи, окрашенные гематоксилин-эозином.

3. Проводится автоматизированная компьютеризированная морфометрия ядер лимфоцитов с исчислением средних значений показателей УПЯ, площади ядер (S), периметра ядер (Р), диаметра Фере (DF), фактора формы (Ff) на участке среза на уровне дермы, где обнаруживаются максимальные скопления лимфоцитов: не менее 5 полей, не менее 100 клеток; производится интегрированная оценка полученных показателей с исчислением M±m; ДИ.

4. Проводится сравнение исследованных у конкретного больного показателей с данными обучающей выборки (табл.2).

5. Анализируется векторная направленность изменений параметров исследуемого образца и статистическая оценка различий с данными обучающей выборки. На основании полученных данных делается заключение о наличии у больного ХДД или ГМ.

Стекла с образцами кожи подвергают компьютеризированной морфометрии ядер дермальных лимфоцитов с подсчетом УПЯ, площади, периметра ядер, среднего диаметра Фере, фактора формы (от 100 до 150 ядер в каждом образце), вычислены для каждого образца М±m; ДИ. Из числа обследованных больных у 11 пациентов был диагностирован ГМ, у 4 пациентов - ХДД (в т.ч. атопический дерматит, взрослая фаза, диффузная форма - 3 больных; хроническая экзема - 1 больной).

Образцы кожи от пациентов с установленным в процессе диагнозом ГМ или ХДД в дальнейшем были исследованы методом иммунофенотипирования с использованием панели специфических моноклональных антител и диагноз ГМ или ХДД был окончательно верифицирован (100% совпадение с «золотым стандартом»).

Изобретение иллюстрируется следующими конкретными примерами.

Больная К.М.М., 59 лет, поступила в клинику Института для уточнения диагноза. Больна в течение 5 лет, когда появились зудящие пятна на коже верхних конечностей и на коже живота. Высыпания полностью регрессировали после применения топических глюкокортикостероидных (ГКС) гормонов сильного действия (адвантан, акридерм). Однако появлялись свежие высыпания после инсоляции и/или после контакта с предметами бытовой химии. В течение последних 2 лет зудящие пятна появились также на коже лица, боковых поверхностей туловища. Лечение топическими ГКС приводило к уменьшению зуда, однако регресса высыпаний не было. В анамнезе: аллергические реакции на цитрусовые, пыльцу растений в форме ринита. Из семейного анамнеза выявлено наличие аллергического дерматита (диагноз установлен клинически) у дочери.

Объективный статус: при общем осмотре патологических отклонений по системам и органам не выявлено.

Локальный статус: процесс носит распространенный характер: в области предплечий на сгибательных и разгибательных поверхностях, на коже живота, боковых поверхностей туловища, а также на коже лба и в зоне пограничной с волосистой частью головы мономорфные слегка элевирующие пятна и тонкие бляшки с неправильными очертаниями размерами до 8,5×12 см, застойного розово-красного цвета с четкими границами, мелкопластинчатым шелушением на поверхности. Дермографизм скорый, белый.

Учитывая указания на аллергические реакции у пациентки и аллергический дерматит у дочери больной, характер клинических проявлений и белый дермографизм, дифференциальная диагностика проводилась между диагнозами: атопический дерматит, взрослая фаза и грибовидный микоз на ранней стадии развития. Данные общеклинического обследования патологических изменений не выявили. Проведенное гистологическое исследование кожи установило интактный эпидермис, наличие умеренно выраженного лимфоцитарного инфильтрата вокруг посткапиллярных венул и в собственно дерме. Признаки эпидермотропизма - минимальные. Эксперт-патоморфолог не установил всех необходимых признаков атопического дерматита, а также не исключил возможности наличия ранних проявлений ГМ.

Гистологические препараты кожи больного нами были подвергнуты компьютеризированной морфометрии с использованием компьютерной программы SIAMS-Photolab, установленные показатели:

Средняя УПЯ - 0,01534±0,004

Средняя площадь ядер (S) - 15,152±0,06

Средний периметр ядер (Р) - 16,033±0,080

Средний диаметр Фере (DF) - 5,215±0,07

Средний фактор формы (Ff) - 0,8281±0,006

При сравнении с обучающей выборкой все показатели у данной пациентки имели векторную направленность и числовые параметры, характерные для ГМ. Таким образом, больной К.М.М. был выставлен предварительный диагноз ГМ Ib стадии, в последующем проведенное иммунофенотипирование образца кожи подтвердило установленный нами диагноз.

Больная К.Н.М., 45 лет, поступила в клинику Института для уточнения диагноза. Больна в течение 5 лет, когда впервые стала отмечать появление отечных зудящих пятен на коже лица, верхних конечностей, кистей, на коже в области голеностопных суставов, выраженное уплотнение и шелушение кожи стоп. Лечение у дерматолога с диагнозом хроническая экзема и использованием антигистаминных препаратов, топических ГКС давало лишь кратковременный эффект. В последний год к специалистам не обращалась, самостоятельно использовала общее УФО (солярий), в больших количествах наружно применяла средства китайской медицины, после чего заметила появление выраженной сухости кожи. Из анамнеза жизни выявлено наличие высыпаний, сопровождавшихся зудом на коже щек и предплечий в возрасте до 1 года, разрешившихся без специальной терапии. Пациентка работает в условиях вредного производства, постоянно контактирует с продуктами переработки нефти.

При общем осмотре патологических отклонений по системам и органам не выявлено.

Локальный статус: процесс носит распространенный характер, в области щек, лба и на шее отечные и слабоинфильтрированные плоские бляшки овальной формы, застойно-красного цвета, следы расчесов. На коже ладоней и подошв выраженный гиперкератоз, местами с небольшими трещинами, крупнопластинчатое шелушение. Дермографизм скорый, белый.

Учитывая указания на зудящие высыпания в детском возрасте (атопический дерматит детская фаза?) и белый дермографизм, клинически нельзя было исключить наличие у больной взрослой фазы АД. В то же время неэффективность предшествующей терапии, длительное периодическое воздействие УФО и наружных препаратов неизвестного состава, а также перманентное воздействие облигатных канцерогенов позволили заподозрить у пациентки дебют ГМ.

Данные общеклинического обследования патологических изменений не выявили. Проведенное гистологическое исследование кожи установило наличие слабовыраженного очагового спонгиоза и акантоза в эпидермисе, наличие умеренно выраженного периваскулярного лимфоцитарного инфильтрата с примесью эозинофилов, на отдельных участках имелся экзоцитоз лимфоцитов. Эксперт-патоморфолог не исключил возможности наличия ранних проявлений ГМ.

Гистологические препараты кожи больного нами были подвергнуты компьютеризированной морфометрии с использованием компьютерной программы SIAMS-Photolab, вычисленные показатели:

Средняя УПЯ - 0,0077±0,005

Средняя площадь ядер (S) - 10,894±0,07

Средний периметр ядер (Р) - 13,18±0,05

Средний диаметр Фере (DF) - 4,34±0,03

Средний фактор формы (Ff) - 0,882±0,004

При сравнении с обучающей выборкой все показатели у данной пациентки имели векторную направленность и числовые параметры, характерные для ХДД. Таким образом, больной был выставлен диагноз АД, взрослая фаза. Проведенная терапия системными ГКС, десенсибилизирующими и антигистаминными препаратами, рациональная дифференцированная наружная терапия топическими ГКС, а также перманентный оптимизированный уход за кожей позволили добиться полного разрешения высыпаний. В последующем, с изменением условий профессиональной деятельности на более благоприятные, длительность клинической ремиссии составила более 2 лет.

Таким образом, заявляемый способ позволяет устанавливать диагноз ГМ или отвергать его при изучении пораженной ткани кожи с высокой достоверностью. Предлагаемый способ эффективен, экономичен и легко воспроизводим, т.к. имеет медико-экономическую эффективность, поскольку уменьшает потребность медицинского учреждения (пациента) в иммуногистохимических, иммуноцитохимических, молекулярно-биологических и других дорогостоящих методах исследования.

Использованная литература:

Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики заболеваний кожи. Сущность способа заключается в том, что путем компьютерной морфометрии ядер лимфоцитов дермы в гистологическом срезе кожи из очага поражения проводят определение планиметрических характеристик ядер лимфоцитов. Дополнительно определяют удельную плотность ядер лимфоцитов на единицу площади имиджа среза, периметр и усредненный диаметр ядра, фактор формы. При удельной средней плотности ядер лимфоцитов на единицу площади более 0,0141±0,0016 (ДИ 0,01301; 0,01932), средней площади ядер более 13,661±0,0802 (ДИ 12,912; 14,9934), среднем периметре ядер более 15,05±0,089 (ДИ 14,5178; 17,2189), среднем диаметре Фере более 4,59±0,014 (ДИ 4,48790; 4,9745), среднем значении фактора формы менее 0,8452±0,005 (ДИ 0,8311; 0,8423) диагностируют грибовидный микоз (ГМ), а при отсутствии у диагностируемого больного указанных векторов изменений параметров диагностируют хронический доброкачественный дерматоз (ХДД). Изобретение позволяет устанавливать диагноз ГМ или ХДД или отвергать его при изучении пораженной ткани кожи с высокой достоверностью. Предлагаемый способ эффективен, экономичен и легко воспроизводим, т.к. имеет медико-экономическую эффективность, поскольку уменьшает потребность медицинского учреждения (пациента) в иммуногистохимических, иммуноцитохимических, молекулярно-биологических и других дорогостоящих методах исследования. 2 табл.

Способ дифференциальной диагностики заболеваний кожи, включающий анализ взятого у больного биологического материала из очага поражения, определение планиметрических характеристик ядер лимфоцитов, их оценку и выставление диагноза на их основании, отличающийся тем, что анализ проводят путем автоматизированной компьютерной морфометрии ядер лимфоцитов на участке среза на уровне дермы, где обнаруживаются максимальные скопления лимфоцитов: не менее 5 полей, не менее 100 клеток, дополнительно определяют удельную плотность ядер лимфоцитов на единицу площади имиджа среза, периметр и усредненный диаметр ядра, фактор формы, и при удельной средней плотности ядер лимфоцитов на единицу площади более 0,0141±0,0016 (ДИ 0,01301; 0,01932), средней площади ядер более 13,661±0,0802 (ДИ 12,912; 14,9934), среднего периметра ядер более 15,05±0,089 (ДИ 14,5178; 17,2189), среднего диаметра Фере более 4,59±0,014 (ДИ 4,48790; 4,9745), среднего значения фактора формы менее 0,8452±0,005 (ДИ 0,8311; 0,8423) диагностируют грибовидный микоз, а при отсутствии у диагностируемого больного указанных векторов изменений параметров и присутствии статистически значимых различий менее 0,05 по сравнению с цифровыми значениями параметров грибовидного микоза диагностируют хронический доброкачественный дерматоз.