СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ Т-КЛЕТОЧНЫХ ЛИМФОМ КОЖИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно, к дерматологии и гематологии, предназначено для ранней диагностики и дифференциальной диагностики T-клеточных лимфом кожи.

Наиболее часто приходится дифференцировать эритродермические варианты T-клеточных лимфом кожи и эритродермии, возникающие при доброкачественных воспалительных дерматозах (экземе, псориазе, нейродермите и др.). Кроме того, до настоящего времени не дана оценка изменений в лимфоцитах у больных с эритродермическими состояниями, которые определяются как предлимфомные: эксфолиативный дерматит Вильсона-Брока и красный отрубевидный лишай Гебры. В клинической практике нередко приходится решать вопрос о злокачественной трансформации в лимфому хронических воспалительных дерматозов.

Существующие методы диагностики T-клеточных лимфом кожи не могут полностью удовлетворить клиницистов, так как позволяют установить диагноз только при наличии выраженной клинической картины, трудоемки в исполнении (иммунологические, цитохимические, цитогенетические и др.) и достоверно не отражают изменения в популяции лимфоцитов, характеризующие злокачественность процесса.

Одним из наиболее известных диагностических методов является обнаружение атипичных форм лимфоцитов у больных эритродермиями при злокачественных T-клеточных лимфомах. К этим эритродермиям относят эритродермическую форму грибовидного микоза и синдром Сезари, который в настоящее время рассматривается как лейкемический вариант эритродермической формы грибовидного микоза.

Ранее предпринимались попытки описания атипичных Т-лимфоцитов (клеток Сезари) у больных эритродермиями. Однако, каждый из ниже перечисленных методов имеет свои недостатки.

Гистологическая картина эритродермических состояний далеко не всегда отражает нозологическую специфичность процесса, ввиду выраженного воспалительного компонента биопсийного материала. Нередко для постановки диагноза требуется несколько биопсий, что травматично для больного.

Световая микроскопия позволяет обнаруживать атипичные лимфоциты в периферической крови лишь в запущенных стадиях заболевания, кроме того, так как анализ проводится визуально, то результатом является качественное описание морфологии, что не позволяет объективизировать и количественно оценить полученные результаты [1].

Электронно-микроскопические исследования позволяют получить общие представления о распределении хроматина в лимфоцитах, но методика не позволяет оценить функциональное состояние генома, достаточно трудоемка, особенно в подготовке материала для исследования [2],
Сканирующая электронная микроскопия не может применяться в диагностике эритрoдермий, поскольку не позволяет получить информацию об изменениях ядер лимфоцитов, специфичных для диагностики [3].

Цитохимические исследования не дают четкой разницы в содержании ферментов в реактивных Т-лимфоцитах при доброкачественных воспалительных дерматозах и злокачественных T-лимфомах, т.е. нет специфических цитохимических маркеров клеток Сезари [4].

Цитофотометрия лимфоцитов отражает их пролиферативную активность на основании определения клеток, включающих тимидин только в S-фазу и не отражает качественное перераспределение хроматина в каждой клетке [5].

Цитогенетические исследования не имеют строгой специфичности и не всегда выявляют патологические изменения даже при далеко зашедших процессах [6].

Морфометрия лимфоцитов показывает, что степень изрезанности ядра, определенная по соотношению окружности ядра, составляет индекс ядерного контура, который был наибольшим у клеток Сезари и наименьшим у лимфоцитов больных хроническим лимфолейкозом. Но применение только метода классической морфометрии не позволяет оценить тонкую структуру надмолекулярной организации хроматина в ядре [7].

Иммуно-фенотипическая характеристика с применением моноклональных антител, выявляющих специфические опухолевые маркеры на мембранах лимфоцитов, является наиболее информативной для диагностики проявлений T-клеточных лимфом и дифференциальной диагностики их с доброкачественными воспалительными заболеваниями кожи. Однако, данная методика требует наличие дорогостоящих реактивов, позволяет диагностировать T-клеточные лимфомы на более поздних стадиях заболевания, когда выражены инфильтрация кожи и лимфоаденопатия, чем метод, предлагаемый в данной заявке, а также имеются сложности в подготовке материала для исследования, т.к. кровь берется из вены, что более травматично для больного с поражением кожи [8].

Этот метод можно рассматривать в качестве прототипа, поскольку он является наиболее информативным для диагностики T-клеточных лимфом и дифференциальной диагностики их с доброкачественными воспалительными заболеваниями кожи.

Постановка реакции осуществляется в 3 этапа.

I. Выделение и подготовка лимфоцитов для постановки реакции.

Забор крови из локтевой вены и выделение лимфоцитов по обычному способу на градиенте плотности феко-верографина центрифугированием. Подсчет клеток осуществляется в камере Горяева.

II. Подготовка и проведение реакции непрямой иммунофлюоресценции.

На чистые обезжиренные стекла наносят лунки из парафильма, по 4 на каждого больного. В каждую лунку наносят поли-L-лизин для фиксации клеток. Препарат инкубируют в термостате 40 мин при 37^oC. Постановка реакции состоит из последовательных инкубаций. Сначала - с суспензией клеток, затем препараты отмывают и в лунки наносятся моноклональные антитела. После промывания для удаления антител, препараты инкубируют с антисывороткой против Ig G мыши, леченой флюоресцеином изотиоцианатом. Затем после отмывания препараты заливают глицерином, смешанным с физиологическим раствором (1 : 1) и накрывают покровными стеклами.

III. Подсчет субпопуляций Т-лимфоцитов в люминесцентном микроскопе, оснащенном фазово-контрастным устройством.

Определяют отношение клеток, имеющих кольцевое свечение, к общему количеству клеток, подсчитанному в фазово-контрастном устройстве, выраженное в процентах, что отражает содержание определенных фенотипических популяций и позволяет отнести исследуемый материал к определенной нозологической форме (T-лимфопролиферирующий процесс). Диффузно-окрашенные (погибшие) клетки не учитываются.

Целью настоящего изобретения является разработка способа более ранней диагностики и дифференциальной диагностики T-клеточных лимфом кожи (эритродермических вариантов) и снижение травматизации больного.

Способ осуществляется следующим образом.

Готовят мазок периферической крови, взятой из пальца руки, фиксируют (например, смесью Никифорова: этанол и эфир в соотношении 1 : 1) в течение 15 - 20 мин, высушивают на воздухе. Проводят рибонуклеазную обработку, рибонуклеаза (Reanal, BHP) разводится в осмолярном растворе сахарозы в концентрации 200 ME/100 мл. Обработка длится 50 - 60 мин при температуре 37^oC, после чего мазок промывают в 3-х сменах дистиллированной воды. Окраску производят в растворе галлоцианин-хромовых квасцов (ГХК), приготовленном по стандартной методике [9] в течение 3 - 4 ч при 37^oC. Препарат промывают 4 - 5 мин отстоявшейся водопроводной водой.

После окраски препарат накрывают покровным стеклом и проводится микроденситометрическое исследование на системе анализа изображений. Результатом микроденситометрии являются оптические, топологические и геометрические характеристики интерфазного хроматина по компонентам (эухроматин и гетерохроматин) и ядра в целом.

Предварительно на обучающих выборках были установлены наиболее информативные для данной патологии показатели структуры интерфазного хроматина:
OD4 - оптическая плотность эухроматина;
FORM_P - форм-фактор ядра;
IOD2 - интегральная оптическая плотность гетерохроматина;
AREA - площадь ядра.

Для комплексной оценки этих показателей рассчитывается параметр: DF = -0,14379•OD4 + 0,00003•IOD2 + 10,4952•FORM_P + 0,0001•AREA - 11,1241.

Формула для расчета параметра DF получена применением линейного дискриминантного анализа [10] при помощи стандартного пакета статистических программ. При отрицательном значении показателя DF диагностируют T-клеточную лимфому кожи.

Подобную связь между численными значениями установили при обследовании групп больных, находящихся на лечении в кожной клинике МОНИКИ по поводу T-клеточной лимфомой кожи (11 человек) и доброкачественных воспалительных дерматозов (псориаз и нейродермит - 10 человек). В результате проведенного анализа выявили наиболее значимые показатели структуры интерфазного хроматина лимфоцитов периферической крови, рассчитали производный параметр DF для выявления T-клеточной лимфомы кожи.

Пример 1. Больной Б,, 63 лет, N истории болезни - 7646, МОНИКИ.

Поступил в клинику с жалобами на покраснение кожи, зуд, жжение, озноб.

Клинический диагноз: T-клеточная лимфома кожи, эритродермическая стадия.

Во время лечения в клинике предлагаемым в данной заявке способом был исследован хроматин интерфазных ядер лимфоцитов периферической крови больного, при этом использовалась стандартная методика приготовления мазка цельной крови, взятой из пальца руки. Полученный мазок высушивали на воздухе, фиксировали смесью Никифорова. Далее для устранения влияния рибонуклеиновой кислоты на результаты сканирования проводили рибонуклеазную обработку. Рибонуклеазу разводили в осмолярном растворе сахарозы в концентрации 2000 E на 100 мл раствора. Препараты обрабатывали в этом растворе в течение 1 ч при 37^oC, после чего их промывали в 3-х сменах дистиллированной воды. Далее проводили окрашивание препаратов в растворе ГХК. Раствор ГХК готовится по стандартной методике [9]. Окрашивание проводится в течение 3 ч в термостате при 37^oC, после чего препараты промывали 5 мин отстоявшейся водопроводной водой.

Окрашенные препараты заключали в канадский бальзам и после высушивания исследовали на системе анализа изображений.

Показатели структуры хроматина для обследованного больного:
OD4 - 3,02207; FORM_P - 0,82145; IOD2 - 39080,8; AREA - 7938,7.

Далее для комплексной оценки был рассчитан показатель DF = -0,9710674,
Значение показателя DF < 0; следовательно, у больного выявлены изменения структуры интерфазного хроматина соответствующие T-клеточной лимфоме кожи, что полностью совпадает с данными клинических и лабораторных исследований.

Пример 2. Больной В., 40 лет, N истории болезни 14762, МОНИКИ.

Поступил в кожную клинику МОНИКИ с жалобами на покраснение кожи, больше на нижних конечностях, зуд.

Клинический диагноз: Нейродермит.

С помощью предложенного способа исследуется структура хроматина лимфоцитов периферической крови больного (см. пример 1.).

Показатели структуры хроматина для обследованного больного:
OD4 - 4,48286; FORM_P - 0,938331; IOD2 - 74411,4; AREA - 13686.

Далее для комплексной оценки был рассчитан показатель DF = 1,6802235.

Значение показателя DF > 0, следовательно, выявленные изменения структуры хроматина соответствуют изменениям при доброкачественных воспалительных дерматозах.

Пример 3. Больной Г., 56 лет, N истории болезни - 1497; МОНИКИ.

Поступил в клинику с жалобами на покраснение кожи, озноб.

Клинический диагноз: псориаз.

С помощью предложенного способа исследуется структура хроматина лимфоцитов периферической крови больного (см. пример 1.).

Показатели структуры хроматина для обследованного больного:
OD4 - 3,26156; FORM_P - 0,933456; IOD2 - 79238,4; AREA - 14092,6.

Далее для комплексной оценки был рассчитан показатель DF = 1,9901397.

Значение показателя DF > 0, следовательно, выявленные изменения структуры хроматина соответствуют изменениям при доброкачественных воспалительных дерматозах.

Пример 4. Больная Д., 48 лет, N истории болезни - 16105, МОНИКИ.

Поступила в клинику с жалобами на изменение цвета кожи (покраснение), зуд, озноб, жжение, покалывание. Больна с детства, отмечает сезонные рецидивы каждую весну и осень, последние 3 года без ремиссии. Ранее лечилась антигистаминными препаратами по поводу атонического дерматита.

Клинический диагноз на момент поступления: T-клеточная лимфома кожи.

Клинические данные при поступлении: кожные покровы застойно-синюшного цвета, 100% эритродермия, выраженная инфильтрация, увеличены все группы периферических лимфоузлов, особенно бедренные и паховые (до 4 - 5 см).

С помощью предложенного способа исследуется структура хроматина лимфоцитов периферической крови больной (см. пример 1.).

Показатели структуры хроматина для обследованной больной:
OD4 - 4,78724; FORM_P - 0,944441; IOD2 - 66646,9; AREA - 11071,9.

Далее для комплексной оценки был рассчитан показатель DF = 1,206237183.

Значение показателя DF > 0, следовательно, выявленные изменения структуры хроматина соответствуют изменениям при доброкачественных воспалительных дерматозах.

При обследовании в клинике в мазках периферической крови у больной обнаружены единичные клетки Сезари (бласты, подобные крупноклеточному варианту), но по заключению биопсийного исследования - нейродермит (типичный).

На фоне лечения тавегилом, активированным углем, гемодезом, клеритином у больной отмечено улучшение самочувствия, уменьшение эритемы и инфильтрации кожи.

Таким образом, проведенные клинические обследования больной и эффективность терапии подтвердили наличие у больной доброкачественного воспалительного дерматоза (нейродермита).

Пример 5. Больная П., 80 лет, N истории болезни - 9743, МОНИКИ.

Поступила в клинику с жалобами на зуд, покраснение кожи, озноб, покалывание, жжение. Больна с 1970 года, ранее лечилась преднизолоном по поводу аллергического дерматита.

За 4 мес до настоящего поступления в клинику больная обследовалась в кожной клинике МОНИКИ с предполагаемым диагнозом: эксфолиативный дерматит Вильсона-Брока.

Результат гистологического исследования кожного биоптата: изменения более соответствуют генерализованной эритродерме.

Клинический диагноз на момент поступления: аллергический дерматит.

Клинические данные при поступлении: кожные покровы ярко красного цвета; выраженная инфильтрация, 100% эритродермия, поредение волос, выраженный гиперкератоз на ладонях и подошвах, умеренно увеличены подмышечные, паховые и бедренные лимфоузлы.

С помощью предложенного способа исследуется структура хроматина лимфоцитов периферической крови больной (см. пример 1.).

Показатели структуры хроматина для обследованной больной:
OD4 - 4,10798; FORM_P - 0,820714; IOD2 - 42548,7; AREA - 8391,45.

Далее для комплексной оценки был рассчитан показатель DF = -0,9856234.

Значение показателя DF < 0; следовательно, выявленные изменения структуры хроматина соответствуют изменениям при T-клеточной лимфоме кожи.

При обследовании в клинике выявлены изменения в периферической крови (лимфоцитов - 72%, клетки Сезари - 15%); при биопсии подтвержден диагноз T-клеточной лимфомы: cиндром Сезари, диффузный инфильтрат с полиморфизмом, микроабсцессы, в инфильтрате крупные многоядерные клетки.

Совпадение результатов проведенных тестов с помощью предложенного способа и клинической картины заболевания говорит о специфичности способа диагностики T-клеточных лимфом кожи (эритродермических вариантов).

Таким образом, по сравнению с прототипом предложенный способ ранней диагностики и дифференциальной диагностики T-клеточных лимфом кожи позволяет:
а) выявлять злокачественные формы лимфоцитов на более ранних стадиях, когда еще не обнаруживаются клетки Сезари и устанавливать диагноз до развития выраженных клинических проявлений;
б) проводить дифференциальную диагностику эритродермических состояний при T-клеточных лимфомах кожи и доброкачественных воспалительных дерматозах;
в) снизить травматизацию больного с заболеванием кожи, так как кровь для исследования берется не из вены, а из пальца.

Литература
1. Orbaneja J.G., Vus E.S, Diar-Flores L., Huarte P.S., Cytology of the micosis fungoides and Sezary syndrome. - Brit. J. Derm. 1972, 87, 2, 96 - 105.

2. Персина И. С. Клиническая морфология злокачественных лимфом кожи. - Автореф. дисс, докт. мед. наук.: - М. 1989.

3. Polliak A., Dialdettim, Reyes F. Surface Features of Sezary cells: a scanning Electron microscopy Study of 5 cases. - Scand, J, Haemat, 1977, 18, 3, 207 - 213.

4. Lennert К. S., Raiserbing E. Cytological and functional criteria for the classication of malignant lymphomata. - Br. J. Cancer 1975, 31, Suppl II, 29 - 49.

5. Vloten W. A. , Schaberg A., van der Ploegm. Cytometric studies on mycosis fungoides and other cutaneous retieulosis. - Bull. cancer 1977, 64,2, 249 - 258.

6. Dewald G., Spurbeck J. L., Viteic M. A. Chromosomes in a patient with Sezary Syndrome. - Mago clin. Proc. 1974, 49, 8, 553 - 557.

7. Willemze R., Van. Vloten W.A., Hermans J., Damstug M.J.M., Meifer C. J. L.M. Diagnostic criteria in Sezary syndrome: a multiparameter lymphosytes in 32 patients with erytroderma. - J. Invest. Derm. 1989, 81, 5, 392 - 397.

8. Hastrup N. , Pallesen G., Ralfkiaer E. Use of monoclonal antibodies for the diagnosis of T-cell malignansies. Application and limitations. Leukemia / lymphoma 1990, 2, 35 - 45.

9. Пирс Э. Гистохимия. - М., 1962, с. 190 - 192, 746.

10. Афифи А. , Эйзен С. Статистический анализ: подход с использованием ЭВМ. Пер. с англ. - М.: Мир, 1982. - 488 с.

Использование: изобретение относится к медицине, а именно, к дерматологии и гематологии, предназначено для ранней диагностики и дифференциальной диагностики T-клеточных лимфом кожи. Способ диагностики T-клеточных лимфом кожи (эритродермических вариантов) путем цитологического анализа взятого у больного биологического материала, отличающийся тем, что в качестве биологического материала берут мазок крови, фиксируют, проводят рибонуклеазную обработку, окрашивают галлоцианин-хромовыми квасцами, микроденситометрируют интерфазный хроматин лимфоцитов, на основании полученных параметров (OD4 - оптическая плотность эухроматина; FORM_P - форм-фактор ядра; IOD2 - интегральная оптическая плотность гетерохроматина; AREA - площадь ядра) рассчитывают показатель: DF = -0,14379•OD4 + 0,00003•IOD2 + 10,4952•FORM_P + 0,0001•AREA - 11,1241 и при отрицательном значении этого показателя диагностируют T-клеточную лимфому кожи.

Способ диагностики Т-клеточных лимфом кожи (эритродермических вариантов) путем цитологического анализа, взятого у больного биологического материала, отличающийся тем, что в качестве биологического материала берут мазок крови, фиксируют, проводят рибонуклеазную обработку, окрашивают галлоцианин хромовыми квасцами, микроденситометрируют интерфазный хроматин лимфоцитов, на основании полученных параметров (OD₄) оптическая плотность эухроматина, FORM_ P форм-фактор ядра; IOD₂ интегральная оптическая плотность гетерохроматина; AREA площадь ядра), рассчитывают показатель DF -0,14379 • OD₄ + 0,00003 • 1OD₂ + 10,4952 • FORM_P + 0,001 • AREP 11,1241 и при отрицательном значении этого показателя диагностируют Т-клеточную лимфому кожи.