ГЕЛЕОБРАЗУЮЩИЕ СМЕШАННЫЕ ФОСФОРНОКИСЛЫЕ И КАРБАМАТНЫЕ ЭФИРЫ ДЕКСТРАНА, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2012 года по МПК A61K31/721 A61K31/17 A61K9/52 A61K33/42 A61K49/12 A61P35/00 C08B37/02 

Изобретение относится к медицине, в частности к высокомолекулярным соединениям, конкретно, эфирам декстрана, содержащим фосфорнокислые и карбаматные группы, обладающим биологической активностью и предназначенным для создания пролонгированных лекарственных средств.

Декстран - полисахарид, состоящий из глюкопиранозных звеньев, связанных между собой преимущественно α-1,6 связью, а также, в значительно меньшей степени, α-1,2 и α-1,3 связями. Декстран растворим в воде, обладает биосовместимостью и способностью к биодеградации в тканях живого организма без выделения токсичных веществ. Известно, что введение в состав декстрана функциональных групп определенного типа (сульфатных, карбоксильных, альдегидных, фосфорнокислых и др.) сообщает ему набор дополнительных физико-химических и медико-биологических свойств [1-9]. Например [1], сульфат декстрана обладает антикоагулянтной активностью, низкой токсичностью и находит применение в клинике. Кроме того, известно [2], что сульфаты декстрана оказывают антипролиферативное действие по отношению к различным вирусам, а также ВИЧ-инфекции. В отличие от сульфатов декстрана синтезу и изучению медикобиологических свойств фосфатов декстрана посвящено сравнительно небольшое количество исследований [3, 6-8]. В работе [3] описывается метод получения низкозамещенных фосфатов декстрана путем этерификации раствором полифосфорной кислоты в формамиде и установлено, что фосфат декстрана (содержание фосфора - 1,7%) обладает иммуномодулирующей активностью и способен индуцировать иммуномодулирующее действие интерферонов (IL - 10 и γ-IFN).

Фосфаты декстрана - это производные декстрана, в которых путем этерификации часть гидроксильных групп полисахарида замещена фосфорнокислыми группами, в основном, с образованием моно- и диэфиров. Образование диэфиров предопределяет сшивку макромолекул декстрана, т.е. возможность получения его не только в виде растворов, но и гидрогелей.

Получение гидрогелей, способных поглощать значительное количество воды (или другой жидкости) и удерживать ее без растворения, является одним из перспективных и интенсивно развивающихся направлений в химии высокомолекулярных соединений. Гидрогели используются при разработке композиций для изготовления мягких контактных линз, лекарственных форм с пролонгированным высвобождением активного вещества, трансдермальных терапевтических систем, сорбентов, материалов для изготовления эндопротезов и т.д. Причиной широкого и разнообразного применения гидрогелей является их уникальная пористая структура, обеспечивающая высокую скорость набухания в воде, высокую проницаемость для низко- и высокомолекулярных соединений, а также хорошую биосовместимость [10, 11].

Соотношение моно- и дизамещенных фосфатов декстрана зависит от вида и состава этерифицирующей смеси, условий проведения реакции фосфорилирования. В литературе описаны разнообразные методы этерификации декстрана. Известно [3, 7-9], что для получения высокозамещенных фосфатов декстрана (степень замещения гидроксильных групп фосфорнокислыми в одном глюкопиранозном звене равна или превышает 0,8) используются, как правило, высокотоксичные и агрессивные реагенты, такие как хлорокись фосфора, оксид фосфора (V). Применение менее агрессивных реагентов, например, фосфатов натрия или калия, полифосфатов, ортофосфорной, полифосфорных кислот и др., способствует получению низкозамещенных фосфатов декстрана. Низкозамещенные фосфаты декстрана, полученные вышеуказанными методами, являются водорастворимыми соединениями.

Прототипом изобретения являются смешанные эфиры крахмала в виде гидрогелей, содержащие фосфорнокислые и карбаматные группы, способ их получения [12, 13]. Полученные смешанные эфиры крахмала могут быть использованы в качестве сорбентов для очистки воды от полизарядных катионов металлов, как загущающие агенты. Включение карбаматных групп в структуру фосфата полисахарида способствует возникновению дополнительных межмолекулярных взаимодействий (водородные связи, химические сшивки) и, как следствие, получению продуктов реакции этерификации в виде гидрогелей в широком интервале изменения степени замещения по фосфорнокислым группам. Известный процесс фосфорилирования крахмала проводят ортофосфорной кислотой в расплаве мочевины при температуре 110-140°С под вакуумом (0,01-0,13 атм) в течение 1-3 часов. После охлаждения к реакционной массе добавляют дистиллированную воду для набухания полученных гидрогелей, промывают 3 раза раствором метилового спирта (80%-ный раствор), высушивают под вакуумом при 50°С в течение трех часов.

Указанный способ не может быть использован для получения гидрогелей фосфатов декстрана по следующим причинам:

- интенсивно протекающий процесс деструкции декстрана приводит к получению фосфорнокислых эфиров темного цвета исключительно в виде вязких растворов;

- непригодность данного способа этерификации для получения гидрогелей полисахаридов, имеющих низкую степень полимеризации.

Задачей изобретения является получение малотоксичных низко- и высокозамещенных фосфатов декстрана в виде гидрогелей, содержащих дополнительно карбаматные группы и проявляющих противоопухолевое действие.

Поставленная задача решается тем, что в качестве малотоксичного противоопухолевого высокомолекулярного соединения предложены эфиры декстрана, содержащие фосфорнокислые и карбаматные группы, согласно формуле:

{C₆H₇O₂(OH)_3-x-y{[(OP(O)ONa)_m(ONa)]_x1[(O₂P(O)ONa)_k]_x2}_x(OCONH₂)_y}_n, где

x=x₁+x₂ - степень замещения по фосфорнокислым группам (моно- и диэфирам), х=0,47-1,09;

x₁ - степень замещения по моноэфирам, x₁=0,01-0,48;

x₂ - степень замещения по диэфирам, x₂=0,01-1,09;

m - число фосфатов в моноэфирах, m=1-2;

k - число фосфатов в диэфирах, k=1-2;

y - степень замещения по карбаматным группам, y=0,39-1,23;

n - степень полимеризации, 20≥n≤1000.

Способ получения фосфата декстрана, включающий фосфорилирование декстрана ортофосфорной кислотой в расплаве мочевины при 110-140°С и остаточном давлении, добавление воды до пастообразного состояния реакционной массы с последующей промывкой и сушкой конечного продукта, отличается тем, что исходный декстран перед модификацией дополнительно высушивают, фосфорилирование проводят при более высоком остаточном давлении 0,05-0,27 атм с последующей обработкой реакционной массы 0,75 М раствором хлорида натрия в 70%-ном растворе этилового спирта, доведением рН раствора до значений 11,0-12,0, промывкой полученного осадка 70%-ным раствором этилового спирта.

Метод получения эфиров декстрана, содержащих фосфорнокислые и карбаматные группы, по сравнению с методом [13] модифицирован следующим образом:

- для преимущественного образования дифосфорнокислых эфиров декстрана и получения продуктов в виде гидрогелей исходный декстран предварительно перед реакцией этерификации высушивают при 50°С и остаточном давлении 0,1 атм в течение 5-16 часов;

- процесс фосфорилирования декстрана ортофосфорной кислотой в расплаве мочевины проводят при остаточном давлении 0,05-0,27 атм. Этот параметр процесса фосфорилирования оказывает существенное влияние на выход фосфатов декстрана в виде гель-фракции. При остаточном давлении 0,5 атм выход гель-фракции значительно снижается (примерно в 2 раза). При атмосферном давлении могут быть получены только низкозамещенные водорастворимые образцы фосфата декстрана;

- для замены токсичного растворителя (метанол) в процессе промывки фосфатов декстрана, сокращения ее периода, а также получения Na-формы фосфорнокислых эфиров продукт модификации после охлаждения реакционной массы, добавления дистиллированной воды осаждают 0,75М раствором хлорида натрия в смеси этиловый спирт - вода (70%-ный раствор), рН которого доведен раствором гидроксида натрия до значений 11,0-12,0. Полученный осадок промывают в аппарате Сокслета 70%-ным раствором этилового спирта и сушат при 50°С в вакуумном шкафу при остаточном давлении 0,1 атм.

В качестве исходного материала для получения заявляемых соединений используется декстран с молекулярной массой в пределах 40-1000 кДа.

Способ позволяет получить малотоксичные гелеобразующие фосфаты декстрана, обладающие противоопухолевой активностью. При этом рН набухших гидрогелей находится в пределах 7,2-7,4, что соответствует рН крови.

Выход продуктов реакции, рассчитанный от теоретически возможного, - количественный.

Изобретение иллюстрируют рисунки, таблицы, примеры.

Рисунок 1. Электронные микрофотографии гранул исходного (1) и фосфатов (2, 3) декстранов: 2 - СЗ_P=0,48, СЗ_N=0,42; 3 - СЗ_P=0,68, СЗ_N=0,47.

Рисунок 2. Зависимость количества поглощенной воды 1 г фосфата декстрана (СЗ_P=1,09; CЗ_N=1,23) от времени (Q, г/г).

Рисунок 3. Динамика роста Саркомы М-1 (V, см³) у крыс в контроле и после внутрибрюшинного введения фосфата декстрана (СЗ_P=0,48, СЗ_N=0,42) в дозе 2,0 г/кг.

Пример 1. К 20 г предварительно высушенного при 50°С и остаточном давлении 0,1 атм в течение 16 часов декстрана (Mw=40000 Да) при постоянном перемешивании добавляют 29,76 г мочевины (хч) и 5,2 мл 85% ортофосфорной кислоты. Мольное соотношение d-ангидроглюкопиранозное звено (ГПЗ): ортофосфорная кислота (Н₂РО₄): мочевина [(NH₂)₂CO] составляет 1,0:0,6:4,0. Выдерживают при температуре 125°С и остаточном давлении 0,06-0,25 атм в течение 3 ч. По окончании реакции фосфорилирования реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры. Затем добавляют дистиллированную воду для получения пастообразной массы, приливают 400 мл (модуль ванны (г/мл) - 1:20) раствора NaCl (30 г на 1 л раствора 70% этилового спирта, рН которого доводят гидроксидом натрия до значения 11,5) и оставляют при комнатной температуре на 24 ч. Выпавший осадок промывают в аппарате Сокслета 70%-ным раствором этанола, сушат при температуре 50°С в вакуумном шкафу при остаточном давлении 0,1 атм. Выход гель-фракции составляет 96,7%. Содержание фосфора в полученном образце составляет 7,0%, азота - 2,7%. Степень замещения по фосфорнокислым группам (СЗ_P) равна 0,49; по карбаматным группам (СЗ_N) - 0,42. Количество поглощенной воды 1 г фосфата декстрана - 174,6 г/г.

Примеры 2-14. Образцы фосфатов декстрана получают аналогично примеру 1 при различных параметрах процесса. Условия осуществления процесса фосфорилирования для всех примеров приведены в таблице 1.

Образцы фосфатов декстрана, полученные в соответствии с примерами 1-14, охарактеризованы по содержанию фосфорнокислых и карбаматных групп, структурным особенностям, степени набухания, кислотно-основным свойствам методами элементного анализа, ИК-спектроскопии, сканирующей электронной микроскопии, потенциометрического титрования [15].

Элементный анализ. Содержание фосфорнокислых групп в образцах фосфатов декстрана определяют спектрофотометрическим методом [14], азота - методом Кьельдаля [15].

Полученные соединения характеризуются по степени замещения по фосфорнокислым (СЗ_P) и карбаматным (СЗ_N) группам (число фосфорнокислых или карбаматных групп, приходящихся на ангидроглюкопиранозное звено (ГПЗ) полисахарида). Полученные данные приведены в таблице 1.

ИК-спектроскопия. В ИК-спектре заявляемого соединения видна полоса поглощения вблизи 790 см^-1 (неплоскостные деформационные колебания групп Р-O-Р), плечо вблизи 950 см^-1 и полоса поглощения вблизи 1020 см^-1 (валентные колебания групп Р-О-Р и Р-О-Н), плечо вблизи 1210 см^-1 (валентные колебания фосфорильной группы Р=O), свидетельствующие об образовании фосфорнокислых групп. В ИК-спектрах всех образцов декстрана, этерифицированных ортофосфорной кислотой в расплаве мочевины, присутствует интенсивная полоса поглощения вблизи 1720 см^-1, обусловленная асимметричными валентными колебаниями связей С=O карбаматных групп. С увеличением степени этерификации указанные спектральные изменения усиливаются.

Сканирующая электронная микроскопия. В результате фосфорилирования (рисунок 1) гранулы декстрана разрушаются на неоднородные по длине и ширине осколки, которые имеют рыхлую, пористую структуру (размеры микропор находятся в интервале от 2 до 10 нм). Увеличение концентрации ортофосфорной кислоты в этерифицирующей смеси способствует постепенному уплотнению структуры декстрана, увеличению размеров осколков и исчезновению микропор.

Водопоглощающая способность. Водопоглощающую способность (Q, г/г) определяют гравиметрическим методом и рассчитывают по формуле:

,

где Q - водопоглощающая способность (Q, г/г);

m₁ - масса набухшего в воде образца, г;

m₂ - масса образца, высушенного до постоянной массы, г.

Гидрогели фосфатов декстрана отделяют от избытка воды центрифугированием на стеклянном фильтре с размером пор 160 мкм при центробежной силе 2400 g. Высушивание до постоянной массы осуществляют в присутствии оксида фосфора (V) при температуре 50°С, остаточном давлении 0,1 атм.

Значения водопоглощающей способности гидрогелей на основе фосфатов декстрана приведены в таблице 1 и на рисунке 2.

Полученные гидрогели фосфатов декстрана характеризуются высокой скоростью водопоглощения: водопоглощение гидрогелей с разным содержанием фосфорнокислых и карбаматных групп достигает своего максимального значения менее чем за 5 минут и с последующим течением времени практически не меняется (рисунок 2) - на примере фосфата с М.м. 60 кДа (СЗ_P=1,09; CЗ_N=1,23).

Потенциометрическое титрование. Из данных таблицы 2 следует, что

Таблица 2 Результаты потенциометрического титрования гидрогелей на основе фосфатов декстрана   СЗ_P CЗ_N Данные потенциометрического титрования OE₁, мг-экв/г ПОЕ, мг-экв/г pK₁ pK₂ 1 0,48 0,42 1,5 3,2 2,9 7,0 2 0,78 0,83 1,9 1,9 3,1 - 3 1,09 1,23 1,3 1,3 3,0 -

полученные фосфаты декстрана имеют полную обменную емкостью в диапазоне 1,3-3,2 мг-экв/г. Согласно значениям кажущихся констант ионизации (pK₁ и pК₂) в составе фосфатов декстрана имеется одна или же две кислые функциональные группы, которые диссоциируют, в основном, в области рН - 1,8-5,4 и 5,0-9,0.

Исследование острой токсичности гидрогелей фосфатов полисахаридов in vivo. Определение острой токсичности гидрогелей ФД проводилось на крысах (каждая серия по 4 крысы весом 200-250 г). Животным вводилось по 10 г 50% гидрогеля внутрибрюшинно. Установлено (таблица 3), что фосфаты декстрана относятся к классу малотоксичных веществ.

Таблица 3 Острая токсичность гидрогелей фосфатов декстрана Полисахарид СЗ_P C3_N LD₅₀ Декстран (Mw=60 000) 1,09 1,22 ~5000 мг/г Декстран (Mw=500 000) 0,85 1,16 >5000 мг/г

Оценка противоопухолевой активности гидрогелей фосфатов декстрана. Сопоставительное исследование противоопухолевой активности предлагаемых фосфатов декстрана проведено в условиях in vitro и in vivo.

Исследование противоопухолевой активности гидрогелей фосфатов декстрана in vitro.

Оценку противоопухолевого эффекта гидрогелей на основе фосфатов декстрана проводили на монослойной культуре опухолевых клеток Hela (эпителиоидная карцинома шейки матки человека, клон М) путем сравнения количества выживших клеток с их исходным числом до воздействия фосфатов декстрана.

Снижение числа клеток (N) после воздействия заявляемых соединений ниже исходного уровня свидетельствует о преобладании цитотоксического эффекта, а выше исходного, но ниже контроля - о преобладании цитостатического эффекта. Показатель эффективности противоопухолевого действия гидрогелей ИК₅₀ (концентрация, вызывающая ингибирование пролиферации на 50%) рассчитывали методом регрессионного анализа полученных данных. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Origin 7.

Результаты представлены в таблице 4. Видно, что с ростом содержания фосфорнокислых групп в декстране способность заявляемых эфиров ингибировать пролиферацию опухолевых клеток увеличивается. Цитостатическая активность исследованных соединений является дозозависимой.

          2   460±20 280 45  

Исследование противоопухолевой активности in vivo. Эффективность противоопухолевого действия гидрогелей на основе фосфатов декстрана in vivo была проверена на белых беспородных крысах обоего пола (16 животных), которым подкожно в область левого бедра перевивали саркому М-1.

На 7-10 сутки после перевивки опухоли крысам однократно внутрибрюшинно (доза - 2000 мг/кг) вводили гидрогель фосфата декстрана. Измерения размеров опухолей в контрольных и опытных группах проводили 3 раза в неделю, а объем опухоли (V, см³) рассчитывали по формуле Шрека:

V=(a×b×c)×π/6, где a, b, с - линейные размеры опухоли (см).

Торможение роста опухоли определяли по формуле:

(Vcp.(Контроль)-Vср.(Опыт))/Vср.(Контроль)

Полученные результаты (рисунок 3) выявляют противоопухолевую активность заявляемых соединений. Через двое суток после введения фосфатов декстрана разница в скорости роста опухолевых клеток опытной партии по сравнению с контрольной становится очевидной; на 7 сутки - объем опухоли по сравнению с контролем уменьшается примерно в два раза.

Таким образом, модификация декстрана смесью ортофосфорной кислоты и мочевины приводит к образованию малотоксичных соединений, обладающих противоопухолевым действием. Заявляемое соединение обеспечивает по сравнению с декстраном и существующими фосфатами декстрана следующие преимущества:

- соединения могут быть получены в виде гидрогелей в достаточно широком диапазоне изменения содержания фосфорнокислых групп и молекулярной массы декстрана;

- гидрогели на основе фосфатов декстрана обладают высокой скоростью набухания;

- при получении используются сравнительно нетоксичные реагенты, что делает стадию очистки целевого продукта более простой и экономичной.

Предложенные фосфаты декстрана могут быть получены в условиях предприятий, выпускающих химические и фармацевтические препараты.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. WO Pat. 90/04970, МКИ 5 А61К 31/725, 1990.

2. Baba M., Pauwells R., Balzarini J., Arnout J., Desmyter J. at al. Mechanism of ingibitory effect of dextran sulfate and heparin on replication of human immunodeficiency virus in vitro. Proceeding of the National Academy of the United States of America. 1988. Vol.85. P.6132-6136.

3. US Pat. 20060154896, МКИ А61К 31/721, 2006.

4. US Pat. 6303148, МКИ А61K 9/16, A61K 9/14, 2001.

5. US Pat. 4847091, МКИ А61K 9/66, 1989.

6. Suzuki M., Mikami Т., Malsumoto Т., Suzuki S. Preparation and antitumor activity of o-palmitoyldextran phosphate, o-palmitoyldextrans and dextran phosphate. Carbohydrate Reseach. 1977. Vol.53. P.223-229.

7. US Pat. 2970141, МКИ С12P 19/08, C12P 19/00, 1961.

8. Kirci В., Kaplan H., Rzaev Z.M., Guner A. Preparation conditions and swelling equilibria of dextran hydrogels prepared by some crosslinking agents. Polymer. 2004. Vol.45. P.6431-6435.

9. Whistler R.L., Towie G.A. Preparation and characterization of polysaccharide phosphates. Achives of biochemistry and biophysics. 1969. Vol.13. P.396-401.

10. European Pat. 1 184 032, МКИ А61К 9/16; С08В 37/00; 2002.

11. Nakamae К., Miyata Т., Hoffman A.S. // Makromol. Chem. 1992. V.193. N 4. P.983-990.

12. Heinze U., Klemm D., Under E., Piescher F. New starch Phosphate Carbamides of High Swelling Ability: Syntesis and Characterization // Starch/ Stärke 2003. V.55. P.55-60.

13. US Pat. 6703496 B1, МКИ C08B 31/00; C08B 31/06; C08B 33/00; C08B 33/02; C08B 35/00; 2004.

14. Колориметрические (фотометрические) методы определения неметаллов: Пер. с англ. под ред А.И.Бусева. M.: ИЛ, 1963. 260 с.

15. Губен-Вейль. Методы органической химии. - M.: Госхимиздат, 1963. 468 с.

Изобретение относится к медицине и представляет собой гелеобразующие смешанные эфиры декстрана, содержащие фосфорнокислые и карбаматные группы, общей формулы: {С₆Н₇O₂(ОН)_3-х-y{[(OP(O)ONa)_mONa)]x₁[(O₂P(O)ONa)_k]x₂}x(OCONH₂)_y}_n, где х=х₁+х₂ - степень замещения по фосфорнокислым группам (моно- и диэфирам), х=0,47-1,09; x₁ - степень замещения по моноэфирам, x₁=0,01-0,48; m - число фосфатов в моноэфирах, m=1-2; х₂ - степень замещения по диэфирам, х₂=0,01-1,09; k - число фосфатов в диэфирах, k=1-2; у - степень замещения по карбаматным группам, у=0,39-1,23; n - степень полимеризации, 20≥n≤1000. Изобретение обеспечивает получение малотоксичных низко- и высокозамещенных фосфатов декстрана в виде гидрогелей, содержащих дополнительно карбаматные группы и проявляющих антипролиферативную активность по отношению к опухолевым клеткам. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 14 пр.

1. Гелеобразующие смешанные эфиры декстрана, содержащие фосфорнокислые и карбаматные группы, общей формулы: {C₆H₇O₂(ОН)_3-х-у{[(OP(O)ONa)_mONa)]_x1[(O₂P(O)ONa)_k]_x2}_x(OCONH₂)_y}_n, где х=x₁+х₂ - степень замещения по фосфорнокислым группам (моно- и диэфирам), х=0,47-1,09;
x₁ - степень замещения по моноэфирам, х=0,01-0,48;
m - число фосфатов в моноэфирах, m=1-2;
х₂ - степень замещения по диэфирам, х=0,01-1,09;
k - число фосфатов в диэфирах, k=1-2;
у - степень замещения по карбаматным группам, у=0,39-1,23;
n - степень полимеризации, 20≤n≤1000, обладающие антипролиферативной активностью по отношению к опухолевым клеткам.

2. Способ получения фосфата декстрана по п.1, включающий фосфорилирование декстрана ортофосфорной кислотой в расплаве мочевины при 110-140°С и остаточном давлении, добавление воды до пастообразного состояния реакционной массы с последующей промывкой и сушкой конечного продукта, отличающийся тем, что исходный декстран перед модификацией дополнительно высушивают, фосфорилирование проводят при более высоком остаточном давлении 0,05-0,27 атм с последующей обработкой реакционной массы 0,75М раствором хлорида натрия в 70%-ном растворе этилового спирта, доведением рН раствора до значений 11,0-12,0, промывкой полученного осадка 70%-ным раствором этилового спирта.