ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ УСКОРЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ M. tuberculosis К ОСНОВНЫМ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫМ ПРЕПАРАТАМ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицине, а именно к области фтизиатрии и бактериологии, и может быть использовано для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза.

Продолжающийся рост лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis (МБТ), и в особенности множественной лекарственной устойчивости, повышает значимость лабораторного тестирования клинических изолятов возбудителя. Особенно важны результаты определения лекарственной чувствительности для выбора режима терапии впервые выявленных больных. Так, анализ данных англоязычной литературы за период 1965-2007 гг., проведенный W.Lew и соавторами [1], показал, что безуспешность лечения и рецидивы связаны именно с первичной лекарственной устойчивостью. Учет результатов определения лекарственной чувствительности стандартным непрямым методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена производится на 21-й день после посева изолята МБТ. Методы ускоренного определения лекарственной чувствительности МБТ с помощью жидких сред сокращают сроки получения данных, необходимых для назначения адекватной химиотерапии. К таким методам относится тестирование чувствительности МБТ на автоматизированной системе бульонного культивирования ВАСТЕС MGIT 960, на сегодняшний день наиболее эффективной [2, 3, 4]. Но как сама система, так и наборы реагентов очень дороги (набор их для определения чувствительности только 1 штамма МБТ к 4 препаратам первого ряда стоит 1200 рублей). Поэтому актуальной остается задача быстрого выявления резистентных штаммов МБТ с помощью быстрых недорогих фенотипических методов, доступных для практических фтизиобактериологических лабораторий любого уровня.

Известна полужидкая среда Сотона (патент №2226398), которая неприменима для определения чувствительности микобактерий туберкулеза к этамбутолу [5]. Прототипом предлагаемой среды является жидкая питательная среда Миддлбрука, которая готовится из коммерческого сухого питательного бульона Миддлбрука 7Н9. Жидкая питательная среда Миддлбрука требует применения дополнительных опосредованных физических или биохимических методов регистрации роста культур микобактерий [6, 7, 8, 9, 10], что повышает стоимость проводимого исследования, в случае использования автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 - в значительной степени.

Таким образом, преимущество предлагаемой среды - 1) быстрота получения результатов - 3-8 суток; 2) меньшая стоимость в сравнении с другими методами, использующими жидкую среду Миддлбрука; 3) доступность любой фтизиобактериологической лаборатории, так как не требуется дополнительное оснащение дорогостоящей аппаратурой; 4) простота считывания результата, которое осуществляется визуально.

Задачей предлагаемого изобретений является разработка питательной среды для ускоренного определения лекарственной чувствительности штаммов МБТ к четырем основным препаратам - стрептомицину, изониазиду, рифампицину, этамбутолу.

Задача решается за счет того, что в жидкий питательный бульон Миддлбрука 7Н9 добавляют агар-агар микробиологический - 1,25 г и панкреатический гидролизат казеина - 1,25 г.

Приготовление питательной среды для ускоренного определения лекарственной чувствительности МБТ

Основу среды представляет коммерческий сухой питательный бульон Миддлбрука 7Н9 (Becton Dickinson), который готовят в соответствии с прописью и затем добавляют панкреатический гидролизат казеина - 1,25 г и микробиологический агар-агар - 1,25 г. Среда по консистенции близка к жидкой, введение панкреатического гидролизата казеина улучшает ростовые свойства питательной среды, что обусловливает быстрый рост микобактерий. Кроме того, агар-агар не дает инокуляту опускаться на дно, повышая локальную концентрацию МБТ и обеспечивая хорошую аэрацию этих аэрофильных микроорганизмов. Все перечисленные факторы обуславливают быструю визуализацию роста: на 3-4 сутки при посеве суспензий плотностью 10^-1 и на 8-9 сутки при плотности 10^-3. В последнем случае сроки роста совпадают с таковыми при тестировании лекарственной чувствительности в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960.

Состав питательной среды

Сухой бульон Миддлбрука 7Н9 - 4,7 г, в состав которого входят:

сульфат аммония - 0,5 г

L-глутаминовая кислота - 0,5 г

натрия цитрат - 0,1 г

пиридоксин - 0,001 г

биотин - 0,0005 г

натрий фосфорнокислый двузамещенный - 2,5 г

калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,0 г

железо лимонноаммонийное - 0,04 г

магния сульфат - 0,05 г

кальция хлорид - 0,0005 г

цинка сульфат - 0,001 г

меди сульфат - 0,001 г

Глицерин - 2 мл

Казеина панкреатический гидролизат - 1,25 г

Агар-агар микробиологический - 1,25 г

Вода дистиллированная - 900 мл

Ростовая добавка OADC - 100 мл, в состав которой входят:

натрия хлорид - 8,5 г

альбумин бычий (фракция 5) - 50,0 г

глюкоза - 20,0 г

каталаза - 0,03 г

кислота олеиновая - 0,6 мл

В соответствии с прописью коммерческой сухой среды к навеске порошка сухого бульона Миддлбрука 7Н9 добавляют дистиллированную воду, вносят глицерин, кроме того, для обогащения бульона добавляют панкреатический гидролизат казеина. Все компоненты перемешивают до полного растворения и вносят 1,25 г микробиологического агар-агара. Затем смесь доводят до кипения для растворения агар-агара. Готовую среду стерилизуют при 120°C 20 мин. Затем в остуженную до 50°C полужидкую среду асептически вносят коммерческую ростовую добавку OADC (Beckton Dickinson). Готовую среду разливают по 99 мл в 4 колбы, содержащие по 1 мл разведении противотуберкулезных препаратов в конечных концентрациях: стрептомицин 1 мкг/мл, изониазид 0,1 мкг/мл, рифампицин 1 мкг/мл, этамбутол 5 мкг/мл. Затем среду с препаратами асептически разливают в пробирки по 5 мл. К каждому ряду, состоящему из 4 пробирок со стрептомицином, изониазидом, рифампицином, этамбутолом, присоединяют 2 контрольные пробирки с 5 мл среды, не содержащей препаратов.

Определение лекарственной чувствительности МБТ методом пропорций осуществляется следующим образом.

Готовят суспензию исследуемого штамма МБТ в физиологическом растворе по стандарту мутности 5 ед. (ФГУН Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора). Суспензии разводят в 10 (10^-1) и в 1000 (10^-3) раз. Взвесь МБТ плотностью 10^-1 вносят в одну из контрольных пробирок с разработанной полужидкой средой и во все пробирки с препаратами, плотностью 10^-3 - во вторую контрольную пробирку. Объем инокулята - 0,5 мл. Суспензию МБТ на полужидкую среду наносят поверхностно, методом наслоения, каплями по стенке наклоненной пробирки, без перемешивания и встряхивания. Посевы инкубируют при 37°C, делая просмотр полужидких сред каждый день, начиная с третьего, и фиксируя срок появления колоний МБТ в контроле и в пробирках с препаратами. При появлении на среде с препаратом роста культуры МБТ, сравнимого с ростом в контроле 10^-1, регистрируют устойчивость (3-5 сутки). Чувствительность к препарату определяется отсутствием роста - прозрачностью среды, либо ростом, меньшим, чем рост в контроле 10^-3 на 8-9-е сутки.

Испытание предлагаемой среды проведено на 38 панельных (полученных по программе Федеральной системы внешней оценки качества) и 47 клинических штаммах, выделенных из патологического материала больных туберкулезом различных локализаций. Лекарственную чувствительность исследовали параллельно на предлагаемой среде, на среде Левенштейна-Йенсена стандартным методом, и на средах-прототипах: 1) полужидкой среде Сотона; 2) в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960 с помощью набора SIRE Kit.

Результаты определения скорости роста МБТ на предлагаемой среде в сравнении со средами-прототипами представлены в табл.1.

Таблица 1 Скорость роста панельных и клинических штаммов M.tuberculosis на предлагаемой среде и средах-прототипах. Питательная среда Число исследований Скорость роста в сутках при плотности суспензии (x±I) 10^-1 10^-3 Панельные штаммы Полужидкая Миддлбрука 38 4,13±0,25 6,74±0,23* BBL MGIT 38 - 7,36±0,22 Полужидкая Сотона 18 3,95±0,23 8,33±0,56# Клинические штаммы Полужидкая Миддлбрука 47 3,46±0,16 8,13±0,55 BBL MGIT 46 - 8,30±0,31 Полужидкая Сотона 47 3,77±0,22 8,96±0,72 Примечания. 1) x±I - средняя ± доверительный интервал; 2)*, # - различия между средами достоверны при p<0,05.

Как видно из приведенных данных, срок роста МБТ на предлагаемой среде меньше или равен таковому на средах-прототипах, что делает среду перспективной для ускоренного определения лекарственной чувствительности МБТ.

Таким образом, проведенные исследования показали, что использование предлагаемой полужидкой среды Миддлбрука для ускоренного определения чувствительности МБТ к 4 основным противотуберкулезным препаратам является альтернативным методу тестирования с помощью автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960. Внесение в бульон Миддлбрука агар-агара в небольшом количестве (1,25 г) позволяет в короткие сроки (3-4 дня) визуально регистрировать рост МБТ (плотность суспензии 5 ед. стандарта мутности, разведенной в 10 раз), а введение панкреатического гидролизата казеина улучшает ростовые свойства питательной среды. На полужидкой среде средний срок роста разведенной в 100 раз суспензии микобактерий не отличается от такового в системе бульонного культивирования. Это дает возможность через 7-9 дней давать ответ о чувствительности исследуемого штамма. Совпадение сроков роста в контрольной пробирке и в пробирке с препаратом при резистентности к нему исследуемого изолята позволяет на 3-7 сутки выявлять лекарственноустойчивые штаммы, в особенности наиболее эпидемиологически опасные культуры с множественной лекарственной устойчивостью. В отношении изониазида, рифампицина, стрептомицина предлагаемый метод по своим параметрам не отличается от системы ВАСТЕС MGIT 960 SIRE Kit, а относительно этамбутола даже несколько превосходит. Метод ускоренного определения лекарственной чувствительности МБТ с помощью полужидкой среды Миддлбрука не уступает таковому в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960, но значительно дешевле, так как не требует дорогостоящей аппаратуры и реагентов. Поэтому для ускоренного определения чувствительности МБТ к 4 основным противотуберкулезным препаратам целесообразно использовать предлагаемую полужидкую среду.

Питательная среда для определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis к четырем основным препаратам - стрептомицину, изониазиду, рифампицину, этамбутолу, содержит: 4,7 г сухого бульона Миддлбрука 7Н9, 1,25 г микробиологического агар-агара, 1,25 г панкреатического гидролизата казеина, 900 мл воды дистиллированной и 100 мл ростовой добавки OADC. В состав добавки входят, г/л: натрия хлорид 8,5, альбумин бычий (фракция 5) 50,0, глюкоза 20,0, каталаза 0,03 и кислота олеиновая 0,6 мл/л. Изобретение обеспечивает быстроту получения результатов исследования и простоту считывания результатов, которая осуществляется визуально. 4 табл.

Питательная среда для определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis к основным противотуберкулезным препаратам, включающая:
Сухой бульон Миддлбрука 7Н9 4,7 г Глицерин 2 мл Казеина панкреатический гидролизат 1,25 г Агар-агар микробиологический 1,25 г Вода дистиллированная 900 мл Ростовая добавка OADC 100 мл