СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2005 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 C12N1/26 C12Q1/04 C12R1/32 

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологической диагностике лекарственной чувствительности M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам, и может найти применение в бактериологических лабораториях противотуберкулезных учреждений в условиях ограниченного финансирования.

Известен метод определения ЛЧ микобактерий с помощью ручной флюоресцентной системы BBL MGIT (BD). Индикация роста микобактерий в этой системе осуществляется по флюоресценции индикатора, расположенного в придонной части пробирки MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube), содержащей бульон Middlebrook 7H9. Для оценки результатов в этой системе необходим источник ультрафиолетового излучения - трансиллюминатор (длина волны 365 нм) или прибор MicroMGIT. Кроме того, альтернативу классическим методикам представляют бактериологические системы, основанные на бульонном культивировании с помощью анализаторов: полуавтоматического радиометрического ВАСТЕС 460 и полностью автоматизированного ВАСТЕС MGIT 960, которые хорошо совместимы между собой по результатам. Определение ЛЧ с использованием ручной бактериологической системы BBL MGIT или анализаторов ВАСТЕС 460 и ВАСТЕС 960 занимает по времени 3-4 недель, при этом тестирование связано с дорогостоящим оборудованием и реактивами, что делает его неприемлемым при недостаточных ресурсах здравоохранения (Проблемы туберкулеза. – 2002 - №1, - стр.58-62).

Наиболее близким ускоренным и дешевым способом определения ЛЧ M.tuberculosis является способ посева микробных клеток в жидкую обогащенную среду Школьниковой с противотуберкулезными препаратами с последующим определением роста M.tuberculosis.

(Драбкина P.O. Микробиология туберкулеза. - М.: Медгиз, 1963, - 225 стр.).

Однако известный способ не обеспечивает необходимый рост M.tuberculosis, эффективность, скорость и точность определения ЛЧ.

Целью предложенного способа является увеличение скорости роста М. tuberculosis, повышение точности и сокращение срока определения ЛЧ M.tuberculosis, что повышает эффективность определения ЛЧ к противотуберкулезным препаратам и как следствие своевременное назначение необходимой противотуберкулезной терапии и коррекцию проводимого лечения.

Указанная цель достигается тем, что создают двухфазную жидкую среду, в качестве нижней фазы в которой используют перфтордекалин-газовую подложку - с концентрацией свободных ионов менее 10^-6 М, при соотношении слоев обогащенной среды Школьниковой к подложке, равном 1:1, с последующей оценкой метаболической активности микробных клеток с помощью 2%-ного трифенил-тетразолия хлористого.

Использование газовой подложки дает возможность улучшить аэрацию растущей культуры и замедлить развитие ацидоза за счет газообмена между средой и подложкой и на разделе фаз проводить калориметрическую оценку наличия или отсутствия роста M.tuberculosis посредством 2%-ного трифенил-тетразолия хлористого (далее - ТТХ), который в течение 24 часов окрашивает активно растущую микробную популяцию.

В присутствии растущих микобактерий бесцветный ТТХ изменяет свой цвет на бордовый/малиновый, окрашивая микроколонии. Величину микобактериального роста, который располагается преимущественно на границе фаз, значительно легче оценить визуально при использовании ТТХ.

Предлагаемый способ определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis с использованием двухфазной среды с ПФД осуществляется следующим образом.

Для приготовления двухфазной среды стерильный ПФД в количестве 2 мл помещался в пробирку, на него наслаивали 2 мл обогащенной среды Школьниковой. Таким образом, формировалась двухфазная система, нижнюю фазу которой составлял более тяжелый ПФД, а верхнюю - питательный бульон - обогащенная среда Школьниковой.

Готовили навески основных противотуберкулезных препаратов из чистых субстанций, затем порошки разводили стерильной дистиллированной водой, раствор вносили в питательную среду по 0,1 мл. В результате окончательная концентрация каждого из препаратов в среде соответствовала приведенной в таблице 1.

Таблица 1

Критические (низкие) концентрации препаратов (мкг/мл) в пробирках

Среда для определения ЛЧПротивотуберкулезные препараты, содержащиеся в средах СтрептомицинИзониазидРифампицинЭтамбутолШкольниковой0,8*0,1*1,0*3,5*

В таблице 2 представлены все необходимые при постановке теста компоненты, которые вносились в 4 пробирки с противотуберкулезными препаратами и 1 пробирку для контроля роста.

Таблица 2

Определение лекарственной чувствительности M.tuberculosis с использованием двухфазной системы

ПрепаратПФДОбогащенная среда Шк.Р-р препаратаДистил. водаМикробная взвесьТТХСтрептомицин2,02,00,1 0,20,1Изониазид2,02,00,1 0,20,1Рифампицин2,02,00,1 0,20,1Этамбутол2,02,00,1 0,20,1Контроль роста (без препарата)2,02,0 0,10,20,1

Объектом исследования служили три культуры микобактерий:

M.tuberculosis H37Rv, лабораторный штамм, чувствительный к

противотуберкулезным препаратам;

M.tuberculosis, клинический изолят, устойчивый к изониазиду;

M.tuberculosis, клинический изолят, устойчивый к стрептомицину,

изониазиду, рифампицину и этамбутолу.

Из каждой культуры готовили микробную взвесь в физиологическом растворе с 0,05% твина-80 по стандарту мутности ГИСК, соответствующему 5×10⁸ микробных тел/мл, затем взвесь разводили 1:10. Тестируемый штамм в виде микробной взвеси вносили в каждую пробирку по 0,2 мл.

Микробный рост в пробирках с противотуберкулезными препаратами оценивали по сравнению с ростом в контроле с помощью 2% раствора ТТХ, который добавляли по 0,1 мл в каждую из 5 пробирок на 8 день культивирования. Затем пробирки инкубировались еще 24 часа, в течение этого периода колонии микобактерий, выросшие на границе фаз, окрашивались в бордовый цвет. Культуру считали устойчивой, если интенсивность окрашивания колоний, выросших на границе фаз, в пробирке с препаратом примерно соответствовала интенсивности окраски в контроле.

Полученный результат определения лекарственной чувствительности сравнивался с референс-методами, которые регламентированы приказом МЗ РФ №109 от 2003 г.: на плотной среде Левенштейна-Йенсена (Л-Й) и с помощью оборудования BBL MGIT AST, в котором используются жидкие среды и флуоресцентный метод.

На плотной среде Левенштейна-Йенсена (Л-Й) удается обнаружить лекарственно устойчивые мутанты в культуре М. tuberculosis в течение 3-4 недель. Наиболее существенным недостатком этого метода является длительный срок исследования, значительно осложняющий своевременное назначение необходимой противотуберкулезной терапии и коррекцию проводимого лечения. Недостатком метода с применением оборудования BBL MGIT AST, в котором используются жидкие среды и флуоресцентный метод, является его высокая стоимость, поскольку требуется дорогое импортное оборудование и дорогие реактивы.

Пример 1 осуществления определения ЛЧ M.tuberculosis в жидкой двухфазной среде.

Для определения ЛЧ M.tuberculosis отбирали 30 изолятов M.tuberculosis, выделенных от больных с различными формами туберкулеза легких. Из них 16 культур M.tuberculosis были чувствительными, а 14 - устойчивыми к противотуберкулезным препаратам первого ряда.

Внесение противотуберкулезных препаратов: стрептомицина (S), изониазида (I), рифампицина (R) и этамбутола (Е), а также инокуляцию исследуемой культуры M.tuberculosis в двухфазную систему культивирования производили в соответствии со схемой, приведенной выше.

Результаты, полученные разработанным способом, сравнивали с данными определения ЛЧ, полученными классическим методом абсолютных концентраций на плотных средах Ливенштейна-Йенсена и методом с применением оборудования BBL MGIT AST, которые рассматривались в качестве референс-методов. Получено полное совпадение результатов чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам. Однако на плотных средах исследование заняло 28 дней, на жидких средах с применением оборудования BBL MGIT AST - 20 дней, а предлагаемым способом - всего 9 дней, при этом способ низкозатратен и удобен в исполнении.

Наиболее важным для лечения и прогноза заболевания является выявление мультирезистентности, то есть определение чувствительности M.tuberculosis к рифампицину и изониазиду.

Таким образом, предлагаемый способ, не требующий дорогостоящего оборудования и реактивов, сопоставим по результатам с традиционными методами и позволяет определить ЛЧ культур M.tuberculosis, что самое главное - к рифампицину и изониазиду, в течение 9 дней, что в несколько раз быстрее, чем другими методами, и позволяет осуществить своевременное назначение необходимой противотуберкулезной терапии и коррекцию проводимого лечения.

Изобретение относится к микробиологической диагностике лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам и может найти применение в бактериологических лабораториях противотуберкулезных учреждений. Предлагаемый способ определения лекарственной чувствительности M.tuberculosis осуществляют на питательной среде, состоящей из двух слоев. Для приготовления двухслойной среды стерильный ПФД (перфтордекалин) в количестве 2 мл помещают в пробирку, на него наслаивают 2 мл обогащенной среды Школьниковой. Таким образом формируют систему, нижнюю фазу которой составляет более тяжелый ПФД, а верхнюю - питательный бульон. Для разведения в среде готовят навески основных противотуберкулезных препаратов из чистых субстанций, затем порошки разводят стерильной дистиллированной водой, раствор вносят в питательную среду по 0,1 мл. В результате окончательная концентрация каждого из препаратов в среде соответствует критической. Тестируемый штамм в виде микробной взвеси вносят в каждую пробирку по 0,2 мл. Микробный рост в пробирках с противотуберкулезными препаратами оценивают по сравнению с ростом в контроле с помощью 2% раствора ТТХ (трифенил-тетразолия хлористого), который добавляют по 0,1 мл в каждую из 5 пробирок на 8 день культивирования. Затем пробирки инкубируют еще 24 часа, в течение этого периода колонии микобактерий, выросшие на границе фаз, окрашиваются в бордовый цвет. Культуру считают устойчивой, если интенсивность окрашивания колоний, выросших на границе фаз, в пробирке с препаратом примерно соответствует интенсивности окраски в контроле. При сравнении результатов точности определения лекарственной чувствительности с референс-методами получено полное совпадение результатов, однако способ по изобретению позволит сократить длительность определения до 9-ти дней. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза путем посева микробных клеток в жидкую обогащенную среду Школьниковой с противотуберкулезным препаратом, отличающийся тем, что посев осуществляют в двуслойную среду, нижний слой которой представляет собой перфтордекалин с концентрацией свободных ионов менее 10^-6 М и количеством недофторированных примесей менее 0,003 мас.%, а верхний слой - обогащенная среда Школьниковой при соотношении слоев 1:1, с последующей оценкой метаболической активности микробных клеток, и по степени метаболической активности определяют чувствительность или резистентность микобактерий к противотуберкулезному препарату.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что метаболическую активность определяют с помощью окрашивания микробных клеток растворов трифенил-тетразолия хлористого.