СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИНФИЛЬТРАТИВНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ, ВЫЗВАННОГО МНОЖЕСТВЕННО-ЛЕКАРСТВЕННОУСТОЙЧИВЫМИ И ВЫСОКОТОКСИЧНЫМИ ШТАММАМИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2011 года по МПК A61K31/4409 A61K31/573 A61K31/47 A61P31/06 

Изобретение относится к медицине, а именно фтизиатрии, и может быть использовано с целью лечения инфильтративного туберкулеза легких, вызванного множественно-лекарственноустойчивыми (МЛУ) и высокотоксичными штаммами микобактерий туберкулеза (МБТ).

Эффективность лечения туберкулеза решающим образом зависит от скорости определения лекарственной чувствительности возбудителя к противотуберкулезным препаратам. Сопоставление клинической картины заболевания, эффективности химиотерапии туберкулеза со свойствами вирулентности и лекарственной устойчивостью МБТ позволяют дать прогностическую оценку течению туберкулезного процесса и осуществить наиболее оптимальную коррекцию режимов химиотерапии.

Прототипом предлагаемого изобретения явилась работа, задачей которой было лечение множественно-лекарственного туберкулеза (Анализ случаев смерти от туберкулеза в Архангельской области в 2004 г. / Е.И.Никишова, Н.И.Низовцева, А.О.Марьяндышев // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2006. - № 12. - С.54-57).

Однако авторы не использовали в режимах химиотерапии данного контингента больных изониазид, в том числе в виде интенсивного внутривенного введения, а также не учитывали цитотоксичность возбудителя туберкулеза и ее клиническое значение для режимов химиотерапии, что снижает эффективность лечения МЛУ туберкулеза.

Применение современных автоматизированных систем с использованием жидких сред - ВАСТЕС MGIT 960 (Becton Dickinson) или BacT/Alert 3D (BioMerieux) сокращает время обнаружения возбудителя и с учетом определения чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам составляет 2-3 недели. Однако на современном этапе существует возможность использования трехмерных биологических наночипов, позволяющих выявлять МБТ и идентифицировать мутации на генетическом уровне по молекулярно-генетическим маркерам резистентности за 1 сутки. Такими маркерами являются определенные мутации в бактериальных генах - rpoB для рифампицина и katG, inhA и в регуляторном регионе между генами ahpC и oxyR для изониазида.

Исследования показали, что в режиме лечения МЛУ-туберкулеза обязательно использование изониазида. Особенностью резистентных форм специфического процесса является сохранение чувствительности к средним и высоким концентрациям изониазида (в 85% среди всех штаммов МБТ с устойчивостью к изониазиду), что при увеличении дозы препарата (до 15-20 мг/кг) позволяет проводить адекватную химиотерапию.

Установлена зависимость тяжести туберкулезного процесса от цитотоксических свойств возбудителя. При высокой цитотоксичности МБТ чаще определяются выраженные симптомы интоксикации (75% наблюдений), наиболее значительные изменения в периферической крови, обильное бактериовыделение (61,1%), двухсторонняя и полисегментарная распространенность специфического процесса (76,5%).

Идентификация мутации в бактериальных генах и выявление высокой цитотоксичности МБТ по тесту цитотоксичности с использованием перевиваемой линии человеческих моноцитарных клеток ТНР-1 является основанием для коррекции проводимого режима химиотерапии туберкулеза, а именно использования интенсивных режимов с внутривенным введением препаратов и удлинения сроков интенсивной фазы терапии.

Задачей предлагаемого способа является повышение эффективности лечения инфильтративного туберкулеза легких, вызванного МЛУ МБТ и высокотоксичными штаммами микобактерий туберкулеза.

Задача осуществляется за счет того, что при выявлении множественной лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза больному назначают фторхинолоны и изониазид внутривенно, а также преднизолон в дозе 25-30 мг в течение 1,5 месяцев, с последующей коррекцией дозы изониазида - при лекарственной устойчивости к малым концентрациям изониазид вводят внутривенно из расчета 15 мг/кг, а при лекарственной устойчивости к средним и высоким концентрациям - в дозе 20 мг/кг в два приема - внутривенно и per os 0,3 г с интервалом 5-6 часов, в случае же подтверждения высокотоксичных свойств микобактерий продлевают интенсивный режим терапии до 8-10 месяцев.

Способ осуществляется в несколько этапов.

Определение лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза с использованием трехмерных биологических наночипов.

Биочип содержит 72 иммобилизованных дискриминирующих зонда, 3 маркерные ячейки для корректного обсчета интенсивности флуоресценции с использованием программного обеспечения и 2 ячейки пустого геля, играющие роль отрицательного контроля. Гелевые ячейки, содержащие олигонуклеотиды, объединены в 21 группу таким образом, что сравнение интенсивности флуоресцентных сигналов ячеек внутри каждой группы позволяет сделать заключение о наличии или отсутствии мутации, приводящей к замене одного аминокислотного остатка. Тест-система «ТБ-Биочип» позволяет выявить 27 мутаций в гене rpoB и 21 мутацию в генах katG, inhA, ahpC.

Способ осуществляется проведением ряда последовательных этапов, включающих деконтаминацию клинического материала, лизис микроорганизмов и выделение ДНК, две последовательные стадии мультиплексной ПЦР, гибридизацию полученных ПЦР продуктов (ампликонов) на биологическом микрочипе, регистрацию и интепретацию полученных результатов:

1. Выделение тотальной ДНК из респираторного материала (мокрота, промывные воды бронхов, смыв с бронхиального дерева). Данный этап включает пробоподготовку исследуемого материала (деконтаминацию клинического материала), респираторный материал заливается двумя объемами приготовленного раствора (4% NaOH, 1.45% Na-citrate, 0.5% N-acetyl-L-cysteine). Постоянно перемешивается при комнатной температуре в течение 15 мин, затем заливается 10 объемами 6,7 ммоль/л фосфатным буфером (рН 7,4) и центрифугируется 15 мин при скорости 4000 об/мин. Надосадочная жидкость сливается. Процедура повторяется дважды, полученный осадок ресуспезируется в 0,5 мл фосфатного буфера и аликвота в 0,1 мл используется для выделения ДНК. Тотальная ДНК выделяется с помощью набора для выделения «Проба НК» компании «ДНК-технология» Москва, Россия.

2. Первая стадия ПЦР служит для амплификации:

- специфичной для МБТ нуклеотидной последовательности IS6110-элемента,

- фрагментов генома МБТ, отвечающих за резистентность. При следующем режиме амплификации:

95°С - 4 мин предварительная денатурация - 1 цикл,

95°С - 3 0 сек денатурация ДНК,

67°С - 30 сек отжиг праймеров,

72°С - 30 сек достройка праймеров - 36 циклов,

72°С - 5 мин завершающая инкубация - 1 цикл.

После проведения ПЦР результаты регистрируют с помощью горизонтального электрофореза в агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. На вторую стадию отбираю ампликоны, в которых был выявлен при проведении гел-документации набор полос следующего размера: 309 п.н. (IS6110), 212 п.н. (rpoB), 166 п.н. (katG), 133 п.н. (inhA) и 126 п.н. (ahpC).

3. Вторая стадия ПЦР проводится по ассимитричному типу и служит для получения преимущественно одноцепочечных ПЦР продуктов (используя ампликоны, полученные на 1 стадии) с одновременным введением в них флуоресцентной метки при следующем режиме амплификации:

95°С - 5 мин предварительная денатурация - 1 цикл,

95°С - 20 сек денатурация ДНК,

65°С - 30 сек отжиг праймеров,

72°С - 30 сек достройка праймеров - 37 циклов,

72°С - 5 мин завершающая инкубация - 1 цикл.

После проведения ПЦР результаты регистрируют с помощью горизонтального электрофореза в агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. Результаты второй стадии ПЦР не подлежат учету и 10 мкл реакционной смеси используют для проведения гибридизации.

4. Гибридизация. К 10 мкл реакционной смеси добавляют 20 мкл гибридизационного буфера, перемешивают на вортексе и полученную смесь заливают в гибридизационную камеру биочипа. Заполненный чип помещают в суховоздушный термостат при температуре 37°С на 3-6 часов.

5. Учет результатов гибридизации регистрируют с помощью комплекса аппаратно-программного оборудования для анализа изображения биологических микрочипов в автоматическом режиме согласно рекомендациям производителя.

При получении данных устойчивости возбудителя к изониазиду и рифампицину (методом ПЦР, в среднем через 5-7 дней от момента поступления в клинику) назначается интенсивный режим химиотерапии с внутривенным введением изониазида (в дозе 10 мг/кг), фторхинолонов и преднизолона.

При получении культуры МБТ и определении устойчивости к различным концентрациям изониазида (в среднем через 1,5 месяца) осуществляется коррекция дозы основного противотуберкулезного препарата: при лекарственной устойчивости к малым концентрациям изониазид вводят внутривенно из расчета 15 мг/кг, а при лекарственной устойчивости к средним и высоким концентрациям - в дозе 20 мг/кг в два приема - внутривенно и per os 0,3 г с интервалом 5-6 часов.

Исследование индукции клеточной гибели (цитотоксичности).

Исследуемые штаммы МБТ пересевали на среду Левенштейна-Йенсена, в опытах использовали 2-ю - 5-ю генерации, возраст культуры - 3 недели.

Полную лопатку культуры МБТ вносили в сухую стерильную пробирку с 8-9 стеклянными бусами, помещали пробирку в "Вортекс" на 30 сек для растирания. В пробирку добавляли питательный бульон Middlebrook 7H9 с ростовой добавкой OADC и 0,02% Tween 80 и вновь помещали в "Вортекс" на 10 сек. Затем суспензию оставляли на 1 час для осаждения крупных частиц и обрабатывали ультразвуком в ванне (ультразвуковая ванна УЗВ7-0,063/37). Цель добавления Tween 80, как и применения ультразвука, - приготовление суспензии, состоящей из одиночных клеток микобактерий, избавление от агрегатов, образование которых свойственно для МБТ. Затем суспензии культур доводили до 5 ед. по стандарту мутности, разводили бульоном Миддлбрука в 10 раз и термостатировали при 37°С 3 суток. Полученную субкультуру вновь обрабатывали ультразвуком, доводили до оптической плотности, равной 0,066 и 0,033 при 600 нм (спектрофотометр "Ultraspect 2000"). В опытах использовали клетки ТНР-1 - человеческой моноцитоподобной клеточной линии. Клетки засевали в питательную среду DMEM/F12 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (ЭСК) и выращивали при 37°С в 5% СО₂ (CO₂-инкубатор МСО 5АС фирмы "Sanyo"). Затем моноциты помещали в 96-луночный планшет для культур клеток, по 50 мкл/лунку. Конечное число клеток/лунку - 3×10⁴. Дифференцировку и адгезию клеток осуществляли форболовым эфиром (РМА, phorbol myristat acetate, Sigma), добавляя его в конечной концентрации 50 нМ в объеме 50 мкл/лунку. Затем клетки инкубировали 48 ч при 37°С в 5% CO₂, среду меняли на свежую без РМА и культивировали еще 24 ч часа в тех же условиях. Клетки ТНР-1 заражали штаммами пропорциях: 50:1 бактерий/макрофаг. Зараженные клетки инкубировали при 37°С в 5% СO₂ в течение 96 часов. Содержимое лунок в планшетах фиксировали 10% раствором формалина и окрашивали 0,1% раствором генцианвиолета в течение 30 минут, а затем промывали проточной водой в течение 15 минут. После просушки и обработки 0,2% раствором Triton Х-100 (для лизирования клеточных структур и выхода красителя в раствор) супернатант перемещали в чистый 96-луночный планшет для дальнейшей оценки оптической плотности (ОП) в планшетном фотометре (EIA Microwell Reader II, Sigma). Процент гибели инфицированных клеток вычисляли по формуле:

% погибших клеток = (ОП контроля-ОП образца/ОП контроля)×100%

Цитотоксичность штамма исследовали в сравнении с музейным штаммом H₃₇Rv: как высокую, если процент гибели макрофагов был достоверно выше, среднюю - при значениях, колеблющихся в пределах доверительного интервала средних значений стандартного штамма, низкую - при достоверно меньших значениях.

При получении результатов цитотоксичности МБТ (в среднем через 2-2,5 месяца) решается вопрос о сроках интенсивных режимов терапии. Для пациентов-бактериовыделителей высокоцитотоксичных МЛУ - штаммов МБТ срок интенсивных режимов терапии удлиняется до 8-10 месяцев.

Результат проведенного исследования основан на результатах определения чувствительности и цитотоксичности МБТ и клинического наблюдения 52 больных инфильтративным туберкулезом легких, получавших интенсивные режимы химиотерапии с внутривенным введением изониазида, фторхинолонов, у этой же группы пациентов при получении данных цитотоксичности культуры удлинялся срок интенсивной фазы терапии в среднем до 6 месяцев. В качестве контрольной группы изучены клинико-рентгенологические показатели 42 больных, получавших лечение соответственно приказу №109. По клинико-рентгенологическим параметрам группы репрезентативны. Установлено, что применение метода позволяет повысить эффективность терапии туберкулеза легких по основным клинико-рентгенологическим показателям (табл.1, 2).

Таблица 1 Динамика прекращения бактериовыделения (методом бактериоскопии) Группы больных МБТ 2 мес 4 мес 6 мес (+) МБТ (-) МБТ (-) МБТ (-) Абс % Абс % Абс % 1 группа 42 1 2,4 12 28,5 22 52,3 n=42               2 группа 52 38 73,1 46 88,5 50 96,1* n=52               * - р<0,05

Таблица 2 Закрытие полостей распада Группы больных CV(+) 2 мес 4 мес 6 мес n=96   CV (-) CV (-) CV (-)   Абс % Абс % Абс % 1 группа 42 0 0 7 16,7 19 45,2 n=42               2 группа 52 19 36,5 41 78,8 47 90,4 n=52               * p<0,05

Клиническое наблюдение

Больная ПЭС, 13.11.1985 года рождения.

Поступила в стационар 07.09. Тубконтакт не известен. Изменения в легких выявлены при обращении к врачу по поводу ухудшения самочувствия. После дообследования установлен диагноз «Инфильтративный туберкулез нижней доли правого легкого в фазе распада и обсеменения, МБТ (+)». После поступления в СПбНИИФ наряду с общепринятым комплексом обследования были проведены исследования мокроты на МБТ с помощью ПЦР и через 2 недели получены результаты теста лекарственной чувствительности методом трехмерных биологических наночипов и установлена множественная лекарственная устойчивость МБТ. Противотуберкулезная терапия назначена с учетом чувствительности к препаратам с внутривенным введением изониазида, цепрова и преднизолона. Выявлено сохранение чувствительности штамма МБТ к средним и высоким концентрациям изониазида и проведена коррекция дозы с увеличением до 15 мг/кг. После получения данных о высокой степени цитотоксичности штамма МБТ интенсивная фаза терапии продлена до 10 месяцев. Через 3 месяца проведенного лечения у пациентки прекратилось бактериовыделение, через 9 месяцев перестала определяться полость деструкции. Таким образом, ускоренное определение ЛУ МБТ методом трехмерных биологических наночипов и цитотоксичности МБТ позволило скорректировать режим химиотерапии и сроки интенсивной фазы лечения, что позволило добиться клинического излечения туберкулеза органов дыхания у пациентки с МЛУ и высокой степенью цитотоксичности МБТ.

Изобретение относится к медицине, а именно фтизиатрии, и может быть использовано с целью лечения инфильтративного туберкулеза легких (ИТЛ), вызванного множественно-лекарственноустойчивыми и высокотоксичными штаммами микобактерий туберкулеза (МЛУ МБТ). При выявлении множественной лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза больному назначают фторхинолоны и изониазид внутривенно, а также преднизолон в дозе 25-30 мг в течение 1,5 месяцев. Затем проводят интенсивный режим терапии с коррекцией дозы изониазида - при лекарственной устойчивости к малым концентрациям изониазид вводят внутривенно из расчета 15 мг/кг, а при лекарственной устойчивости к средним и высоким концентрациям - в дозе 20 мг/кг в два приема - внутривенно и per os 0,3 г с интервалом 5-6 часов, в случае же подтверждения высокотоксичных свойств микобактерий продлевают интенсивный режим терапии до 8-10 месяцев. Использование изобретения позволяет повысить эффективность лечения ИТЛ, вызванного МЛУ МБТ, за счет проведения оптимальной коррекции режима химиотерапии и сроков интенсивной фазы лечения. 2 табл.

Способ лечения инфильтративного туберкулеза легких, вызванного множественно-лекарственноустойчивыми и высокотоксичными штаммами микобактерий туберкулеза путем использования противотуберкулезных препаратов, отличающийся тем, что при выявлении множественной лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза больному назначают фторхинолоны и изониазид внутривенно, а также преднизолон в дозе 25-30 мг в течение 1,5 месяцев, затем проводят интенсивный режим терапии с коррекцией дозы изониазида - при лекарственной устойчивости к малым концентрациям изониазид вводят внутривенно из расчета 15 мг/кг, а при лекарственной устойчивости к средним и высоким концентрациям - в дозе 20 мг/кг в два приема - внутривенно и per os 0,3 г с интервалом 5-6 ч, в случае же подтверждения высокотоксичных свойств микобактерий продлевают интенсивный режим терапии до 8-10 месяцев.