Способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии у мужчин с сахарным диабетом 2 типа на основе генотипирования полиморфизма rs836478 гена RAC1 Российский патент 2022 года по МПК G01N33/52 G01N33/49 C12Q1/6804 C12Q1/6827 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии у мужчин славянского этноса с сахарным диабетом 2 типа.

Сахарный диабет 2 типа является самым распространенным эндокринологическим заболеванием, патогенетическую основу которого составляют нарушения в системе редокс-гомеостаза, такие как дефицит продукции эндогенных антиоксидантов и избыточное образование свободных радикалов [Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase p22phox subunit polymorphisms, systemic oxidative stress, endothelial dysfunction, and atherosclerosis in type 2 diabetes mellitus / G. Osmenda, P. T. Matusik, T. Sliwa [et al.] // Polish archives of internal medicine. - 2021. - Vol.131, Iss. 5. - P. 447-454]. Обозначенные патологические изменения способствуют формированию в клетках и тканях окислительного стресса - ведущей причины развития микрососудистых осложнений, включая диабетическую ретинопатию [Oxidative stress and inflammation in renal and cardiovascular complications of diabetes / A. Charlton, J. Garzarella, K. A. Jandeleit-Dahm, J. C. Jha // Biology. - 2021. - Vol.10, Iss. 1. - Art. 18. - URL: https://doi.org/10.3390/biology10010018 (date of the application: 10.12.2021)]. Основным источником супероксид-радикала в клетках является мультимерный комплекс НАДФН-оксидаза, регуляторной субъединицей которого служит малая ГТФ-аза RAC1, кодируемая соответствующим геном [Sies, H. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents / H. Sies, D. P. Jones // Nature reviews. Molecular cell biology. - 2020. - V. 21, Iss. 7. - P. 363-383]. По данным транскриптомного анализа GTex Portal полиморфный вариант rs7784465 ассоциирован с увеличением экспрессии гена RAC1 в широком спектре тканей [https://www.gtexportal.org].

Известен способ прогнозирования формирования микрососудистых осложнений сахарного диабета 2 типа по патенту на изобретение RU2741715C1 (публикация: 28.01.2021) с помощью клинико-анамнестических и лабораторных данных. У пациента определяют возраст, стаж диабета, креатинин, ACT, общий холестерин, скорость клубочковой фильтрации, уровень постпрандиальной гликемии, содержание гликированного гемоглобина (HbA1c), индекс атерогенности. При сочетании таких факторов, как возраст старше 57,7 лет, стаж диабета более 10,3 лет, уровень постпрандиальной гликемии более 7,9 ммоль/л, содержание общего холестерина выше 5,05 ммоль/л, прогнозируют развитие микрососудистого осложнения СД 2 типа в виде диабетической ретинопатии. При сочетании факторов - возраст старше 63 лет, стаж диабета больше 8 лет, уровень креатинина более 94,17 мкмоль/л, скорость клубочковой фильтрации ниже 77,4 мл/мин/1,73 м², уровень гликированного гемоглобина (HbA1c) выше 9,58%, показатель индекса атерогенности выше 3,7% и уровень ACT более 21,4 ед/л - прогнозируют развитие микрососудистого осложнения СД 2 типа в виде диабетической нефропатии.

Недостаток метода заключается в том, что он разработан без учета индивидуальных генетических особенностей пациентов с сахарным диабетом 2 типа.

Известен способ прогнозирования развития диабетической ретинопатии (патент на изобретение RU 2124727C1, дата публикации 10.01.1999), включающий иммунологическое исследование слезной жидкости с определением концентрации иммуноглобулина А. При значениях не менее 0,20 г/л прогнозируют переход непролиферативной стадии диабетической ретинопатии в пролиферативную.

Недостаток метода заключается в том, что он не позволяет спрогнозировать склонность пациента с сахарным диабетом 2 типа к развитию диабетической ретинопатии как таковой, прогнозируя риск перехода одной стадии диабетической ретинопатии - непролиферативной - в другую, пролиферативную.

Наиболее близок по результату исследования способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 у якуток по патенту на изобретение RU2461005C1 (дата публикации 10.09.2012), включающий забор образца периферической венозной крови, выделение ДНК и анализ полиморфизма T45G полиморфизм гена адипонектина (ADIPOQ). При выявлении генотипа Т/Т и аллеля Т прогнозируют риск развития диабетической ретинопатии.

В данном изобретении выявлена связь предрасположенности к диабетической ретинопатии у якуток, что подтверждает невозможность использования этого способа для мужчин Славянского этноса.

Технический результат заключается в получении критериев оценки риска формирования диабетической ретинопатии у мужчин Славянского этноса с сахарным диабетом 2 типа по данным о генетическом полиморфизме rs836478 (С>Т).

Технический результат достигается тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта гена малой ГТФ-азы RAC1 rs836478 (С>Т) и прогнозируют повышенный риск формирования диабетической ретинопатии у мужчин с сахарным диабетом 2 типа в случае выявления генотипа rs836478-Т/Т, а при обнаружении генотипов rs836478-С/Т и rs836478-С/С - низкий риск развития диабетической ретинопатии у мужчин с сахарным диабетом 2 типа.

Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация генотипов по локусу гена RAC1 rs836478 при генотипировании на основе масс-спектрометрии: генотипы rs836478-С/С показаны оранжевым цветом, генотипы rs836478-С/Т показаны зеленым цветом, генотипы rs836478-Т/Т показаны голубым цветом.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс.об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс.об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

Экстракция геномной ДНК из цельной крови колоночным методом проводилась с помощью набора QIAamp DNA blood mini kit (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QiaCube (QIAGEN, Германия). Роботизированный протокол продолжительностью 58 минут включал этап лизиса клеток 0,2 мл цельной крови с помощью лизирующего буфера и протеиназы К QIAGEN, инкубирование, перенос лизата в колонку, связывание ДНК с мембраной колонки, центрифугирование, двукратное промывание колонки буфером AW1 и AW2, центрифугирование колонки и, наконец, элюирование очищенной ДНК. Получаемый раствор ДНК в воде имел идеальную чистоту А260/280=1,7-1,9 и среднюю концентрацию около 40-50 нг/мкл. Экстрагированные из крови образцы ДНК хранились в морозильниках Thermo Fisher Scientific (США) при -20°С.

2. Подготовка образцов ДНК к масс-спектрометрическому анализу. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 10 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs836478 гена RAC1 - генотипирование методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF. Использовали следующие последовательности праймеров: прямой F: 5`- ACGTTGGATGCCTATCCGCAAACAGTAAGG -3`, обратный R: 5`- ACGTTGGATGATGCACTAATTAAGCGCTCG -3`, праймер удлинения E: 5`-ATTATATACTCTAAAAGACACATTAAAA-3`. Для приготовления ПЦР-микса (в расчете на один спектральный чип) в центрифужную микропробирку вносили 80,6 мкл ddH2O, 50,4 мкл 10x буфера, 40,3 мкл MgCl2 (концентрация 25 ммоль/л), 10,1 мкл смеси дНТФ (концентрация 25 ммоль/л), 100,8 мкл смеси ПЦР-праймеров (концентрация 0,5 мкмоль/л) и 20,16 мкл HotStartTaq полимеразы (концентрация 5 ЕД/мкл). Смесь вортексировали и раскапывали в 96-луночный ПЦР-планшет по 3 мкл в лунку, после чего с помощью восьмиканального дозатора вносили по 2 мкл ДНК (концентрация 10 нг/мкл). Планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 125 мин при следующем режиме: денатурация 2 мин при 95°С, амплификация 44 цикла, состоящая из денатурации 30 сек при 95°С, отжига 30 сек при 56°С и элонгации 60 сек при 72°С. После чего пробы инкубировали 5 мин при 72°С. Не прореагировавшие в ходе ПЦР дНТФ удаляли с помощью реакции SAP (shrimp alkaline phosphatase), в ходе которой щелочная фосфатаза креветки гидролизовала дНТФ до нуклеозидов и фосфатов. Для приготовления SAP-микса в микропробирке смешивали 161,6 мкл ddH2O, 18 мкл 10xTS буфера и 31,7 мкл SAP фермента. Далее вносили по 2 мкл SAP-смеси в каждую лунку, планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 55 мин при следующем режиме: 45 мин при 37°С и 10 мин при 85°С.Для проведения третьей реакции iPLEX готовили Е-праймер-микс из расчета 8,8 мкл праймеров Е1-Е9, 11,7 мкл праймеров Е10-Е18, 14,6 мкл праймеров Е19-Е27, 17,5 мкл праймеров Е28-Е35 и 45,1 мкл ddH2O. После масс-спектрометрической оценки интенсивности пиков Е-праймеров в полученной смеси, в микс добавляли Е-праймеры в количествах, необходимых для достижения одинаковой интенсивности сигнала. Для приготовления iPLEX-микса в микропробирке смешивали 65,4 мкл ddH2O, 21,2 мкл iPLEX буфера, 21,2 мкл терминирующей смеси, 99,3 мкл Е-праймер-микса и 4,33 мкл iPLEX-фермента, вортексировали и раскапывали в лунки по 2 мкл. Планшет заклеивали, центрифугировали 20 секунд при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 135 мин при следующем режиме: денатурация 30 сек при 94°С, затем 40 циклов, состоящие из денатурации 5 сек при 94°С, отжига 5 сек при 52°С, элонгации 5 сек при 80°С, с последующим инкубированием в течение 3 мин при 72°С. По завершении реакции iPLEX, планшет охлаждали до +4°С, добавляли по 30 мкл воды во все лунки, центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин и загружали в масс-спектрометр. Ввиду того, что небольшие полярные молекулы и положительно заряженные катионы натрия и калия могут образовывать аддукты с олигонуклеотидами и создавать серию контаминантных пиков, ампликоны были подвергнуты роботизированному обессоливанию путем их обработки смолой SpectroCLEAN (Agena Bioscience). Перенос образцов на спектральный чип с матрицей для ионизации осуществлялся в автоматическом режиме на рабочей станции Nanodispenser. Пример кластерного распределения генотипов по SNP rs836478 в результате масс-спектрометрического анализа на геномном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience) показан на рисунке 1.

Статистические расчеты проводили с помощью программы SNPStats (Solé, X., Guinó, E., Valls, J., Iniesta, R., & Moreno, V. (2006). SNPStats: a web tool for the analysis of association studies. Bioinformatics, 22(15), 1928-1929).

4. Прогнозирование повышенного риска формирования диабетической ретинопатии в случае выявления генотипа rs836478-T/Т и пониженного риска развития этого осложнения сахарного диабета 2 типа при выявлении генотипов rs836478-С/Т и rs836478-С/С.

Возможность использования предложенного способа для определения риска развития диабетической ретинопатии у мужчин подтверждает анализ результатов наблюдений 447 пациентов с СД2, у 269 из которых установлена диабетическая ретинопатия. В исследование включались лица славянской национальности Славянского этноса. Диагноз СД2 был установлен врачами-эндокринологами ОБУЗ ГК БСМП на основе клинического и лабораторно-инструментального обследования. Установлено, что генотипы rs836478-С/Т и rs836478-С/С значимо чаще встречались у мужчин без диабетической ретинопатии (85,4%) по сравнению с больными СД2, имеющими данное осложнение основного заболевания (74,0%). Генотип rs836478-Т/Т значимо чаще встречался у пациентов с СД2 и диабетической ретинопатией (26,0%) по сравнению с больными СД2 без данного осложнения (14,6%). Носительство генотипа rs836478-Т/Т RAC1 ассоциировалось с повышенным риском развития диабетической ретинопатии: OR=2,11, 95% CI 1,26-3,53, P=0,0034 (таблица 1).

Таблица 1 Ассоциация полиморфного варианта rs836478 гена RAC1 с диабетической дистальной нейропатией у женщин с сахарным диабетом 2 типа Ген
(SNP ID) Гено-
тип, аллель Больные с СД2, n (%) _adjP³ _adjOR (95% CI)⁴ Без диабетической ретинопатии
(n=178) С диабетической ретинопатии
(n=269) RAC1
С>Т
rs836478 C/C-С/T 152 (85,4%) 199 (74,0%) 0,0034 1.00 Т/T 26 (14,6%) 70 (26,0%) 2,11 (1,26-3,53) Т 39,6% 49,8% 0,003 1,15-1,99 ¹Уровень значимости ассоциации с поправками на ковариаты - возраст и индекс массы тела;
²Отношения шансов и 95% доверительный интервал с поправками на ковариаты - возраст и индекс массы тела.

Резюме

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что генотип rs836478-Т/Т RAC1 является генетическим фактором риска развития диабетической ретинопатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа (OR=2,11).

Использование предложенного способа позволит прогнозировать развитие диабетической ретинопатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа, что даст возможность осуществлять мероприятия по профилактике данного осложнения - диспансерное наблюдение, регулярный осмотр офтальмолога, контроль уровня глюкозы в крови.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии у мужчин с сахарным диабетом 2 типа. Осуществляют забор образца периферической венозной крови. После экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта гена малой ГТФ-азы RAC1 rs836478 (С>Т). В случае выявления генотипа rs836478-Т/Т прогнозируют повышенный риск формирования диабетической ретинопатии у мужчин с сахарным диабетом 2 типа. При обнаружении генотипов rs836478-С/Т и rs836478-С/С прогнозируют низкий риск развития диабетической ретинопатии у мужчин с сахарным диабетом 2 типа. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска формирования диабетической ретинопатии у мужчин славянского этноса с сахарным диабетом 2 типа по данным о генетическом полиморфизме rs836478 (С>Т). 1 ил., 1 табл.

Способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии у мужчин с сахарным диабетом 2 типа, включающий забор образца периферической венозной крови, отличающийся тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта гена малой ГТФ-азы RAC1 rs836478 (С>Т) и прогнозируют повышенный риск формирования диабетической ретинопатии у мужчин с сахарным диабетом 2 типа в случае выявления генотипа rs836478-Т/Т, а при обнаружении генотипов rs836478-С/Т и rs836478-С/С – низкий риск развития диабетической ретинопатии у мужчин с сахарным диабетом 2 типа.