КОНЪЮГАТЫ ДИСОРАЗОЛОВ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ИХ ОСНОВЕ, НАЗВАННЫЕ КОНЪЮГАТЫ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА, НАБОР И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2013 года по МПК C07K14/655 C07K14/59 C07D498/22 A61K31/424 A61K38/24 A61K38/31 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к конъюгатам дисоразолов и их производных с молекулами, связывающими клетки, такими как пептиды и белки, а также к новым дисоразоловым производным и способам их получения. Данные соединения можно использовать в качестве лекарственных препаратов, в частности, для лечения различных опухолей.

Уровень техники

В течение последующих нескольких лет во всем мире ожидают резкое повышение уровня онкогенеза и связанных с опухолями случаев смерти. В 2001 г. во всем мире приблизительно 10 миллионов человек страдали от рака и более 6 миллионов человек умерли от данного заболевания. Развитие опухолей является основным заболеванием высших организмов в царстве растений, в царстве животных и у человека. В общем признанная многостадийная модель канцерогенеза позволяет предположить, что в результате накопления ряда мутаций в индивидуальной клетке она так модифицируется в поведении пролиферации и дифференцировки, что, наконец, через доброкачественные промежуточные стадии достигается злокачественное состояние с метастазами.

Термин рак или опухоль включает клиническую картину более чем двух сотен различных самостоятельных заболеваний. Онкогенез может протекать доброкачественным или злокачественным образом. Наиболее важными опухолями являются опухоли легкого, молочной железы, желудка, шейки матки, простаты, головы и шеи, толстой и тонкой кишки, печени и кровеносной системы. Имеется большая разница в плане протекания, прогноза и ответа на лечение. Более чем 90% выявленных случаев относятся к солидным опухолям, которые, в частности, на запущенной стадии или на стадии метастазирования излечиваются с трудом или являются неизлечимыми. Тремя основными принципами борьбы с раком до сих пор являются хирургическое удаление, облучение и химиотерапия. Несмотря на большие преимущества, до настоящего времени невозможно было разработать лекарственные препараты, которые приводят к заметному увеличению времени выживаемости или даже полному излечению при широко распространенных солидных опухолях. Вследствие этого изобретение новых лекарственных препаратов для борьбы с раком имеет большое значение.

Природные вещества представляют собой важный источник новых перспективных структур в фармацевтическом исследовании и в ряде случаев также непосредственно подходят для создания нового лекарственного препарата (см. статью Shu Y, J. Nat. Prod. 1998, 61: 1053-1071). Известно, что многие природные вещества обладают сильным цитотоксическим действием (см. Ram VJ et al., Drug News Perspect 2001, 14(8):465-482).

Известно, что природные вещества группы, состоящей из дисоразолов, выделены из бактериального штамма Sorangium cellulosum So ce12 (см. статью Jansen R et al., Liebigs Ann. Chem. 1994, (8): 759-773).

В целом выделено и физико-химически охарактеризовано 29 дисоразолов. Для дисоразола А1 показано, что он обладает антипролиферативным действием на клеточных моделях (см. статьи Irschik H et al., J. Antibiotics 1995, 48(1): 31-35; Elnakady YA, Dissertation 2001, Technische Universitat Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig). Однако использование для лечения онкологических заболеваний не описано и не предполагалось. Биологическое исследование других дисоразолов не проводилось.

В заявке WO 2004/024149 представлены данные о том, что, в частности, дисоразолы Е1 и D1 обладают цитотоксическим действием на различные линии опухолевых клеток человека. В нано- и пикомолярных концентрациях происходит ингибирование деления, в числе прочих, клеток карциномы яичников, карциномы простаты, глиобластомы, карциномы легкого и рака молочной железы. Действие дисоразолов Е1 и D1 является в данном случае зависимым от клеточного цикла. Даже в наномолярных концентрациях клеточный цикл поддерживается в фазе G2/M и раковые клетки вводят в апоптоз.

В заявке WO 2004/024149 далее показано, что антипролиферативное действие дисоразолов основано, в числе прочего, на эффективном ингибировании полимеризации тубулина. Кроме того, дисоразол Е1 активен в отношении паклитаксел- и виндезин-усточивых клеточных линий. Это имеет значение, в частности, потому, что дисоразол А1 непригоден для использования в качестве цитостатика (см. Hoefle G, Annual Report 1999/2000 of the Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung (GBF), стр.101/103).

Wipf и коллеги исследовали клеточную активность дисоразола С и связь структура-активность восьми его аналогов (см. статью Wipf et al., Chem. Biol. Drug Des. 2006, 67(1): 66-73).

Общие стратегии синтеза в плане синтеза дисоразолов А1 и С1 исследованы и всесторонне описаны (см. статьи Hillier MC et al., J. Org. Chem. 2001, 66:6037-6045; Hartung IV et al., Organic Letters 2002, 4(19): 3239-3242; Wipf P et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126(47); 15346-15347).

Дисоразол А1 был также далее охарактеризован: показано, что он действует как антимитотический агент на полимеризацию тубулина и индуцирует апоптоз в клетках млекопитающих (см. статью Elnakady YA et al., Biochem. Pharmacol. 2004, 67(5): 927-935). Кроме того, получены продукты метанолиза дисоразола А1 и исследованы на потенциальную антипролиферативную активность (см. статью Hearn BR et al., J. Nat. Prod. 2006, 69(1):148-150).

Документы, соответствующие предшествующему уровню техники, направлены на биосинтез дисоразолов или родственных соединений: WO 2004/053065 описывает полинуклеотиды, которые кодируют дисоразол-поликетидсинтазу. Schupp и коллеги охарактеризовали кластер генов Sorangium cellulosum, ответственных за биосинтез макролидного антибиотика сорафена А (см. статью Schupp T et al., Journal of Bacteriology 1995, 177: 3673-3679). Биосинтетические гены, ответственные за биосинтез дисоразола, также охарактеризованы Carvalho R et al. (см. статью Carvalho R et al., Gene 2005, 359: 91-98), Kopp с коллегами (см. статью Kopp М et al., Chembiochem. 2005, 6(7); 1277-1286) и в заявке WO 2006/075013.

Однако ни в одном из вышеупомянутых документов, соответствующих предшествующему уровню техники, не раскрывают или не предполагают конъюгаты дисоразолов.

В патенте США №6214969 описаны аналоги рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона (LHRH) с цитотоксическими группами. Данные группы могут представлять собой также D/L-Mel(4-[бис(2-хлорэтил)амино]-D/L-фенилаланин), циклопропаналканоил, азиридин-2-карбонил, эпоксиалкил, 1,4-нафтохинон-5-оксикарбонил-этил, доксорубицинил (Доксорубицин, DOX), митомицинил (митомицин С), эсперамицинил или метотрексоил.

Однако отсутствует упоминание дисоразолов, которые ингибиторуют полимеризацию и индуцируют апоптоз, и не становится очевидным их применение.

Патент США №5843903 посвящен цитотоксическим антрациклиновым аналогам, таким как доксорубицин (DOX) или его производные с модифицированным даунозамином. Данные цитотоксические группы конъюгированы с пептидными гормонами, такими как LHRH, бомбезин и соматостатин и их аналоги.

Обзор Schally и Nagy посвящен новым терапевтическим способам воздействия на различные формы рака, которые состоят в том, что используются направленные цитотоксические аналоги LHRH, бомбезина и соматостатина, которые включают доксорубицин (DOX) или 2-пирролино-ООХ (см. статьи Schally AV et al., Life Sciences 2003, 72; 2305-2320; Nagy A et al., Current Pharmaceutical Design 2005, 11:1167-1180).

Во всех трех вышеуказанных ссылках дисоразолы не раскрываются или не предполагаются.

Другие документы, соответствующие предшествующему уровню техники, в которых рассматривают конъюгаты, содержащие цитотоксический агент, включают конъюгаты антитело-цитотоксический агент, предназначенные для применения при лечении рака (см. статью Chen J et al., Expert Opin. Drug DeNv. 2005, 2(5): 873-890), конъюгаты антитело-лекарственный препарат, предназначенные для применения в онкологии (см. статью Hamann PR, Expert Opin. Drug DeNv. 2005, 15(9); 1087-1103), конъюгаты противораковых лекарственных препаратов множества классов, предназначенные для применения в получении направленности на опухоль (см. статью Jaracz S et at., Bioorganic & Medicinal Chemistry 2005, 13: 5043-5054), конъюгаты алкалоидный цитотоксический фактор барвинка-олигопептид,

предназначенные для лечения рака простаты и/или доброкачественной гиперплазии простаты (WO 97/12624, WO 98/10651 и WO 99/02175), пролекарственные конъюгаты винбластин-пептидил, предназначенные для лечения рака простаты (см. статью Brady SF et al., J. Med. Chem. 2002, 45: 4706-4715), активируемые ферментом и протоном пролекарственные формы для избирательных противораковых препаратов (см. статью Tietze LF et al., Current Pharmaceutical Design 2003, 9: 2155-2175) пролекарственные формы природных антрациклинов, предназначенные для применения в направляемом антителом ферментном пролекарственном препарате (см. статью Michel S et al., Studies in Natural Products Chemistry 2000, 21: 157-180).

Снова во всех данных вышеуказанных ссылках не упоминают дисоразолы, которые, тем не менее, являются ингибиторами полимеризации тубулина и индуцируют апоптоз, и не предполагают их применение.

Раскрытие изобретения

Цель настоящего изобретения состоит в получении конъюгатов дисоразолов и их производных с молекулами, связывающимися с клетками. Другой целью, лежащей в основе изобретения, является получение новых производных дисоразолов. Следующей целью настоящего изобретения является разработка способов их получения. Еще одна цель, лежащая в основе изобретения, состоит в получении конъюгатов дисоразолов и их производных с молекулами, связывающими клетки, и новых производных дисоразолов, которые можно использовать в качестве лекарственных препаратов, в частности, предназначенных для лечения различных опухолей.

Цель изобретения неожиданно была достигнута в одном аспекте тем, что получены соединения, соответствующие формуле (I)

,

где А представляет собой группу дисоразола, соответствующую формуле II

где Ra_n, Rb_n, Rc_n, Rd_n, Re_m, Rf_m, Rg_m, Rh_m, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22, R23, R24 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из "водорода, алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, гетероциклила, гетероциклилалкила, алкилсульфонила, арилсульфонила, арилалкилсульфонила, галогена, гидроксила, карбонила, ацетила, карбоксила, сложного эфира карбоксила, амида, карбоната, карбамата, остатков α-аминокислот, остатков β-аминокислот, алкоксила, амино, имино, гидроксиламино, моноалкиламино, диалкиламино, гидразинила, циано, алкилциано, сульфгидрила, дисульфидилалкила и/или алкилсульфидила", которые необязательно замещены в алкильной, циклоалкилной, циклоалкилалкильной, арильной, гетероарильной, арилалкильной, гетероарилалкильной, гетероциклильной, гетероциклилалкильной, алкилсульфонильной, арилсульфонильной, арилалкилсульфонильной, карбонильной, ацетильной, карбоксильной, сложного эфира карбоксила, амидной, карбонатной, карбаматной, алкоксильной, моноалкиламино, диалкиламино, алкилциано, дисульфидилалкильной и/или алкилсульфидильной группе 1, 2 или 3 заместителями, независимо друг от друга выбранными из группы, состоящей из "алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, гетероциклила, гетероциклилалкила, алкилсульфонила, арилсульфонила, арилалкилсульфонила, галогена, -F, -Cl, -Br, -I, -N₃, -NO₂, =O, =S, =S(O)₂, гидроксила, карбонила, ацетила, карбоксила, сложного эфира карбоксила, -С(O)ОН, -С(O)NH₂, амида, карбоната, карбамата, остатков α-аминокислот, остатков β-аминокислот, алкоксила, амино, имино, гидроксиламино, моноалкиламино, диалкиламино, гидразинила, циано, алкилциано, сульфгидрила, дисульфидилалкила и/или алкилсульфидила"; необязательно любые два соседних радикала R из радикалов Ra_n, Rb_n, Rc_n, Rd_n, Re_m, Rf_m, Rg_m, Rh_m,, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R18, R19, R20, R21, R22, R23, R24 могут формировать атомную связь с образованием двойной связи или могут формировать эпоксидную(оксирановую), азирановую(азиридиновую),алкил-, циклоалкил-, циклоалкилалкил-, гетероарил-, арилалкил-, гетероарилалкил-, гетероциклил- и/или гетероциклилалкил-замещенную азирановую (азиридиновую), тиирановую и/или тииран-S-оксидную группу;

В1, В2 независимо друг от друга представляют собой линкер, который ковалентно связывает А с С1 и/или С2;

С1, С2 независимо друг от друга представляют собой связывающуюся с клетками молекулу, выбранную из группы, состоящей из "пептида, пептидного гормона, белка, белкового гормона, лиганда рецептора, белка плазмы крови, сывороточного белка, антитела, фрагмента антитела";

n означает 0, 1, 2, 3;

m означает 0, 1, 2, 3.

Чтобы избежать неопределенности, соединения, соответствующие вышеуказанным формулам (I) и (II), но также соединения, соответствующие нижеприведенным формулам (III)-(VI), могут присутствовать в форме всех возможных изомеров с двойной связью, таких как "чистые" Е- или Z-изомеры или смеси данных изомеров с двойной связью. Кроме того, относительно вышеуказанной формулы (II), а также нижеприведенных формул (III)-(VI), n/о=0 означает, что имеется только 6 атомов углерода между оксазольным циклом слева и карбоксигруппой справа. Что касается n/о=1, 2, 3, то это означает, что включено 8, 10 или 12 атомов углерода. Аналогичным образом это применимо к m/p=0, 1,2, 3, где соответственно 6, 8, 10 или 12 атомов углерода включено между оксазольным циклом справа и карбоксигруппой слева.

В предпочтительном варианте осуществления предусматривают соединения, соответствующие вышеуказанным формулам (I) и (II), где А представляет собой группу дисоразола, соответствующую формуле (III)

где Ri_o, Rj_o, Rk_p, Rl_p, Rm_p, Rn_p, R25, R26, R27, R28, R29, R30, R31, R32, R33, R34, R35, R36, R37, R38, R39, R40, R41, R42, R43, R44 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из "водорода, алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, гетероциклила, гетероциклилалкила, алкилсульфонила, арилсульфонила, арилалкилсульфонила, галогена, гидроксила, карбонила, ацетила, карбоксила, сложного эфира карбоксила, амида, карбоната, карбамата, остатков α-аминокислот, остатков β-аминокислот, алкоксила, амино, имино, гидроксиламино, моноалкиламино, диалкиламино, гидразинила, циано, алкилциано, сульфгидрила, дисульфидилалкила и/или алкилсульфидила", которые необязательно замещены в алкильной, циклоалкильной, циклоалкилалкильной, арильной, гетероарильной, арилалкильной, гетероарилалкильной, гетероциклильной, гетероциклилалкильной, алкилсульфонильной, арилсульфонильной, арилалкилсульфонильной, карбонильной, ацетильной, карбоксильной, сложного эфира карбоксила, амидной, карбонатной, карбаматной, алкоксильной, моноалкиламино, диалкиламино, алкилциано, дисульфидилалкильной и/или алкилсульфидильной группе 1, 2 или 3 заместителями, независимо друг от друга выбранными из группы, состоящей из "алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, гетероциклила, гетероциклилалкила, алкилсульфонила, арилсульфонила, арилалкилсульфонила, галогена, -F, -Cl, -Br, -I, -N₃, -NO₂, =O, =S, =S(O)₂, гидроксила, карбонила, ацетила, карбоксила, сложного эфира карбоксила, -С(O)ОН, -С(O)NH₂, амида, карбоната, карбамата, остатков α-аминокислот, остатков β-аминокислот, алкоксила, амино, имино, гидроксиламино, моноалкиламино, диалкиламино, гидразинила, циано, алкилциано, сульфгидрила, дисульфидилалкила и/или алкилсульфидила"; необязательно любые два соседних радикала R из радикалов Ri_o, Rj_o, Rk_p, Rl_p, Rm_p, Rn_p, R25, R26, R27, R28, R29, R30, R31, R32, R33, R34, R35, R36, R37, R38, R39, R40, R41, R42, R43, R44 могут формировать атомную связь с образованием двойной связи или могут формировать эпоксидную (оксирановую), азирановую (азиридиновую), алкил-, циклоалкил-, циклоалкилалкил-, гетероарил-, арилалкил-, гетероарилалкил-, гетероциклил- и/или гетероциклилалкил-замещенную азирановую (азиридиновую), тиирановую и/или тииран-S-оксидную группу;

o означает 0, 1, 2, 3;

p означает 0, 1, 2, 3.

В следующем предпочтительном варианте осуществления предусматривают соединения, соответствующие вышеуказанным формулам (I), (II) и (III) и вышеуказанным вариантам осуществления, в которых линкеры В1, В2 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из "ферментативно расщепляемого линкера, протеолитически расщепляемого линкера, саморазрушающегося линкера, кислотолабильного линкера, дисульфидного (обменивающегося) линкера, гидролитически лабильного линкера, бифункционального линкера, мультифункционального линкера, сложноэфирного линкера, пептидного линкера, линкера с 1, 2, 3, 4 или 5 остатками аминокислот, дипептидного линкера, тетрапептидного линкера, гидразонового линкера, гидразинового линкера, линкера на основе остатка дикарбоновой кислоты, полиэтиленгликолевого (ПЭГ) линкера".

В еще одном предпочтительном варианте осуществления предусматривают соединения, соответствующие вышеуказанным формулам (I), (II) и (III) и вышеуказанным вариантам осуществления, где линкеры В1, В2 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из: "Х1-алкил-Х2, Х3-циклоалкил-Х4, Х5-циклоалкилалкил-Х6, Х7-алкилциклоалкилалкил-Х8, Х9-арил-Х10, Х11-арилалкил-Х12, Х13-алкиларилалкил-Х14, Х15-гетероарил-Х16, Х17-гетероарилалкил-Х18, Х19-алкилгетероарилалкил-Х20, Х21-гетероциклил-Х22, Х23-гетероциклилалкил-Х24, Х25-алкилгетероциклилалкил-Х26", где Х1, Х2, Х3, Х4, Х5, Х6, Х7, Х8, Х9, Х10, Х11, Х12, Х13, Х14, Х15, Х16, Х17, Х18, Х19, Х20, Х21, Х22, Х23, Х24, Х25, Х26 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из "O-, S-, S-S-, С(O)O-, С(O)-, ОС(O)O-, С(O)NH-, OC(O)NH-, NHC(O)-NHC(O)O-, NH-, NY1-, C(O)NY2-, OC(O)NY3- NY4C(O)-, NY5C(O)O-, C=N-NH-, NH-N=C-, C=N-NY6-, NY7-N=C-", где Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из "алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, гетероциклила, гетероциклилалкила, галогена, -F, -Cl, -Br, -I, -N₃, -NO₂, гидроксила, алкоксила, амино, имино, гидроксиламино, гидразинила, циано, алкилциано, сульфгидрила";

оксалила, малонила, сукцинила, глутарила, адипинила, малеинила, фумарила; и

линкеров на основе следующих молекул: Gly-Phe-Leu-Gly, Phe-Lys, Val-Cit (цитруллин); 1,4-бис(аминометил)-циклогексана, 1,4-бис(аминометил)-циклогептана, 1,3-бис(аминометил)-циклопентана, 1-амино-4-(аминометил)-циклогексана, 1,4-диаминоциклогексана, 1,4-бис(аминометил)бицикло[2.2.2]октана, гамма-малеимидоапроилгидразида, 4-гидразиносульфонилбензойной кислоты, бифункционального линкера SMCC, MDS (метилдисульфанила), PEG2, PEG3, PEG7;

линкера Lilly:

;

линкера Lilly BAMME:

.

линкера Lilly ВАР:

;

цис-аконитового линкера:

;

линкера РАВС1:

;

линкера РАВС2:

;

линкера РАВС3:

линкера РАВС4:

линкера РАВС5:

;

линкера РАВС6:

.

Термин "линкер" в объеме настоящего изобретения предназначен для включения любого линкера, линкерной группы, спейсера и других молекул/групп, которые известны компетентному специалисту и подходят для связывания групп дисоразолов А со связывающими клетки молекулами С1 и/или С2.

В объем знаний компетентного специалиста входит использование подходящих активированных форм и/или радикалов вышеуказанных предпочтительных линкерных молекул для создания конечных конъюгатов.

Соответствующая литература предшествующего уровня техники, относящаяся к подходящим линкерам, включает, например статьи Michel S et al., Studies in Natural Products Chemistry 2000, 21:157-180; Tietze LF et at., Current Pharmaceutical Design 2003, 9:2155-2175; Brady SF et al., J. Med. Chem. 2002, 45:4706-4715; заявку WO 99/02175; статьи Jaracz S et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 2005, 13:5043-5054; Hamann PR, Expert Opin. Drug Deliv. 2005, 15(9): 1087-1103; Chen J et al., Expert Opin. Drug Deliv. 2005, 2(5):873-890; патенты США №5843903 и 6214969,

В другом предпочтительном варианте осуществления предусматривают соединения, соответствующие вышеуказанным формулам (I), (II) и (III) и вышеуказанным вариантам осуществления, где связывающие клетки молекулы С1, С2 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из "октамерного пептида, нонамерного пептида, декамерного пептида, аналога LHRH, агониста LHRH, антагониста LHRH, бомбезина, аналога бомбезина, антагониста бомбезина, соматостатина, аналога соматостатина, сывороточного альбумина, человеческого сывороточного альбумина (HSA), лиганда рецептора галанина, лиганда рецептора GAL1, лиганда рецептора GAL2, галанина (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №119418-04-1) и аналогов, лиганда рецептора соматостатина, лиганда рецептора sst1, лиганда рецептора sst2, лиганда рецептора sst4, лиганда рецептора sst5, соматостатина (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №38916-34-6) и аналогов, октреотида (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №83150-76-9) и аналогов, RC-121 (D-Phe-Cys-Tyr-O-Trp-Lys-Val-Cys[цикло(2→7)дисульфид]-Thr-NH₂; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №99660-13-6) и аналогов, лиганда рецептора бомбезина, лиганда рецептора ВВ1, лиганда рецептора ВВ2, лиганда рецептора ВВ3, лиганда рецептора гастрин-высвобождающего пептида (GRP-R), бомбезина (Bn; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №31362-50-2) и аналогов, гастрин-высвобождающего пептида (GRP) и аналогов, нейромедина В (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №102577-19-5) и аналогов, [D-Tyr⁶,β-Ala¹¹,Phe¹³,Nle(норлейцин)¹⁴]-бомбезина(6-14) и аналогов, RC-3095(H-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ψ-Leu-NH₂; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №138147-78-1; заявки US 5244883; US 5369094) и аналогов, Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-ψ-Leu-Leu-NHa (US 5843903) и аналогов, лиганда рецептора гонадотропин-высвобождающего гормона (GnRH-R), лиганда GnRH-R типа I, лиганда GnRH-R типа II, рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона (LHRH; Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂) и аналогов, [D-Lys⁶]-LHRH, трипторелина ([D-Trp⁶]-LHRH; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №57773-63-4) и аналогов, гистрелина (6-[1-(фенилметил)-D-гистидин]-9-(N-этил-L-пролинамид)-10-деглицинамид-LHRH; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №76712-82-8) и аналогов, бусерелина (6-[O-(1,1-диметилэтил)-D-серин]-9-(N-этил-L-пролинамид)-10-деглицинамид-LHRH; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №57982-77-1) и аналогов, лейпрорелина (6-D-лейцин-9-(N-этил-L-пролинамид)-10-деглицинамид-LHRH; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №53714-56-0) и аналогов, джосерелина (6-[O-(1,1-диметилэтил)-D-серин]-LHRH-2-(аминокарбонил)гидразид; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №65807-02-5) и аналогов, нафарелина (6-[3-(2-нафталенил)-D-аланин]-LНРН; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №76932-56-4) и аналогов, LHRH-II (Pyr-His-Trp-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH₂) и аналогов, цетрореликса (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №120287-85-6) и аналогов, тевереликса/антареликса (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №144743-92-0) и аналогов, озареликса (D-63153; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №295350-45-7) и аналогов, абареликса (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №183552-38-7) и аналогов, дегареликса (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №214766-78-6) и аналогов, детриреликса (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №89662-30-6) и аналогов, ганиреликса (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №124904-93-4) и аналогов, итуреликса/антида (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №112568-12-4) и аналогов, лигандов рецептора GPR54, кисспептинов и аналогов, кисспептин-10/Кр-10 (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №374675-21-5) и аналогов, кисспептина-13/Кр-13 (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №374675-18-0) и аналогов, метастина (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №388138-21-4) и аналогов, лиганда рецептора нейрокинина, лиганда рецептора NK1/NKA, лиганда рецептора NK2/NKB, лиганда рецептора NK3, вещества Р (H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №33507-63-0) и аналогов, H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu-Nle-NH₂ и аналогов, [Sar⁹, Met(O₂)¹¹]-вещества Р и аналогов, [Nle¹⁰]-нейрокинина А(4-10) и аналогов, [MePhe⁷]-нейрокинина В и аналогов, [β-Ala⁸]-нейрокинина А(4-10) и аналогов, лиганда рецептора брадикинина, лиганда рецептора В1, лиганда рецептора В2, брадикинина (H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №58-82-2) и аналогов, дезArg⁹[Leu⁸]-брадикинина и аналогов, дезArg⁹-брадикинина и аналогов, LysдезArg⁹-брадикинина и аналогов, LysдeзArg9[Leu⁸]-брадикинина и аналогов, [Hyp³, Tyr(Me)⁸]-брадикинина и аналогов, D-Arg[Hyp³,D-Phe⁷,Leu⁸]-брадикинина и аналогов, ВКМ 718 (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №259883-69-7) и аналогов, ВКМ 822 (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №259884-10-1) и аналогов, ВКМ 570 (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №259885-54-6) и аналогов, ВКМ-638 (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №259885-81-9) и аналогов, лиганда рецептора GHS, грелина (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №304853-26-7) и аналогов, гексарелина (зарегистрированный в реферативной службе похимии с №140703-51-1) и аналогов, GHRP-1 (зарегистрированный в реферативной службе похимии с №141925-59-9) и аналогов, GHRP-2 (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №158861-67-7) и аналогов, GHRP-6 (His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №87616-84-0) и аналогов, D-Lys³-GHRP-6 и аналогов, ЕР-1572 (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №381231-18-1) и аналогов, дезоктаноилгрелина и аналогов, лиганда рецептора релаксина, лиганда рецептора LGR7, лиганда рецептора LGR8, релаксина (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №9002-69-1) и аналогов, инсулиноподобного пептида 3 (INSL3; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №166515-61-3) и аналогов, лиганда рецептора глюкагоноподобного пептида 1, лиганда рецептора глюкагона, глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №89750-14-1) и аналогов, глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №116469-36-4) и аналогов, лиганда рецептора холецистокинина, лиганда рецептора CCK1/CCKA, лиганда рецептора CCK2/CCKB, лиганда рецептора ССКС, холецистокинина (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №901 1-97-6) и аналогов, лиганда рецептора нейропептида Y (NPY), лиганда рецептора NPY1, лиганда рецептора NPY2, лиганда рецептора NPY3, нейропептида Y (NPY; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №82785-45-3) и аналогов, [Leu³¹, Pro³⁴] NPY и аналогов, NPY-(13-36) и аналогов, пептида yy (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №106388-42-5) и аналогов, лиганда рецептора эндотелина, лиганда рецептора ЕТА, лиганда рецептора ЕТВ, эндотелина 1 (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №123626-67-5) и аналогов, эндотелина 2 (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №122879-69-0) и аналогов, эндотелина 3 (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №125692-40-2) и аналогов, лиганда рецептора вазоактивного кишечного пептида (VPAC1, VIP1), лиганда рецептора VPAC2/VIP2, лиганда рецептора РАС1/РАСАР, РАСАР(1-27) (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №137061-48-4) и аналогов, РАСАР(1-38) (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №137061-48-4) и аналогов, РАСАР(6-27) (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №137061-48-4) и аналогов, РАСАР(6-38) (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №137061-48-4) и аналогов, вазоактивного кишечного полипептида (VIP) (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №37221-79-7) и аналогов, VIP (6-28) (зарегистрированный в реферативной службе по химии с №37221-79-7) и аналогов, [(Ac-His¹,D-Phe²,Lys¹⁵,Arg¹⁶,Leu²⁷)-VIP (1-7)-GRF(8-27)] и аналогов, [Lys¹,Pro²⁵,Arg³⁴,Tyr⁶]-VIP и аналогов, лиганда рецептора VEGF, лиганда рецептора NP-1, лиганда рецептора нейропилина-1, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №127464-60-2) и аналогов, лиганда рецептора фактора роста фибробластов, фактора роста фибробластов (FGF; зарегистрированный в реферативной службе по химии с №62031-54-3) и аналогов" и предпочтительно выбраны из группы, состоящей из "октамерного пептида, нонамерного пептида, декамерного пептида, рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона (LHRH), [D-Lys⁶]-LHRH, аналога LHRH, агониста LHRH, трипторелин([D-Trp⁶]-LHRH), антагониста LHRH, бомбезина, аналога бомбезина, антагониста бомбезина, соматостатина, аналога соматостатина, сывороточного альбумина, человеческого сывороточного альбумина (HSA)".

Все данные, связывающиеся с клеткой молекулы, и их аналоги хорошо известны в предшествующем уровне техники. Когда имеются, приводят регистрационные номера реферативной службе по химии с № (Chemical Abstract Services (CAS)). Однако не предусматривают ограничивать объем связывающих клетки молекул только теми, на которые ссылаются посредством соответствующего регистрационного номера CAS. Под термином "молекула, связывающаяся с клеткой", предусматривают включение любого возможного структурного и/или функционального варианта/члена семейства.

Под термином "аналог", относящимся к молекуле, связывающейся с клеткой, предусматривают включение в объем настоящего изобретения любого структурно и/или функционально близкого аналога молекулы, связывающейся с клеткой, который известен компетентному специалисту предшествующего уровня техники. Неограничивающие примеры представляют собой, например, аналоги LHRH, такие как трипорелин, цетрореликс и др.

Термин аналог в отношении молекулы, связывающейся с клеткой, предназначен также для включения, если его применяют, агонистов и антагонистов рассматриваемой молекулы, связывающейся с клеткой, т.е. термин аналог LHRH действительно включает агонисты LHRH и антагонисты LHRH в объем настоящего изобретения.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают соединения, соответствующие вышеуказанным формулам (I), (II) и (III) и вышеуказанным вариантам осуществления, в которых линкеры В1 и В2 идентичны и молекулы, связывающие клетку, С1 и С2 идентичны.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают соединения, соответствующие вышеуказанным формулам (I), (II) и (III) и вышеуказанным вариантам осуществления, где линкер В2 и связывающая клетку молекула С2 отсутствуют, согласно формуле (IV)

.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают соединения, соответствующие вышеуказанным формулам (I), (II) и (III) и вышеуказанным вариантам осуществления, где А представляет собой группу дисоразола, соответствующую формуле (III); Ri_o, Rj_o, Rk_p, Rm_p, R28, R30, R31, R32, R33, R34, R35, R36, R38, R40, R41, R42, R43, R44 представляют собой водород; Rl_p, Rn_p вместе образуют двойную связь или независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из "водорода, алкоксила"; R27, R29 совместно формируют двойную связь или эпоксид (оксиран); R37, R39 совместно формируют двойную связь или эпоксид (оксиран); R25, R26 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из: "алкила", который необязательно замещен в алкильной группе 1, 2 или 3 заместителями, независимо друг от друга выбранными из группы, состоящей из "алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, гетероциклила, гетероциклилалкила, алкилсульфонила, арилсульфонила, арилалкилсульфонила, галогена, -F, -Cl, -Br, -I, -N₃, -NO₂, =O, =S, =S(O)₂, гидроксила, карбонила, ацетила, карбоксила, сложного эфира карбоксила, амида, карбоната, карбамата, остатков α-аминокислот, остатков β-аминокислот, алкоксила, амино, имино, гидроксиламино, моноалкиламино, диалкиламино, гидразинила, циано, алкилциано, сульфгидрила, дисульфидилалкила и/или алкилсульфидила";

В1 и/или В2 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из "линкера на основе дикарбоновой кислоты, сукцинила, глутарила";

С1 и/или С2 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из "LHRH, [D-Lys⁶]-LHRH, соматостатина, аналогов соматостатина, сывороточного альбумина человека (HSA)";

o означает 1 или 2;

p означает 1 или 2.

В следующем предпочтительном варианте осуществления n или о означает 1, m или р означает 1. В другом предпочтительном варианте осуществления n или о означает 2, m или р означает 2.

В еще одном следующем предпочтительном варианте осуществления соединение выбрано из группы, состоящей из:

"дисоразол А1 - сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH" (региоизомерных соединений 11 и 12):

"дисоразол Е1 - сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH" (региоизомерных соединений 13 и 14):

"дисоразол А1 - сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH)₂" (соединения 15)

"дисоразол Z - сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH" (соединения 16):

"дисоразол Z - (глутарил-[D-Lys⁶]LHRH₂" (соединения 17):

"дисоразол Z - сукцинил-соматостатина" (соединения 18):

В другом аспекте цель настоящего соединения неожиданно достигается получением дисоразоловых соединений, соответствующих формуле (V)

где Za_n, Zb_n, Zc_n, Zd_n, Ze_m, Zf_m, Zg_m, Zh_m, Z1, Z2, Z3, Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9, Z10, Z11, Z12, Z13, Z14, Z15, Z16, Z17, Z18, Z19, Z20, Z21, Z22, Z23, Z24 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из "водорода, алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, гетероциклила, гетероциклилалкила, алкилсульфонила, арилсульфонила, арилалкилсульфонила, галогена, гидроксила, карбонила, ацетила, карбоксила, сложного эфира карбоксила, амида, карбоната, карбамата, остатков α-аминокислот, остатков β-аминокислот, алкоксила, амино, имино, гидроксиламино, моноалкиламино, диалкиламино, гидразинила, циано, алкилциано, сульфгидрила, дисульфидилалкила и/или алкилсульфидила", которые необязательно замещены в алкильной, циклоалкильной, циклоалкилалкильной, арильной, гетероарильной, арилалкильной, гетероарилалкильной, гетероциклильной, гетероциклилалкильной, алкилсульфонильной, арилсульфонильной, арилалкилсульфонильной, карбонильной, ацетильной, карбоксильной, сложного эфира карбоксила, амидной, карбонатной, карбаматной, алкоксильной, моноалкиламино, диалкиламино, алкилциано, дисульфидилалкильной и/или алкилсульфидильной группе 1, 2 или 3 заместителями, независимо друг от друга выбранными из группы, состоящей из "алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, гетероциклила, гетероциклилалкила, алкилсульфонила, арилсульфонила, арилалкилсульфонила, галогена, -F, -Cl, -Br, -I, -N₃, -NO₂, =O, =S, =S(O)₂, гидроксила, карбонила, ацетила, карбоксила, сложного эфира карбоксила, -С(O)ОН, -C(O)NH₂, амида, карбоната, карбамата, остатков α-аминокислот, остатков β-аминокислот, алкоксила, амино, имино, гидроксиламино, моноалкиламино, диалкиламино, гидразинила, циано, алкилциано, сульфгидрила, дисульфидилалкила и/или алкилсульфидила"; при условии, что по меньшей мере один из радикалов Za_n, Zb_n, Zc_n, Zd_n, Ze_m, Zf_m, Zg_m, Zh_m, Z1, Z2, Z3, Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9, Z10, Z11, Z12, Z13, Z14, Z15, Z16, Z17, Z18, Z19, Z20, Z21, Z22, Z23, Z24 независимо выбран из группы, состоящей из "сложного эфира карбоксила, амида, карбоната, карбамата, остатков α-аминокислот, остатков β-аминокислот";

при дальнейшем условии, что ацетил исключен из "сложного эфира карбоксила";

необязательно любые два соседних радикала Z из радикалов Za_n, Zb_n, Zc_n, Zd_n, Ze_m, Zf_m, Zg_m, Zh_m, Z1, Z2, Z3, Z4, Z5, Z6, Z7, Z8, Z9, Z10, Z11, Z12, Z13, Z14, Z15, Z16, Z17, Z18, Z19, Z20, Z21, Z22, Z23, Z24 могут формировать атомную связь с образованием двойной связи или могут формировать эпоксидную (оксирановую), азирановую (азиридиновую), алкил-, циклоалкил-, циклоалкилалкил-, гетероарил-, арилалкил-, гетероарилалкил-, гетероциклил- и/или гетероциклилалкил-замещенную азирановую (азиридиновую), тиирановую и/или тииран-S-оксидную группу;

n означает 0, 1, 2, 3;

m означает 0, 1, 2, 3.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают дисоразоловые соединения, соответствующие нижеприведенной формуле (VI)

где

Zi_o, Zj_o, Zk_p, Zl_p, Zm_p, Zn_p, Z25, Z26, Z27, Z28, Z29, Z30, Z31, Z32, Z33, Z34, Z35, Z36, Z37, Z38, Z39, Z40, Z41, Z42, Z43, Z44 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из "водорода, алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, гетероциклила, гетероциклилалкила, алкилсульфонила, арилсульфонила, арилалкилсульфонила, галогена, гидроксила, карбонила, ацетила, карбоксила, сложного эфира карбоксила, амида, карбоната, карбамата, остатков α-аминокислот, остатков β-аминокислот, алкоксила, амино, имино, гидроксиламино, моноалкиламино, диалкиламино, гидразинила, циано, алкилциано, сульфгидрила, дисульфидилалкила и/или алкилсульфидила", которые необязательно замещены в алкильной, циклоалкильной, циклоалкилалкильной, арильной, гетероарильной, арилалкильной, гетероарилалкильной, гетероциклильной, гетероциклилалкильной, алкилсульфонильной, арилсульфонильной, арилалкилсульфонильной, карбонильной, ацетильной, карбоксильной, сложного эфира карбоксила, амидной, карбонатной, карбаматной, алкоксильной, моноалкиламино, диалкиламино, алкилциано, дисульфидилалкильной и/или алкилсульфидильной группе 1, 2 или 3 заместителями, независимо друг от друга выбранными из группы, состоящей из "алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, гетероциклила, гетероциклилалкила, алкилсульфонила, арилсульфонила, арилалкилсульфонила, галогена, -F, -Cl, -Br, -I, -N₃, -NO₂, =O, =S, =S(O)₂, гидроксила, карбонила, ацетила, карбоксила, сложного эфира карбоксила, -С(O)ОН, -С(O)NH₂, амида, карбоната, карбамата, остатков α-аминокислот, остатков β-аминокислот, алкоксила, амино, имино, гидроксиламино, моноалкиламино, диалкиламино, гидразинила, циано, алкилциано, сульфгидрила, дисульфидилалкила и/или алкилсульфидила";

при условии, что по меньшей мере один из радикалов Zi_o, Zj_o, Zk_p, Zl_p, Zm_p, Zn_p, Z25, Z26, Z27, Z28, Z29, Z30, Z31, Z32, Z33, Z34, Z35, Z36, Z37, Z38, Z39, Z40, Z41, Z42, Z43, Z44 независимо выбран из группы, состоящей из "сложного эфира карбоксила, амида, карбоната, карбамата, остатков α-аминокислот, остатков β-аминокислот";

при дальнейшем условии, что ацетил исключен из "сложного эфира карбоксила";

необязательно любые два соседних радикала Z из радикалов Zi_o, Zj_o, Zk_p, Zl_p, Zm_p, Zn_p, Z25, Z26, Z27, Z28, Z29, Z30, Z31, Z32, Z33, Z34, Z35, Z36, Z37, Z38, Z39, Z40, Z41, Z42, Z43, Z44 могут формировать атомную связь с образованием двойной связи или могут формировать эпоксидную (оксирановую), азирановую (азиридиновую), алкил-, циклоалкил-, циклоалкилалкил-,гетероарил-,арилалкил-,гетероарилалкил-,гетероциклил-и/или гетероциклилалкил-замещенную азирановую (азиридиновую), тиирановую и/или тииран-S-оксидную группу;

o означает 0, 1, 2, 3;

p означает 0, 1,2, 3.

В следующем предпочтительном варианте осуществления предусматривают дисоразоловые соединения, соответствующие формулам (V) и (VI), где n или о означает 1 и m или р означает 1. В другом предпочтительном варианте осуществления предусматривают дисоразоловые соединения, соответствующие формулам (V) и (VI), где n или о означает 2, m или р означает 2.

В еще одном предпочтительном варианта осуществления дисоразоловое производное выбрано из группы, состоящей из:

региоизомерных соединений 1 и 2:

соединения 3:

соединения 4:

региоизомерных соединений 5 и 6:

соединения 7:

соединения 9:

соединения 10:

соединения 19:

соединения 20:

соединения 21:

Все соединения, т.е. конъюгаты дисоразола и производные дисоразола, проиллюстрированные в данном контексте, в общем [приведенными выше формулами (I)-(VI) и различными радикалами R] и в деталях в дальнейшем называют соединениями, соответствующими (настоящему) изобретению.

Термины, которые требуются для характеристики вышеуказанных соединений, соответствующих изобретению, всегда, пока в описании или в формуле изобретения не указано иначе, имеют следующие значения:

Термин "замещенный" означает, что соответствующий радикал или группа имеет один или более заместителей. Когда радикал имеет множество заместителей и выбор различных заместителей определен, заместители выбирают независимо друг от друга, и они необязательно должны быть идентичными. Термин "незамещанный" означает, что соответствующая группа не имеет заместителя. Термин "необязательно замещенный" означает, что соответствующая группа является либо незамещенной, либо замещенной одним или более заместителей. Термин "имеющий до 3 заместителей" означает, что соответствующий радикал или группа замещены либо одним, либо двумя, либо тремя заместителями.

Термин "алкил" включает для целей данного изобретения нециклические насыщенные, частично ненасыщенные или ненасыщенные углеводороды, имеющие С1-С12 атомов углерода, которые могут быть неразветвленными или разветвленными и могут включать одну или более двойных связей и/или одну или более тройных связей. Термин "алкил" предпочтительно служит для обозначения алкильных цепей из 1-8, особенно предпочтительно 1-6 атомов углерода. Примерами подходящих алкильных радикалов являются метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, изо-пентил, нео-пентил, трет-пентил, 2- или 3-метилпентил, н-гексил, 2-гексил, изогексил, н-гептил, н-октил, н-нонил, н-децил, н-ундецил, н-додецил, н-тетрадецил, н-гексадецил, н-октадецил, н-эйкозанил, н-докозанил, этиленил (винил), пропенил (-СН₂СН=CH₂,; -СН=СН-СН₃, -С(=СН₂)-СН₃), бутенил, пентенил, гексенил, гептенил, октенил, октадиенил, октадеценил, октадец-9-енил, эйкозенил, эйкоз-11-енил, (Z)-эйкоз-11-енил, докозанил, докоз-13-енил, (Z)-докоз-13-енил,этинил,пропинил(-СН₂-С≡СН,-С≡С-СН₃), бутинил, пентинил, гексинил, гептинил и октинил.

Термин "циклоалкил" служит для обозначения насыщенной или частично ненасыщенной неароматической циклической углеводородной группы/радикала, включающих 1, 2 или 3 цикла, в том числе моноциклического алкила, бициклического алкила и трициклического алкила, и содержащих в целом 3-20 атомов углерода, формирующих циклы, предпочтительно 3-10, наиболее предпочтительно (С₃-С₈)-циклоалкил. Примерами подходящих циклоалкильных радикалов являются циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, циклодецил, циклогексенил, циклопентенил, циклооктадиенил.

Термин "циклоалкил-алкил" относится к радикалу, в котором циклоалкильная группа связана через алкильную группу, где алкильная и циклоалкильная группы имеют значения, определенные в данном контексте, предпочтительно (С₃-С₈)-циклоалкил-(С₁-С₄)-алкильный радикал. Примерами данных групп являются циклопропилметил, циклогексилметил, циклопентилэтил, циклогексенилэтил. Термин "арил" относится к ароматическим углеводородным системам, имеющим 3-14, предпочтительно 5-14 атомов углерода. Термин "арил" включает также системы, в которых ароматический цикл представляет собой часть би- или полициклической насыщенной, частично насыщенной и/или ароматической системы, такой как ароматический цикл, слитый с "арильной", "циклоалкильной", "гетероарильной" или "гетероциклильной" группой, как определено в данном контексте, посредством любого требуемого и возможного члена цикла арильного радикала. Данные "арильные" радикалы могут быть связаны посредством любого члена цикла. Примерами "арила" являются в числе прочих фенил, бифенил, нафтил и антраценил, а также инданил, инденил или 1,2,3,4-тетрагидронафтил.

Термин "гетероарил" относится к 5-, 6- или 7-членному циклическому ароматическому радикалу, который включает по меньшей мере 1, в соответствующем случае также 2, 3, 4 или 5 гетероатомов, предпочтительно азота, кислорода и/или серы, причем гетероатомы одинаковы или различны. Число атомов азота составляет предпочтительно 0, 1, 2 или 3 и атомов кислорода и серы независимо составляет 0 или 1. Термин "гетероарил" также включает системы, в которых ароматический цикл является частью би- или полициклической насыщенной, ненасыщенной и/или ароматической системы, такой, которой являлся бы ароматический цикл, слитый с "арильной", "циклоалкильной", "гетероарильной" или "гетероциклильной" группой, как определено в данном контексте, посредством любого требуемого и возможного члена цикла гетероарильного радикала. Данные "гетероарильные радикалы" могут быть связаны посредством любого члена цикла. Примеры "гетероарила" включают пирролил, тиенил, фурил, имидазолил, тиазолил, изотиазолил, оксазолил, оксадиазолил, изоксазолил, пиразолил, пиридинил, пиримидинил, пиризинил, индолил, хинолинил, изохинолинил, имидазолил, триазолил, тетразолил, пиридазинил, фталазинил, индазолил, индолизинил, хиноксалинил, хиназолинил, птердинил, карбазолил, феназинил, феноксазинил, фенотиазинил, акридинил.

Термины "арилалкил" и "гетероарилалкил" относятся к радикалам, в которых арильный или гетероарильный радикал связан посредством алкильной группы, где алкильная, арильная и гетероарильная группы имеют значения, определенные в данном контексте. Предпочтительными "арилалкильными" группами являются фенил-(С₁-С₄)-алкильные радикалы, предпочтительно бензильный или фенилэтильный радикалы. Предпочтительными "гетероарилалкильными" группами являются индолил-(С₁-С₄)-алкильные радикалы, предпочтительно 1H-индол-3-ил-метил или 2-(1Н-индол-3-ил)-этил.

Термин "гетероциклил" относится к моно- или полициклической системе из 3-20, предпочтительно 5-6 до 14 атомов цикла, включающего атомы углерода и 1, 2, 3, 4 или 5 гетероатомов, в частности, азота, кислорода и/или серы, которые одинаковы или различны. Циклическая система может быть насыщенной, моно- или полиненасыщенной, но не может быть ароматическим. В случае циклической системы, состоящей из по меньшей мере двух циклов, циклы могут быть слитыми или спиро- или иным образом соединенными. Данные "гетероциклильные" радикалы могут быть связаны посредством любого члена цикла. Термин "гетероциклил", кроме того, включает системы, в которых гетероцикл представляет собой часть би- или полициклической насыщенной, частично насыщенной и/или ароматической системы, такой как, где гетероцикл слит с "арильной", "циклоалкильной", "гетероарильной" или "гетероциклильной" группой, как определено в данном контексте, посредством любого требуемого и возможного члена цикла гетероциклильного радикала. Примеры "гетероциклила" включают пирролидинил, тиапирролидинил, пиперидинил, пиперазинил, оксапиперазинил, оксапиперидинил, оксадиазолил, тетрагидрофурил, имидазолидинил, тиазолидинил, тетрагидропиранил, морфолинил, тетрагидротиофенил, дигидропиранил.

Термин "гетероциклилалкил" относится к радикалам, в которых гетероциклильная группа связана посредством алкильной группы, где алкильная и гетероциклильная группы имеют значения, определенные в данном контексте. Предпочтительными являются гетероциклил-(С₁-С₄)-алкильные радикалы. Термины "алкилсульфонил", "арилсульфонил" и "арил-алкилсульфонил" относятся к радикалам, в которых алкильная, арильная или арилалкильная группа связана посредством -SO₂-группы, где алкильная, арильная и арилалкильная группы имеют значения, определенные в данном контексте. Примерами являются метилсульфонил и фенилсульфонил.

Термин "галоген", "атом галогена" или "галогеновый заместитель" (Hal-) относится к одному, при необходимости множеству атомов фтора (F, фтор), брома (Br, бром), хлора (Cl, хлор) или йода (I, йод). Названия "дигалоген", "тригалоген" и "пергалоген" относятся соответственно к двум, трем и четырем заместителям, где каждый заместитель может быть независимо выбран из группы, состоящей из фтора, хлора, брома и йода. "Галоген" предпочтительно означает атом фтора, хлора или брома.

Термин "карбонил" относится к радикалам, в которых алкильная, циклоалкильная, циклоалкилалкильная, арильная, гетероарильная, арилалкильная, гетероарилалкильная, гетероциклильная и/или гетероциклилалкильная группа связана посредством -С(O)-группы, где алкильная, циклоалкильная, циклоалкилалкильная, арильная, гетероарильная, арилалкильная, гетероарилалкильная, гетероциклильная и/или гетероциклилалкильная группы имеют значения, определенные в данном контексте. Примерами являются -С(O)-СН₃, -C(O)-CH₂CH₃, -С(O)-изопропил и -C(O)-tBu (tBu = трет-бутил).

Термин "карбоксил" относится к радикалам, в которых алкильная, циклоалкильная, циклоалкилалкильная, арильная, гетероарильная, арилалкильная, гетероарилалкильная, гетероциклильная и/или гетероциклилалкильная группа связана посредством -С(O)O-группы, где алкильная, циклоалкильная, циклоалкилалкильная, арильная, гетероарильная, арилалкильная, гетероарилалкильная, гетероциклильная и/или гетероциклилалкильная группы имеют значения, определенные в данном контексте. Примерами являются -С(O)O-СН₃ и -С(O)O-фенил.

Термин "сложный эфир карбоксила" относится к радикалам, в которых алкильная, циклоалкильная, циклоалкилалкильная, арильная, гетероарильная, арилалкильная, гетероарилалкильная, гетероциклильная и/или гетероциклилалкильная группа связана посредством -ОС(O)-группы, где алкильная, циклоалкильная, циклоалкилалкильная, арильная, гетероарильная, арилалкильная, гетероарилалкильная, гетероциклильная и/или гетероциклилалкильная группы имеют значения, определенные в данном контексте. Примерами являются ацетил, -ОС(O)-фенил и т.п.

Термин "карбонат" относится к радикалам, в которых алкильная, циклоалкильная, циклоалкилалкилная, арильная, гетероарильная, арилалкильная, гетероарилалкильная, гетероциклильная и/или гетероциклилалкильная группа связана посредством -ОС(O)O-группы, где алкильная, циклоалкильная, циклоалкилалкильная, арильная, гетероарильная, арилалкильная, гетероарилалкильная, гетероциклильная и/или гетероциклилалкильная группы имеют значения, определенные в данном контексте. Примерами являются -ОС(O)O-СН₃ и -ОС(O)O-фенил.

Термин "карбамат" относится к радикалам, в которых алкильная, циклоалкильная, циклоалкилалкильная, арильная, гетероарильная, арилалкильная, гетероарилалкильная, гетероциклильная и/или гетероциклилалкильная группа связана посредством -ОС(O)NH-группы, -NНС(O)O-группы, -OC(O)NR-группы или -NRC(O)O-группы, где R независимо выбраны из группы, состоящей из "алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, гетероциклила, гетероциклилалкила, галогена, -F, -Cl, -Br, -I, -N₃, -NO₂, гидроксила, алкоксила, амино, имино, гидроксиламино, гидразинила, циано, алкилциано, сульфгидрила", где алкильная, циклоалкильная, циклоалкилалкильная, арильная, гетероарильная, арилалкильная, гетероарилалкильная, гетероциклильная, гетероциклилалкильная, алкоксильная, гидразинильная и/или алкилцианогруппы имеют значения, определенные в данном контексте.

Термин "остаток α-аминокислоты" для целей настоящего изобретения относится ко всем известным 20 протеиногенным α-аминокислотам, а также природным (т.е. в любых биологических системах) α-аминокислотам, таким как, например, селеноцистеин, пирролизин, цитруллин, орнитин, гомоцистеин, N-метиларгинин, N-ацетиллизин, гамма-карбоксиглутамат, 5-гидроксилизин, 3-метилгистидин и/или N,N,N-триметиллизин. В данной связи термин "остаток" относится ко всей группе аминокислоты, включая присоединенную к α-атому углерода боковую цепь и скелет. Термин "остаток α-аминокислоты" для целей настоящего изобретения также относится ко всем известным α-аминокислотам, которые не являются ни протеиногенными, ни, как известно, присутствующими в природных условиях (т.е. в каких-либо биологических системах). Примерами являются норлейцин, циклогексилглицин, 2-нафтилаланин, замещенные α-аминокислоты (например, галоген-замещенные Tyr или Phe), а также защищенные боковые цепи α-аминокислот, где защитная группа, такая как Fmoc, Boc, Cbz, Aloc, тритил, ацетил и/или бензил, непосредственно присоединена/реагирует с функционализацией (например амино, гидрокси и/или карбоксиостатком). В данной связи термин "остаток" относится ко всей группе аминокислоты, включая присоединенную к α-атому углерода боковую цепь и скелет.

Соответственно, термин "остаток β-аминокислоты" для целей настоящего изобретения относится ко всем известным β-аминокислотам, которые не являются ни протеиногенными, ни, как известно, присутствующими в природных условиях (т.е. в каких-либо биологических системах). В данной связи термин "остаток" относится ко всей группе аминокислоты, включая присоединенную к β-атому углерода боковую цепь и скелет.

Термин "алкоксил" относится к радикалам, в которых "алкильная", "циклоалкильная", "циклоалкилалкильная", "арильная", "арилалкильная", "гетероарильная", "гетероарилалкильная", "гетероциклильная" и/или "гетероциклилалкильная" группа связана посредствомп атома кислорода (-O-группа), где "алкил", "циклоалкил", "циклоалкилалкил", "арил", "арилалкил", "гетероарил", "гетероарилалкил", "гетероциклил" и "гетероциклилалкил" имеют значения, как определено в данном контексте.

Термины "моноалкиламино" и "диалкиламино" относятся к радикалам, в которых одна или две алкильные группы соответственно связаны посредством атома азота, причем алкильная группа имеет значение, определенное в данном контексте. Примерами являются этиламино, диметиламино и изопропилэтиламино.

Термин "гидразинил" относится к C=N-NH-, NH-N=C-, C=N-NR- и/или NR-N=C-группе, где R независимо выбраны из группы, состоящей из "алкила, циклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, гетероциклила, гетероциклилалкила, галогена, -F, -Cl, -Br, -I, -N₃, -NO₂, гидроксила, алкоксила, амино, имино, гидроксиламино, гидразинила, циано, алкилциано, сульфгидрила", где алкильная, циклоалкильная, циклоалкилалкильная, арильная, гетероарильная, арилалкильная, гетероарилалкильная, гетероциклильная, гетероциклилалкильная, алкоксильная, гидразинильная и/или алкилцианогруппы имеют значения, определенные в данном контексте.

Термин "алкилциано" относится к радикалам, в которых алкильная группа связана посредством цианогруппы, где алкильная группа имеет значение, определенное в данном контексте. Примерами являются метилциано и н-пропилциано.

Термин "дисульфидалкил" относится к радикалам, в которых алкильная группа связана посредством -S-S-группы, где алкильная группа имеет значение, определенное в данном контексте.

Термин "алкил-сульфидил" относится к радикалам, в которых алкильная группа связана посредством атома серы, где алкильная группа имеет значение, определенное в данном контексте.

Предусматривают все стереоизомеры соединений, соответствующих изобретению, либо в смеси, либо с чистой или в существенной мере чистой форме. Соединения, соответствующие настоящему изобретению, могут иметь асимметрические центры в любом из атомов углерода, включая любой из радикалов заместителей. Следовательно, соединения, соответствующие изобретению, могут существовать в форме своих рацематов, в форме чистых энантиомеров и/или диастереомеров или в форме смесей данных энантиомеров и/или диастереомеров. Смеси могут иметь любой требуемое соотношение стереоизомеров. Все данные стереохимические формы и смеси входят в объем настоящего изобретения.

Так, например, соединения, соответствующие настоящему изобретению, которые имеют один или более центров хиральности и которые существуют как рацематы или смеси диастереомеров, можно фракционировать способами, известными как таковые, на свои оптически чистые изомеры, т.е. энантиомеры или диастереомеры. Разделение соединений, соответствующих изобретению, можно осуществить путем колоночного разделения на хиральную или нехиральную фазы или путем перекристаллизации из необязательно оптически активного растворителя или при использовании оптически активной кислоты или основания, либо путем дериватизации оптически активным реагентом, таким как, например, оптически активный спирт, и последующего удаления радикала.

Чтобы избежать неясности, соединения, соответствующие изобретению, могут присутствовать в форме всех возможных изомеров с двойной связью, таких как "чистые" Е- или Z-изомеры или смеси данных изомеров с двойной связью.

Если это возможно, соединения, соответствующие настоящему изобретению, могут находиться в форме таутомеров.

Аналогичным образом возможно, чтобы соединения, соответствующие изобретению, находились в виде каких-либо требуемых пролекарственных форм, таких как, например, сложные эфиры, карбонаты, карбаматы, мочевины, амиды или фосфаты, когда действительно биологически активная форма высвобождается только посредством метаболизма. Любое соединения, которое можно превратить in vivo с получением биоактивного агента (т.е. соединения, соответствующего изобретению), представляет собой пролекарственную форму, соответствующую объему и сущности изобретения. Различные виды пролекарственных форм хорошо известны в области техники и описаны, например, в:

(i) монографии The Practice of Medicinal Chemistry (Практические методы медицинской химии) (Wermuth CG et аl., гл. 31, Academic Press 1996);

(ii) монографии Design of Prodrugs (Создание пролекарственных форм) (под ред. Bundgaard H, Elsevier 1985); и

(iii) монографии A Textbook of Drug Design и Development (Справочник по созданию и разработке лекарств) (под ред. Krogsgaard-Larson P и Bundgaard H, гл. 5:113-191, Harwood Academic Publishers 1991).

Указанные материалы включены в данном контексте в виде ссылки. Кроме того, известно, что химические вещества превращаются в организме в метаболиты, которые могут при необходимости аналогичным образом вызывать требуемый биологический эффект, в ряде случаев даже в более выраженной форме.

Любое биологически активное соединение, которое превращают in vivo метаболическим путем из любого соединения, соответствующего изобретению, представляет собой метаболит, соответствующий объему и сущности изобретения.

Соединения, соответствующие изобретению, можно, если они имеют достаточно основную группу, такую как, например, первичный, вторичный или третичный амин, превратить с помощью неорганических и органических кислот в соли. Предпочтительно, когда фармацевтически приемлемые соли соединений, соответствующих изобретению, формируются с использованием хлористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, йодноватой кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, метансульфоновой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, угольной кислоты, муравьиной кислоты, уксусной кислоты, сульфоуксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, щавелевой кислоты, малоновой кислоты, малеиновой кислоты, янтарной кислоты, винной кислоты, виноградной кислоты, яблочной кислоты, эмбоновой кислоты, миндальной кислоты, фумаровой кислоты, молочной кислоты, лимонной кислоты, таурохолевой кислоты, глутаровой кислоты, стеариновой кислоты, глутамовой кислоты или сапарагиновой кислоты. Соли, которые образуются, представляют собой, в числе прочих, гидрохлориды, хлориды, гидробромиды, бромиды, йодиды, сульфаты, фосфаты, метансульфонаты, тозилаты, карбонаты, бикарбонаты, формиаты, ацетаты, сульфоацетаты, трифлаты, оксалаты, малонаты, малеаты, сукцинаты, тартраты, малаты, эмбонаты, манделаты, фумараты, лактаты, цитраты, глутарат, стеарат, аспартаты и глутаматы. Стехиометрия солей, сформированных из соединений, соответствующих изобретению, может, кроме того, представлять собой их кратное или некратное целое.

Соединения, соответствующие изобретению, можно, если они имеют достаточно кислотную группу, такую как, например карбокси, серной кислоты, фосфорной кислоты или фенольную группу, превратить с помощью неорганических и органических оснований в их физиологически переносимые соли. Примерами подходящих неорганических оснований являются аммоний, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция и органических оснований - этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, этилендиамин, трет-бутиламин, трет-оксиламин, дегидробисэтиламин, циклогексиламин, дибензилэтилендиамин и лизин. Стехиометрия солей, сформированных из соединений, соответствующих изобретению, может, кроме того, представлять собой их кратное или некратное целое.

Аналогичным образом возможно, чтобы соединения, соответствующие изобретению, находились в форме своих сольватов, в частности гидратов, которые можно получить, например, путем кристаллизации из растворителя или из водного раствора. Более того, возможно, чтобы одна, две, три или любое число молекул сольвата или воды комбинировались с соединениями, соответствующими изобретению, с образованием сольватов и гидратов.

Известно, что химические вещества образуют твердые вещества, которые существуют в состояниях различного порядка, которые называют полиморфными формами или модификациями. Различные модификации полиморфного вещества могут значительно различаться по своим физическим свойствам. Соединения, соответствующие изобретению, могут существовать в различных полиморфных формах, и некоторые модификации могут быть, кроме того, метастабильными. Все данные полиморфные формы соединений, соответствующих изобретению, следует считать принадлежащими изобретению.

Соединения, соответствующие изобретению, благоприятно характеризуются сильным биологическим действием. Что касается конъюгатов дисоразола, соответствующих настоящему изобретению, они превосходят конъюгаты, соответствующие предшествующему уровню техники, вследствие повышенной свойственной им активности. Более того, особенно бис-замещенные С1-В1-А-В2-С2-конъюгаты неожиданно проявляют более высокую специфичность и пониженную токсичность до высвобождения цитотоксической группы дисоразола.

При использовании конъюгатов, соответствующих настоящему изобретению, возможна специфическая направленность на (опухолевые) ткани, представляющие интерес, например, путем использования требуемого рецептора-лиганда в качестве связывающей клетку молекулы, которая направляет конъюгат на данные экспрессирующие рецептор (опухолевые) ткани. Более того, специфическая направленность преимущественно дает в результате высокие местные концентрации конъюгатов in situ (в области опухоли), приводя к существенно повышенной эффективности. Данные преимущества могут перейти в уменьшение доз вводимого потенциального лекарственного препарата в клинике, а также к уменьшенным медицинским вредным эффектам или их отсутствию.

В другом аспекте цели настоящего изобретения неожиданно достигают тем, что создан способ получения соединений, соответствующих изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления предусматривают способ получения соединений, соответствующих изобретению, включающий стадии:

а) реакции дисоразолового соединения с линкером, предпочтительно линкерным ангидридом с получением моно- и/или бисфункционализированной дисоразол-линкерной группы,

b) необязательного отделения (очистки) моно- и/или бисфункционализированной дисоразол-линкерной группы от продуктов реакции и побочных продуктов,

c) связывания необязательно разделенных (очищенных) моно- и/или бисфункционализированной дисоразол-линкерной групп с молекулами, связывающимися с клеткой, с получением конъюгата дисоразола формулы (I) С1-В1-А-В2-С2 и/или формулы (IV) С1-В1-А,

d) необязательного отделения (очистки) конъюгата дисоразола формулы (I) С1-В1-А-В2-С2 и/или формулы (IV) С1-В1-А от продуктов реакции и побочных продуктов.

Соединения, соответствующие изобретению, можно вводить различным видам млекопитающих, включая человека, для лечения или профилактики физиологических и/или патофизиологических состояний.

Для цели настоящего изобретения считают, что включены все виды млекопитающих. Предпочтительно, когда данные млекопитающие выбраны из группы, состоящей из "человека, домашних животных, крупного рогатого скота, домашнего скота, домашних питомцев, коровы, овцы, свиньи, козы, лошади, пони, осла, лошака, мула, зайца, кролика, кошки, собаки, морской свинки, хомяка, крысы, мыши". Более предпочтительно, когда млекопитающее представляет собой человека.

В другом аспекте цели настоящего изобретения неожиданно достигают получением соединений, соответствующих изобретению, для приготовления лекарственного средства.

В другом аспекте цели настоящего изобретения неожиданно достигают получением соединений, соответствующих изобретению, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики "острого лейкоза, аденокарциномы, базалиомы, доброкачественных опухолей, рака мочевого пузыря, рака кишки, опухолей головного мозга, рака молочной железы, бронхиальной карциномы, карциноидов, карцином, рака шейки матки, карциномы шейки матки, хронического лейкоза, рака толстой кишки, карциномы толстой кишки, колоректального рака, рака соединительной ткани, карциномы тела, рака эндометрия, рака пищевода, саркомы Эвига, гастриномы, глиобластомы, глиомы, гинекологических опухолей, рака головы и/или шеи, гепатобластомы, гепатомы, гиперплазии, гиперпролиферативных заболеваний, внутриглазной меланомы, саркомы Капоши, карциномы гортани, рака гортани, лейомиомы, лейкоза, опухоли печени, рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, лимфомы, злокачественных опухолей, карциномы молочной железы, медуллобластомы, меланомы, множественной миеломы, нефробластомы, нейробластомы, нейроэндокринных опухолей, остеосаркомы, рака яичников, опухоли поджелудочной железы, рака простаты, карциномы простаты, карциномы прямой кишки, рака почки, карциномы клеток почки, ретинобластомы, рабдоидной опухоли, сарком, рака кожи, саркомы мягких тканей, солидных опухолей, спиналиомы, рака желудка, рака яичка, тимомы, рака щитовидной железы, опухолей, исходящих из головного мозга и/или нервной системы и/или мозговых оболочек (WO 99/01764), рака мочевых путей и/или рака матки".

В следующем аспекте цели настоящего изобретения неожиданно достигают получением соединений, соответствующих изобретению, предназначенных для изготовления лекарственного средства, где лекарственное средство, кроме того, включает по меньшей мере одну дополнительную фармацевтически активное вещество.

В следующем аспекте цели настоящего изобретения неожиданно достигают получением соединений, соответствующих изобретению, предназначенных для изготовления лекарственного средства, где лекарственное средство применяют до, и/или во время, и/или после лечения по меньшей мере одним дополнительным фармацевтически активным веществом.

В следующем аспекте цели настоящего изобретения неожиданно достигают получением соединений, соответствующих изобретению, предназначенных для изготовления лекарственного средства, где лекарственное средство вводят до, и/или во время, и/или после радиотерапевтического лечения и/или хирургического вмешательства.

В ходе настоящего изобретения соединения, соответствующие изобретению, можно, таким образом, вводить, как проиллюстрировано, в виде отдельных веществ или в комбинации со всеми известными фармакологически активными веществами во время курса комбинированной терапии.

В предпочтительном варианте осуществления предусматривают соединения, соответствующие изобретению, для вышепоказанного применения, причем дополнительное фармакологически активное вещество выбрано из группы, состоящей из "ингибиторов ДНК-топоизомеразы 1 и/или II, ДНК-интеркаляторов, алкилирующих агентов, дестабилизаторов микротрубочек, агонистов и/или антагонистов рецепторов гормонов и/или факторов роста, ингибиторов сигнальной трансдукции, антител к факторам роста и их рецепторам, ингибиторов киназы, антиметаболитов".

В предпочтительном варианте осуществления предусматривают соединения, соответствующие изобретению, для вышепоказанного применения, причем дополнительное фармакологически активное вещество выбрано из группы, состоящей из: "актиномицина D, аминоглутетимида, аспарагиназы, авастина, азатиоприна, BCNU (кармустина), блеомицина, бусульфана, карбоплатина, CCNU (ломустина), хлорамбуцила, цисплатина, коласпазы, циклофосфамида, цитарабина, дактиномицина, даунорубицина, диэтилстилбестрола, доцетаксела, доксорубицина (адриамицина), DTIC (дакарбацина), эпирубицина, эпотилона, эрбитакса, эритрогидроксинониладенина, этинилэстрадиола, этопозида, флударабин фосфата, флуоксиместрона, флутамида, гемцитабина, глиивека/гливека, герцептина, гексаметилмеламина, гидроксимочевины, гидроксипрогестерон капроата, идарубицина, ифосфамида, интерферона, ирессы, иринотекана, L-аспарагиназы, лейковорина, мехлорэтамина, медроксипрогестерон ацетата, мегестрол ацетата, мелфалана, месны, метотрексата, митомицина С, митотана, митоксантрона, N-фосфоноацетил-L-аспартата (PALA), оксалиплатина, паклитаксела, пентозостатина, пликамицина, преднизолона, преднизона, прокарбазина, ралоксифена, рапамицина, семустина, сорафениба, стрептозоцина, тамоксифена, тарцевы, таксотера, тенипозида, тестостерон пропионата, тиогуанина, тиотепы, топотекана, триметиленамина, уридина, винбалстина, винкристина, виндезина, винорелбина, 2',2'-дифтордезоксицитидина, 5-фтордезоксиуридин монофосфата, 5-азацитидин кладрибина, 5-фтордезоксиуридина, 5-фторурацила (5-FU), 6-меркаптопурина".

Соединения, соответствующие настоящему изобретению, можно вводить известным образом. Путь введения может быть, таким образом, любым путем, который эффективно доставляет активное соединение в подходящий или требуемый центр действия, например неперорально или перорально, в частности внутривенно, местно, чрескожно, легочно, ректально, внутривагинально, назально или парентерально, либо путем имплантации. Внутривенное введение является предпочтительным.

Соединения, соответствующих изобретению, превращают в форму, которую можно ввести, и смешивают при необходимости с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями. Подходящие наполнители и носители описаны, например, в работе Ullman's Encyclopedia of Technical Chemistry (Энциклопедия технической химии Аллмана), т.4, (1953), 1-39; Journal of Pharmaceutical Sciences, т.52 (1963), 918 и далее; Н.v. Czetsch-Lindenwald, "Hilfsstoffe fur Pharmazie и angrenzende Gebiete" (Вспомогательные вещества для фармации и смежных областей); Pharm. Ind. 2,1961,72 и далее; Dr. Н.P.Fiedler, "Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik и angrenzende Gebiete" (Энциклопедия вспомогательных веществ для фармации, косметики и смежных областей), Cantor KG, Aulendorf in Wbirttemberg, 1971.

Непероральное введение можно осуществить, например, путем внутривенной, подкожной, внутримышечной инъекции стерильных водных или масляных растворов, суспензий или эмульсий, посредством имплантатов или с помощью мазей, кремов или суппозиториев. При необходимости возможно также введение в виде формы с замедленным высвобождением. Имплантаты могут включать инертные материалы, например биоразрушаемые полимеры или синтетические силиконы, такие как, например, силиконовая резина. Возможно внутривагинальное введение, например, с помощью вагинальных колец. Возможно внутриматочное введение, например, с помощью диафрагм или других подходящих внутриматочных устройств. Дополнительно предусматривают чрескожное введение, в частности, с помощью препарата, подходящего для данной цели и/или подходящих средств, таких как, например, пластыри.

Пероральное введение может иметь место, например, в твердой форме в виде таблетки, капсулы, гелевой капсулы, покрытой таблетки, гранулированного препарата или порошка, а также в форме питьевого раствора. Соединения, соответствующие изобретению, предназначенные для перорального применения, можно сочетать с известными и обычно используемыми физиологически переносимыми наполнителями и носителями, такими как, например, гуммиарабик, тальк, крахмал, сахара, такие как, например, маннит, метилцеллюлоза, лактоза, желатин, поверхностно-активные вещества, стеарат магния, циклодекстрины, водные или неводные носители, разбавители, диспергирующие агенты, эмульгаторы, скользящие агенты, консерванты и вкусовые добавки (например, эфирные масла). Соединения, соответствующие изобретению, могут быть также диспергированы в композиции из микрочастиц, например, наночастиц.

Как уже объясняли выше, соединения, соответствующие изобретению, можно также объединить с другими активными фармацевтическими ингредиентами. Для целей комбинированной терапии возможно введение пациенту активных ингредиентов одновременно или раздельно, в частности, либо одним и тем же путем (например, внутривенно), либо разными путями (например, внутривенно и в виде перорального применения). Они могут присутствовать и вводиться в одинаковых и различных количествах в унифицированной дозе. Возможно также использовать конкретную схему дозирования, когда это представляется необходимым. В этом плане возможно также комбинировать множество новых соответствующих изобретению соединений общей формулы друг с другом.

Доза может варьировать в широком интервале в зависимости от типа и/или тяжести физиологического и/или патофизиологического состояния, способа введения, возраста, пола, массы тела и чувствительности пациента, которого предусматривают лечить. В возможности компетентного специалиста входит определение "фармакологически эффективного количества" соединения, соответствующие изобретению, и/или дополнительного фармакологически активного вещества. Введение можно осуществить в одной дозе или в множестве раздельных доз.

Подходящая унифицированная доза составляет, например, от 0,0001 мг до 100 мг активного ингредиента, т.е. по меньшей мере одного соединения, соответствующего изобретению, и, при необходимости, по меньшей мере одной дополнительного фармакологически активного вещества на кг массы тела пациента.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей фармакологически активное количество по меньшей мере одного соединения, соответствующего изобретению, в частности, "дисоразол A1-сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH" (региоизомерные соединения 11 и 12), дисоразол E1-сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH" (региоизомерные соединения 13 и 14), дисоразол A1-(сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH)₂" (соединение 15), дисоразол Z-сукцинил-ЕО-[D-Lys⁶]LHRH" (соединение 16), дисоразол Z-(глутарил-[D-Lys⁶]LHRH₂" (соединение 17), дисоразол Z-сукцинил-соматостатин" (соединение 18), региоизомерные соединения 1 и 2, соединение 3, соединение 4, региоизомерное соединение 5 и 6, соединение 7, соединение 9, соединение 10, соединение 19, соединение 20, соединение 21".

В следующем аспекте данная фармацевтическая композиция может дополнительно включать по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель и/или может включать по меньшей мере одну дополнительного фармакологически активного вещества.

В предпочтительном варианте осуществления данное дополнительное фармакологически активное вещество выбрано из группы, состоящей из: "ингибиторов ДНК-топоизомеразы I и/или II, ДНК-интеркаляторов, алкилирующих агентов, дестабилизаторов микротрубочек, агонистов и/или антагонистов рецепторов гормонов и/или факторов роста, ингибиторов сигнальной трансдукции, антител к факторам роста и их рецепторам, ингибиторов киназы, антиметаболитов".

В следующем предпочтительном варианте осуществления данное дополнительное фармакологически активное вещество выбрано из группы, состоящей из "актиномицина D, аминоглутетимида, аспарагиназы, авастина, азатиоприна, BCNU (кармустина), блеомицина, бусульфана, карбоплатина, CCNU (ломустина), хлорамбуцила, цисплатина, коласпазы, циклофосфамида, цитарабина, дактиномицина, даунорубицина, диэтилстилбестрола, доцетаксела, доксорубицина (адриамицина), DTIC (дакарбацина), эпирубицина, эпотилона, эрбитакса, эритрогидроксинониладенина, этинилэстрадиола, этопозида, флударабин фосфата, флуоксиместрона, флутамида, гемцитабина, глиивека/гливека, герцептина, гексаметилмеламина, гидроксимочевины, гидроксипрогестерон капроата, идарубицина, ифосфамида, интерферона, ирессы, иринотекана, L-аспарагиназы, лейковорина, мехлорэтамина, медроксипрогестерон ацетата, мегестрол ацетата, мелфалана, месны, метотрексата, митомицина С, митотана, митоксантрона, N-фосфоноацетил-L-аспартата (PALA), оксалиплатина, паклитаксела, пентозостатина, пликамицина, преднизолона, преднизона, прокарбазина, ралоксифена, рапамицина, семустина, сорафениба, стрептозоцина, тамоксифена, тарцевы, таксотера, тенипозида, тестостерон пропионата, тиогуанина, тиотепы, топотекана, триметиленамина, уридина, винбалстина, винкристина, виндезина, винорелбина, 2',2'-дифтордезоксицитидина, 5-фтордезоксиуридин монофосфата, 5-азацитидин кладрибина, 5-фтордезоксиуридина, 5-фторурацила (5-FU), 6-меркаптопурина".

Касательно фармацевтических композиций, соответствующих изобретению, по меньшей мере одно соединение, соответствующее изобретению, присутствует в фармакологически эффективном количестве, предпочтительно в унифицированной дозе, например, вышеупомянутой унифицированной дозе, специально и предпочтительно в форме для введения, которая делает возможным внутривенное введение. Кроме того, можно сделать ссылку на вышеизложенное в связи с возможными вариантами использования и введения соединений, соответствующих изобретению.

В следующем аспекте цели настоящего изобретения неожиданно достигают путем представления набора, включающего фармакологически активное количество по меньшей мере одного соединения, соответствующего изобретению, и фармакологически активного количества по меньшей мере одного дополнительного фармацевтически активного вещества, как определено выше.

Химический синтез

В данном разделе приведены общие способы синтеза, предназначенные для синтеза конъюгатов дисоразола общих формул (I) С1-В1-А-В2-С2 и (IV) С1-В1-А.

Общие стратегии синтеза и/или выделения, направленные на получение дисоразолов, известны в предшествующем уровне техники и, например, описаны в следующих документах, соответствующих предшествующему уровню техники: см. статью Jansen R et al., Liebigs Ann. Chem. 1994, (8): 759-773; заявку WO 2004/024149; статьи Wipf et al., Chem. Biol. Drug Des. 2006, 67(1):66-73); Hillier MC et al., J. Org. Chem. 2001, 66: 6037-6045; Hartung IV et al., Organic Letters 2002, 4(19): 3239-3242; Wipf P et al., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126(47): 15346-15347; Carvalho R et al., Gene 2005, 359: 91-98; Kopp М et al., Chembiochem. 2005, 6(7): 1277-1286; заявку WO 2006/075013.

Дисоразол Z

может быть либо полностью химически синтезирован в соответствии с вышеперечисленными описаниями, соответствующими предшествующему уровню техники, или получен путем ферментации, как проиллюстрировано в пункте II) в разделе Примеры.

Синтез конъюгатов, соответствующих изобретению, осуществляют принятыми способами органической химии на основе растворов.

А. Дериватизация вторичных гидроксильных групп дисоразола посредством эстерификации органическими ангидридами

В типичной реакции твердый дисоразол растворяют в безводном пиридине, предварительно высушенном над молекулярным ситом (40 нм). В атмосфере азота добавляют 1-2,5 моль эквивалентов DMAP и 1,5-10 моль эквивалентов органического ангидрида (глутарового ангидрида, янтарного ангидрида), как рассчитано либо для моно-, либо для бис-эстерификации двух вторичных ОН-групп, доступных в различных молекулах дисоразола. Молекулярное сито необязательно добавляют к реакции, чтобы гарантировать безводные условия на протяжении всего времени. Смесь перемешивают в течение 6 часов - 5 дней, необязательно при комнатной температуре или на бане при температуре 60°C в зависимости от соответствующих требуемых производных. Эстерификацию мониторируют посредством аналитической ВЭЖХ-УФ.

Типичные условия аналитической ВЭЖХ

Элюент А: 20 мМ NH₄OAc, 5% (об./об.) AcN, 0,2% (об./об.) HOAc.

Элюент В: 95% (об./об.) AcN, 5% (об./об.) H₂O.

Колонка: Merck LiChrosphere 100 C₁₈, 5 мкм, 250×4 мм.

Поток: 1 мл/мин.

Детекция: УФ-DAD, 220-380 нм.

Градиент: 40%-100% В в течение 18 мин, 100% В в течение 5 мин, 100%-40% В в течение 2 мин.

Очистку моно- или бисэстерифицированного дисоразола осуществляют либо с помощью автоматизированной экспресс-жидкостной хроматографией при использовании системы Isco Companion, либо с помощью препаративной ВЭЖХ. Вследствие этого избыток пиридина реакционной смеси удаляют при пониженном давлении и масляный осадок подкисляют 10% уксусной кислотой до pH 4-6. Для очистки с помощью Companion подкисленную водную фазу экстрагируют несколько раз этилацетатом, органические экстракты объединяют, сушат на сульфатом натрия и адсорбируют на материал носителя обращенной фазы при пониженном давлении. Экспресс-хроматографию используют для очистки бис-эстерифицированных дисоразолов и проводят в условиях обращенной фазы с использованием 5% AcN (об./об.), 0,1% НОАс в качестве элюента А и 95% AcN в качестве элюента В.

Для препаративной ВЭЖХ подкисленную водную смесь разводят исходным элюентом (50% В), фильтруют через шприц с мембраной фильтра и инъецируют в систему препаративной ВЭЖХ.

Типичные условия препаративной ВЭЖХ.

Элюент А: 20 мМ NH₄OAc, 5% (об./об.) AcN, 0,2% (об./об.) НОАс.

Элюент В: 95% (об./об.) AcN, 5% (об./об.) Н₂О.

Колонка: Macherey & Nagel VarioPrep Nucleodur 100 C₁₈, 7 мкм, 250×21 мм.

Поток: 20 мл/мин.

Детекция: УФ.

Градиент: 50% В в течение 5 мин, 50%-100% В в течение 25 мин, 100% В в течение 10 мин.

ЖХ (полученные жидкостной хроматографией)-фракции, содержащие требуемые продукты, исследуют аналитической ВЭЖХ, очищают от AcN и НОАс при пониженном давлении и лиофилизируют водный концентрат с получением соответствующих сложных эфиров в виде твердых соединений.

В. Амидное связывание моно- и бис-гемикарбоксиловых эфиров дисоразола с пептидами

Моно- и бис-функционализированные карбоксильные производные дисоразола связывают с пептидами с помощью классической стратегии амидного связывания. Вкратце, карбоксильное дисоразоловое соединение растворяют в сухом ДМФ с 3-6 моль эквивалентами DIPEA и активируют добавлением 1,1-1,5 моль эквивалентов HATU/свободный карбоксильный остаток и последующим перемешиванием в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем пептидное соединение, несущее свободную аминогруппу, добавляют при небольшом молярном избытке (1,1-1,3 экв.) и перемешивают реакционную смесь в течение 0,5-12 час при комнатной температуре. Эффективность связывания мониторируют с помощью аналитической ВЭЖХ (вышеописанным способом).

Для очистки препаративной ВЭЖХ раствор ДМФ подкисляют до рН 5-6 10%-ной НОАс и разводят 4-6 объемами исходного элюента (40-50% В). Тот же типичный способ препаративной ВЭЖХ используют как описано выше. Чистые конъюгаты получают после оценки соответствующей фракции аналитической ВЭЖХ, удаляя AcN и НОАс при пониженном давлении и последующей лиофилизации водного концентрата.

С. Амидное связывание бис-гемикарбоксильных сложных эфиров дисоразола с сывороточным альбумином

Связывание функционализированных дисоразоловых производных с более крупными белками, такими как сывороточный альбумин, осуществляют посредством способа NHS/DCC. Различные молярные соотношения белка и дисоразолового соединения используют для достижения различных соотношений нагрузки дисоразола и белка-носителя. В типичной реакции сывороточный альбумин растворяют в 10 мМ PBS pH 7,4 при исходной концентрации 20 мг/мл. Следующее разведение 1:1 (об./об.) в ДМФ дает прозрачный раствор сывороточного альбумина с конечной концентрацией 10 мг/мл. Бис- или моно гемикарбоксильные эфиры дисоразола растворяют в DMF, добавляют 1,2-5 эквивалентов DCC и 2-10 эквивалентов NHS и перемешивают в течение 20 мин, чтобы создать возможность формирования активированного NHS-сложного эфира. Эффективность активации оценивают с помощью аналитической ВЭЖХ (в плане типичного способа см. выше). Отдельные аликвоты данного раствора добавляют по каплям и при интенсивном перемешивании к раствору буфер на основе сывороточного альбумина/ДМФ. Соотношения дисоразол-NHS сложного эфира и сывороточного альбумина выбирают с учетом различных соотношений нагрузки, основываясь на эмпирических данных. Амидное связывание в водной среде осуществляют в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем немного мутную реакционную смесь подвергают вакуум-фильтрации через фильтр SteriCup Filter (Milipore) и промывают фильтр деионизированной водой. Затем фильтрат разводят деионизированной водой и отделяют низкомолекулярные соединения ультрафильтрацией. Для этого разведенный фильтрат SteriCup помещают в фильтрационную камеру AmiconUltra (Milipore) с исключением по размеру 30000 Да и центрифугируют при 4000×g в течение 15 минут. Концентрированный раствор оставшихся белков промывают 3 раза деионизированной водой и центрифугируют для удаления всех избыточных солей, ДМФ и несвязанного дисоразола и DCC/NHS. Затем очищенный раствор конъюгата сывороточного альбумина и дисоразола лиофилизируют с получением кристаллов, окрашенных в бледно-желтый цвет. Ультрафильтрат анализируют на несвязанный дисоразол с помощью аналитической ВЭЖХ, используя типичный способ, описанный выше, с целью оценки средних уровней нагрузки дисоразола/молекулу сывороточного альбумина.

D. Окисление дисоразолов перйодинановым раствором Десс-Мартина

Дисоразолы (например, А1, Е1 или Z) растворяют в дихлорметане. Добавляют 12 моль эквивалентов пиридина и охлаждают смесь до меньше чем 5°С на ледяной бане. Добавляют 3 моль эквивалента перйодинанового реагента Десс-Мартина (триацетоксиперйодинана) несколькими порциями и реакции дают возможность перемешиваться на ледяной бане в течение 15 минут. Смесь нагревают до комнатной температуры и продолжают перемешивание в течение 30 минут (Контроль ТСХ, а именно дихлорметан/метанол 95:5). Реакционную смесь разводят этилацетатом и выливают на 0,5 Н хлористоводородную кислоту. Органическую фазу промывают солевым раствором, пока она не станет почти нейтральной (pH 6), сушат над сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Последующая экспресс-хроматография с использованием дихлорметан/метанола дает дисоразол-кетоновые производные.

Е. Сокращения

5-FU - 5-фторурацил

AcN - ацетонитрил

А1а - аланин(ил)

Aloe - аллилоксикарбонил

Arg - аргинин(ил)

Asn - аспарагин(ил)

BCNU - кармустин

Boc - трет-бутилоксикарбонил

Cbz - карбобензоксикарбонил

CCNU - ломустин

Cit - цитруллин

DCC - N,N'-дициклогексилкарбодиимид

DCM - дихлорметан

DIPEA - диизопропилэтиламин

DMAP - N,N'-4-диметиламинопиридин

DMEM - среда Игла в модификации Дальбекко

ДМФ - N,N'-диметилформамид

ДМСО - диметилсульфоксид

Dox - доксорубицин

DTIC - дакарбацин

например - приведен пример

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ

Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил

Gln - глутамин(ил)

Glp - пироглутамат(ил)

час. - часов

HATU - N,N,N',N'-тетраметил-O-(7-азабензотриазол-1-ил)уроний гексафторфосфат

HEPES - N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота

НОАс - уксусная кислота

HOBt - 1-гидроксибензотриазол

HSA - человеческий сывороточный альбумин

hTyr - гомотирозин(ил)

Hyp - гидроксипролин

Ile - изолейцин(ил)

IPA - изопропиловый спирт

Leu - лейцин(ил)

LH - лютеинизирующий гормон

LHRH (GnRH) - рилизинг-гормон лютеинизирующего гормона

LHRH-R - рецептор рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона

Lys - лизин(ил)

MDS - метилдисульфанил

Me - метил

D/L-Mel - (4-[бис(2-хлорэтил)амино]-D/L-фенилаланин)

МеОН - метанол

мин - минута

мл - миллилитр

NHS - N-гидроксисукцинимид

Nle - норлейцин

PALA - N-фосфоноацетил-L-аспартат

PEG2 - полиэтиленгликоль, состоящий из 2 молекул этиленгликоля

PEG3 - полиэтиленгликоль, состоящий из 3 молекул этиленгликоля

PEG7 - полиэтиленгликоль, состоящий из 4 молекул этиленгликоля

PMS - N-метилдибензопиразинметилсульфат

Руr - пироглутамат(ил)

RIA - радиоиммуноанализ

КТ - комнатная температура

Sar - саркозин

tBu - трет-бутил

TEA - триэтиламин

ТФА - трифторуксусная кислота

ТГФ - тетрагидрофуран

ТСХ - тонкослойная хроматография

Tpi - тетрагидроноргарман-3-карбоновая кислота

Тритил - трифенилкарбонил

Tyr - тирозин(ил)

Val - Валин(ил)

ХТТ - натрий

3'-[1-(фениламинокарбонил)-3,4-тетразолий]-бис(4-метокси-6-нитро) бензолсульфоновая кислота

Краткое описание чертежей

На фигурах 1-17 показывают измеренные Н-ЯМР-спектры выбранных соединений, соответствующих изобретению: соединения 1/2, 3, 4, 5/6, 7, 8, 9, 10, 11/12, 13/14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.

Содержание всех приведенных ссылок и патентов тем самым включено в виде ссылки. Изобретение объясняют более детально посредством следующих примеров, однако, без ограничения ими.

Осуществление изобретения

Примеры

1) Синтез соединений, соответствующих изобретению

Пример 1

Дисоразол Е1 моно-гемисукцинат, оба региоизомера (1) и (2)

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением А., 30 мг дисоразола Е1, 12 мг DMAP и 150 мг янтарного ангидрида растворяют в 2 мл сухого пиридина и перемешивают в течение 4 дней при КТ под азотом. ТСХ-контроль: DCM-MeOH 9:1/DCM-IPA 9:1 и аналитическая ВЭЖХ. Реакционную смесь выливают на холодный солевой раствор/0,5 М HCl и экстрагируют этилацетатом, промывают солевым раствором до pH 4, сушат над Na₂SO₄ и удаляют избыток растворителя при пониженном давлении. Очистку сырца проводят ЖХ с помощью Isco Companion при использовании градиента DCM/MeOH. 13 мг очищенного продукта получают в виде смеси 1:1 обоих региоизомеров 1 и 2 (объединенный выход: 39%).

ЖХ-МС: [М+Н]⁺ 875,6,

Рассчитанная масса: 874.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 1.

Пример 2

Дисоразол Е1 бис-гемиглутарат (3)

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением А., 100 мг дисоразола Е1, 30 мг DMAP и 150 мг глутарового ангидрида растворяют в 3 мл сухого пиридина и добавляют 100 мкл TEA и перемешивают в течение 4 дней при КТ под азотом. ТСХ-контроль: DCM-МеОН 9:1/DCM-IPA9:1 и аналитическая ВЭЖХ. Реакционную смесь выливают на холодный солевой раствор/0,5 М HCl и экстрагируют этилацетатом, промывают солевым раствором до pH 4, сушат над Na₂SO₄ и удаляют избыток растворителя при пониженном давлении. Очистку сырца проводят ЖХ с помощью Isco Companion при использовании градиента DCM/MeOH. Получают 35 мг очищенного продукта (выход: 24%).

ЖХ-МС: [М+Н]⁺ 1003,7.

Рассчитанная масса: 1002.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 2.

Пример 3

Дисоразол Е1 бис-гемисукцинат (4)

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением А., 138 мг дисоразола Е1, 70 мг DMAP и 730 мг янтарного ангидрида растворяют в 10 мл сухого пиридина, добавляют молекулярное сито (4А) на кончике шпателя и перемешивают реакцию в течение 4 дней при КТ под азотом. ТСХ-контроль: DCM-MeOH 9:1/DCM-IPA 9:1 и аналитическая ВЭЖХ. Реакционную смесь разводят этилацетатом, выливают на ледяной солевой раствор/HCl pH 3-4, экстрагируют этилацетатом, органическую фазу промывают солевым раствором до pH 4-5, сушат над Na₂SO₄ и удаляют избыток растворителя при пониженном давлении. Очистку осуществляют посредством ЖХ с помощью Isco Companion с градиентом DCM/MeOH, получая 80 мг твердого продукта (выход 39%).

ЖХ-МС: [М+Н]⁺ 975,5.

Рассчитанная масса: 974.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 3.

Пример 4

Дисоразол А1 моно-гемисукцинат, оба региоизомера (5) и (6)

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением А., 30 мг дисоразола А1, 15 мг DMAP и 160 мг янтарного ангидрида растворяют в 2 мл сухого пиридина и перемешивают реакцию в течение 4 дней при КТ под азотом. ТСХ-контроль: DCM-MeOH 9:1/DCM-IPA 9:1 и аналитическая ВЭЖХ. Реакционную смесь разводят этилацетатом, выливают на ледяной солевой раствор/HCl pH 3-4, экстрагируют этилацетатом, органическую фазу промывают солевым раствором до pH 4-5, сушат над Na₂SO₄ и удаляют избыток растворителя при пониженном давлении. Очистку осуществляют посредством ЖХ с помощью Isco Companion с градиентом DCM/MeOH, получая 5,3 мг твердого продукта, содержащего оба региоизомера в соотношении 1:1 (объединенный выход 15%).

ЖХ-МС: [М+Н]⁺ 859,6.

Рассчитанная масса: 858.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 4.

Пример 5

Дисоразол А1 бис-гемисукцинат (7)

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением А., 138 мг дисоразола А1, 70 мг DMAP и 730 мг янтарного ангидрида растворяют в 10 мл сухого пиридина, добавляют молекулярное сито (4А) на кончике шпателя и перемешивают реакцию в течение 4 дней при КГ под азотом. ТСХ-контроль: DCM-MeOH 9:1/DCM-IPA 9:1. Реакционную смесь разводят этилацетатом, выливают на ледяной солевой раствор/HCl pH 3-4, экстрагируют этилацетатом, органическую фазу промывают солевым раствором до pH 4-5, сушат над Na₂SO₄ и удаляют избыток растворителя при пониженном давлении. Очистку осуществляют посредством ЖХ с помощью Isco Companion с использованием градиента DCM/MeOH, получая 37 мг твердого продукта 7 (выход: 20%).

ЖХ-МС; [М+Н]⁺ 959,4.

Рассчитанная масса: 958.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 5.

Пример 6

Дисоразол Z моно-гемисукцинат (8)

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением А., 80 мг дисоразола Z, 16 мг DMAP и 13 мг янтарного ангидрида растворяют в 1,5 мл пиридина и добавляют к реакции маленькую порцию молекулярного сита 4 А. Смесь нагревают до 60°C (температура масляной бани) и перемешивают в течение 24 час. Реакцию мониторируют посредством ВЭЖХ-УФ. После охлаждения до комнатной температуры добавляют этилацетат и отфильтровывают молекулярное сито. Фильтрат упаривают досуха при пониженном давлении, остаток перерастворяют в 5 мл 40% смеси растворителей В (А: 20 мМ NH₄AcO, 5% AcN, 0,2% HOAc pH 4,5; В: 95% AcN, 5% воды). После фильтрования через мембранный фильтр с наконечников Люэра раствор вводят в препаративную ВЭЖХ (40% В→85% В в течение 25 мин). Собирают пики геми-моносукцината и лиофилизируют фракцию, получая 31 мг чистого продукта 8 в виде твердого вещества светло-коричневого цвета (35%).

ЖХ-МС: [М+Н]⁺ 847,0.

Рассчитанная масса: 846.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 6.

Пример 7

Дисоразол Z бис-гемисукцинат (9)

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением А., 188 мг дисоразола Z, 31 мг DMAP и 500 мг янтарного ангидрида растворяют в 4 мл пиридина и добавляют к реакции небольшую порцию молекулярного сита 4 А. Смесь нагревают до 40°C (температура масляной бани) и перемешивают в течение 72 час. Реакцию мониторируют посредством ВЭЖХ-УФ и ТСХ (DCM/MeOH 9:1). Реакцию разводят DCM, переносят в испарительную колбу и удаляют растворитель при пониженном давлении. Неочищенное масло снова растворяют в DCM, адсорбируют на силикагель RP18, разделяют на две аналогичные фракции и используют для обращенно-фазовой экспресс-хроматографии ЖХ Isco Companion (ацетонитрил/вода/0,1% уксусная кислота) с колонкой для обращенной фазы 12 г.Фракцию No 12-14 из номера прохождения 1 и фракцию No 2-3 из номера прохождения 2 собирают, объединяют и удаляют растворитель при пониженном давлении/лиофилизации. Получают 105 мг продукта бледно-коричневого цвета (45%).

ЖХ-МС: [М+Н]⁺ 947,3.

Рассчитанная масса; 946.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 7.

Пример 8

Дисоразол Z бис-гемиглутарат (10)

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением А., 183 мг дисоразола Z, 30 мг 4-DMAP и 560 мг глутарового ангидрида растворяют в 4 мл пиридина и добавляют к реакции небольшую порцию молекулярного сита 4 А. Смесь нагревают до 40°C (температура масляной бани) и перемешивают в течение 72 час. Реакцию мониторируют посредством ВЭЖХ-УФ и ТСХ (DCM/MeOH 9:1). Реакцию разводят DCM, переносят в испарительную колбу и удаляют растворитель при пониженном давлении. Неочищенное масло затем растворяют в этилацетате и выливают на ледяной солевой раствор/HCl, промывают до pH 4-5 солевым раствором/водой, сушат над Na₂SO₄ и удаляют растворитель при пониженном давлении. Остаток растворяют в DCM и адсорбируют на силикагель RP18 для обращенно-фазовой экспресс-хроматографии ЖХ Isco Companion (ацетонитрил/вода/0,1% уксусная кислота). После удаления AcN/уксусной кислоты при пониженном давлении и лиофилизации водного концентрата получают 75 мг (32%) чистого соединения 10 в виде твердого веществе бледно-коричневого цвета.

ЖХ-МС: [М+Н]⁺ 975,3.

Рассчитанная масса; 974.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 8.

Пример 9

Дисоразол А1 моно-гемисукцинил [D-Lys⁶]LHRH, оба региоизомера (11) и (12)

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением В., 6 мг дисоразола А1 моно-гемисукцината (смесь 1:1 обоих региоизомеров) и 3,2 мг HATU растворяют в 0,25 мл ДМФ. Добавляют 5 мкл DIPEA и перемешивают в течение 20 мин при КТ, чтобы обеспечить возможность формирования активированного сложноэфирного комплекса. 10,1 мг пептида [D-Lys⁶]LHRH растворяют в 0,25 мл ДМФ, добавляют к смеси и перемешивают реакцию в течение 1,5 час при комнатной температуре. Реакцию мониторируют ВЭЖХ-УФ и затем смесь подвергают препаративной ВЭЖХ. Для этого реакционную смесь разводят 1,5 мл 40% смеси раствора В (А: 20 мМ NH₄AcO, 5% AcN, 0,2% HOAc pH 4,5; В: 95% AcN, 5% воды). Раствор подкисляют до pH 6 приблизительно 0,1 мл 10% HOAc. После фильтрования через мембранный фильтр с наконечником Люэра раствор вводят в препаративную ВЭЖХ (40% В→85% В в течение 25 мин). Главный пик собирают и фракцию лиофилизируют, получая 5 мг соединений 11 и 12 в виде хлопьев светло-коричневого цвета (соотношение 1:1, объединенный выход: 35%).

HR-ESI-MS: (заряженное состояние +2) 1048,0.

рассчитанная масса: 2092.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 9.

Пример 10

Дисоразол Е1 моно-гемисукцинил [D-Lys⁶]LHRH, оба региоизомера (13) и (14)

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением В., 40 мг дисоразола Е1 моно-гемисукцината (смесь 1:1 обоих региоизомеров) и 18 мг HATU растворяют в 1 мл ДМФ. Добавляют 25 мкл DIPEA и перемешивают в течение 15 мин при КТ, чтобы обеспечить возможность формирования активированного сложноэфирного комплекса. 54 мг пептида [D-Lys⁶]LHRH растворяют в 1 мл ДМФ, добавляют к смеси и перемешивают реакцию в течение 2 час при комнатной температуре. Реакцию мониторируют ВЭЖХ-УФ и затем смесь подвергают препаративной ВЭЖХ. Для этого реакционную смесь разводят 3,5 мл 40% смеси раствора В (А: 20 мМ NH₄AcO, 5% AcN, 0,2% HOAc pH 4,5; В: 95% AcN, 5% воды). Раствор подкисляют до pH 6 приблизительно 0,5 мл 10% HOAc. После фильтрования через мембранный фильтр с наконечником Люэра раствор вводят в препаративную ВЭЖХ (40% В - 85% В в течение 25 мин). Главный пик собирают и фракцию лиофилизируют, получая 29 мг соединений 13 и 14 в виде хлопьев светло-коричневого цвета (соотношение 1:1, объединенный выход: 36%).

HR-ESI-MS: (заряженное состояние +2) 1056,0.

Рассчитанная масса: 2108.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 10.

Пример 11

Дисоразол А1 бис-гемисукцинил [D-Lys⁶]LHRH (15)

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением В., 15,7 мг дисоразола А1 бис-гемисукцината и 7,5 мг HATU растворяют в 1 мл DMF. Добавляют 11 мкл DIPEA и перемешивают в течение 20 мин при КТ, чтобы создать возможность формирования активированного сложноэфирного комплекса. 23,6 мг пептида [D-Lys⁶]LHRH растворяют в 1 мл ДМФ, добавляют к смеси и перемешивают реакцию в течение 2 час при комнатной температуре. Реакцию мониторируют ВЭЖХ-УФ и затем смесь подвергают препаративной ВЭЖХ. Для этого реакционную смесь разводят 4,5 мл 40% смеси раствора В (А: 20 мМ NH₄AcO, 5% АсМ, 0,2% НОАс pH 4,5; В: 95% AcN, 5% воды). Раствор подкисляют до pH 6 приблизительно 0,5 мл 10% НОАс. После фильтрования через мембранный фильтр с наконечником Люэра раствор вводят в препаративную ВЭЖХ (40% В→85% В в течение 25 мин). Главный пик собирают и фракцию лиофилизируют, получая 18 мг соединения 15 в виде хлопьев белого цвета (выход: 32%).

HR-ESI-MS: (заряженное состояние +4) 858,4.

Рассчитанная масса: 3426.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 11.

Пример 12

Дисоразол Z моно-гемисукцинил [D-Lys⁶]LHRH (16)

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением В., 45 мг дисоразола Z моно-гемисукцината и 24 мг HATU растворяют в 1 мл DMF. Добавляют 37 мкл DIPEA и перемешивают в течение 20 мин при КТ, чтобы создать возможность формирования активированного сложноэфирного комплекса. 76 мг пептида [D-Lys⁶]LHRH растворяют в 1 мл ДМФ, добавляют к смеси и перемешивают реакцию в течение 1,5 час при комнатной температуре. Реакцию мониторируют ВЭЖХ-УФ и затем смесь подвергают препаративной ВЭЖХ. Для этого реакционную смесь разводят 4,5 мл 40% смеси раствора В (А: 20 мМ NH₄AcO, 5% AcN, 0,2% HOAc pH 4,5; В: 95% AcN, 5% воды). Раствор подкисляют до pH 6 приблизительно 0,75 мл 10% HOAc. После фильтрования через мембранный фильтр с наконечником Люэра раствор вводят в препаративную ВЭЖХ (40% В→85% В в течение 25 мин). Главный пик собирают и фракцию лиофилизируют, получая 42 мг соединения 16 в виде хлопьев светло-коричневого цвета (выход: 38%).

HR-ESI-MS: (заряженное состояние +2) 1042,0.

Рассчитанная масса: 2080.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 12.

Пример 13

Дисоразол Z бис-гемиглутарил [D-Lys⁶]LHRH (17)

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением В., 35 мг дисоразол Z бис-гемиглутарата и 34 мг HATU растворяют в 1 мл DMF. Добавляют 54 мкл DIPEA и перемешивают в течение 20 мин при КТ, чтобы создать возможность формирования активированного сложноэфирного комплекса. 128 мг пептида [D-Lys⁶]LHRH растворяют в 1 мл ДМФ, добавляют к смеси и перемешивают реакцию в течение 2 час при комнатной температуре. Реакцию мониторируют ВЭЖХ-УФ и затем смесь подвергают препаративной ВЭЖХ. Для этого реакционную смесь разводят 4,5 мл 40% смеси раствора В (А: 20 мМ NH₄AcO, 5% AcN, 0,2% HOAc pH 4,5; В: 95% AcN, 5% воды). Раствор подкисляют до pH 6 приблизительно 1 мл 10% HOAc. После фильтрования через мембранный фильтр с наконечником Люэра раствор вводят в препаративную ВЭЖХ (40% В→85% В в течение 25 мин). Главный пик собирают и фракцию лиофилизируют, получая 39 мг соединения 17 в виде хлопьев белого цвета (выход: 33%).

HR-ESI-MS: (заряженное состояние +4) 862,4.

Рассчитанная масса: 3442.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 13.

Пример 14

Дисоразол Z моно-гемисукцинил соматостатин (18)

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением В., 20 мг дисоразола Z моно-гемисукцината и 21 мг HATU растворяют в 1 мл ДМФ. Добавляют 15 мкл DIPEA и перемешивают в течение 15 мин при КТ, чтобы создать возможность формирования активированного сложноэфирного комплекса. 25 мг синтетического пептида H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(Fmoc)-Val-Cys-Thr-NH₂×HCl (сдисульфидными мостиками) растворяют в 1 мл ДМФ, добавляют к смеси и перемешивают реакцию в течение 4 час при комнатной температуре. Реакцию мониторируют ВЭЖХ-УФ. Неочищенную реакционную смесь разводят 2 мл ДМФ и добавляют пиперидин до конечной концентрации 10% (об./об.). После перемешивания в течение 5 мин при КТ смесь непосредственно подвергают препаративной ВЭЖХ. Для этого реакционную смесь разводят 4,5 мл 50% смеси раствора В (А: 20 мМ NH₄AcO, 5% AcN, 0,2% HOAc pH 4,5; В: 95% AcN, 5% воды). Раствор подкисляют до pH 6 приблизительно 1,5 мл 10% HOAc. После фильтрования через мембранный фильтр с наконечником Люэра раствор вводят в препаративную ВЭЖХ (50% В→100% В в течение 25 мин). Главный пик собирают и фракцию лиофилизируют, получая 12 мг соединения 18 в виде хлопьев бежевого цвета (выход: 33%).

HR-ESI-MS: (заряженное состояние+2) 937,4.

Рассчитанная масса: 1873.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 14.

Пример 15

Соединение 19

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением D., 20 мг дисоразола Е1 окисляют с целью получения 10 мг дикетонового продукта (56%).

ЖХ-МС: [М+Н]⁺: 771,5.

Рассчитанная масса: 770.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 15.

Пример 16

Соединение 20

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением D., 25 мг дисоразола А1 окисляют с целью получения 17 мг дикетонового продукта (67%).

ЖХ-МС: [М+Н]⁺: 755,6.

Рассчитанная масса: 754.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 16.

Пример 17

Соединение 21

Согласно общему способу синтеза, приведенному под обозначением D., 44 мг дисоразола Z окисляют с целью получения 15 мг дикетонового продукта (29%).

ЖХ-МС: [М+НГ: 743,3.

Рассчитанная масса: 742.

Н-ЯМР-спектроскопия: см. фигуру 17.

II) Получение дисоразола Z путем ферментации

Дисоразол Z получают ферментацией штамма-продуцента миксобактерии Sorangium cellulosum Soce 1875 (доступном в DSMZ под регистрационным No. DSM53600).

Предпочтительно, когда для инокуляции ферментера посевную культуру выращивают во встряхиваемых колбах. Процесс ферментации осуществляют, например, как периодический или подпитываемый.

В качестве посевной культуры используют среду, включающую следующие компоненты: 0,8% растворимого крахмала (Merck 1.01252), 0,2% дрожжевого экстракта, 0,2% обезжиренной соевой муки, 0,1% CaCl₂×2H₂O, 0,1% MgSO₄×7H₂O, 8 мг/л Na-Fe-ЭДТА, 1% буфера HEPES, 0,2% глюкозы, 1% смолы XAD при pH 7,4 в начале культивирования. Встряхиваемые колбы с посевной культурой можно инкубировать при 30°C при встряхивании со 160 об./мин. Для ферментации используют периодическую ферментацию 70 литров среды, идентичной среде для посевной культуры, но без буфера HEPES с pH 7,9 до автоклавирования. Добавляют 1% (об./об.) XAD (Amberlite XAD 16, Rohm и Haas) для адсорбции дисоразола Z.

Ферментер инокулируют одним литром посевной культуры. Культивирование осуществляют при температуре 30°С, аэрации 5,5 л/мин при скорости мешалки 80 об./мин. При необходимости поддерживают постоянный pH на уровне или выше 6,8 добавлением 5% раствора КОН во время ферментации. Остаточный крахмал контролируют йодной реакцией. Концентрацию глюкозы мониторируют, например, используя тест-полоски (Roche).

Продуктивная культура готова для сбора, когда глюкоза и крахмал в основном метаболзируются и когда концентрация дисоразола Z достигает плато. Обычно через двенадцать дней ферментацию останавливают и получают путем сбора смолы XAD фильтрованием. Клетки, которые присоединяются к XAD, включают в последующие стадии экстракции и очистки.

Для аналитических целей аликвоту ферментационной культуры используют для сбора смолы XAD и клеточной массы с последующими экстракциями с использованием метанола, системы метанол: этанол: изопропанол (80:15:5) и конечной стадии с использованием ацетона. Экстракты объединяют, концентрируют и анализируют ВЭЖХ-МС.

При использовании альтернативного штамма Sorangium cellulosum, предпочтительно Soce 427 (перечислен в DSMZ под регистрационным номером DSM53419) для посевной культуры можно использовать следующую среду: 0,3% крахмала (Cerestar SF 12618, Cerestar Deutschland, Krefeld), 0,2% обезжиренной соевой муки (Soyamine 50T, Lucas Meyer, Hamburg), 0,1% дрожжевого экстракта (Marcor), 0,1% сульфата магния (Roth, P027.2), 0,05% хлорида кальция (Merck, 1.02382), 8 мг/л соли натрия-железа этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na-Fe-ЭДТА) (Merck, 108413) и 0,9% буфера HEPES (Roth, 9105.3), при pH 7,5. После автоклавирования добавляют 20% раствор глюкозы (Riedel-de Haen 16301) до конечной концентрации 0,3% глюкозы. Для ферментации используют ту же среду за исключением того, что буфер HEPES используют при pH 7,9 до автоклавирования.

После ферментации согласно вышеприведенному описанию сырую клеточную массу и смолу XAD, собранную центрифугированием 70 л ферментационного бульона Sorangium cellulosum штамм So ce427, экстрагируют порциями по 3 л метанола. Объединенный фильтрат упаривают с получением остаточной водной смеси. При необходимости добавляют воду, получая 1,2-1,5 л, которые экстрагируют тремя порциями по 1,2 л дихлорметана. Объединенные органические растворы сушат безводным сульфатом натрия и затем упаривают досуха. Остаток перерастворяют в 1 л водного метанола (97%) и разделяют тремя порциями гептана. Метанольный слой упаривают, разводят толуолом и упаривают досуха. Остаток разделяют гель-хроматографией с использованием метанола на Sephadex LH-20 (Pharmacia), получая обогащенную фракцию дисоразола Z, который очищают RP-MPLC (ODS-AQ, 120 A, S 16 мкм) с использованием системы метанол-вода (65/35), получая очищенный дисоразол Z.

III) Антипролиферативное действие на различные опухолевые клеточные линии

Выбранные соединения, соответствующие изобретению, исследуют на их антипролиферативную активность в пролиферационном тесте на адаптированных опухолевых клеточных линиях.

В используемом тесте определяют активность клеточной дегидрогеназы, и он дает возможность определить жизнеспособность клеток и, косвенно, число клеток.

Используемые клеточные линии представляют собой клеточную линию карциномы шейки матки человека KB/HeLa (ATCC CCL17), клеточную линию аденокарциномы яичника SKOV-3 (ATCC HTB77), клеточную линию глиобластомы человека SF-268 (NCI 503138) и клеточную линию карциномы легкого NCI-H460 (NCI 503473). Кроме того, для исследования специфического действия соединений, соответствующих изобретению, на клеточный цикл, используют клеточную систему RKOp27 (см. статью Schmidt М et al. Oncogene 2000, 19(20): 2423-2429). RKO представляет собой клеточную линию карциномы толстой кишки человека (ATCC CRL-2577), в которой ингибитор клеточного цикла p27^kip1, индуцируемый посредством экспрессирующей системы ecdysone, экспрессируется и может привести к остановке клеточного цикла, в частности, в G2. Неспецифически действующие вещества ингибируют пролиферацию независимо от того, блокированы или не блокированы клетки в G1 или G2. Однако специфические в отношении клеточного цикла вещества, такие как, например, ингибиторы тубулина, цитотоксичны только, если клетки не блокированы и клеточный цикл не остановлен.

ХТТ-тест на активность клеточной дегидрогеназы

Растущие в прикрепленном состоянии опухолевые клеточные линии KB/HeLa, SKOV-3, SF-268 и NCI-H460 культивируют в стандартных условиях в термостате при 37°C, 5% CO₂ и 95% влажности воздуха. В день эксперимента 1 клетки отделяют, используя трипсин/ЭДТА и осаждают центрифугированием. Затем клеточную пеллету ресуспендируют в соответствующей среде для культивирования с соответствующим числом клеток и проводят реакцию в 96-луночном планшете для микротитрования. Затем планшеты культивируют в течение ночи в термостате. Тестируемые вещества готовят в виде маточных растворов 1 мг/мл в ДМСО и разводят до соответствующих концентраций в день эксперимента 2, используя среду для культивирования. Субстанции в среде для культивирования затем добавляют к клеткам и инкубируют в термостате в течение 45 час. В качестве контроля используют клетки, которые не обработаны тестируемым веществом. Для ХТТ-анализа 1 мг/мл ХТТ (натрий 3'-[1-(фениламинокарбонил)-3,4-тетразолий]-бис(4-метокси-6-нитро)бензолсульфоновая кислота)растворяют вереде RPM 1-1640 без фенолового красного. Дополнительно готовят раствор 0,383 мг/мл PMS (N-метилдибензопиразинметилсульфата) в забуференном фосфатом солевом растворе (PBS). В день эксперимента 4 75 мкг/лунку смеси XTT-PMS пипеткой наносят на планшеты с клетками, которые к тому времени инкубируют с тестируемым и веществами в течение 45 час. Для этого незадолго до использования раствор ХТТ смешивают с раствором PMS в соотношении 50:1 (об./об.). Затем планшеты с клетками инкубируют в термостате в течение следующих 3 час и определяют оптическую плотность (OD_490нм) в фотометре. С помощью установленной (OD_490нм) рассчитывают процент ингибирования относительно контроля и строят полулогарифмическую кривую зависимости концентрации и действия. IC₅₀ рассчитывают посредством регрессионного анализа на основании кривой зависимости эффекта от концентрации, используя программу Graphpad Prism.

Анализ клеточного цикла с помощью модели RKOp27

Анализ проводят на 96-луночных планшетах. Посредством индуцируемой экспрессии p27_kip1 полностью блокируют рост клеток, но они не погибают. На основании активности индуцированных и неиндуцированных клеток можно сделать заключения о механизме действия (специфичности в отношении клеточного цикла) терапевтических препаратов. Индуцированные клетки инокулируют в приблизительно тройном количестве, поскольку деление более не происходит во время анализа, по сравнению с неиндуцированными клетками (20000 клеток/лунку индуцированных, 6250 клеток/лунку неиндуцированных). Контролями являются необработанные клетки (+/-индукция). Индукцию осуществляют 3 мкМ муристероном А. В день 1 клетки подвергают воздействию (+/- муристерон А) и инкубируют при 37°C в течение 24 часов. В день 2 добавляют тестируемое вещество (контроль-ДМСО) и продолжают инкубирование при 37°C в течение последующих 45 час до проведения стандартного анализа ХТТ.

В таблице 1 показаны цитотоксическая и/или ингибирующая рост активности выбранных соединений при наличии/отсутствии экспрессии p27_kip1 по сравнению с цитотоксической группой доксорубицина, конъюгата, соответствующего предшествующему уровню техники AN-152 и дисоразоловым группам, дисоразолу А1, Е1 и Z, и выбранным соединениям, соответствующим изобретению: дисоразол Z-(глутарил-[D-Lys⁶]LHRH)₂ - соединение 17; дисоразол Z - сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH - соединение 16; дисоразол Е1 - сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH - соединения 13/14; дисоразол А1 -сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH - соединения 11/12; дисоразол А1 - (Сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH)₂ - соединение 15.

Тестированные соединения не проявляют цитотоксическую активность в индуцированном состоянии p27_kpi1. Результаты показывают очень высокий уровень ингибирования пролиферации выбранных опухолевых клеточных линий выбранными соединениями, соответствующими изобретению. Более того, тестированные конъюгаты показывают явное снижение токсичности по сравнению со свободными неконъюгированными группами дисоразола.

Таблица 1 Соединение IC₅₀ [мкг/мл] KB/HELA SKOV-3 SF-268 NCI-H460 RKOp27 RKOp27 индуцированная Доксорубицин 0,320 0,347 0,305 0,105 0,082 0,124 AN-152 0,871 1,238 1,258 0,558 0,587 0,632 Дисоразол Z 0,001005 0,000504 0,001284 0,000670 0,000659 >3,16 Соединение 16 0,018915 0,007683 0,017800 0,009235 0,005180 >3,16 Соединение 17 >3,16 >3,16 >3,16 >3,16 >3,16 >3,16 Дисоразол Al 0,000049 0,000027 0,000125 0,000022 0,033960 >3,16 Соединения 11/12 0,058930 0,042800 0,113100 0,029660 0,033960 >3,16 Соединение 15 >3,16 >3,16 >3,16 >3,16 >3,16 >3,16 Дисоразол E1 0,000170 0,000074 0,000474 0,000065 0,000170 >3,16 Соединения 13/14 0,018910 0,016850 0,055660 0,012803 0,017240 >3,16

IV) Анализ пролиферации, зависимой от рецептора GnRH

Исследуют дозозависимое опосредованное рецептором ингибирование пролиферации клеток выбранными соединениями, соответствующими изобретению. Для исследования данных эффектов используют клеточную линию, положительную по человеческому рецептору GnRH (hGnRH-R) (5C6; см. статью Beckers et al., Eur. J. Biochem. 1995, 231: 535-543) и отрицательную по hGnRH-R клеточную линию (LTK-; ЕСАСС No. 8501 1432).

Соответственные клетки подвергают воздействию 1 мл среды для культивирования в 24-луночных мультипланшетах для титрования (МТР) с числом клеток 15000 клеток/лунку. Число клеток регулируют таким образом, чтобы через 5 дней тестирования необработанные контрольные клетки еще находились в экспоненциальной фазе роста.

Тест-соединения дают культивируемым клеткам через 4 часа исходного роста (адгезии) в объеме 100 мкл, получая конечные концентрации, приведенные в таблице 2.

Через 30 минут инкубирования при 37°C всю культуральную среду отсасывают и клетки дважды промывают средой для культивирования без тест-соединений. После промывания клетки помещают в термостат (при 37°C, 5% CO₂ и 95% влажности воздуха) и инкубируют в течение следующих 4 дней. Для определения числа клеток после инкубирования клетки отделяют, используя трипсин/ЭДТА, и центрифугируют. Число жизнеспособных клеток и общее число клеток подсчитывают, используя клеточный анализатор Vi-Cell Analyzer (Beckman Coulter).

Число жизнеспособных клеток анализируют в сравнении с необработанными контрольными клетками (=100%). Считают только группы клеток (соответствующие лунки), в которых общая выживаемость клеток превышает 90%, т.е. исключено ингибирование пролиферации клеток посредством неспецифической активности.

В таблице 2 представляют статус пролиферации через 96 часов инкубирования hGnRH-R-положительных и -отрицательных клеток в присутствии и в отсутствие различных концентраций тест-соединений. Статус пролиферации необработанных контрольных клеток через 96 часов принимают за 100%. Используемые тест-соединения представляют собой конъюгат, соответствующий предшествующему уровню техники AN-152 и следующие выбранные соединения, соответствующие изобретению: дисоразол Z-(глутарин-[D-Lys⁶]LHRH)₂ - соединение 17, дисоразол Z-сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH-соединение 16, дисоразол E1-сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH - соединения 13 и 14, дисоразол A1-сукцилин-[D-Lys⁶]LHRH - соединения 11 и 12; дисоразол А1-(сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH)₂ - соединение 15.

Все тестированные соединения, соответствующие изобретению показывают дозозависимое ингибирование клеточной пролиферации на протяжении периода исследования 96 часов. Данный эффект ингибирования специфичен, как можно видеть из результатов, полученных с hGnRH-R-отрицательной клеточной линией LTK-.

Таблица 2 Соединение Клеточная линия 5С6 Клеточная линия LTK- 100 нМ 10 нМ 1 нМ 0,1 нМ 100 нМ 10 нМ 1нМ 0,1 нМ Контроль 100% 100% AN-152 42,1   101,3   Соединение 17 41,7 58,5 85,9 95,5 98,0 98,8 99,8 100,9 Контроль 100% 100% AN-152 43,9   102,3   Соединение 16 21,9 54,1 80,9 83,8 61,7 103,4 105,8 101,8 Контроль 100% 100% AN-152 42,1   101,3   Соединения 13/14 14,6 45,9 80,8 85,9 27,0 93,2 98,8 98,6 Контроль 100% 100% AN-152 43,9   102,3   Соединения 11/12 23,5 52,5 80,3 88,0 77,2 101,4 11,5 109,6 Контроль 100% 100% AN-152 43,9   102,3   Соединение 15 43,0 66,6 98,6 95,1 101,7 108,0 111,3 108,6

V) GnRH-рецептор-зависимое антипролиферативное действие соединения 16 in vivo

Голых мышей 30 CD 1 nu/nu инокулируют подкожно GnRH-рецептор-положительной клеточной линией карциномы яичника человека OVCAR-3 (5 миллионов клеток/животное). Эксперимент начинают после образования солидных опухолей. Используют 5 животных/группу дозы.

В день 0 эксперимента объем отдельной опухоли определяют пальпацией и принимают за 100%. Тест-соединения вводят последовательно в день 0 эксперимента путем инъекции в хвостовую вену тест-животных. Стандартный объем 10 мл 0,9% солевого раствора/кг (200 мкл/20 г мышь), содержащий тест-соединение в требуемой концентрации, вводят однократно только в день 0 эксперимента.

Размер опухоли снова определяют пальпацией в день 18 эксперимента. В случае появления дополнительных опухолей объемы суммируют.

На протяжении эксперимента не регистрируют никаких токсических эффектов, например, потерю массы тела.

Группа Контроль (солевой раствор) Дисоразол Z(0,16 мг/кг = 215 нмоль/кг) Соединение 16 (0,5 мг/кг = 215 нмоль/кг) Соединение 16 (0,1 мг/кг = 43 нмоль/кг) Средний размер опухоли День 0 86 92 74 79 Стандартное отклонение День 0 15 34 59 21 Средний размер опухоли День 18 206 146 40 76 Стандартное отклонение День 18 165 97 26 64

Результаты показывают рост нелеченых опухолей, умеренное подавление роста опухолей дисоразолом Z в виде монотерапии и явно повышенную дозозависимую антипролиферативную эффективность, полученную путем конъюгирования дисоразола Z с [D-Lys⁶]-LHRH.

Настоящее изобретение относится к конъюгатам дисоразолов с молекулами, связывающими клетки, такими как пептиды, белки, гормоны, белки крови и способам получения конъюгатов. Конъюгаты дисоразолов могут быть использованы в качестве лекарственных средств для лечения различных опухолей. 6 н. и 13 з.п. ф-лы, 17 ил., 2 табл., 17 пр.

1. Конъюгаты дисоразолов, охватываемые общими структурными формулами (I) или (IV)
,
,
где А представляет собой дисоразоловую группу, охватываемую общей структурной формулой (III)
,
где Ri_o, Rj_o, Rk_p, Rm_p, R28, R30, R31, R32, R33, R34, R35, R36, R38, R40, R41, R42, R43 и R44 представляют собой водород;
Rl_p и Rn_p вместе образуют двойную связь или независимо друг от друга выбраны из следующей группы: водород, C₁-С₆алкоксил;
R27 и R29 вместе образуют двойную связь или эпоксид (оксиран);
R37 и R39 вместе образуют двойную связь или эпоксид (оксиран);
R25 и R26 представляет собой C₁-С₈алкил, который может включать одну двойную связь, и который необязательно замещен одним, двумя или тремя заместителями, выбранных из группы заместителей, включающей гидроксил и -C(O)O-CH₃;
В1 и/или В2 независимо друг от друга выбраны из следующих линкеров: линкер на основе дикарбоновой кислоты, сукцинил, глутарил;
С1 и/или С2 независимо друг от друга выбраны из следующих связывающихся с клеткой молекул: LHRH, [D-Lys⁶]-LHRH, соматостатин, аналог соматостатина, сывороточный альбумин человека (HSA);
o представляет собой целое число 1 или 2;
p представляет собой целое число 1 или 2.

2. Конъюгаты по п.1, которые выбраны из следующей группы:
дисоразол А1-сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH (региоизомеры соединений 11 и 12)

дисоразол E1-сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH (региоизомеры соединений 13 и 14)

дисоразол A1-сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH (соединение 15)

дисоразол Z-сукцинил-[D-Lys⁶]LHRH (соединение 16)

дисоразол Z-(глутарил-[D-Lys⁶]LHRH)₂ (соединение 17)

дисоразол Z-сукцинил-соматостатин (соединение 18)

3. Способ получения конъюгата дисоразола по п.1 или 2, включающий в себя реакцию дисоразолового соединения с линкером, предпочтительно линкерным ангидридом, с получением моно- и/или бисфункционализированной дисоразол-линкерной группы, необязательно отделение или очистку моно- и/или бисфункционализированной дисоразол-линкерной группы от продуктов реакции и побочных продуктов, связывание необязательно выделенных или очищенных моно-и/или бисфункционализированных дисоразол-линкерных групп с молекулами, связывающимися с клеткой, с получением конъюгата дисоразола формулы (I) C1-B1-A-B2-C2 и/или формулы (IV) С1-В1-А, необязательно отделение или очистку конъюгата дисоразола формулы (I) С1-В1-А-В2-С2 и/или формулы (IV) С1-В1-А от продуктов реакции и побочных продуктов.

4. Фармацевтическая композиция для лечения опухолей, включающая фармакологически активное количество, по меньшей мере, одного конъюгата дисоразола по п.1 или 2.

5. Композиция по п.4, в которой, по меньшей мере, одно вещество присутствует в унифицированной дозе от 0,0001 мг до 100 мг на кг массы тела пациента.

6. Композиция по п.4, которая дополнительно включает, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.

7. Композиция по п.5, которая дополнительно включает, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.

8. Композиция по любому из пп.4-7, которая включает, по меньшей мере, одно фармакологически активное вещество.

9. Композиция по п.8, которая дополнительно включает в себя следующее фармакологически активное вещество: ингибитор ДНК-топоизомеразы I и/или II, ДНК-интеркалятор, алкилирующий агент, дестабилизатор микротрубочек, агонист и/или антагонист рецептора гормонов и/или факторов роста, ингибитор сигнальной трансдукции, антитело к фактору роста и их рецепторам, ингибитор киназы, антиметаболит.

10. Композиция по п.8, которая дополнительно включает в себя следующее фармакологически активное вещество: актиномицин D, аминоглутетимид, аспарагиназа, авастин, азатиоприн, BCNU (кармустин), блеомицин, бусульфан, карбоплатин, CCNU (ломустин), хлорамбуцил, цисплатин, коласпаза, циклофосфамид, цитарабин, дактиномицин, даунорубицин, диэтилстилбестрол, доцетаксел, доксорубицин (адриамицин), DTIC (дакарбацин), эпирубицин, эпотилон, эрбитакс, эритрогидроксинониладенин, этинилэстрадиол, этопозид, флударабина фосфат, флуоксиместрон, флутамид, гемцитабин, глиивек/гливек, герцептин, гексаметилмеламин, гидроксимочевина, гидроксипрогестерон капроат, идарубицин, ифосфамид, интерферон, иресса, иринотекан, L-аспарагиназа, лейковорин, мехлорэтамин, медроксипрогестерон ацетат, мегестрола ацетат, мелфалан, месна, метотрексат, митомицин С, митотан, митоксантрон, N-фосфоноацетил-L-аспартат (PALA), оксалиплатин, паклитаксел, пентозостатин, пликамицин, преднизолон, преднизон, прокарбазин, ралоксифен, рапамицин, семустин, сорафениб, стрептозоцин, тамоксифен, тарцева, таксотер, тенипозид, тестостерон пропионат, тиогуанин, тиотепа, топотекан, триметиленамин, уридин, винбалстин, винкристин, виндезин, винорелбин, 2',2'-дифтордезоксицитидин, 5-фтордезоксиуридина монофосфат, 5-азацитидин, кладрибин, 5-фтордезоксиуридин, 5-фторурацил (5-FU), 6-меркаптопурин.

11. Применение конъюгата дисоразола по п.1 или 2 для изготовления лекарственного средства для лечения опухолей.

12. Применение конъюгата дисоразола по п.1 или 2 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики острого лейкоза, аденокарциномы, базалиомы, доброкачественных опухолей, рака мочевого пузыря, рака кишки, опухолей головного мозга, рака молочной железы, бронхиальной карциномы, карциноидов, карцином, рака шейки матки, карциномы шейки матки, хронического лейкоза, рака толстой кишки, карциномы толстой кишки, колоректального рака, рака соединительной ткани, карциномы тела, рака эндометрия, рака пищевода, саркомы Эвига, гастриномы, глиобластомы, глиомы, гинекологических опухолей, рака головы и/или шеи, гепатобластомы, гепатомы, гиперплазии, гиперпролиферативных заболеваний, внутриглазной меланомы, саркомы Капоши, карциномы гортани, рака гортани, лейомиомы, лейкоза, опухоли печени, рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, лимфомы, злокачественных опухолей, карциномы молочной железы, медуллобластомы, меланомы, множественной миеломы, нефробластомы, нейробластомы, нейроэндокринных опухолей, остеосаркомы, рака яичников, опухоли поджелудочной железы, рака простаты, карциномы простаты, карциномы прямой кишки, рака почки, карциномы клеток почки, ретинобластомы, рабдоидной опухоли, сарком, рака кожи, саркомы мягких тканей, солидных опухолей, спиналиомы, рака желудка, рака яичка, тимомы, рака щитовидной железы, опухолей, происходящих из головного мозга и/или нервной системы и/или мозговых оболочек, рака мочевых путей и/или рака матки.

13. Применение по п.11, в котором лекарственное средство дополнительно содержит, по меньшей мере, одно дополнительное фармацевтически активное вещество.

14. Применение по п.11 или 13, в котором лекарственное средство применяют перед, и/или во время, и/или после лечения, по меньшей мере, одним дополнительным фармакологически активным веществом.

15. Применение по п.13, в котором лекарственное средство содержит следующее фармакологически активное вещество: ингибитор ДНК-топоизомеразы I и/или II, ДНК-интеркалятор, алкилирующий агент, дестабилизатор микротрубочек, агонист и/или антагонист рецепторов гормонов и/или факторов роста, ингибитор сигнальной трансдукции, антитело к фактору роста и его рецептору, ингибитор киназы, антиметаболит.

16. Применение по п.13, в котором лекарственное средство содержит следующее фармакологически активное вещество: актиномицин D, аминоглутетимид, аспарагиназу, авастин, азатиоприн, BCNU (кармустин), блеомицин, бусульфан, карбоплатин, CCNU (ломустин), хлорамбуцил, цисплатин, коласпазу, циклофосфамид, цитарабин, дактиномицин, даунорубицин, диэтилстилбестрол, доцетаксел, доксорубицин (адриамицин), DTIC (дакарбацин), эпирубицин, эпотилон, эрбитакс, эритрогидроксинониладенин, этинилэстрадиол, этопозид, флударабина фосфат, флуоксиместрон, флутамид, гемцитабин, глиивек/гливек, герцептин, гексаметилмеламин, гидроксимочевина, гидроксипрогестерона капроат, идарубицин, ифосфамид, интерферон, иресса, иринотекан, L-аспарагиназу, лейковорин, мехлорэтамин, медроксипрогестерона ацетат, мегестрола ацетат, мелфалан, месна, метотрексат, митомицинС, митотан, митоксантрон, N-фосфоноацетил-L-аспартат (PALA), оксалиплатин, паклитаксел, пентозостатин, пликамицин, преднизолон, преднизон, прокарбазин, ралоксифен, рапамицин, семустин, сорафениб, стрептозоцин, тамоксифен, тарцева, таксотер, тенипозид, тестостерона пропионат, тиогуанин, тиотепа, топотекан, триметиленамин, уридин, винбалстин, винкристин, виндезин, винорелбин, 2',2'-дифтордезоксицитидин, 5-фтордезоксиуридина монофосфат, 5-азацитидинакладрибин, 5-фтордезоксиуридин, 5-фторурацил (5-FU), 6-меркаптопурин.

17. Применение по любому из пп.11, 13, 15 и 16, в котором лекарственное средство вводят перед, и/или во время, и/или после радиотерапевтического лечения и/или хирургического вмешательства.

18. Набор для лечения опухолей, содержащий фармакологически активное количество, по меньшей мере, одного конъюгата дисоразола по п.1 или 2 и фармакологически активное количество, по меньшей мере, одного дополнительного фармацевтически активного вещества, выбранного из группы, включающей ингибитор ДНК-топоизомеразы I и/или II, ДНК-интеркалятор, алкилирующий агент, дестабилизатор микротрубочек, агонист и/или антагонист рецепторов гормонов и/или факторов роста, ингибитор сигнальной трансдукции, антитело к фактору роста и его рецептору, ингибитор киназы, антиметаболит.

19. Набор по п.18, в котором дополнительное фармацевтически активное вещество выбрано из группы, включающей актиномицин D, аминоглутетимид, аспарагиназу, авастин, азатиоприн, BCNU (кармустин), блеомицин, бусульфан, карбоплатин, CCNU (ломустин), хлорамбуцил, цисплатин, коласпазу, циклофосфамид, цитарабин, дактиномицин, даунорубицин, диэтилстилбестрол, доцетаксел, доксорубицин (адриамицин), DTIC (дакарбацин), эпирубицин, эпотилон, эрбитакс, эритрогидроксинониладенин, этинилэстрадиол, этопозид, флударабина фосфат, флуоксиместрон, флутамид, гемцитабин, глиивек/гливек, герцептин, гексаметилмеламин, гидроксимочевина, гидроксипрогестерона капроат, идарубицин, ифосфамид, интерферон, иресса, иринотекан, L-аспарагиназу, лейковорин, мехлорэтамин, медроксипрогестерона ацетат, мегестрола ацетат, мелфалан, месна, метотрексат, митомицинС, митотан, митоксантрон, N-фосфоноацетил-L-аспартат (PALA), оксалиплатин, паклитаксел, пентозостатин, пликамицин, преднизолон, преднизон, прокарбазин, ралоксифен, рапамицин, семустин, сорафениб, стрептозоцин, тамоксифен, тарцева, таксотер, тенипозид, тестостерона пропионат, тиогуанин, тиотепа, топотекан, триметиленамин, уридин, винбалстин, винкристин, виндезин, винорелбин, 2',2'-дифтордезоксицитидин, 5-фтордезоксиуридина монофосфат, 5-азацитидинакладрибин, 5-фтордезоксиуридин, 5-фторурацил (5-FU), 6-меркаптопурин.