КОНЪЮГАТЫ ЛИГАНДА С НЕСКОЛЬКИМИ ЛЕКАРСТВЕННЫМИ СРЕДСТВАМИ Российский патент 2012 года по МПК A61K47/48 A61K31/519 A61K31/475 A61K31/407 A61P35/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет согласно 35 U.S.C. § 119(e) по предварительной патентной заявке США с серийным номером № 60/709950, поданной 19 августа 2005 года, и предварительной патентной заявке с серийным номером № 60/787558, поданной 30 марта 2006 года, описания которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам для применения для направленной доставки лекарственного средства. В частности, настоящее изобретение относится к конъюгатам лиганда, включающим два или более лекарственных средств и их аналогов и производных, таким как конъюгаты связывающих рецептор для витамина соединений и двух или более лекарственных средств.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Иммунная система млекопитающих обладает средствами для распознавания и устранения опухолевых клеток, других патогенных клеток и проникающих чужеродных патогенов. Несмотря на то что в норме иммунная система обеспечивает интенсивную защиту, существует много примеров, когда опухолевые клетки, другие патогенные клетки или инфекционные агенты не поддаются иммунному ответу хозяина и пролиферируют или персистируют с сопутствующей патогенностью для хозяина. Для устранения, например, воспроизводящихся новообразований были разработаны химиотерапевтические средства и лучевая терапия. Однако многие из имеющихся в настоящее время химиотерапевтических средств и схем лучевой терапии обладают неблагоприятными побочными эффектами, поскольку они действуют не только посредством уничтожения патогенных клеток, но также они повреждают нормальные клетки организма-хозяина, такие как клетки кроветворной системы. Неблагоприятные побочные эффекты этих лекарственных средств против злокачественной опухоли демонстрируют необходимость в разработке новых лекарственных средств против патогенных популяций клеток, обладающих сниженной токсичностью для хозяина.

Исследователи разработали терапевтические протоколы для уничтожения патогенных клеток посредством нацеливания на такие клетки цитотоксических соединений. Во многих из этих протоколов с целью минимизировать доставку токсина к нормальным клеткам применяют токсины, конъюгированные с антителами, которые связываются с антигенами, присущими только патогенным клеткам или сверхэспрессирующимися ими. С использованием этого подхода были разработаны определенные иммунотоксины, состоящие из антител, направленных на определенные антигены на патогенных клетках, где антитела связаны с токсинами, такими как рицин, экзотоксин Pseudomonas, дифтерийный токсин и фактор некроза опухоли. Эти иммунотоксины нацелены на патогенные клетки, такие как опухолевые клетки, обладающие определенными антигенами, распознаваемыми антителом (Olsnes S., Immunol. Today, 10, p. 291-295, 1989; Melby EL., Cancer Res., 53(8), p. 1755-1760, 1993; Better M.D., международная публикация PCT № WO 91/07418, опубликованная 30 мая 1991).

Другим подходом для нацеливания на популяции патогенных клеток, таких как злокачественные клетки или чужеродные патогены, в организме-хозяине является повышение иммунного ответа хозяина против патогенных клеток для избежания необходимости введения соединений, которые также могут обладать независимой токсичностью для хозяина. Одной описанной стратегией для иммунотерапии является связывание антител, например, полученных способами генетической инженерии мультимерных антител, с поверхностью опухолевых клеток для экспонирования константного участка антител на клеточной поверхности и, таким образом, для индукции уничтожения опухолевых клеток различными опосредуемыми иммунной системой процессами (De Vita V.T., Biologic Therapy of Cancer, 2d ed. Philadelphia, Lippincott, 1995; Soulillou J.P., патент США № 5672486). Однако эти подходы были осложнены трудностями, связанными с определением опухолеспецифических антигенов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем описании описаны конъюгаты лиганда с лекарственными средствами и их аналоги и производные. Конъюгаты включают связывающие клеточный рецептор лиганды, которые ковалентно связаны с двумя или более лекарственными средствами, которые могут быть нацелены на клетки. Конъюгаты, описанные в настоящем описании, также могут включать поливалентный линкер для присоединения лигандов к лекарственным средствам.

В одном варианте осуществления описан связывающий рецептор конъюгат лекарственного средства. Конъюгат для доставки лекарственного средства включает лиганд для рецептора клеточной поверхности, два или более лекарственных средств или их аналоги или производные и необязательно поливалентный линкер, который, главным образом, может быть представлен формулой

(B)-(L)-(D)_n

где (В) представляет собой связывающую рецептор группу; (D) представляет собой лекарственное средство или его аналог или производное, подлежащее нацеливанию на клетку с помощью связывающей рецептор группы; (L) представляет собой поливалентный линкер и n представляет собой число, большее 1. Поливалентный линкер (L) может содержать несколько линкеров, ковалентно связанных друг с другом. Например, поливалентный линкер (L) может содержать один или несколько спейсерных линкеров (l_S) и/или высвобождаемых линкеров (l_r), где они соединены друг с другом и с лигандом и с лекарственным средством посредством одного или нескольких линкеров с гетероатомами (l_н). Эти различные линкеры можно выбирать и размещать в любом порядке для конструирования поливалентного линкера (L). В качестве примера, поливалентный линкер (L) можно конструировать из одного или нескольких из следующих двухвалентных линкеров:

где а, b, с, d и e представляют собой целые числа, такие как числа из диапазона от 0 до приблизительно 4, и (l_S), (l_н) и (l_r) представляют собой спейсерные линкеры, высвобождаемые линкеры, линкеры с гетероатомами соответственно. Дополнительные иллюстративные примеры двухвалентных линкеров, которые можно использовать для конструирования поливалентных линкеров, описанных в настоящем описании, описаны в патентной заявке США с серийным № 10/765336 (также встречающейся как публикация патентной заявки США № US 2005/0002942 А1) и международной публикации РСТ № WO 2006/012527, описания которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

Следует понимать, что поливалентные линкеры могут соединять связывающую рецептор группу с двумя или более лекарственными средствами в виде множества структурных конфигураций, включая, но не ограничиваясь ими, следующие иллюстративные общие формулы:

где В представляет собой связывающий рецептор лиганд, каждый из (L¹), (L²) и (L³) представляет собой поливалентный линкер, сконструированный из одного или нескольких спейсерных линкеров, высвобождаемых линкеров или линкеров с гетероатомами, и каждый из (D¹), D² и D³ представляет собой лекарственное средство или его аналог или производное. Также в настоящем описании рассматривают другие варианты, включающие дополнительные лекарственные средства или их аналоги или производные, дополнительные линкеры и дополнительные конфигурации по расположению каждого из (В), (L) и (D).

В одном варианте в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, включено более одного связывающего рецептор лиганда, включая, но не ограничиваясь ими, следующие иллюстративные общие формулы:

где каждый В представляет собой связывающий рецептор лиганд, каждый из (L¹), (L²) и (L³) представляет собой поливалентный линкер, сконструированный из одного или нескольких спейсерных линкеров, высвобождаемых линкеров и/или линкеров с гетероатомами, и каждый из (D¹), D² и D³ представляет собой лекарственное средство или его аналог или производное. Также в настоящем описании рассматривают другие варианты, включающие дополнительные лекарственные средства или их аналоги или производные, дополнительные линкеры и дополнительные конфигурации по расположению каждого из (В), (L) и (D). В одном варианте связывающие рецептор лиганды предназначены для одного и того же рецептора, и в другом варианте связывающие рецептор лиганды предназначены для различных рецепторов.

В одном иллюстративном варианте осуществления конъюгатов для доставки лекарственного средства, описанных в настоящем описании, поливалентный линкер включает по меньшей мере один высвобождаемый линкер (l_r). В другом иллюстративном варианте осуществления конъюгатов для доставки лекарственного средства, описанных в настоящем описании, поливалентный линкер включает по меньшей мере два высвобождаемых линкера (l_r)₂. В другом иллюстративном аспекте поливалентный линкер (L) включает по меньшей мере один высвобождаемый линкер (l_r), который представляет собой не дисульфидный высвобождаемый линкер. В другом иллюстративном аспекте поливалентный линкер (L) обладает по меньшей мере двумя высвобождаемыми линкерами (l_r)₂, где один высвобождаемый линкер представляет собой не дисульфидный высвобождаемый линкер. Понятно, что, когда в поливалентный линкер включено более одного высвобождаемого линкера, эти высвобождаемые линкеры могут быть соседними. Далее, понятно, что, когда в поливалентном линкере два высвобождаемых линкера являются соседними, два высвобождаемых линкера могут совместно обеспечивать высвобождение лекарственного средства.

В другом варианте осуществления поливалентный линкер включает по меньшей мере один спейсерный линкер, который представляет собой пептид, образованный из аминокислот. В одном аспекте пептид включает встречающиеся в природе аминокислоты и их стереоизомеры. В другом аспекте пептид образован только из встречающихся в природе аминокислот и их стереоизомеров.

Лиганды, описанные в настоящем описании, как правило, включают лиганды рецепторов клеточной поверхности. Иллюстративные лиганды, пригодные в конъюгатах, описанных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, витамины и другие группы, которые связываются с рецептором для витамина, переносчиком или другим представленным на поверхности белком, который специфично связывает витамины или их аналоги или производные, пептидные лиганды, идентифицированные посредством скрининга библиотеки, специфичные в отношении опухолевых клеток пептиды, специфичные в отношении опухолевых клеток аптамеры, специфичные в отношении опухолевых клеток углеводы, специфичные в отношении опухолевых клеток моноклональные или поликлональные антитела. Fab или scFv (т.е. одноцепочечный вариабельный участок) фрагменты антител, например, такие как Fab-фрагмент антитела, направленный против EphA2 или других белков, специфично экспрессируемых или доступных только на метастазирующих злокачественных клетках, низкомолекулярные органические молекулы, образованные из комбинаторных библиотек, факторы роста, такие как EGF, FGF, инсулин и инсулинподобные факторы роста, и гомологичные полипептиды, соматостатин и его аналоги, трансферрин, комплексы липопротеинов, соли желчных кислот, селектины, стероидные гормоны, содержащие Arg-Gly-Asp пептиды, ретиноиды, различные галектины, лиганды δ-опиодиных рецепторов, лиганды рецептора для холицистокинина А, лиганды, специфичные для рецепторов для ангиотензина AT1 или АТ2, лиганды для пероксисомных пролифератор-активируемых рецепторов λ, β-лактамные антибиотики, такие как пенициллин, низкомолекулярные органические молекулы, включающие противомикробные лекарственные средства, и другие молекулы, которые специфично связываются с рецептором, предпочтительно экспрессируемым на поверхности опухолевых клеток или на инфекционном организме, противомикробные и другие лекарственные средства, разработанные для встраивания в связывающий карман конкретного рецептора, на основе кристаллической структуры рецептора или другого белка клеточной поверхности, лиганды опухолевых антигенов или другие молекулы, предпочтительно экспрессируемые на поверхности опухолевых клеток, или фрагменты любой из этих молекул.

Опухолеспецифические антигены, которые могут функционировать в качестве участка для связывания для конъюгатов лиганд-лекарственное средство, включают внеклеточные эпитопы членов семейства белков эфринов, таких как EphA2. Экспрессия EphA2 в нормальных клетках ограничена областями соединения клеток, однако в метастазирующих опухолевых клетках EphA2 распределен по всей поверхности клеток. Таким образом, EphA2 на метастазирующих клетках может быть доступным для связывания, например, с Fab-фрагментом антитела, конъюгированным с лекарственным средством, или его аналогом или производным, в то время как на нормальных клетках белок не является доступным для связывания с Fab-фрагментом, что приводит к тому, что конъюгат лиганд-лекарственное средство является специфичным в отношении метастазирующих злокачественных клеток.

Лекарственные средства и их различные аналоги и производные, описанные в настоящем описании, главным образом, представляют собой лекарственные средства для устранения, уничтожения, препятствования росту и/или снижения роста популяции патогенных клеток, включающих инфекционных агентов, злокачественные опухоли, опухоли и т.п. Кроме того, лекарственные средства и их различные аналоги и производные, пригодные в конъюгатах, описанных в настоящем описании, могут обладать широким множеством механизмов действия, включая, но не ограничиваясь ими, алкилирующие средства, ингибиторы микротрубочек, включающие ингибиторы, которые стабилизируют и/или дестабилизируют образование микротрубочек, включая средства на основе бета-тубулина, ингибиторы циклинзависимых киназ (CDK), такие как CDKN1a, CDKN1b и т.п., ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы белкового синтеза, ингибиторы протеинкиназ, включающие ингибиторы Ras, Raf, РКС, PI3K и т.п., ингибиторы транскрипции, антифолаты, блокаторы белков теплового шока и т.п.

В другом варианте осуществления описана фармацевтическая композиция. Фармацевтическая композиция содержит конъюгат для доставки лекарственного средства, описанный в настоящем описании, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем и/или разбавителем для него.

В другом варианте осуществления описан способ устранения популяции патогенных клеток в животном-хозяине. В одном иллюстративном аспекте члены патогенной клеточной популяции обладают доступным участком для связывания связывающей рецептор группы или ее аналога или производного, и этот участок связывания экспрессируется только патогенными клетками, сверхэкспрессируется или предпочтительно экспрессируется ими. Способ включает стадию введения хозяину конъюгата для доставки лекарственного средства, описанного в настоящем описании, или его фармацевтической композиции, как описано в настоящем описании.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На ФИГ.1А представлена относительная аффинность связывания соединения примера 9 (■, 0,24) относительно фолиевой кислоты (●, 1,0) с рецептором фолиевой кислоты.

На ФИГ.1В представлена активность соединения примера 9 в отношении включения ³H-тимидина в клетки KB при избытке фолиевой кислоты (о) и без него (●); IC₅₀ соединения примера 2 составляет приблизительно 58 нМ.

На ФИГ.2 представлена относительная аффинность связывания соединения примера 11 (■, 0,21) относительно фолиевой кислоты (●, 1,0) с рецепторами фолиевой кислоты.

На ФИГ.3 представлена активность соединения примера 11 (конъюгат с несколькими лекарственными средствами) в отношении включения ³H-тимидина при избытке фолиевой кислоты (о) и без него (●); IC₅₀ соединения примера 11=5 нМ.

На ФИГ.4 представлена цитотоксическая активность соединения примера 11 in vitro (а) в отношении трех различных опухолевых клеточных линий (KB, 4T-1c12 и ID8-C115) по сравнению с соединением примера 11+ избыток фолиевой кислоты (b).

На ФИГ.5А представлена активность соединения примера 11 при 1 мкмоль/кг TIW (6 доз) (●) и 2 мкмоль/кг TIW (6 доз) (▼) в отношении FR-положительных опухолей М109 у мышей Balb/c относительно контролей без введения (■).

На ФИГ.5В представлено отсутствие эффекта соединения примера 11 при 1 мкмоль/кг TIW (6 доз) (●) и 2 мкмоль/кг TIW (6 доз) (▼) на массу мышей Balb/c относительно контролей без введения (■).

На ФИГ.6 представлена активность соединения примера 11 при 1 мкмоль/кг TIW в течение 2 недель (6 доз) на FR-положительные опухоли KB с 40 мкмоль/кг ЕС20 (комплекс рения) (□) и без него (■) относительно контролей без введения (●); соединение примера II отдельно показало 5/5 полных ответов; соединение примера 11+ЕС20 показали 0/5 полных ответов.

На ФИГ.7 представлено отсутствие эффекта соединения примера 11 при 1 мкмоль/кг TIW в течение 2 недель (6 доз) на массу мышей nu/nu с 40 мкмоль/кг ЕС20 (комплекс рения) (D) и без него (■) относительно контролей без введения (●).

На ФИГ.8 представлена активность соединения примера 11 при 1 мкмоль/кг TIW в течение 2 недель (6 доз) в отношении подкожных ксенотрансплантатов опухолей KB человека, имплантированных мышам nude с 40 мкмоль/кг ЕС20 (комплекс рения) (b) и без него (с) относительно контролей без введения (а); соединение примера 11 отдельно показало 5/5 полных ответов; соединение примера 11+ЕС20 показали 0/5 полных ответов.

На ФИГ.9 представлено отсутствие эффекта соединения примера 11 при 1 мкмоль/кг TIW в течение 2 недель (6 доз) на массу мышей nude с 40 мкмоль/кг ЕС20 (комплекс рения) (b) и без него (с) относительно контролей без введения (а).

На ФИГ.10 представлена активность соединения примера 11 при 2 мкмоль/кг TIW (е) на положительные в отношении рецептора для фолата опухоли человека у мышей nude по сравнению со смесью неконъюгированных основных лекарственных средств, митомицином С и дезацетилвинбластином моногидразидом при 0,5 мкмоль/кг TIW (b), 1 мкмоль/кг TIW (с) и 2 мкмоль/кг TIW (d) и по сравнению с контролями без введения (а).

На ФИГ.11 представлено отсутствие эффекта соединения примера 11 при 2 мкмоль/кг TIW в течение 2 недель (е) на массу мышей nude по сравнению с контролями (а). Снижение массы происходило при всех трех дозах смеси неконъюгированных основных лекарственных средств, митомицина С и дезацетилвинбластина моногидразида (0,5 мкмоль/кг TIW (b), 1 мкмоль/кг TIW (с), 2 мкмоль/кг TIW (d)). Введение высокой дозы (d) прекратили ранее 20 суток.

На ФИГ.12 представлена активность соединения примера 11 в отношении крупных опухолей KB трех размеров, 250 мм³ (b), 500 мм³ (с) и 750 мм³ (d) у мышей nu/nu при 2 мкмоль/кг TIW в течение 2 недель по сравнению с контролями (а).

На ФИГ.13 представлена активность соединения примера 11 (е) по сравнению с конъюгатами только одного лекарственного средства митомицина С (b), дезацетилвинбластина моногидразида (с) или смеси этих двух конъюгатов с одним лекарственным средством (d) по сравнению с контролями (а).

На ФИГ.14 представлено отсутствие активности соединения примера 11 (b) при введении 2 мкмоль/кг TIW в течение двух недель в отношении отрицательных по рецептору для фолата опухолей 4Т1 у мышей Ваblb/с по сравнению с контролями (а). Данные на ФИГ.14 показывают, что соединение примера 11 (b) не обладает никаким эффектом на опухоли по сравнению с контролями (а) вследствие отсутствия рецепторов для фолата на этих опухолях.

На ФИГ.15 представлена активность соединения примера 12 в отношении включения ³H-тимидина в FR-положительные клетки КВ.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В настоящем описании описаны конъюгаты лиганда с лекарственными средствами, и их аналогами и производными. Конъюгаты включают связывающие клеточный рецептор лиганды, включая лиганды для рецепторов клеточной поверхности, которые ковалентно присоединены к двум или более лекарственным средствам, которые могут быть нацелены на клетки, включая патогенные клетки. Конъюгаты, описанные в настоящем описании, также могут включать поливалентный линкер для присоединения лигандов к лекарственным средствам.

Описаны связывающие рецептор конъюгаты для доставки лекарственного средства, содержащие связывающую рецептор группу (В), поливалентный линкер (L) и два или более лекарственных средств, или аналогов лекарственных средств, или производных лекарственных средств, (D)_n, где n больше или равно 2. В конъюгатах для доставки, описанных в настоящем описании, каждый из связывающей рецептор группы (В) и двух или более лекарственных средств (D)_n связаны с поливалентным линкером (L) через независимо выбранный линкер с гетероатомом (l_н). Поливалентный линкер (L) содержит один или несколько спейсерных линкеров, линкеров с гетероатомом и высвобождаемых линкеров и их сочетания в любом порядке.

В одном варианте осуществления описан связывающий рецептор конъюгат для доставки лекарственного средства. Конъюгат для доставки лекарственного средства содержит лиганд, такой как лиганд для рецептора клеточной поверхности, два или более лекарственных средств или их аналогов или производных и необязательно поливалентный линкер, который, главным образом, может быть представлен формулой

(B)-(L)-(D)_n

где (В) представляет собой связывающую рецептор группу; (D) представляет собой лекарственное средство или его аналог или производное, подлежащее нацеливанию на клетку посредством связывающей рецептор группы; (L) представляет собой поливалентный линкер и n представляет собой целое число, большее 1. Поливалентный линкер (L) может содержать несколько линкеров, ковалентно связанных друг с другом. Например, поливалентный линкер (L) может содержать один или несколько спейсерных линкеров (l_S) и/или высвобождаемых линкеров (l_r), где все они соединены другим с другом и с лигандом и лекарственном средством посредством одного или нескольких линкеров с гетероатомом (l_H). Для конструирования поливалентного линкера (L) эти различные линкеры можно выбирать и располагать в любом порядке.

В качестве иллюстративного примера поливалентный линкер (L) может быть сконструирован из одного или нескольких из следующих двухвалентных линкеров:

где а, b, с, d и е представляют собой целые числа, такие как числа из диапазона от 0 до приблизительно 4, и (l_S), (l_н) и (l_r) представляют собой спейсерные линкеры, высвобождаемые линкеры, линкеры с гетероатомом соответственно. Дополнительные иллюстративные примеры двухвалентных линкеров, которые можно использовать для конструирования поливалентных линкеров, описанных в настоящем описании, описаны в патентной заявке США с серийным № 10/765336 (также встречающейся как публикация патентной заявки США № US 2005/0002942 А1) и в международной публикации РСТ № WO 2006/012527, описание которых включено в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.

Следует понимать, что поливалентные линкеры могут соединять связывающую рецептор группу с двумя или более лекарственными средствами в виде разнообразных структурных конфигураций, включая, но не ограничиваясь ими, следующие иллюстративные общие формулы:

где В представляет собой связывающий рецептор лиганд, каждый из (L¹), (L²) и (L³) представляет собой поливалентный линкер, сконструированный из одного или нескольких спейсерных линкеров, высвобождаемых линкеров и/или линкеров с гетероатомами, и каждый из (D¹), D² и D³ представляет собой лекарственное средство или его аналог или производное. Также в настоящем описании рассматривают другие варианты, включая дополнительные лекарственные средства или их аналоги или производные, дополнительные линкеры и дополнительные конфигурации по расположению каждого из (В), (L) и (D).

В одном варианте в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, включено более одного связывающего рецептор лиганда, включая, но не ограничиваясь ими, следующие иллюстративные общие формулы:

где каждый В представляет собой связывающий рецептор лиганд, каждый из (L¹), (L²) и (L³) представляет собой поливалентный линкер, сконструированный из одного или нескольких спейсерных линкеров, высвобождаемых линкеров и/или линкеров с гетероатомами, и каждый из (D¹), D² и D³ представляет собой лекарственное средство или его аналог или производное. Также в настоящем описании рассмотрены другие варианты, включающие дополнительные лекарственные средства или их аналоги или производные, дополнительные линкеры и дополнительные конфигурации по расположению каждого из (В), (L) и (D). В одном варианте связывающие рецептор лиганды представляют собой лиганды для одного и того же рецептора, и в другом варианте связывающие рецептор лиганды представляют собой лиганды для различных рецепторов. Понятно, и как показано выше в формулах, что в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, может быть включено более одного поливалентного линкера. Понятно, что в одном аспекте количество линкеров выбирают в зависимости от конфигурации связывающих рецептор лигандов и лекарственных средств.

Например, в одном иллюстративном варианте осуществления способа, посредством которого ковалентно связывают линкеры для образования поливалентного линкера, или части поливалентного линкера, линкеры с гетероатомом, спейсерные линкеры и высвобождаемые линкеры соединяют с образованием поливалентной группы формулы:

где формула также может быть изображена как

где (l_s)¹ представляет собой трипептид Asp-Asp-Asp, (l_S)₂  представляет собой Cys, (l_r)¹ представляет собой S-S, (l_S)³ представляет собой СН₂СН₂, (l_н)¹ представляет собой О, (l_r)² представляет собой C(O)NHNH, (l_S)⁴ представляет собой o-Lys, (l_S)⁵ представляет собой С(O)СН₂СН₂, (l_r)³ представляет собой S-S и (l_S)⁶ представляет собой CH₂CH₂.

Лиганды для рецепторов клеточной поверхности, пригодные для описанных в настоящем описании конъюгатов, включают, но не ограничиваются ими, витамины и другие группы, которые связываются с рецептором для витамина, переносчиком или другим представленным на поверхности белком, который специфично связывает витамины или их аналоги или производные, пептидные лиганды, идентифицированные посредством скрининга библиотек, специфичные в отношении опухолевых клеток пептиды, специфичные в отношении опухолевых клеток аптамеры, специфичные в отношении опухолевых клеток углеводы, специфичные в отношении опухолевых клеток моноклональные или поликлональные антитела, фрагменты антител Fab или scFv (т.е. одноцепочечный вариабельный участок) например, такой как Fab-фрагмент антитела, направленного на ЕрhА2 или другие белки, специфично экспрессируемые или имеющиеся только на метастазирующих злокачественных клетках, низкомолекулярные органические молекулы, образованные из комбинаторных библиотек, факторы роста, такие как EGF, FGF, инсулин и инсулиноподобные факторы роста, и гомологичные полипептиды, соматостатин и его аналоги, трансферрин, комплексы липопротеинов, соли желчных кислот, селектины, стероидные гормоны, содержащие пептиды Arg-Gly-Asp, ретиноиды, различные галектины, лиганды δ-опиодного рецептора, лиганды рецептора для холицистокинина А, лиганды, специфичные для рецепторов для ангиотензина AT1 или АТ2, лиганды для пероксисомных пролифератор-активируемых рецепторов λ, β-лактамные антибиотики, такие как пенициллин, низкомолекулярные органические молекулы, включающие противомикробные лекарственные средства, и другие молекулы, которые специфично связываются с рецептором, предпочтительно экспрессируемым на поверхности опухолевых клеток или на инфекционном организме, противомикробные и другие лекарственные средства, разработанные для встраивания в связывающий карман конкретного рецептора, на основе кристаллической структуры рецептора или другого белка клеточной поверхности, лиганды опухолевых антигенов или другие молекулы, предпочтительно экспрессируемые на поверхности опухолевых клеток, или фрагменты любой из этих молекул. Пример опухолеспецифического антигена, который может функционировать в качестве участка для связывания для конъюгатов лиганд-лекарственное средство, включает внеклеточные эпитопы члена семейства белков эфринов, такого как EphA2. Экспрессия EphA2 в нормальных клетках ограничена областями соединения клеток, однако EphA2 распределен по всей поверхности клеток в метастазирующих опухолевых клетках. Таким образом, EphA2 на метастазирующих клетках может быть доступным для связывания, например, с Fab-фрагментом антитела, конъюгированным с лекарственным средством или его аналогом или производным, в то время как белок не является доступным для связывания с Fab-фрагментом на нормальных клетках, что приводит к тому, что конъюгат лиганд-лекарственное средство является специфичным в отношении метастазирующих злокачественных клеток.

В одном варианте осуществления связывающая рецептор группа представляет собой витамин или связывающий рецептор для витамина его аналог или производное, такой как витамины и их аналоги и производные, которые способны связывать рецепторы для витаминов.

Витамины, которые можно использовать в соответствии со способами и соединениями, описанными в настоящем описании, включают карнитин, инозитол, липоевую кислоту, пиридоксаль, аскорбиновую кислоту, ниацин, пантотеновую кислоту, фолиевую кислоту, рибофлавин, тиамин, биотин, витамин В12, витамины A, D, Е и K, другие сходные молекулы витаминов, их аналоги и производные и их сочетания. Эти витамины и их связывающие рецептор аналоги и производные представляют собой иллюстративные группы для нацеливания, которые можно присоединять к соединениям лекарственного средства или их аналогам или производным, посредством поливалентных линкеров (L), описанных в настоящем описании, для получения конъюгатов для доставки лекарственного средства.

В одном иллюстративном аспекте витамин может представлять собой фолиевую кислоту, аналог фолиевой кислоты или другую связывающую рецептор для фолата молекулу. Иллюстративные примеры аналогов фолата, которые можно использовать, включают фолиновую кислоту, птероилполиглутаминовую кислоту, птероевую кислоту и другие их аминокислотные производные и связывающие рецептор для фолата птеридины, такие как тетрагидроптерины, дигидрофолаты, тетрагидрофолаты, и их деаза- и дидеаза-аналоги. Термины "деаза"- и "дидеаза"-аналоги относится к известным в данной области аналогам, имеющим атом углерода, замещенный одним или двумя атомами азота во встречающейся в природе структуре фолиевой кислоты. Например, деаза-аналоги включают 1-деаза-, 3-деаза-, 5-деаза-, 8-деаза- и 10-деаза-аналоги. Дидеаза-аналоги включают, например, 1,5-дидеаза-, 5,10-дидеаза-, 8,10-дидеаза- и 5,8-дидеаза-аналоги. Указанные выше аналоги фолиевой кислоты обычно называют "фолатами", что отражает их способность связываться с рецепторами для фолата. Другие связывающие рецептор для фолата аналоги включают аминоптерин, аметоптерин (метотрексат), N¹⁰-метилфолат, 2-дезаминогидроксифолат, деаза-аналоги, такие как 1-деазаметоптерин или 3-деазаметоптерин и 3',5'-дихлор-4-амино-4-дезокси-N¹⁰-метилптероилглутаминовая кислота (дихлорметотрексат). Другие пригодные лиганды, способные связываться с рецепторами для фолата для запуска опосредуемого рецептором эндоцитозного транспорта конъюгата для доставки лекарственного средства, включают антитела к рецептору для фолата. Таким образом, в одном иллюстративном аспекте для запуска трансмембранного транспорта комплекса можно использовать соединение барвинка в комплексе с антителом к рецептору для фолата.

Иллюстративные варианты осуществления аналогов и/или производных витаминов также включают аналоги и производные биотина, такие как биоцитин, биотина сульфоксид, оксибиотин и другие связывающие рецептор для биотина соединения и т.п. Понятно, что также в настоящем описании рассматривают аналоги и производные других витаминов, описанных в настоящем описании.

В настоящем описании рассматривают любую форму описанных конъюгатов, и она определяется тем, каким образом соединены лекарственные средства, связывающая рецептор группа и различные поливалентные линкеры. В одном аспекте общая трехмерная форма описанных в настоящем описании конъюгатов является линейной. В другом аспекте общая трехмерная форма описанных в настоящем описании конъюгатов представляет собой форму "Y" или "Т". В другом аспекте общая форма описанных в настоящем описании конъюгатов представляют собой форму "X" или форму креста.

В одном иллюстративном варианте осуществления конъюгатов для доставки лекарственного средства, описанных в настоящем описании, поливалентный линкер включает по меньшей мере один высвобождаемый линкер (l_r). В другом иллюстративном варианте осуществления конъюгатов для доставки лекарственного средства, описанных в настоящем описании, поливалентный линкер включает по меньшей мере два высвобождаемых линкера (l_r)₂. В другом иллюстративном аспекте поливалентный линкер (L) включает по меньшей мере один высвобождаемый линкер (l_r), который представляет собой не дисульфидный высвобождаемый линкер. В другом иллюстративном аспекте поливалентный линкер (L) обладает по меньшей мере двумя высвобождаемыми линкерами (l_r)₂, где один высвобождаемый линкер представляет собой не дисульфидный высвобождаемый линкер. Понятно, что, когда в поливалентный линкер включено более одного высвобождаемого линкера, эти высвобождаемые линкеры могут быть соседними. Далее, понятно, что, когда два высвобождаемых линкера являются соседними в поливалентном линкере, два высвобождаемых линкера могут совместно обеспечивать высвобождение лекарственного средства. Как используют в настоящем описании, термин "высвобождаемый линкер" и также известный как "расщепляемый линкер" относится к линкеру, который включает по меньшей мере одну связь, которая может разрушаться в физиологических условиях (например, рН-лабильную, неустойчивую к кислотам, неустойчивую к окислению или неустойчивую к ферментам связь). Следует понимать, что такие физиологические условия, приводящие к разрушению связи, включают стандартные реакции химического гидролиза, которые проходят, например, при физиологических значениях рН или в результате компартментализации в клеточной органелле, такой как эндосома, имеющей более низкие значения рН, чем цитозольные значения рН.

Понятно, что расщепляемая связь может соединять два соседних атома в высвобождаемом линкере, и/или она может соединять другие линкеры или (В) и/или (D), как описано в настоящем описании, на любом или обоих концах высвобождаемого линкера. В случае когда расщепляемая связь соединяет два соседних атома в высвобождаемом линкере, после разрушения связи высвобождаемый линкер разделяется на два или более фрагментов. Альтернативно в случае, если расщепляемая связь расположена между высвобождаемым линкером и другой группой, такой как линкер с гетероатомом, спейсерный линкер, другой высвобождаемый линкер, лекарственное средство или его аналог или производное или витамин или его аналог или производное, то после разрушения связи высвобождаемый линкер отделяется от другой группы.

Лабильность расщепляемой связи можно корректировать, например, посредством замещения в расщепляемой связи или рядом с ней, такого как включение альфа-ветвления рядом с расщепляемой дисульфидной связью, повышение гидрофобности заместителей на оксиде кремния в группе, имеющей связь оксид кремния-кислород, которая может быть гидролизована, получение гомологов алкоксигрупп, которые могут образовывать часть кеталя или ацеталя, которая может быть гидролизована и т.п.

Иллюстративные механизмы для расщепления двухвалентных линкеров, описанных в настоящем описании, включают следующие механизмы 1,4- и 1,6-фрагментации

где Х представляет собой экзогенный или эндогенный нуклеофил, глутатион или биологический восстановитель и т.п. и каждый из Z или Z' представляет собой витамин или его аналог или производное, или лекарственное средство или его аналог или производное, или группу витамина или лекарственного средства, соединенную с другой частью поливалентного линкера. Следует понимать, что, несмотря на то что указанные выше механизмы фрагментации изображены в качестве согласованных механизмов, для достижения окончательной фрагментации поливалентного линкера до представленных конечных продуктов может быть проведено любое количество отдельных стадий. Например, следует понимать, что расщепление связи также может происходить посредством катализируемого кислотой удаления группы карбамата, которому может анхимерно способствовать стабилизация, обеспечиваемая либо арильной группой бета-серы, либо дисульфидом, иллюстрированными в представленных выше примерах. В таких вариантах этого варианта осуществления высвобождаемый линкер представляет собой группу карбамата. Альтернативно фрагментация может быть запущена нуклеофильной атакой на дисульфидную группу, вызывающей расщепление с образованием тиолята. Тиолят может внутримолекулярно вытеснять группу угольной кислоты или карбаминовой кислоты и образовывать соответствующий тиациклопропан. В случае содержащих бензил поливалентных линкеров после иллюстративного расщепления дисульфидной связи полученный фенилтиолят далее может быть фрагментирован с высвобождением группы угольной кислоты или карбаминовой кислоты посредством образования промежуточного соединения со стабилизированным резонансом. В любом из этих случаев высвобождаемый характер иллюстративных поливалентных линкеров, описанных в настоящем описании, может быть реализован любым механизмом, который может быть связан с имеющимися химическими, метаболическими, физиологическими или биологическими условиями.

Другие иллюстративные механизмы для расщепления связи высвобождаемого линкера включают расщепление при помощи оксония следующим образом:

где Z представляет собой витамин или его аналог или производное или лекарственное средство или его аналог или производное или каждый из них представляет собой группу витамина или лекарственного средства совместно с другими частями поливалентного линкера, такую как группа лекарственного средства или витамина, включающая один или несколько спейсерных линкеров, линкеров с гетероатомом и/или других высвобождаемых линкеров. В этом варианте осуществления катализируемое кислотой удаление карбамата приводит к высвобождению СО₂ и содержащей азот группы, присоединенной к Z, и образованию катиона бензила, который может улавливаться водой, или любого другого основания Льюиса.

Другой иллюстративный механизм включает расположение высвобождаемого линкера, спейсерного линкера и линкера с гетероатомом таким образом, чтобы после расщепления связи в поливалентном линкере высвобождаемые функциональные группы химически способствовали разрушению или расщеплению дополнительных связей, также называемому расщеплением или разрушением при помощи анхимерного эффекта. Иллюстративный вариант осуществления такого поливалентного линкера или его части включает соединения формулы:

где Х представляет собой гетероатом, такой как азот, кислород или сера, n представляет собой целое число, выбранное из 0, 1, 2 и 3, R представляет собой водород или заместитель, включающий заместитель, способный стабилизировать положительный заряд индуктивно или посредством резонанса на арильном кольце, такой как алкокси и т.п., и каждый из Z или Z' представляет собой витамин или его аналог или производное, или лекарственное средство или его аналог или производное, или группу витамина или лекарственного средства совместно с другими частями поливалентного линкера. Понятно, что на арильном кольце, углероде бензила, азоте карбамата, алкановой кислоте или метиленовом мостике могут быть представлены другие заместители, включая, но не ограничиваясь ими, гидрокси, алкил, алкокси, алкилтио, галоген и т.п. Расщепление под воздействием может включать механизмы, вовлекающие промежуточные соединения бензилия, промежуточные соединения бензина, циклизацию лактона, промежуточные соединения оксония, бета-отщепление и т.п. Далее, понятно, что в дополнение к фрагментации после расщепления высвобождаемого линкера первоначальное расщепление высвобождаемого линкера можно облегчать посредством вспомогательного анхимерного механизма.

В этом варианте осуществления гидроксиалкановая кислота, которая может осуществлять циклизацию, способствует расщеплению метиленового мостика, например, посредством иона оксония и способствует расщеплению связи или последующей фрагментации после расщепления связи высвобождаемого линкера. Альтернативно катализируемое кислотой расщепление метиленового мостика при помощи иона оксония может запускать каскад фрагментации этого иллюстративного поливалентного линкера или его фрагмента. Альтернативно, катализируемый кислотой гидролиз карбамата может способствовать бета-отщеплению гидроксиалкановой кислоты, которая может осуществлять циклизацию, и способствовать расщеплению метиленового мостика, например, посредством иона оксония. Понятно, что такой каскад фрагментации могут запускать другие химические механизмы разрушения или расщепления связи в метаболических, физиологических или клеточных условиях, описанные в настоящем описании.

В одном варианте осуществления поливалентные линкеры, описанные в настоящем описании, представляют собой соединения следующей формулы

где n представляет собой целое число, выбранное от 1 до приблизительно 4; каждый R^a и R^b независимо выбран из группы, состоящей из водорода и алкила, включая низший алкил, такой как С₁-С₄-алкил, который является необязательно разветвленным; или R⁸ и R¹³ совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют карбоциклическое кольцо; R представляет собой необязательно замещенную алкильную группу, необязательно замещенную ацильную группу или пригодную выбранную защитную группу азота; и (*) указывает на положения для присоединения лекарственного средства, витамина, радиофармацевтического средства, диагностического средства, других поливалентных линкеров или других частей конъюгата.

В другом варианте осуществления поливалентные линкеры, описанные в настоящем описании, включают соединения следующих формул

где m представляет собой целое число, выбранное от 1 до приблизительно 4; R представляет собой необязательно замещенную алкильную группу, необязательно замещенную ацильную группу или пригодную выбранную защитную группу азота; и (*) указывает на положение для присоединения лекарственного средства, витамина, радиофармацевтического средства, диагностического средства, других поливалентных линкеров или других частей конъюгата.

В другом варианте осуществления поливалентные линкеры, описанные в настоящем описании, включают соединения следующих формул

где m представляет собой целое число, выбранное от 1 до приблизительно 4; R представляет собой необязательно замещенную алкильную группу, необязательно замещенную ацильную группу или пригодную выбранную защитную группу азота; и (*) указывает на положения для присоединения лекарственного средства, витамина, радиофармацевтического средства, диагностического средства, других поливалентных линкеров или других частей конъюгата.

В другом варианте осуществления высвобождаемый линкер, спейсерный линкер и линкер с гетероатомом может быть расположен таким образом, чтобы после расщепления связи в поливалентном линкере высвобождаемые функциональные группы химически способствовали разрушению или расщеплению дополнительных связей, также называемому разрушением или расщеплением при помощи анхимерного эффекта. Иллюстративный вариант осуществления такого поливалентного линкера или его части включает соединения формулы:

где Х представляет собой гетероатом, такой как азот, кислород или сера, n представляет собой целое число, выбранное из 0, 1, 2 и 3, R представляет собой водород или заместитель, включающий заместитель, способный стабилизировать положительный заряд индуктивно или посредством резонанса на арильном кольце, такой как алкокси и т.п., и символом (*) показаны положения для присоединения дополнительного спейсерного линкера, линкера с гетероатомом или высвобождаемого линкера, образующих поливалентный линкер, или альтернативно для присоединения лекарственного средства или его аналога или производного или витамина или его аналога или производного. Понятно, что на арильном кольце, углероде бензила, алкановой кислоте или метиленовом мостике могут быть представлены другие заместители, включая, но не ограничиваясь ими, гидрокси, алкил, алкокси, алкилтио, галоген и т.п. Расщепление под воздействием может включать механизмы, вовлекающие промежуточные соединения бензилия, промежуточные соединения бензина, циклизацию лактона, промежуточные соединения оксония, бета-отщепление и т.п. Далее, понятно, что в дополнение к фрагментации после расщепления высвобождаемого линкера первоначальное расщепление высвобождаемого линкера можно облегчать посредством вспомогательного анхимерного механизма.

В другом варианте осуществления поливалентный линкер включает линкеры с гетероатомом, спейсерные линкеры и высвобождаемые линкеры, соединенные с образованием поливолентной группы 3-тиосукцинимид-1-илалкилоксиметилокси, иллюстрируемой следующей формулой

где n представляет собой целое число от 1 до 6, алкильная группа является необязательно замещенной и метил необязательно замещен дополнительным алкилом или необязательно замещен арильной группой, каждый из которых представлен независимо выбранной группой R. Символами (*) указаны положения для присоединения фрагмента поливалентного линкера к другим частям конъюгатов, описанных в настоящем описании.

В другом варианте осуществления поливалентный линкер включает линкеры с гетероатомом, спейсерные линкеры и высвобождаемые линкеры, соединенные с образованием поливалентной группы 3-тиосукцинимид-1-илалкилкарбонила, иллюстрируемой следующей формулой

где n представляет собой целое число от 1 до 6 и алкильная группа является необязательно замещенной. Символами (*) указаны положения для присоединения фрагмента поливалентного линкера к другим частям конъюгатов, описанных в настоящем описании. В другом варианте осуществления поливалентный линкер включает линкеры с гетероатомом, спейсерные линкеры и высвобождаемые линкеры, соединенные с образованием поливалентной группы 3-тиоалкилсульфонилалкил(дизамещенный силил)окси, где дизамещенный силил замещен алкилом и/или необязательно замещен арильными группами.

В другом варианте осуществления поливалентный линкер включает линкеры с гетероатомом, спейсерные линкеры и высвобождаемые линкеры, соединенные с образованием поливалентной группы дитиоалкилкарбонилгидразида или поливалентной группы 3-тиосукцинимид-1-илалкилкарбонилгидразида, иллюстрируемыми следующими формулами

где n представляет собой целое число от 1 до 6, алкильная группа является необязательно замещенной и гидразид образует гидразон с (В), (D) или другой частью поливалентного линкера (L). Символами (*) указаны положения для присоединения фрагмента поливалентного линкера к другим частям конъюгатов, описанных в настоящем описании.

В другом варианте осуществления поливалентный линкер включает линкеры с гетероатомом, спейсерные линкеры и высвобождаемые линкеры, соединенные с образованием поливалентной группы 3-тиосукцинимид-1-илалкилоксиалкилоксиалкилидена, иллюстрируемой следующей формулой

где каждый n представляет собой независимо выбранное целое число от 1 до 6, каждая алкильная группа является независимо выбранной и необязательно замещена, например, алкилом или представляет собой необязательно замещенный арил и где алкилиден образует гидразон с (В), (D) или другой частью поливалентного линкера (L). Символами (*) указаны положения для присоединения фрагмента поливалентного линкера к другим частям конъюгатов, описанных в настоящем описании.

В другом варианте осуществления поливалентный линкер включает линкеры с гетероатомом, спейсерные линкеры и высвобождаемые линкеры, соединенные с образованием поливалентной группы 3-тио- или 3-дитиоарилалкилоксикарбонила, группы 3-тио- или 3-дитиоарилалкиламинокарбонила, поливалентного 3-тио- или 3-дитиоалкилоксикарбонила или поливалентного 3-тио- или 3-дитиоалкиламинокарбонила, где алкилкарбонил образует карбонат, карбамат или мочевину с (В), (D) или другой частью поливалентного линкера (L). В качестве иллюстративного примера алкильная группа представляет собой этил.

В другом варианте осуществления поливалентный линкер включает линкеры с гетероатомом, спейсерные линкеры и высвобождаемые линкеры, соединенные с образованием поливалентной группы 3-дитиоалкиламино, где амино образует винилогический амид с (В), (D) или с другой частью поливалентного линкера (L). В качестве иллюстративного примера алкильная группа представляет собой этил.

В другом варианте осуществления поливалентный линкер включает линкеры с гетероатомом, спейсерные линкеры и высвобождаемые линкеры, соединенные с образованием поливалентной группы 1-алкоксициклоалкиленокси, поливалентной группы алкиленаминокарбонил(дикарбоксиларилен)карбоксилата, поливалентной группы 3-дитиоалкилоксикарбонила, поливалентной группы 3-дитиоалкилоксикарбонилгидразида, поливалентной.

В другом варианте осуществления поливалентный линкер включает по меньшей мере один спейсерный линкер, который представляет собой пептид, образованный из аминокислот. В одном аспекте пептид включает встречающиеся в природе аминокислоты и их стереоизомеры. В другом аспекте пептид образован только из встречающихся в природе аминокислот и их стереоизомеров.

Дополнительные иллюстративные примеры спейсерных и высвобождаемых линкеров представлены в таблицах 1 и 2, где (*) указывает на положение для присоединения другого линкера, алкалоида барвинка или его аналога или производного или связывающей рецептор группы.

Таблица 1

Рассматриваемые спейсерные линкеры и линкеры с гетероатомами и их сочетания

Таблица 2

Рассматриваемые высвобождаемые линкеры и линкеры с гетероатомами и их сочетания

В конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, может быть включено лекарственное средство любого типа. В одном иллюстративном варианте осуществления лекарственные средства выбирают исходя из активности в отношении одной или нескольких популяций патогенных клеток. В одном аспекте эти патогенные клетки представляют собой клетки злокачественной опухоли, включая солидные опухоли.

В другом иллюстративном варианте осуществления выбирают лекарственные средства исходя из активности в отношении одной или нескольких популяций патогенных клеток с конкретным механизмом действия. Иллюстративные механизмы действия включают алкилирующие средства, ингибиторы микротрубочек, включая ингибиторы, которые стабилизируют и/или дестабилизируют образование микротрубочек, включая средства на основе бета-тубулина, ингибиторы циклинзависимых киназ (CDK), ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы белкового синтеза, ингибиторы протеинкиназ, включая Ras, Raf, PKC, PI3K, и сходные ингибиторы, ингибиторы транскрипции, антифолаты, блокаторы теплового шока и т.п.

Иллюстративные алкилирующие средства включают, но не ограничиваются ими, митомицины CBI и т.п. Иллюстративные ингибиторы циклинзависимых киназ (CDK) включают, но не ограничиваются ими, CYC202, селициклиб, R-росковитин, AGM-1470, и т.п. Иллюстративные ингибиторы топоизомеразы включают, но не ограничиваются ими, доксорубицин, другие антрациклины и т.п. Иллюстративные ингибиторы белкового синтеза включают, но не ограничиваются ими, бруцеантин и т.п. Иллюстративные ингибиторы протеинкиназ, включающие ингибиторы Ras, Raf, PKC, PI3K и т.п., включают, но не ограничиваются ими, L-779,450, R115777 и т.п. Иллюстративные ингибиторы транскрипции включают, но не ограничиваются ими, α-амантин, актиномицин и т.п. Иллюстративные антифолаты включают, но не ограничиваются ими, метотрексат и т.п. Иллюстративные блокаторы теплового шока включают, но не ограничиваются ими, гелданамицин и т.п.

Иллюстративные ингибиторы микротрубочек, включающие ингибиторы, которые стабилизируют и/или дестабилизируют образование микротрубочек, включают средства на основе β-тубулина, токсичные для микротрубочек средства и т.п. Иллюстративные токсичные для микротрубочек средства, которые связываются с выбранными рецепторами, включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы, связывающиеся с участком для связывания соединения барвинка, такие как аренастатин, доластатин, халихондрин B, майтанзин, фомопсин A, ризоксин, устилоксин, винбластин, винкристин и т.п., стабилизаторы, связывающиеся с участком для связывания таксола, такие как дискодермалид, эпотилон, таксол, паклитаксол и т.п., ингибиторы, связывающиеся с участком для связывания колхицина, такие как колхицин, комбретастатин, курацин A, подофиллотоксин, стеганацин и т.п., и другие средства, связывающиеся с неизвестными участками, такие как криптофицин, тубулизины и т.п.

В одном варианте осуществления конъюгатов для доставки лекарственного средства, описанных в настоящем описании, по меньшей мере одно из лекарственных средств представляет собой ингибитор микротрубочек или его аналог или производное. В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств представляет собой алкилирующее ДНК средство. В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств представляет собой алкилирующее ДНК средство и по меньшей мере одно другое из лекарственных средств представляет собой ингибитор микротрубочек. Алкалоиды, описанные в настоящем описании, включают все члены индол-дигидроиндолового семейства алкалоидов барвинка, таких как, но не ограничиваясь ими, виндезин, винбластин, винкристин, катарнитин, виндолин, леурозин, винорелбин, имидокарб, сибутамин, толтразурил, винбластиновая кислота и т.п., и их аналоги и производные.

В другом варианте осуществления конъюгатов для доставки лекарственного средства, описанных в настоящем описании, по меньшей мере одно из лекарственных средств представляет собой ингибитор P-гликопротеина (PGP). В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой ингибитор PGP, и по меньшей мере одно другое из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, представляет собой субстрат PGP. В качестве иллюстративного примера в этом последнем варианте осуществления субстрат PGP представляет собой алкилирующее ДНК средство. В отношении этого варианта осуществления понятно, что спаривание ингибитора PGP с субстратом PGP, таким как алкилирующее ДНК средство, включая, но не ограничиваясь ими, любой из митомицинов, такой как митомицин C, митомицин A и т.п., может улучшать общее действие лекарственного средства, которое иначе представляет собой субстрат PGP. В конъюгатах с высвобождением, описанных в настоящем описании, как лекарственное средство на основе ингибитора PGP, так и лекарственное средство на основе субстрата PGP высвобождаются в клетке после эндоцитоза. Таким образом, лекарственное средство на основе ингибитора PGP может повышать общую эффективность и/или активность лекарственного средства на основе субстрата PGP. Кроме того, ингибитор PGP может снижать экспрессию PGP, что, в свою очередь, снизит выход из патогенной клетки одного или нескольких лекарственных средств, включенных в конъюгаты с несколькими лекарственными средствами, описанные в настоящем описании. Понятно, что митомицины или их аналоги или производные, такие как митомицин C, могут действовать в качестве ингибитора PGP или отрицательного регулятора PGP. Далее, понятно, что алкалоид барвинка или его аналог или производное, такой как аналоги и производные винбластина, могут представлять собой субстрат PGP, который защищен от выхода из патогенной клетки посредством ингибитора или отрицательного регулятора PGP.

В другом варианте осуществления конъюгатов для доставки лекарственного средства, описанных в настоящем описании, по меньшей мере одно из лекарственных средств представляет собой алкалоид барвинка или его аналог или производное. Алкалоиды барвинка, описанные в настоящем описании, включают все члены индол-дигидроиндольного семейства алкалоидов барвинка, такие как, но не ограничиваясь ими, виндезин, винбластин, винкристин, катарантин, виндолин, леурозин, винорелбин, имидокарб, сибутрамин, толтразурил, винбластиновая кислота и т.п., и их аналоги и производные.

Как упомянуто в настоящем описании, лекарственные средства на основе барвинка, пригодные в конъюгатах, описанных в настоящем описании, включают все члены индол-дигидроиндольного семейства алкалоидов барвинка, такие как виндезин, винбластин, винкристин, катарантин, виндолин, леурозин, винорелбин, имидокарб, сибутрамин, толтразурил, винбластиновая кислота и т.п., и их аналоги и производные. В качестве иллюстративного примера такие аналоги и производные включают 3-карбоксазиды, описанные в патенте США № 4203898; N²-алкил- и другие производные 4-дезацетилвинбластин-3-карбоксигидразида, описанные в патенте США № 4166810; гидразид леурозина, описанный в Neuss et al. Tetrahedron Lett. 783 (1968); производные гидразида, описанные в Barnett et al. J. Med. Chem. 21:88 (1978); производные сложного эфира C-4, описанные в патентах США № 3392173 и 3387001; производные дикарбоновой кислоты, полученные посредством окисления, описанного в Langone et al. Anal. Biochem. 95:214 (1979); и гидразиды алкалоидов барвинка, описанные в EP 0247792 A2. Все упомянутые выше патенты и публикации включены в настоящее описание в качестве ссылок в отношении всех описаний способов синтеза и условий реакции для получения соединений барвинка.

В одном иллюстративном варианте осуществления лекарственные средства на основе алкалоидов барвинка представляют собой соединения формулы

где:

один из R¹ и R² представляет собой H, а другой представляет собой этил и R³ представляет собой H или R¹ представляет собой этил;

R² и R³ вместе образуют -O-;

каждый R⁴, R⁷ и R⁸ независимо выбран из H, алкила и ацила,

каждый R⁵ и R⁶ независимо выбран из алкила;

R⁹ представляет собой группу -NHNHR, где R представляет собой H, алкил или ацил;

R¹⁰ представляет собой H или ацил и

R¹¹ представляет собой этил.

В одном аспекте лекарственные средства на основе алкалоидов барвинка представляют собой соединения указанной выше формулы, где каждый из R⁴ и R⁸ представляет собой H и каждый из R⁵, R⁶, R⁹ и R¹⁰ представляет собой метил.

В другом варианте осуществления описан связывающий рецептор конъюгат для доставки лекарственного средства, содержащий связывающую рецептор группу, поливалентный линкер (L), лекарственное средство на основе алкалоида барвинка или его аналог или производное и другое лекарственное средство или его аналог или производное, где каждый из связывающей рецептор группы, алкалоида барвинка и другого лекарственного средства связаны с поливалентным линкером (L) через линкер с гетероатомом (l_н). Поливалентный линкер (L) содержит один или несколько спейсерных линкеров, линкеров с гетероатомом и высвобождаемых линкеров и их сочетание в любом порядке.

В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой акламицин или его аналог или производное. Возможно, акламицины и их аналоги и производные представляют собой субстраты для выкачивающего насоса для PGP. В одном аспекте по меньшей мере одно другое из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой алкилирующее ДНК средство, такое как митомицин или его аналог или производное.

В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой ингибитор синтеза ДНК или его аналог или производное. В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой ингибитор образования веретена деления или его аналог или производное. В одном аспекте по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой ингибитор синтеза ДНК или его аналог или производное и по меньшей мере одно другое из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой ингибитор образования веретена деления или его аналог или производное.

В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой стабилизатор микротрубочек или его аналог или производное. В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой ингибитор синтеза микротрубочек или его аналог или производное. В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой дестабилизирующее микротрубочки средство или его аналог или производное.

В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой индуцирующее апоптоз средство или его аналог или производное. В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой таксол или его аналог или производное. В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой антифолат или его аналог или производное. В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой метотрексат или его аналог или производное. В одном аспекте по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой антифолат или его аналог или производное, такой как метотрексат, и по меньшей мере одно другое из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой таксол или его аналог или производное.

В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой фолат или его аналог или производное. В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой ингибитор рецептора эпидермального фактора роста-2 человека (HER-2) или его аналог или производное. В другом варианте осуществления по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой меченное радиоактивной меткой химиотерапевтическое средство, такое как цисплатин и т.п. В одном аспекте по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой антифолат или его аналог или производное, такой как метотрексат, и по меньшей мере одно другое из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой фолат или его аналог или производное. В другом аспекте по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой таксол или его аналог или производное, и по меньшей мере одно другое из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой ингибитор HER-2 или его аналог или производное. В другом аспекте по меньшей мере одно из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой таксол или его аналог или производное, по меньшей мере одно другое из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой меченное радиоактивной меткой химиотерапевтическое средство, такое как цисплатин, и по меньшей мере одно другое из лекарственных средств, включенных в конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, представляет собой ингибитор HER-2 или его аналог или производное.

Конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, можно получать общепринятыми способами синтеза. Способы синтеза выбирают в зависимости от выбора линкеров с гетероатомом и функциональных групп, представленных на спейсерных линкерах и высвобождаемых линкерах. Как правило, соответствующие реакции образования связей описаны в Richard С.Larock, "Comprehensive Organic Transformations, a guide to functional group preparations," VCH Publishers, Inc. New York (1989), и в Theodora E. Greene & Peter G.M. Wuts, "Protective Groups ion Organic Synthesis", 2d edition, John Wiley & Sons, Inc. New York (1991), описания которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. Дополнительные способы синтеза и условия реакции описаны в публикации патентной заявки США № US 2005/0002942 A1.

В качестве иллюстративного примера конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, можно получать с использованием как линейных, так и конвергентных способов синтеза. Иллюстративные промежуточные соединения, пригодные в таких способах, включают промежуточные соединения, содержащие поливалентный линкер, который включает группу для присоединения на каждом конце, пригодную для ковалентного присоединения к связывающей рецептор группе или ее аналогу или производному и к алкалоиду барвинка или его аналогу или производному. Другие иллюстративные промежуточные соединения, пригодные в таких способах, включают промежуточные соединения, содержащие связывающую рецептор группу или ее аналог или производное, присоединенную к поливалентному линкеру, который включает группу для присоединения. Другие иллюстративные промежуточные соединения, пригодные в таких способах, включают промежуточные соединения, содержащие алкалоид барвинка или его аналог или производное, присоединенный к поливалентному линкеру, который включает группу для присоединения. В любом случае группа для присоединения может представлять собой нуклеофил, электрофил или их предшественника.

В одном иллюстративном варианте осуществления синтетических промежуточных соединений группа для присоединения представляет собой акцептор Михаэля и поливалентный линкер включает высвобождаемый линкер, имеющий формулу -C(O)NHN=, -NHC(O)NHN= или -СН₂С(O)NHN=. В одном иллюстративном аспекте группа для присоединения и поливалентный линкер вместе образуют соединение формулы:

или его защищенное производное, где (D) представляет собой алкалоид барвинка или его аналог или производное, способный образовывать гидразон, как представлено в настоящем описании; и n представляет собой целое число, такое как 1, 2, 3 или 4. В другом иллюстративном аспекте промежуточного соединения связывающего рецептор конъюгата для доставки лекарственного средства, описанного в настоящем описании, второй линкер ковалентно присоединен к представленной выше формуле через алкилтиольный нуклеофил, включенный во второй линкер. В другом иллюстративном аспекте связывающая рецептор группа или ее аналог или производное ковалентно присоединена к представленной выше формуле через алкилтиольный нуклеофил, включенный в эту группу.

В другом иллюстративном варианте осуществления группа для присоединения представляет собой гетероатом, такой как азот, кислород или сера, и поливалентный линкер включает один или несколько линкеров с гетероатомом и один или несколько спейсерных линкеров, ковалентно соединяющих связывающую рецептор группу с группой для присоединения. В одном иллюстративном аспекте промежуточное соединение, описанное в настоящем описании, включает соединение формулы:

или его защищенное производное, где X представляет собой кислород, азот или серу и m представляет собой целое число, такое как 1, 2 или 3, и где (B), l_S и l_H являются такими, как определено в настоящем описании. В одном иллюстративном аспекте l_H представляет собой -NH- и m представляет собой 1. В другом иллюстративном аспекте l_H представляет собой -NH-, m представляет собой 1 и X представляет собой -S-.

В другом иллюстративном варианте осуществления промежуточное соединение, описанное в настоящем описании, включает соединение формулы:

или его защищенное производное, где Y представляет собой H или заместитель, в качестве иллюстративного примера электрон-акцепторный заместитель, включая, но не ограничиваясь ими, нитро, циано, галоген, алкилсульфонил, производное карбоновой кислоты и т.п., и где (B) и l_S являются такими, как определено в настоящем описании. В другом иллюстративном варианте осуществления промежуточного соединения, описанного в настоящем описании, группа для присоединения представляет собой акцептор Михаэля и поливалентный линкер включает один или несколько линкеров с гетероатомом и один или несколько спейсерных линкеров, ковалентно соединяющих связывающую рецептор группу с группой для присоединения. В одном иллюстративном аспекте группа для присоединения и поливалентный линкер вместе образуют соединение формулы:

или его защищенное производное, где X представляет собой кислород, азот или серу и m и n представляют собой независимо выбранные целые числа, такие как 1, 2 или 3, и где (B), l_S и l_H являются такими, как определено в настоящем описании. В другом иллюстративном аспекте алкалоид барвинка или его аналог или производное ковалентно присоединен к представленной выше формуле через алкилтиольный нуклеофил, включенный в алкалоид барвинка.

В другом иллюстративном аспекте промежуточное соединение включает соединения формул:

или их защищенные производные, где AA представляет собой одну или несколько аминокислот, в качестве иллюстративного примера выбранную из встречающихся в природе аминокислот, или их стереоизомеров, X представляет собой азот, кислород или серу, Y представляет собой водород или заместитель, в качестве иллюстративного примера электронно-акцепторный заместитель, включая, но не ограничиваясь ими, нитро, циано, галоген, алкилсульфонил, производное карбоновой кислоты и т.п., n и m представляют собой независимо выбранные целые числа, такие как 1, 2 или 3, и p представляет собой целое число, такое как 1, 2, 3, 4 или 5.

AA также может представлять собой любую другую аминокислоту, такую как любая аминокислота общей формулы:

где R представляет собой водород, алкил, ацил или пригодную защитную группу азота, R' и R" представляют собой водород или заместитель, каждый из которых в каждом случае выбран независимо, и t представляет собой целое число, такое как 1, 2, 3, 4 или 5. В качестве иллюстративного примера R' и/или R" независимо соответствуют, но не ограничиваются ими, водороду или боковым цепям, представленным на встречающихся в природе аминокислотах, таким как метил, бензил, гидроксиметил, тиометил, карбоксил, карбоксилметил, гуанидинопропил и т.п., и их производных и защищенных производных. Описанная выше формула включает все стереоизомерные варианты. Например, аминокислота может быть выбрана из аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, лизина, глутамина, аргинина, серина, орнитина, треонина и т.п. В другом иллюстративном аспекте промежуточного соединения связывающего рецептор для витамина конъюгата для доставки лекарственного средства, описанного в настоящем описании, лекарственное средство или его аналог или производное включает алкилтиольный нуклеофил.

Каждое из представленных выше промежуточных соединений можно получать с использованием общепринятых способов синтеза. Дополнительные способы синтеза и условия реакций описаны в публикации патентной заявки США № US 2005/0002942 A1 и международной публикации PCT № WO 2006/012527.

Представленные выше иллюстративные варианты осуществления предназначены для иллюстрации этого изобретения, описанного в настоящем описании, и их не следует понимать или толковать как ограничивающие каким-либо образом это изобретение, как описано в настоящем описании. Например, для включения в это изобретение предназначены соединения, главным образом, соответствующие следующим иллюстративным промежуточным соединениям конъюгатов витамин-лекарственное средство, как описано в настоящем описании,

где каждый из R¹ и R² независимо представляет собой водород или алкил, такой как метил; и l_H представляет собой гетероатом, такой как кислород, сера, необязательно замещенный азот или необязательно защищенный азот и т.п. Два или более лекарственных средств и необязательно дополнительные связывающие рецептор лиганды, такие как фолаты и их аналоги и производные, могут быть ковалентно присоединены к (l_H) или к любой другой представленной функциональной группе, такой как азот амида или карбонил, карбоксилат кислоты или аминогруппа гуанидина, этого иллюстративного промежуточного соединения.

В другом варианте осуществления описано промежуточное соединение фолатного лиганда следующей формулы

где m, n и q представляют собой целые числа, которые независимо выбраны из диапазона от 0 до приблизительно 8; AA представляет собой аминокислоту, R¹ представляет собой водород, алкил или защитную группу азота и лекарственные средства необязательно присоединены к атомам (*). В одном аспекте AA представляет собой встречающуюся в природе аминокислоту природной или неприродной конфигурации. В другом аспекте одна или несколько из AA во фрагменте (-NH-AA-C(O)-)_n представляют собой гидрофильную аминокислоту. В другом аспекте одна или несколько AA во фрагменте (-NH-AA-C(O)-)_n представляют собой Asp и/или Arg. В другом аспекте целое число o представляет собой 1 или более. В другом аспекте целое число m представляет собой 2 или более. Лекарственные средства или их аналоги или производные и необязательно дополнительные линкеры и дополнительные связывающие рецептор лиганды могут быть соединены с представленной выше формулой в области трех свободных боковых цепей NH фрагментов 2,ω-диаминоалкановой кислоты или в области концевого карбоксилата, как показано посредством свободных валентностей в них.

В другом варианте осуществления описано промежуточное соединение фолатного лиганда следующей формулы

где m, n, q и p представляют собой целые числа, которые независимо выбраны из диапазона от 0 до приблизительно 8; AA представляет собой аминокислоту, R¹ представляет собой водород, алкил или защитную группу азота и лекарственные средства необязательно присоединены к атомам (*). В одном аспекте AA представляет собой встречающуюся в природе аминокислоту либо природной, либо неприродной конфигурации. В другом аспекте одна или несколько AA во фрагменте (-NH-AA-C(O)-)_n представляет собой гидрофильную аминокислоту. В другом аспекте одна или несколько AA во фрагменте (-NH-AA-C(O)-)_n представляет собой Asp и/или Arg. В другом аспекте целые числа o и p представляют собой 1 или более. В другом аспекте целое число m представляет собой 2 или более. Лекарственные средства или их аналоги или производные и необязательно дополнительные линкеры и дополнительные связывающие рецептор лиганды могут быть присоединены к указанной выше формуле в области свободных боковых цепей NH фрагментов 2,ω-диаминоалкановой кислоты, в области тиольных групп цистеинила или в области концевого карбоксилата, как указано посредством свободных валентностей в них.

В другом варианте осуществления описано промежуточное соединение фолатного лиганда следующей формулы

где m, n, q, p и r представляют собой целые числа, которые независимо выбраны из диапазона от 0 до приблизительно 8; AA представляет собой аминокислоту, R¹ представляет собой водород, алкил или защитную группу азота и лекарственные средства необязательно присоединены к атомам (*). В одном аспекте AA представляет собой встречающуюся в природе аминокислоту либо природной, либо неприродной конфигурации. В другом аспекте одна или несколько AA во фрагмент (-NH-AA-C(O)-)_n представляет собой гидрофильную аминокислоту. В другом аспекте одна или несколько AA во фрагменте (-NH- AA-C(O)-)_n представляет собой Asp и/или Arg. В другом аспекте целые числа o, p и r представляют собой 1 или более. В другом аспекте целое число m представляет собой 2 или более. Лекарственные средства или их аналоги или производные и необязательно дополнительные линкеры и дополнительные связывающие рецептор лиганды могут быть присоединены к указанной выше формуле в области свободных боковых цепей фрагментов NH 2,ω-диаминоалкановой кислоты, в области тиольных групп цистеинила, гидроксигрупп серинила или концевого карбоксилата, как указано посредством свободных валентностей в них.

В другом варианте осуществления описано промежуточное соединение фолатного лиганда, которое включает митомицин в качестве одного из лекарственных средств, имеющее следующую формулу

где m, n и q представляют собой целые числа, которые независимо выбраны из диапазона от 0 до приблизительно 8; и AA представляет собой аминокислоту. В одном аспекте AA представляет собой встречающуюся в природе аминокислоту либо природной, либо неприродной конфигурации. В другом аспекте одна или несколько AA во фрагменте (-NH-AA-C(O)-)_n представляет собой гидрофильную аминокислоту. В другом аспекте одна или несколько AA во фрагменте

(-NH-AA-C(O)-)_n представляет собой Asp и/или Arg. В другом аспекте целое число o представляет собой 1 или более. В другом аспекте целое число m представляет собой 2 или более. Лекарственные средства или их аналоги или производные и необязательно дополнительные линкеры и дополнительные связывающие рецептор лиганды могут быть соединены к представленной выше формуле в области дополнительных свободных боковых цепей NH фрагментов 2,ω-диаминоалкановой кислоты или в области концевого карбоксилата, как указано посредством свободных валентностей в них.

В другом варианте осуществления описан конъюгат фолатного лиганда и нескольких лекарственных средств, который включает митомицин и алкалоид барвинка, имеющий следующую формулу

В другом варианте осуществления описан конъюгат фолатного лиганда и нескольких лекарственных средств, который включает митомицин, акламицин и алкалоид барвинка, имеющий следующую формулу

В другом варианте осуществления описана фармацевтическая композиция. Фармацевтическая композиция содержит конъюгат для доставки лекарственного средства, описанный в настоящем описании, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем и/или разбавителем для него.

В другом варианте осуществления описан способ устранения популяции патогенных клеток в животном-хозяине, обладающем популяцией патогенных клеток. В одном иллюстративном аспекте члены популяции патогенных клеток обладают участком для связывания, доступным для связывающей рецептор группы или ее аналога или производного, и этот участок для связывания экспрессируется только патогенными клетками, сверхэкспрессируется или предпочтительно экспрессируется ими. Способ включает стадию введения хозяину конъюгата для доставки лекарственного средства, описанного в настоящем описании, или его фармацевтической композиции, как описано в настоящем описании.

Популяции патогенных клеток, против которых можно проводить лечение с использованием способов, описанных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, злокачественные опухоли, такие как эпителиальные злокачественные опухоли яичника, молочной железы, толстого кишечника, легкого, носа, горла, головного мозга и другие типы опухолевых клеток, инфекционные агенты, активированные макрофаги, активированные моноциты и т.п.

Конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, можно использовать как для клинической медицины человека, так и для ветеринарных способов применения. Таким образом, животное-хозяин, которое имеет популяцию патогенных клеток и которое лечат конъюгатами для доставки лекарственного средства, может представлять собой человека или в случае ветеринарных способов применения может представлять собой лабораторное, сельскохозяйственное, домашнее или дикое животное. Конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, можно вводить животным-хозяевам, включая, но не ограничиваясь ими, человека, лабораторных животных, таких как грызуны (например, мыши, крысы, хомяки и т.д.), кролики, обезьяны, шимпанзе, домашние животные, такие как собаки, кошки и кролики, сельскохозяйственные животные, такие как коровы, лошади, свиньи, овцы, козы, и дикие животные в неволе, такие как медведи, панды, львы, тигры, леопарды, слоны, зебры, жирафы, гориллы, дельфины и киты.

Конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, можно использовать для лечения множества патологий и патогенных клеток в животном-хозяине. Как используют в настоящем описании, "патогенные клетки" означают злокачественные клетки, инфекционные агенты, такие как бактерии и вирусы, инфицированные бактериями или вирусами клетки, активированные макрофаги, способные вызывать болезненное состояние, и любой другой тип патогенных клеток, которые единственные экспрессируют, предпочтительно экспрессируют или сверхэкспрессируют рецепторы для лигандов, такие как рецепторы для витаминов или рецепторы, которые связывают аналоги или производные витаминов. Патогенные клетки также могут включать любые клетки, вызывающие болезненное состояние, лечение которого посредством конъюгатов для доставки лекарственного средства приводит к снижению симптомов заболевания. Патогенные клетки также могут представлять собой клетки-хозяева, которые являются патогенными в некоторых условиях, такие как клетки иммунной системы, которые ответственны за реакцию "трансплантат против хозяина", но не являются патогенными в других условиях.

Таким образом, популяция патогенных клеток может представлять собой популяцию злокачественных клеток, которые вызывают опухоли, включая доброкачественные опухоли и злокачественные опухоли, или они могут представлять собой не вызывающие опухоли клетки. Популяция злокачественных клеток может возникать спонтанно или при помощи таких процессов, как мутации, имеющиеся в эмбриональных клетках животного-хозяина, или соматические мутации, или они могут быть индуцированными химически, вирусами или облучением. Это изобретение можно применять для лечения таких злокачественных опухолей, как карциномы, саркомы, лимфомы, болезнь Ходжкина, меланомы, мезотелиомы, лимфома Беркитта, носоглоточные карциномы, лейкозы и миеломы. Популяция злокачественных клеток может включать, но не ограничиваться ими, злокачественную опухоль ротовой полости, щитовидной железы, эндокринной системы, кожи, желудка, пищевода, гортани, поджелудочной железы, толстого кишечника, мочевого пузыря, кости, яичника, шейки матки, матки, молочной железы, яичка, предстательной железы, прямой кишки, почки, печени и легкого.

В вариантах осуществления, где популяция патогенных клеток представляет собой популяцию злокачественных клеток, эффект введения конъюгата для доставки лекарственного средства представляет собой терапевтический ответ, определяемый снижением или устранением опухолевой массы или ингибированием пролиферации опухолевых клеток. В случае опухоли устранение может представлять собой устранение клеток первичной опухоли или клеток, которые метастазировали или находятся в процессе диссоциации от первичной опухоли. Также предусмотрено профилактическое лечение конъюгатом для доставки лекарственного средства для предотвращения повторного возникновения опухоли после ее удаления посредством любого терапевтического подхода, включающего хирургическое удаление опухоли, лучевую терапию, химиотерапию или биологическую терапию. Профилактическое лечение может представлять собой первоначальное лечение конъюгатом для доставки лекарственного средства, такое как лечение по схеме с несколькими дозами в сутки, и/или оно может представлять собой вспомогательное лечение или серию лечений после интервала, составляющего сутки или месяцы после исходного лечения(ий). Таким образом, устранение любой из популяций патогенных клеток, описанных выше, включает снижение количества патогенных клеток, ингибирование пролиферации патогенных клеток, профилактическое лечение, которое предотвращает повторное возникновение патогенных клеток, или лечение против патогенных клеток, которое приводит к уменьшению симптомов заболевания.

В случаях когда устранению подлежат клетки злокачественной опухоли, описанный в настоящем описании способ можно использовать в сочетании с хирургическим удалением опухоли, лучевой терапией, химиотерапией или биологическими способами терапии, такими как другие способы иммунотерапии, включая, но не ограничиваясь ими, терапию моноклональными антителами, лечение иммуномодулирующими средствами, адоптивный перенос иммунных эффекторных клеток, лечение гемопоэтическими факторами роста, цитокинами и вакцинация.

Способ, описанный в настоящем описании, также является применимым в отношении популяций патогенных клеток, которые вызывают множество инфекционных заболеваний. Например, настоящее изобретение является применимым для таких популяций патогенных клеток, как бактерии, грибы, включая дрожжи, вирусы, инфицированные вирусом клетки, микоплазму и паразиты. Инфекционные организмы против которых можно проводить лечение посредством конъюгатов для доставки лекарственного средства, описанных в настоящем описании, представляют собой любые известные в данной области инфекционные организмы, которые приводят к патогенезу у животного, включая такие организмы, как бактерии, которые представляют собой грамотрицательные или грамположительные кокки или бациллы. Например, с помощью конъюгатов для доставки лекарственного средства можно проводить лечение от видов Proteus, видов Klebsiella, видов Providencia, видов Yersinia, видов Erwinia, видов Enterobacter, видов Salmonella, видов Serratia, видов Aerobacter, видов Escherichia, видов Pseudomonas, видов Shigella, видов Vibrio, видов Aeromonas, видов Campylobacter, видов Streptococcus, видов Staphylococcus, видов Lactobacillus, видов Micrococcus, видов Moraxella, видов Bacillus, видов Clostridium, видов Corynebacterium, видов Eberthella, видов Micrococcus, видов Mycobacterium, видов Neisseria, видов Haemophilus, видов Bacteroides, видов Listeria, видов Erysipelothrix, видов Acinetobacter, видов Brucella, видов Pasteurella, видов Vibrio, видов Flavobacterium, видов Fusobacterium, видов Streptobacillus, видов Calymmatobacterium, видов Legionella, видов Treponema, видов Borrelia, видов Leptospira, видов Actinomyces, видов Nocardia, видов Rickettsia и любого другого бактериального вида, который вызывает заболевание в животном-хозяине.

Особый интерес представляют бактерии, которые являются устойчивыми к антибиотикам, такие как устойчивые к антибиотикам виды Streptococcus и виды Staphlococcus, или бактерии, которые являются чувствительными к антибиотикам, но вызывают рекуррентные инфекции, которые лечат антибиотиками, так что в итоге развиваются устойчивые организмы. Для избежания развития этих устойчивых к антибиотикам штаммов лечение против бактерий, которые являются чувствительными к антибиотикам, но вызывают рекуррентные инфекции, которые лечат антибиотиками, так что в итоге развиваются устойчивые организмы, можно проводить посредством описанных в настоящем описании конъюгатов для доставки лекарственного средства в отсутствие антибиотиков или в сочетании с более низкими дозами антибиотиков, чем обычно вводят животному-хозяину.

Заболевания, вызываемые вирусами, такими как ДНК- и РНК-вирусы, также можно лечить посредством конъюгатов для доставки лекарственного средства, описанных в настоящем описании. Такие вирусы включают, но не ограничиваются ими, ДНК-вирусы, такие как вирусы папилломы, парвовирусы, аденовирусы, герпес-вирусы и вирусы коровьей оспы и РНК-вирусы, такие как аренавирусы, коронавирусы, риновирусы, респераторные синцитиальные вирусы, вирусы гриппа, пикорнавирусы, парамиксовирусы, реовирусы, ретровирусы, лентивирусы и рабдовирусы.

Конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, также можно использовать для лечения заболеваний, вызываемых любыми грибами, включая дрожжи, виды микоплазмы, паразиты или другие инфекционные организмы, которые вызывают заболевание у животных. Примеры грибов, от которых можно лечить посредством способа и конъюгатов для доставки лекарственного средства, описанных в настоящем описании, включают грибы, которые растут в виде плесени или являются дрожжеподобными, включая, например, грибы, которые вызывают заболевания, такие как стригущий лишай, гистоплазмоз, бластомикоз, аспергиллез, криптококкоз, споротрихоз, кокцидиоидомикоз, паракокцидиоидомикоз, мукормикоз, хромобластомикоз, дерматофитоз, прототекоз, фузариоз, питириоз, мицетома, паракокцидиоидомикоз, феогифомикоз, псевдаллешериоз, споротрихоз, трихоспороз, инфекция Pneumocystis и кандидоз.

Конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, также можно использовать для лечения паразитарных инфекций, включая, но не ограничиваясь ими, инфекции, вызываемые гельминтами, такими как виды Taenia, Hymenolepsis, Diphyllobothrium и Echinococcus, трематодами, такими как виды Fasciolopsis, Heterophyes, Metagonimus, Clonorchis, Fasciola, Paragonimus и Schitosoma, круглыми червями, такими как виды Enterobius, Trichuris, Ascaris, Ancylostoma, Necator, Strongyloides, Trichinella, Wuchereria, Brugia, Loa Onchocerca и Dracunculus, амебами, такими как виды Naegleria и Acanthamoeba, и простейшими, такими как виды Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania, Toxoplasma, EntamoeIba, Giardia, Isospora, Cryptospondium и Enterocytozoon.

Патогенные клетки, на которые направлены конъюгаты для доставки лекарственного средства, также могут представлять собой клетки, обладающие эндогенными патогенами, такими как клетки, инфицированные вирусами, микоплазмой, паразитами или бактериями, если эти клетки предпочтительно экспрессируют рецепторы для лигандов, такие как рецепторы для витаминов или их аналоги или производные.

В одном варианте осуществления конъюгаты для доставки лекарственного средства могут интернализовываться в патогенные клетки-мишени при связывании лиганда с рецептором, переносчиком или другим представленным на поверхности белком, который специфично связывает лиганд и который предпочтительно экспрессируется на патогенных клетках. Такая интернализация может происходить, например, посредством опосредуемого рецептором эндоцитоза. Если конъюгат для доставки лекарственного средства содержит высвобождаемый линкер, то лиганд и соединение барвинка могут диссоциировать внутриклеточно и соединение барвинка может действовать на его внутриклеточную мишень.

В другом иллюстративном варианте осуществления лиганд конъюгата для доставки лекарственного средства может связываться с патогенной клеткой, обеспечивая расположение соединения барвинка близко к поверхности патогенной клетки.

Затем соединение барвинка может высвобождаться посредством расщепления высвобождаемого линкера. Например, соединение барвинка может высвобождаться посредством протеиндисульфидизомеразы, если высвобождаемый линкер представляет собой дисульфидную группу. Соединение барвинка может захватываться патогенной клеткой, с которой связался связывающий рецептор конъюгат для доставки лекарственного средства, или соединение барвинка может захватываться другой патогенной клеткой, расположенной вблизи к ней. Альтернативно соединение барвинка может высвобождаться посредством протеиндисульфидизомеразы внутри клетки, где высвобождаемый линкер представляет собой дисульфидную группу. Соединение барвинка также может высвобождаться посредством механизма гидролиза, такого как катализируемый кислотой гидролиз, как описано выше для определенных механизмов бета-отщепления, или посредством расщепления с помощью анхимерного эффекта через механизм образования иона оксония или иона лактония. Выбор высвобождаемого линкера или линкеров будет определять механизм, посредством которого соединение барвинка высвобождается из конъюгата. Понятно, что такой выбор может быть предварительно определен условиями, в которых будет использоваться конъюгат для доставки лекарственного средства.

В другом иллюстративном варианте осуществления, где линкер не содержит высвобождаемого линкера, группа лиганда конъюгата для доставки лекарственного средства может связываться с патогенной клеткой, обеспечивая расположение соединения барвинка на поверхности патогенной клетки для нацеливания на патогенную клетку атаки другими молекулами, способными связываться с соединением барвинка. Альтернативно в этом варианте осуществления конъюгаты для доставки лекарственного средства могут при связывании интернализовываться в клетки-мишени, и группа лиганда и соединение барвинка может оставаться связанным внутриклеточно с соединением барвинка, оказывающим свои эффекты без диссоциации от группы лиганда.

В другом варианте осуществления или в сочетании с описанными выше вариантами осуществления, где конъюгат для доставки лекарственного средства связывает рецептор для витамина или рецептор для другого лиганда, конъюгат может связываться с растворимыми рецепторами для витаминов, имеющимися в сыворотке, или с сывороточными белками, такими как альбумин, что приводит к пролонгированной циркуляции конъюгатов относительно неконъюгированного соединения барвинка и повышенной активности конъюгатов в отношении популяции патогенных клеток относительно неконъюгированного соединения барвинка.

Участок для связывания лиганда, такого как витамин, может включать рецепторы для лиганда, способные специфично связывать лиганд, где рецептор или другой белок экспрессируется только популяцией патогенных клеток, сверхэкспрессируется или предпочтительно экспрессируется ей. Представленный на поверхности белок, экспрессируемый только патогенными клетками, сверхэкспрессируемый или предпочтительно экспрессируемый ими, как правило, представляет собой рецептор, который либо не представлен на непатогенных клетках, либо представлен на них в более низких концентрациях, что обеспечивает способ для селективного устранения патогенных клеток. Конъюгаты для доставки лекарственного средства могут быть способны к связыванию с высокой аффинностью с рецепторами на злокачественных клетках или других типах патогенных клеток. Связывание с высокой аффинностью может быть присущим лиганду, или аффинность связывания можно повышать посредством применения химически модифицированного лиганда.

Конъюгаты для доставки лекарственного средства, описанные в настоящем описании, можно вводить в качестве комбинированной терапии с любым другим известным средством независимо от того, является ли дополнительное лекарственное средство нацеленным. Иллюстративные дополнительные лекарственные средства включают, но не ограничиваются ими, пептиды, олигопептиды, ретро-инверсо-олигопептиды, белки, аналоги белков, в которых по меньшей мере одна непептидная связь заменяет пептидную связь, апобелки, гликопротеины, ферменты, коферменты, ингибиторы ферментов, аминокислоты и их производные, рецепторы и другие мембранные белки, антигены и антитела к ним, гаптены и антитела к ним, гормоны, липиды, фосфолипиды, липосомы, токсины, антибиотики, обезболивающие средства, бронходилятаторы, бета-блокаторы, противомикробные средства, антигипертензивные средства, сердечно-сосудистые средства, включающие антиаритмические средства, сердечные гликозиды, антиангинальные средства, вазодилятаторы, средства для центральной нервной системы, включая стимуляторы, психотропные средства, средства против маний и деперессанты, противовирусные средства, антигистамины, лекарственные средства против злокачественной опухоли, включая химиотерапевтические средства, транквилизаторы, антидепрессанты, антагонисты H-2, противосудорожные препараты, средства против тошноты, простагландины и аналоги простагландинов, мышечные релаксанты, противовоспалительные вещества, стимуляторы, противоотечные средства, противорвотные средства, диуретики, спазмолитические средства, противоастматические средства, средства против болезни Паркинсона, отхаркивающие средства, подавляющие кашель средства, муколитические средства и минеральные и питательные добавки.

В другом иллюстративном аспекте дополнительное лекарственное средство может быть выбрано из соединения, способного стимулировать эндогенный иммунный ответ. Пригодные соединения включают, но не ограничиваются ими, цитокины или факторы роста иммунных клеток, такие как интерлейкины 1-18, фактор стволовых клеток, основной FGF, EGF, G-CSF, GM-CSF, лиганд FLK-2, HILDA, MTP-1α, TGF-α, TGF-β, M-CSF, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, растворимый CD23, LIF, и их сочетания.

Можно использовать терапевтически эффективные сочетания этих иммуностимулирующих факторов. В одном варианте осуществления совместно с конъюгатами для доставки лекарственного средства можно использовать, например, терапевтически эффективные количества IL-2, например, в количествах в диапазоне от приблизительно 0,1 ММЕ/м²/доза/сутки до приблизительно 15 ММЕ/м²/доза/сутки по схеме с несколькими дозами в сутки, и IFN-α, например, в количествах в диапазоне от приблизительно 0,1 ММЕ/м²/доза/сутки до приблизительно 7,5 ММЕ/м²/доза/сутки по схеме с несколькими дозами в сутки, для устранения, снижения или нейтрализации патогенных клеток в животном-хозяине, обладающем патогенными клетками (ММЕ = миллионов международных единиц; м² = приблизительная площадь поверхности тела среднего человека). В другом варианте осуществления IL-12 и IFN-α можно использовать в терапевтически эффективных количествах, описанных выше для интерлейкинов и интерферонов, и в другом варианте осуществления IL-15 и IFN-α можно использовать в терапевтически эффективных количествах, описанных выше для интерлейкинов и интерферонов. В альтернативном варианте осуществления IL-2, IFN-α или IFN-γ и GM-CSF можно использовать в сочетании в описанных выше терапевтически эффективных количествах. Также можно использовать любое другое эффективное сочетание цитокинов, включая сочетания других интерлейкинов и интерферонов и колониестимулирующих факторов.

Кроме того, дополнительное лекарственное средство может представлять собой любое лекарственное средство, известное в данной области, которое является цитотоксическим или цитостатическим, повышает проницаемость опухоли, ингибирует пролиферацию опухолевых клеток, запускает апоптоз, снижает антиапоптотическую активность в клетках-мишенях, которое применяют для лечения заболеваний, вызываемых инфекционными агентами, повышения эндогенного иммунного ответа, направленного против патогенных клеток, или является пригодным для лечения болезненного состояния, вызываемого любым типом патогенных клеток. Иллюстративные пригодные дополнительные лекарственные средства включают адренокортикоиды и кортикостероиды, алкилирующие средства, антиандрогены, антиэстрогены, андрогены, акламицин и производные акламицина, эстрогены, антиметаболиты, такие как цитозин-арабинозид, аналоги пуринов, аналоги пиримидинов и метотрексат, бисульфан, карбоплатин, хлорамбуцил, цисплатин и другие соединения платины, тамоксифен, таксол, паклитаксел, производные паклитаксела, Таксотер®, циклофосфамид, дауномицин, ризоксин, токсин T2, алкалоиды растений, преднизон, гидроксимочевину, тенипозид, митомицины, дискодермолиды, не относящиеся к алкалоидам барвинка ингибиторы микротрубочек, эпотилоны, тубулизин, циклопропил бенз[e]индолон, секо-циклопропил-бенз[e]индолон, O-Ac-секо-циклопропил бенз[e]индолон, блеомицин и любой другой антибиотик, азотистые иприты, нитрозомочевины, колхицин, производные колхицина, аллоколхицин, тиоколхицин, тритил-цистеин, халикондрин B, доластатины, такие как доластатин 10, аманитины, такие как α-аманитин, камптотецин, иринотекан и другие производные камптотецина, гелданамицин и производные гелданамицина, эстрамустин, нокодазол, MAP4, колцемид, виндезин, винбластин, винкристин, катарантин, виндолин, леурозин, винорелбин, имидокарб, сибутрамин, толтразурил, винбластиновую кислоту, майтанзины и их аналоги и производные, гемцитабин, воспалительные и провоспалительные средства, пептиды и пептидомиметики ингибиторов передачи сигнала, и другое известное в данной области лекарственное средство или токсин. Другие лекарственные средства, которые можно использовать в способах комбинированной терапии, включают пенициллины, цефалоспорины, ванкомицин, эритромицин, клиндамицин, рифампин, хлорамфеникол, аминогликозидные антибиотики, гентамицин, амфотерицин B, ацикловир, трифлуридин, ганцикловир, зидовудин, амантадин, рибавирин и любое другое известное в данной области противомикробное соединение. Также в способах комбинированной терапии можно использовать аналоги или производные любого из описанных выше дополнительных лекарственных средств.

В другом иллюстративном варианте осуществления предусмотрены фармацевтические композиции. Фармацевтические композиции содержат количество конъюгата для доставки лекарственного средства, эффективное для устранения популяции патогенных клеток в животном-хозяине при введении в виде одной или нескольких доз. Конъюгат для доставки лекарственного средства предпочтительно вводят животному-хозяину парентерально, например внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или интратекально. Альтернативно конъюгат для доставки лекарственного средства можно вводить животному-хозяину другим пригодным с медицинской точки зрения способом, таким как оральный способ, и можно использовать любую эффективную дозу и пригодную терапевтическую дозированную форму, включая дозированные формы с замедленным высвобождением. Иллюстративные наполнители, пригодные для оральных дозированных форм, включают, но не ограничиваются ими, кукурузный крахмал, желатин, лактозу, стеарат магния, бикарбонат натрия, производные целлюлозы и натрия крахмала гликолят.

Примеры парентеральных дозированных форм включают водные растворы активного вещества в изотоническом физиологическом растворе, 5% растворе глюкозы или других хорошо известных фармацевтически приемлемых жидких носителях, таких как жидкие спирты, гликоли, сложные эфиры и амиды. Парентеральная дозированная форма в соответствии с этим изобретением может находиться в форме подлежащего растворению лиофилизата, содержащего дозу конъюгата для доставки лекарственного средства. В одном аспекте данного варианта осуществления можно вводить любую из множества дозированных форм для замедленного высвобождения, известных в данной области, например, такую как биологически деградируемые углеводные матрицы, описанные в патентах США № 4713249; 5266333 и 5417982, описания которых включены в настоящее описание в качестве ссылок, или альтернативно можно использовать медленный дозатор (например, осмотический дозатор).

Дополнительное лекарственное средство в комбинированной терапии можно вводить животному-хозяину до, после или одновременно с конъюгатами для доставки лекарственного средства и дополнительное лекарственное средство можно вводить как часть единой композиции, содержащей конъюгат для доставки лекарственного средства, или как часть композиции, отличающейся от композиции конъюгата для доставки лекарственного средства. Можно использовать любую такую комбинированную терапию с эффективной дозой дополнительного лекарственного средства.

В другом иллюстративном аспекте можно использовать более одного типа конъюгата для доставки лекарственного средства. Например, животное-хозяина можно лечить с помощью протокола совместного дозирования конъюгатами с различными лигандами, такими как, например, конъюгаты фолат-алкалоид барвинка и витамин B12-алкалоид барвинка в сочетании и т.п. В другом иллюстративном варианте осуществления животное-хозяина можно лечить конъюгатами, содержащими более одного лиганда, например, как в случае нескольких молекул фолата или нескольких молекул витамина B12 в одном конъюгате или сочетаний лигандов в одном конъюгате, таких как соединение барвинка, конъюгированное как с лигандом в виде фолата, так и с лигандом в виде витамина B12. Более того, можно использовать конъюгаты для доставки лекарственного средства с различными типами соединений барвинка в отдельных конъюгатах для доставки лекарственного средства.

Однократная суточная дозировка конъюгата для доставки лекарственного средства может значительно варьировать в зависимости от состояния организма хозяина, подлежащего лечению болезненного состояния, молекулярной массы конъюгата, способа его введения и его распределения в тканях и возможности совместного применения других терапевтических способов лечения, таких как лучевая терапия или дополнительные лекарственные средства в комбинированных способах терапии. Эффективное количество, подлежащее введению животному-хозяину, основано на площади поверхности, массе и оценке врачом состояния пациента. Эффективные дозы могут варьировать, например, от приблизительно 1 нг/кг до приблизительно 1 мг/кг, от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 500 мкг/кг и от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 100 мкг/кг.

Можно использовать любую эффективную схему введения конъюгатов для доставки лекарственного средства. Например, конъюгаты для доставки лекарственного средства можно вводить в качестве однократных доз или их можно разделять и вводить по схеме с многократными дозами в сутки. Кроме того, можно использовать смещенную схему, например, от одних до трех суток в неделю в качестве альтернативы введению каждые сутки, и для целей определения этого изобретения такая прерывающаяся или смещенная суточная схема предусмотрена и ее рассматривают как эквивалентную введению каждые сутки. В одном иллюстративном варианте осуществления животное-хозяина лечат многократными инъекциями конъюгата для доставки лекарственного средства для устранения популяции патогенных клеток. В одном варианте осуществления хозяину проводят несколько инъекций (предпочтительно приблизительно от 2 вплоть до приблизительно 50 раз) конъюгата для доставки лекарственного средства, например, с интервалами 12-72 часов или с интервалами 48-72 часов. Дополнительные инъекции конъюгата для доставки лекарственного средства можно проводить животному-хозяину с интервалом, составляющим сутки или месяцы, после исходной инъекции(ий), и дополнительные инъекции могут предотвращать повторное возникновение болезненного состояния, вызываемого патогенными клетками.

В одном иллюстративном аспекте витамины или их аналоги или производные, которые можно использовать в конъюгатах для доставки лекарственного средства, включают витамины или их аналоги или производные, которые связываются с рецепторами, экспрессируемыми специфично на активированных макрофагах, такими как рецептор для фолата, который связывает фолат, или его аналог или производное. Связанные с фолатом конъюгаты, например, можно использовать для уничтожения или подавления активности активированных макрофагов, которые вызывают болезненные состояния в организме-хозяине. Такие нацеленные на макрофаги конъюгаты при введении животному-хозяину, страдающему опосредуемым активированными макрофагами болезненным состоянием, действуют посредством концентрирования и ассоциации конъюгированных соединений барвинка с популяцией активированных макрофагов, уничтожая активированные макрофаги или подавляя функции макрофагов. Устранение, снижение или дезактивация популяции активированных макрофагов действует посредством остановки или снижения характерных признаков опосредуемого активированными макрофагами патогенеза болезненного состояния, подлежащего лечению. Иллюстративные примеры заболеваний, известных как опосредуемые активированными макрофагами, включают ревматоидный артрит, язвенный колит, болезнь Крона, псориаз, остеомиелит, рассеянный склероз, атеросклероз, фиброз легких, саркоидоз, системную склеродермию, отторжение трансплантата органа (РТПХ) и хроническое воспаление. Введение конъюгата для доставки лекарственного средства, как правило, продолжают до тех пор, пока не произойдет снижение или устранение симптомов болезненного состояния.

Конъюгаты для доставки лекарственного средства, вводимые для уничтожения активированных макрофагов или подавления функции активированных макрофагов, также можно вводить животному-хозяину парентерально, например внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно или внутривенно, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Альтернативно конъюгаты для доставки лекарственного средства можно вводить животному-хозяину другими пригодными с медицинской точки зрения способами и эффективные дозы можно вводить в стандартных дозированных формах или дозированных формах с замедленным высвобождением. Терапевтический способ можно использовать отдельно или в сочетании с другими терапевтическими способами, известными для лечения болезненных состояний, опосредуемых активированными макрофагами.

Представленные ниже иллюстративные варианты осуществления не предназначены для ограничения, и их не следует толковать как ограничивающие. Например, в каждом соединении, представленном в настоящем описании, стереохимия аминокислот, используемых для образования ликера, может быть необязательно выбрана из природной L-конфигурации или неприродной D-конфигурации. Каждый пример был охарактеризован посредством ЯМР, МС и/или УФ-спектроскопии и/или ВЭЖХ, как указано; выбранные характерные сигналы указаны соответствующим образом.

ПРИМЕРЫ СПОСОБОВ

ПРИМЕР СПОСОБА 1. Ингибирование роста опухоли у мышей. Противоопухолевую активность соединений, описанных в настоящем описании, при введении внутривенно (i.v.) имеющим опухоль животным оценивали у мышей Balb/c, имеющих подкожные опухоли M 109. Приблизительно через 11 суток после инокуляции опухоли в подкожный слой правой подмышечной впадины посредством 1×10⁶ клеток M109 (средний объем опухоли при t_o=60 мм³) мышам (5/группа) проводили внутривенные инъекции три раза в неделю (TIW) в течение 3 недель посредством 1500 нмоль/кг конъюгата для доставки лекарственного средства или эквивалентного объема дозы PBS (контроль). Рост опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с интервалами 2 суток или 3 суток в каждой группе по введению. Объемы опухолей вычисляли с использованием выражения V = a×b²/2, где "a" представляет собой длину опухоли и "b" представляет собой ширину, выраженную в миллиметрах.

ПРИМЕР СПОСОБА 2. Ингибирование роста опухоли у мышей. Противоопухолевую активность соединений, описанных в настоящем описании, при введении внутривенно (i.v.) имеющим опухоль животным оценивали у мышей nu/nu, имеющих подкожные опухоли KB. Приблизительно через 8 суток после инокуляции опухоли в подкожный слой правой подмышечной впадины посредством 1×10⁶ клеток KB (средний объем опухоли при t_o = 50-100 мм³) мышам (5/группа) проводили внутривенные инъекции три раза в неделю (TIW) в течение 3 недель посредством 5 мкмоль/кг конъюгата для доставки лекарственного средства или эквивалентного объема дозы PBS (контроль). Рост опухоли измеряли с использованием штангенциркуля с интервалами 2 суток или 3 суток в каждой группе по введению. Объемы опухолей вычисляли с использованием выражения V = a×b²/2, где "a" представляет собой длину опухоли и "b" представляет собой ширину, выраженную в миллиметрах.

ПРИМЕР СПОСОБА 3. Ингибирование клеточного синтеза ДНК.

Соединения, описанные в настоящем описании, оценивали с использованием анализа цитотоксичности in vitro, который предсказывает способность лекарственного средства ингибировать рост положительных в отношении рецептора для фолата клеток KB. Соединения состояли из фолата, связанного с соответствующим химиотерапевтическим лекарственным средством, как получали в соответствии с протоколами, описанными в настоящем описании. Клетки KB подвергали воздействию указанных концентраций конъюгата фолат-лекарственное средство в течение вплоть до 7 ч при 37°C в отсутствие или в присутствии по меньшей мере 100-кратного избытка фолиевой кислоты. Затем клетки промывали один раз свежей культуральной средой и инкубировали в свежей культуральной среде в течение 72 часов при 37°C. Жизнеспособность клеток оценивали с использованием анализа включения ³H-тимидина.

Как представлено в настоящем описании на фигурах, зависимая от дозы цитотоксичность была измеримой, и в большинстве случаев значения IC₅₀ (концентрации конъюгата лекарственного средства, требуемой для снижения включения ³H-тимидина во вновь синтезируемую ДНК, на 50%) находились в низком наномолярном диапазоне. Более того, цитотоксичность этих конъюгатов была снижена в присутствии избытка фолиевой кислоты, указывая на то, что наблюдаемое уничтожение клеток было опосредовано рецептором для фолата.

ПРИМЕР СПОСОБА 4. Анализ относительного связывания. Аффинность рецепторов для фолата (FR) в отношении фолата определяли в соответствии с описанным ранее способом (Westerhof G.R., J.H. Schornagel et al. (1995) Mol. Pharm. 48: 459-471) с небольшой модификацией. В кратком изложении, FR-положительные клетки KB плотно высевали в 24-луночные планшеты для культивирования клеток и позволяли прикрепляться к пластмассе в течение 18 ч. Использованную среду для инкубации заменяли в исследуемых лунках не содержащей фолата RPMI (FFRPMI), дополненной 100 нМ ³H-фолиевой кислотой в отсутствие и присутствии возрастающих концентраций тестируемого образца или фолиевой кислоты. Клетки инкубировали в течение 60 мин при 37°C, а затем промывали 3 раза посредством PBS, pH 7,4. В каждую лунку добавляли пятьсот микролитров 1% SDS в PBS, pH 7,4. Затем клеточные лизаты собирали и добавляли в отдельные флаконы, содержащие 5 мл сцинтилляционной смеси, а затем подсчитывали радиоактивность. Пробирки с отрицательным контролем содержали только ³H-фолиевую кислоту в FFRPMI (без конкурента). Пробирки с положительным контролем содержали конечную концентрацию фолиевой кислоты 1 мМ, и из всех образцов вычитали CPM, измеренные в этих образцах (соответствующие неспецифичному связыванию метки). Следует отметить, что относительную аффинность определяли как обратное молярное соотношение для соединения, требуемого для вытеснения 50% ³H-фолиевой кислоты, связанной с FR на клетках KB, и относительной аффинности фолиевой кислоты для FR было присвоено значение 1.

СПОСОБ ПРИМЕРА 5. Анализ объема опухоли 4T-1. От шести до семи мышей в возрасте одной недели (самки линии Balb/c) получали от Harlan, Inc., Indianapolis, IN. Мышей содержали на не содержащем фолата корме Harlan всего в течение трех недель до начала и в ходе этого эксперимента. Отрицательные в отношении рецептора для фолата опухолевые клетки 4T-1 (1×10⁶ клеток на животного) инокулировали в подкожный слой правой подмышечной области. Приблизительно через 5 суток после инокуляции опухоли, когда средний объем опухоли 4T-1 составлял ~100 мм³, мышам (5/группа) проводили внутривенную инъекцию три раза в неделю (TIW), в течение 3 недель, 3 мкмоль/кг конъюгата для доставки лекарственного средства или эквивалентного объема дозы PBS (контроль). Рост опухоли определяли с использованием штангенциркуля с интервалами 2 суток или 3 суток в каждой группе по введению. Объемы опухолей вычисляли с использованием выражения V = a×b²/2, где "a" представляет собой длину опухоли и "b" представляет собой ширину, выраженную в миллиметрах.

ПРИМЕР СПОСОБА 6. Определение массы. Процентное изменение массы мышей определяли у мышей (5 мышей/группа) на указанные сутки после инокуляции опухоли (PTI), как представлено на графике для образцов, описанных в связанном с этим способом анализе объема опухоли.

ПРИМЕР СПОСОБА 7. Общий способ получения линкеров фолат-пептиды. Линкеры, описанные в настоящем описании, которые включают пептид, получают с помощью последовательного подхода с полимерной основой с использованием стандартных способов, таких как стратегия Fmoc на чувствительной к кислоте смоле Fmoc-AA-Wang. В качестве иллюстративного примера фолатсодержащий пептидильный фрагмент Pte-Glu-(AA)_n-NH(CHR₂)CO₂H (3) получают способом, представленным на схеме 1, из смолы Wang с прикрепленными аминокислотами и защищенным Fmoc синтезом аминокислот.

Схема 1

(a) 20% пиперидин/DMF; (b) Fmoc-AA-OH, PyBop, DIPEA, DMF; (c) Fmoc-Glu-O-t-Bu или Fmoc-Glu(γ-O-t-Bu)-OH, PyBop, DIPEA, DMF; (d) N¹⁰(TFA)-Pte-OH; PyBop, DIPEA, DMSO; (e) TFAA, (CH₂SH)₂, i-Pr₃SiH; (f) NH₄OH, pH 9-10.

В этом иллюстративном варианте осуществления процесса, описанного в настоящем описании, R₁ представляет собой Fmoc, R₂ представляет собой требуемую пригодным образом защищенную боковую цепь аминокислоты, Wang представляет собой 2-хлортритил-смолу и DIPEA представляет собой диизопропилэтиламин. Используют стандартные способы присоединения, такие как PyBOP и другие способы, описанные в настоящем описании или известные в данной области, где средство для присоединения, в качестве иллюстративного примера, применяют в качестве активирующего реагента для обеспечения эффективного присоединения. Защитные группы Fmoc удаляют после каждой стадии присоединения в стандартных условиях, таких как обработка пиперидином, фторидом тетрабутиламмония (TBAF) и т.п. Используют соответствующим образом защищенные аминокислотные структурные элементы, такие как Fmoc-Glu-OtBu, N¹⁰-TFA-Pte-OH и т.п., как описано в схеме 1 и представлено на стадии (b) как Fmoc-AA-OH. Таким образом, AA относится к любому исходному веществу на основе аминокислот, которое является соответствующим образом защищенным. Следует понимать, что под термином "аминокислота", как используют в настоящем описании, подразумевают любой реагент, имеющий функциональную группу как амина, так и карбоновой кислоты, разделенные одним или несколькими атомами углерода, и он включает встречающиеся в природе альфа- и бета-аминокислоты, а также аминокислотные производные и аналоги этих аминокислот. В частности, аминокислоты, имеющие защищенные боковые цепи, такие как защищенный серин, треонин, цистеин, аспартат и т.п., также можно использовать в синтезе фолат-пептида, описанном в настоящем описании. Кроме того, также в синтез фолат-пептида, описанный в настоящем описании, можно также включать в качестве исходных веществ гамма-, дельта- или более длинные гомологичные аминокислоты. Кроме того, аналоги аминокислот, имеющие гомологичные боковые цепи или чередующиеся ветвящиеся структуры, такие как норлейцин, изовалин, β-метилтреонин, β-метилцистеин, β,β-диметилцистеин и т.п., также могут быть включены в качестве исходных веществ в синтез фолат-пептида, описанный в настоящем описании.

Последовательность присоединения (стадии (a) и (b)), включающую Fmoc-защищенные аминокислоты (AA) формулы Fmoc-AA-OH, проводят "n" раз для получения пептида на твердой подложке (2), где n представляет собой целое число и может составлять от 0 до приблизительно 100. После последней стадии присоединения остающуюся группу Fmoc удаляют (стадия (a)) и пептид последовательно присоединяют к производному глутамата (стадия (c)), удаляют защитную группу и присоединяют к TFA-защищенной птероевой кислоте (стадия (d)). Затем пептид отщепляют от полимерной подложки посредством обработки трифторуксусной кислотой, этандитиолом и триизопропилсиланом (стадия (e)). Эти условия реакции приводят к одновременному удалению защитных групп t-Bu, t-Boc и Trt, которые могут образовывать часть соответствующим образом защищенных боковых цепей аминокислот. Защитную группу TFA удаляют посредством обработки основанием (стадия (f)) с получением содержащего фолат пептидильного фрагмента (3).

ПРИМЕРЫ СОЕДИНЕНИЙ

ПРИМЕР 1

В соответствии с общим способом примера способа 7 (схема 1) связанный со смолой Wang 4-метокситритил (MTT)-защищенный CyS-NH₂ подвергали реакции в соответствии со следующей последовательностью: 1) a. Fmoc-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 2) a. Fmoc-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 3) a. Fmoc-Arg(Pbf)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 4) a. Fmoc-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 5) a. Fmoc-Glu-OtBu, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 6) N¹⁰-TFA-птероевая кислота, PyBOP, DIPEA. Защитные группы MTT, tBu и Pbf удаляли посредством TFA/H₂O/TIPS/EDT (92,5:2,5:2,5:2,5) и защитную группу TFA удаляли посредством водного раствора NH₄OH при pH 9,3. Выбранные данные ¹H-ЯМР (D₂O) δ (м.д.) 8,68 (с, 1H, FA H-7), 7,57 (д, 2H, J=8,4 Гц, FA H-12 и 16), 6,67 (д, 2H, J=9 Гц, FA H-13 и 15), 4,40-4,75 (м, 5H), 4,35 (м, 2H), 4,16 (м, 1H), 3,02 (м, 2H), 2,55-2,95 (м, 8H), 2,42 (м, 2H), 2,00-2,30 (м, 2H), 1,55-1,90 (м, 2H), 1,48 (м, 2H); МС (ESI, m+H⁺) 1046.

ПРИМЕР 2

В соответствии с общим способом примера способа 7 (схема 1) связанный со смолой Wang 4-метокситритил (MTT)-защищенный CyS-NH₂ подвергали реакции в соответствии со следующей последовательностью: 1) a. Fmoc-β-аминоаланин(NH-MTT)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 2) a. Fmoc-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 3) a. Fmoc-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 4) a. Fmoc-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 5) a. Fmoc-Glu-OtBu, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 6) N¹⁰-TFA-птероевая кислота, PyBOP, DIPEA. Защитные группы MTT, tBu и TFA удаляли посредством a. 2% гидразин/DMF; b. TFA/H₂O/TIPS/EDT (92,5:2,5:2,5:2,5).

Для получения использовали реагенты, представленные в приведенной ниже таблице:

Реагент (Ммоль) Эквиваленты Количество H-Cys(4-метокситритил)-2- хлортритил-смола (дозировка 0,56 ммоль/г) 0,56 1 1,0 г Fmoc-β-аминоаланин(NH-MTT)-OH 1,12 2 0,653 г Fmoc-Asp(OtBu)-OH 1,12 2 0,461 г Fmoc-Asp(OtBu)-OH 1,12 2 0,461 г Fmoc-Asp(OtBu)-OH 1,12 2 0,461 г Fmoc-Glu-OtBu 1,12 2 0,477 г N¹⁰TFA-птероевая кислота (растворенная в 10 мл ДМСО) 0,70 1,25 0,286 г DIPEA 2,24 4 0,390 мл PyBOP 1,12 2 0,583 г

Стадию присоединения проводили следующим образом: в емкость для пептидного синтеза добавляют смолу, добавляют раствор аминокислоты, DIPEA и PyBOP. В течение 1 ч барботируют аргоном и промывают 3X посредством DMF и IPA. Перед присоединением каждой аминокислоты для удаления защитной группы Fmoc используют 20% пиперидин в DMF 3X (10 мин). Продолжают до завершения всех 6 стадий присоединения. В конце смолу промывают 2% гидразином в DMF 3X (5 мин) для отщепления защитной группы TFA на птероевой кислоте.

Пептидный аналог отщепляют от смолы с использованием следующего реагента: 92,5% (50 мл) TFA, 2,5% (1,34 мл) H₂O, 2,5% (1,34 мл) триизопропилсилан, 2,5% (1,34 мл) этандитиол, стадию отщепления проводят следующим образом: добавляют 25 мл реагента для отщепления и барботируют в течение 1,5 ч, высушивают и промывают 3X посредством оставшегося реагента. Выпаривают до приблизительно 5 мл и осаждают в этиловом эфире. Центрифугируют и высушивают. Очистку проводят следующим образом: Column-Waters NovaPak C18 300×19 мм; буфер A = 10 мМ ацетат аммония, pH 5; B=CAN; от 1%B до 20%B в течение 40 минут при 15 мл/мин, с получением 350 мг (64%); ВЭЖХ - RT 10,307 мин, 100% чистота, спектр ¹H-ЯМР согласуется с указанной структурой, и MS (ES-): 1624,8, 1463,2, 1462,3, 977,1, 976,2, 975,1, 974,1, 486,8, 477,8.

ПРИМЕР 3

В соответствии с общим способом примера способа 7 (схема 1) связанный со смолой Wang 4-метокситритил (MTT)-защищенный CyS-NH₂ подвергали реакции в соответствии со следующей последовательностью: 1) a. Fmoc-1β-аминоаланин(NH-IvDde)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 2) a. Fmoc-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 3) a. Fmoc-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 4) a. Fmoc-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 5) a. Fmoc-Glu-OtBu, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 6) N¹⁰-TFA-птероевая кислота, PyBOP, DIPEA. Защитные группы MTT, tBu и TFA удаляли посредством a. 2% гидразин/DMF; b. TFA/H₂O/TIPS/EDT (92,5:2,5:2,5:2,5).

Для получения использовали реагенты, представленные в приведенной ниже таблице:

Реагент (Ммоль) Эквиваленты Количество H-Cys(4-метокситритил)-2- хлортритил-смола (дозировка 0,56 ммоль/г) 0,56 1 1,0 г Fmoc-β-аминоаланин(NH-IvDde)-OH 1,12 2 0,596 г Fmoc-Asp(OtBu)-OH 1,12 2 0,461 г Fmoc-Asp(OtBu)-OH 1,12 2 0,461 г Fmoc-Asp(OtBu)-OH 1,12 2 0,461 г Fmoc-Glu-OtBu 1,12 2 0,477 г N¹⁰TFA-птероевая кислота (растворенная в 10 мл ДМСО) 0,70 1,25 0,286 г Fm-Тиопропионовая кислота 0,70 1,25 199,08 DIPEA 2,24 4 0,390 мл PyBOP 1,12 2 0,583 г

Стадию присоединения проводили следующим образом: в емкость для пептидного синтеза добавляют смолу, добавляют раствор аминокислоты в DMF, DIPEA и PyBOP. В течение 1 ч барботируют аргоном и промывают 3X10 мл посредством DMF и IPA. Перед присоединением каждой аминокислоты для удаления защитной группы Fmoc используют 20% пиперидин в DMF, 3X10 мл (10 мин). Продолжают до завершения 6 стадий присоединения. В конце смолу промывают 2% гидразином в DMF 3X10 мл (5 мин) для отщепления защитной группы TFA на птероевой кислоте и защитной группы IvDde на β-аминоаланине. В завершение, к свободному амину β-аминоаланина присоединяют Fmoc-тиопропионовую кислоту в DMF с использованием DIPEA и PyBop. Барботируют аргоном в течение 1 ч и промывают 3X10 мл посредством DMF и IPA. Сушат смолу в атмосфере аргона в течение 30 мин.

Отщепляют пептидный аналог от смолы с использованием следующего реагента, 92,5% (50 мл) TFA, 2,5% (1,34 мл) H₂O, 2,5% (1,34 мл) триизопропилсилан, 2,5% (1,34 мл) этандитиол, стадию отщепления проводят следующим образом: добавляют 25 мл реагента для отщепления и барботируют в течение 1,5 ч, сушат и промывают 3X оставшимся реагентом. Выпаривают до приблизительно 5 мл и осаждают в этиловом эфире. Центрифугируют и сушат. Очистку проводили следующим образом: Column-Waters NovaPak C₁₈ 300×19 мм; буфер A = 10 мМ ацетат аммония, pH 5; B= CAN; от 1%B до 20%B в течение 40 минут при 15 мл/мин, с получением 450 мг (65%); спектр ¹H-ЯМР согласуется с указанной структурой.

ПРИМЕР 4

В соответствии с общим способом примера способа 7 (схема 1) связанный со смолой Wang (MTT)-защищенный CyS-NH₂ подвергали реакции в соответствии со следующей последовательностью: 1) a. Fmoc-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 2) a. Fmoc-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 3) a. Fmoc-Arg(Pbf)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 4) a. Fmoc-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 5) a. Fmoc-Glu(γ-OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 6) N¹⁰-TFA-птероевая кислота, PyBOP, DIPEA. Защитные группы MTT, tBu и Pbf удаляли посредством TFA/H₂O/TIPS/EDT (92,5:2,5:2,5:2,5) и защитную группу TFA удаляли посредством водного раствора NH₄OH при pH 9,3. Спектр ¹H-ЯМР соответствовал указанной структуре.

ПРИМЕР 5

В соответствии с общим способом примера способа 7 (Схема 1) связанный со смолой Wang MTT-защищенный D-CyS-NH₂ подвергали реакции в соответствии со следующей последовательностью: 1) a. Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 2) a. Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 3) a. Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 4) a. Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 5) a. Fmoc-D-Glu-OtBu, PyBOP, DIPEA; b. 20% пиперидин/DMF; 6) N¹⁰-TFA-птероевая кислота, PyBOP, DIPEA. Защитные группы MTT, tBu и Pbf удаляли посредством TFA/H₂O/TIPS/EDT (92,5:2,5:2,5:2,5) и защитную группу TFA удаляли посредством водного раствора NH₄OH при pH 9,3. Спектр ¹H-ЯМР соответствовал указанной структуре.

ПРИМЕР 6

К раствору гидразида дезацетилвинбластина (668 мг) в 5 мл DCM последовательно добавляли 2-[(бензотриазол-1-ил)-(оксикарбонилокси)этилдисульфанил]пиридин HCl (601 мг) и 378 мкл DIPEA при 0°C. Реакционной смеси позволяли нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 часов. TLC (15% MeOH в DCM) показал полное превращение. Смесь очищали посредством хроматографии на силикагеле (1:9 MeOH/DCM). Объединенные фракции выпаривали, повторно растворяли в DCM и промывали посредством 10% Na₂CO₃, солевого раствора, сушили (MgSO₄) и выпаривали до 550 мг (80%); ВЭЖХ - RT 12,651 мин, 91% чистота, спектр ¹H-ЯМР соответствует указанной структуре, и МС (ESI+): 984,3, 983,3, 982,4, 492,4, 491,9, 141,8. Дополнительное подробное описание этого процесса описано в публикации патентной заявки США № US 2005/0002942 A1, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

ПРИМЕР 7

Митомицин C-этилдисульфидпропионовую кислоту получали в соответствии со следующей схемой

(a) диизопропилэтиламин (DIPEA), MeOH.

К раствору аминоэтилдисульфидпропионовой кислоты (81 мг, 0,372 ммоль) в 2 мл метанола (MeOH) добавляли DIPEA (0,13 мл, 0,746 ммоль). К этому раствору медленно добавляли митомицин-A (100 мг, 0,286 ммоль) в MeOH (3,0 мл). Полученному раствору позволяли перемешаться в течение 3 ч. Анализ TLC (20% MeOH в CHCl₃) показал, что реакция завершилась. Растворитель удаляли при пониженном давлении и осадок очищали с использованием колонки с диоксидом кремния. Градиентное элюирование (от 10% до 20% MeOH в CHCl₃/0,5% TEA) привело к очищенным фракциям продукта (110 мг, 77%). Выбранные сигналы ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ (м.д.) 3,50 (д, 1H), 3,56 (дд, 1H), 3,90 (т, 2H), 4,15 (д, 1H), 4,25 (т, 1H), 4,68 (дд, 1H).

ПРИМЕР 8

Получали в соответствии с процессом примера 7.

ПРИМЕР 9

Во флаконе для центрифугирования из полипропилена в 5 мл воды растворяли вещество примера 2 (82 мг, 0,084 ммоль) и барботировали аргоном в течение 10 мин. В другом флаконе барботировали аргоном 0,1 Н раствор NaHCO₃ в течение 10 мин. pH раствора линкера доводили приблизительно до 6,9 с использованием 0,1 Н раствора NaHCO₃. К указанному выше раствору медленно добавляли производное гидразида винбластина (вещество примера 6, 91 мг, 0,092 мМ) в 5 мл тетрагидрофурана (THF). Полученный прозрачный раствор перемешивали в атмосфере аргона в течение от 15 мин до 1 ч. Мониторинг хода реакции проводили посредством аналитической ВЭЖХ (10 мМ ацетат аммония, pH 7,0 и ацетонитрил). THF выпаривали и водный раствор фильтровали и инъецировали в колонку для препаративной ВЭЖХ (XTerra Column, 19×300 мМ). Элюирование посредством 1 мМ фосфата натрия, pH 7,0, и ацетонитрила приводило к очищенным фракциям, содержащим продукт, который выделяли после лиофилизации в течение 48 ч (78 мг, 50%); C₈₃H₁₀₃N₁₉O₂₆S₂; точная масса: 1845,68; ММ: 1846,95; ВЭЖХ - RT 15,113 мин, 100% чистота, спектр ¹H-ЯМР соответствовал указанной структуре, и МС (ES-): 1846,6, 1845,5, 933,3, 924,2, 923,3, 922,5, 615,6, 614,7, 525,0.

На ФИГ. 1A и 1B представлена относительная аффинность связывания для фолата относительно вещества примера 9 и эффекты вещества примера 9 на включение ³H-тимидина, IC₅₀ конъюгата (58 нМ) и что фолат конкурирует с конъюгатом за связывание с рецептором для фолата, показывая специфичность связывания конъюгата. Анализы проводили в соответствии с примерами способов 4 и 3 соответственно.

На ФИГ. 1B представлена активность вещества примера 9 в отношении включения ³H-тимидина в клетках KB с избытком фолиевой кислоты (○) и без него (●); IC₅₀ примера 9 составляет приблизительно 58 нМ.

ПРИМЕР 10

Во флаконе для центрифугирования из полипропилена в 7,5 мл воды растворяли вещество примера 3 (56 мг) и барботировали аргоном в течение 10 мин. В другом флаконе 0,1 Н раствор NaHCO₃ барботировали аргоном в течение 10 мин. pH раствора вещества примера 3 доводили до 6,9 с использованием 0,1 Н раствора NaHCO₃. К раствору вещества примера 3 медленно добавляли вещество примера 6 (44 мг) в 7,5 мл тетрагидрофурана (THF). Полученный прозрачный раствор перемешивали в атмосфере аргона в течение от 15 мин до 1 ч. Мониторинг хода реакции проводили посредством аналитической ВЭЖХ (10 мМ ацетат аммония, pH 7,0 и ацетонитрил). THF выпаривали и водный раствор фильтровали и очищали посредством препаративной ВЭЖХ. Элюирование посредством 1 мМ фосфата натрия, pH 7,0, и ацетонитрила привело к очищенным фракциями которые объединяли, выпаривали при температуре окружающей среды, и полученный водный раствор доводили до pH 4,0 с использованием 0,1 Н HCl. Вещество примера 10 выделяли после лиофилизации в течение 48 ч (61 мг, 64%). Спектр ¹H-ЯМР и данные LCMS соответствовали указанной структуре.

ПРИМЕР 11

Способ A. Вещество примера 11 получали в соответствии со следующим процессом:

(a) представляет собой DCC, DIPEA, THF; и (b) представляет собой смесь вода/THF при pH 8,5.

Митомицин C-этилдисульфидпропионовую кислоту (34,4 мг, 0,069 ммоль) растворяли в сухом THF (1 мл) в атмосфере аргона. Добавляли N-гидроксисукцинамид (7,9 мг, 0,069 ммоль), а затем дициклогексилкарбодиимид (14,2 мг, 0,069 ммоль). Добавляли диизопропилэтиламин (0,024 мл, 0,138 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение 3 ч. Во флаконе для центрифугирования из полипропилена в 3 мл воды растворяли винбластин-фолат (пример 9,26 мг, 0,014 ммоль). pH раствора медленно доводили до 8,5 с использованием 0,1 Н NaHCO₃. К раствору фолата добавляли активированное производное митомицина C, полученное, как описано в настоящем описании, в качестве раствора в 3 мл THF. Полученный раствор перемешивали в атмосфере аргона в течение от 15 мин до 1 ч, где мониторинг хода реакции проводили посредством аналитической ВЭЖХ (10 мМ ацетат аммония и ацетонитрил, pH 7,0). THF удаляли при пониженном давлении и водный раствор фильтровали и инъецировали в колонку для препаративной ВЭЖХ (X-terra Column, 19×300 мм). Элюирование посредством 1 мМ фосфата натрия (pH 7,0) и ацетонитрила приводило к очищенным фракциям, которые выпаривали и лиофилизировали в течение 48 ч с получением 12 мг (50% исходя из выделенного исходного вещества). Данные ¹H-ЯМР и масс-спектрометрии подтвердили указанную структуру, как представлено на ФИГ. 9 и 10 соответственно. C₁₀₃H₁₂₇N₂₃O₃₂S₄; Точная масса 2325,79; ММ 2327,51. ВЭЖХ - RT 20,054 мин, 99% чистота, спектр ¹H-ЯМР соответствует указанной структуре, и МС (ES+): 1552,5, 116,0, 1165,3, 1164,3, 1148,4, 744,9, 746,4, 745,6.

Способ B: Безводный DMF (4,5 мл) впрыскивали в смесь вещества примера 10 (103 мг, 48,7 мкмоль) и вещества примера 8 (NO₂-PySSCH₂CH₂-MMC, 33,4 мг, 1,25 экв.) при комнатной температуре в атмосфере аргона. В полученный раствор последовательно впрыскивали DIPEA (84,9 мкл, 10 экв.) и DBU (72,9 мкл, 10 экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение 20 минут, затем переносили в перемешиваемый диэтиловый эфир (50 мл). Полученную суспензию центрифугировали, осадок промывали диэтиловым эфиром (15 мл×2), затем растворяли в фосфатном буфере (9 мл, 1,25 мМ, pH 6,8) и подвергали препаративной ВЭЖХ (Колонка: Waters XTerra RP18, 7 мкм, 19×300 мм; подвижные фазы: A = 1,25 мМ фосфатный буфер, pH 6,8, B = ацетонитрил; Способ: от 10%B до 40%B в течение 25 мин при 25 мл/мин). Фракции через 11,72-13,88 минут собирали и лиофилизировали с получением 105,8 мг вещества, содержащего 99,2 мг и 6,6 мг фосфатных солей.

Способ C. Вещество примера 11 получали в соответствии со следующим процессом с выходом 34%:

(a) NHS, DCC-Смола, DIPEA, THF; (b) Пример 7, DIPEA, DMSO.

На ФИГ. 2 представлена относительная аффинность связывания для фолиевой кислоты (●, 1,0) относительно вещества примера 11 (■, 0,21). Данные на ФИГ. 2 показывают, что конъюгат обладает высоким относительным связыванием с рецептором для фолата. Анализ проводили в соответствии с примером способа 4.

На ФИГ. 1B и 3 представлены эффекты веществ примеров 9 (имеющее одно лекарственное средство) и 11 (имеющее два лекарственных средства) соответственно на включение ³H-тимидина, IC₅₀ конъюгатов вещества примера 9 (58 нМ) и вещества примера 11 (5 нМ). Данные на ФИГ. 1B и 3 также показывают, что фолиевая кислота конкурирует с конъюгатами за связывание с рецептором для фолата, демонстрируя специфичность связывания конъюгата. Анализ проводили в соответствии с примером способа 3. Кроме того, вещество примера 11, имеющее два лекарственных средства, показало эффективность, более чем в 10 раз превышающую эффективность в отношении рецептора для фолата, чем вещество примера 9, имеющее только одно лекарственное средство.

На ФИГ. 4 представлена цитотоксическая активность in vitro вещества примера 11 (a) на три различные опухолевые клеточные линии (KB, 4T-1cl2 и ID8-cl15). Кроме того, на ФИГ. 4 показано, что цитотоксическая активность вещества примера 11 снижается в присутствии избытка фолиевой кислоты (b), указывая на то, что вещество примера 11 действует на рецептор для фолата.

На ФИГ. 5A и 5B представлена активность вещества примера 11 в двух различных дозах (1 мкмоль/кг и 2 мкмоль/кг) в отношении опухолей рака легкого M109 у мышей Balb/c и массы мышей Balb/c (Balb/c использовали для анализа объема опухоли M109). Анализы проводили в соответствии с примерами способов 1 и 6 соответственно. Вещество примера 11 ингибировало рост солидных опухолей, но оказывало небольшой эффект на массу мышей в обеих дозах. Кроме того, более высокая доза (2 мкмоль/кг) показала сильное ингибирование роста опухоли даже после завершения дозирования на 20 сутки. Вертикальная линия соответствует последним суткам дозирования (20 сутки). Тестировали пять животных, и при более высокой дозе, составляющей 2 мкмоль/кг, у всех пяти мышей был выявлен полный ответ.

На ФИГ. 6 представлена активность вещества примера 11 в дозе 1 мкмоль/кг TIW в течение 2 недель в отношении FR-положительных опухолей KB с 40 мкмоль/кг EC20 (комплекс рения) (b) и без него (c) по сравнению с контролями (a). Вертикальной пунктирной линией указаны последние сутки дозирования. На фигурах показано, что вещество примера 11 ингибирует рост солидных опухолей и что ингибиторный эффект предотвращается (происходит конкуренция) посредством комплекса рения EC20. Кроме того, на фигурах показано, что введение вещества примера 11 не оказывает значительного влияния на массу тестируемого животного по сравнению с контролями. EC20 (комплекс рения) представляет собой соединение формулы

хелатированное с рением. Получение EC20 описано в публикации патентной заявки США № US 2004/0033195 A1, описание процесса синтеза которой включено в настоящее описание в качестве ссылки. Анализ проводили в соответствии с примером способа 2. EC20 действует в качестве конкурента вещества примера 11 на рецепторы для фолата, и результаты показывают специфичность эффектов вещества примера 11.

На ФИГ. 8 представлена активность вещества примера 11 в дозе 1 мкмоль/кг TIW в отношении положительных по рецептору для фолата подкожно имплантированных ксенотрансплантированных опухолей KB с добавлением 40 мкмоль/кг EC20 (комплекс рения) (b) и без него (c) у мышей nude. Данные на ФИГ. 8 показывают, что вещество примера 11 ингибирует рост солидных опухолей и что ингибиторный эффект предотвращается посредством комплекса рения EC20 (происходит конкуренция с ним), (b) относительно (c). Кроме того, данные на ФИГ. 8 показывают, что введение вещества примера 11 не оказывает значительного влияния на массу тестируемых в модели на животных мышей nude по сравнению с контролями (a).

На ФИГ. 10 представлена активность вещества примера 11 в дозе 2 мкмоль/кг TIW (e) в отношении положительных по рецептору для фолата опухолей человека у мышей nude по сравнению со смесью неконъюгированных основных лекарственных средств, митомицина C и дезацетилвинбластина моногидразида в дозе 0,5 мкмоль/кг TIW (b), 1 мкмоль/кг TIW (c) и 2 мкмоль/кг TIW (d) по сравнению с необработанными контролями (a). Данные на ФИГ. 10 показывают, что вещество примера 11 ингибирует рост солидных опухолей, и оно привело к полному ответу у пяти из пяти тестированных животных. Напротив, введение смеси основных лекарственных средств в дозе 0,5 мкмоль/кг TIW (b) или в дозе 1 мкмоль/кг TIW (c) не показало полного ответа ни у одного из пяти тестированных животных. Введение смесей основных лекарственных средств с высокими дозами в дозе 2 мкмоль/кг TIW (d) прекратили до 20 суток вследствие выявленной токсичности, как представлено на ФИГ. 11, показывающей эффект основных лекарственных средств и вещества примера 11 на массу тестированного животного.

На ФИГ. 11 представлено, что вещество примера 11 (e) не оказывает значительного влияния на массу тестируемых животных в ходе введения по сравнению с контролями (a). В противоположность веществу примера 11, данные на ФИГ. 11 показывают, что пролонгированное введение более низких доз смеси неконъюгированных основных лекарственных средств, митомицина C и дезацетилвинбластина моногидразида (0,5 мкмоль/кг TIW (b) и 1 мкмоль/кг TIW (c)) приводило к значительному снижению массы тестируемых животных по сравнению с контролями (a). Кроме того, смеси неконъюгированных основных лекарственных средств с высокими дозами (2 мкмоль/кг TIW (d)) вызывали наибольшее снижение массы, что привело к прекращению теста.

Соединения, описанные в настоящем описании, могут быть пригодными для лечения крупных или развернутых опухолей. В качестве иллюстративного примера вещество примера 11 является эффективным в отношении крупных опухолей. На ФИГ. 12 представлена активность вещества примера 11 в дозе 2 мкмоль/кг TIW, 2 недели, на крупные (250 мм³, 500 мм³ и 750 мм³) подкожные опухоли KB. Введение вещества примера 11 начинали, когда опухоли достигали одного из трех указанных объемов, как показано вертикальными стрелками, соответствующими объему опухоли. Данные на ФИГ. 12 показывают, что вещество примера 11 ингибирует рост крупных опухолей и приводит к полному ответу у тестируемых животных.

На ФИГ. 13 показана активность вещества примера 11 (e) в дозе 1 мкмоль/кг TIW в течение двух недель введения на развернутые подкожные опухоли KB по сравнению с контролями (a); каждым конъюгатом с одним лекарственным средством отдельно, конъюгатом митомицина C (b) и конъюгатом дезацетилвинбластина моногидразида (c) или смесью этих конъюгатов с одним лекарственным средством (d). Каждый конъюгат лекарственного средства дозировали на одном уровне, составляющем 1 мкмоль/кг TIW в течение двух недель введения. На фигуре показано, что вещество примера 11 действует лучше, чем каждый из конъюгатов с одним лекарственным средством или смесь обоих конъюгатов с одним лекарственным средством. Удивительно, что смесь конъюгатов с одним лекарственным средством не оказывала значительно лучшего действия, чем конъюгаты с одним лекарственным средством, которые дозировали отдельно, и ни одна из схем дозирования конъюгатов с одним лекарственным средством не отличалась статистически значимо от контролей. Только соединение примера 11 было лучше контролей. Кроме того, эти данные подтверждают синергический эффект наличия в одном конъюгате как лекарственного средства на основе алкалоида барвинка, так и лекарственного средства митомицина.

ПРИМЕРЫ с 12 по 14

Проводили в соответствии с процессами и условиями, описанными в настоящем описании, включая процессы, описанные в настоящем описании выше для вещества примера 11. Дополнительное подробное описание получения требуемого активированного тиосульфонатом или пиридилдитио винбластина и активированных малеимидом производных винбластина приведено в публикации патентной заявки США № US 2005/0002942 A1. Дополнительное подробное описание получения требуемых производных митомицина приведено в публикации патентной заявки США № US 2005/0165227 A1, описание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

ПРИМЕР 12

На ФИГ. 15 представлена активность вещества примера 12 в концентрации 100 нМ на включение ³H-тимидина в FR-положительные клетки KB относительно периода повторения импульсов. Анализ проводили в соответствии с примером способа 3.

ПРИМЕР 13

ПРИМЕР 14

Изобретение относится к медицине и касается конъюгата для доставки лекарственного средства. Изобретение касается также фармацевтической композиции для устранения популяции патогенных клеток в животном-хозяине, включающей указанное соединение; а также способа устранения популяции патогенных клеток в животном-хозяине. Изобретение обеспечивает повышенную активность заявленного конъюгата по сравнению с конъюгатами, известными из уровня техники. 3 н.п. ф-лы, 14 пр., 15 ил., 4 табл.

1. Соединение, имеющее следующую формулу:

2. Фармацевтическая композиция для устранения популяции патогенных клеток в животном-хозяине, обладающем популяцией патогенных клеток, включающая соединение по п.1, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель для него, или их комбинацию.

3. Способ устранения популяции патогенных клеток в животном-хозяине, обладающем популяцией патогенных клеток, где члены популяции патогенных клеток обладают доступным участком для связывания связывающей фолатный рецептор клеточной поверхности группы, и где участок для связывания экспрессируется только патогенными клетками, сверхэкспрессируется или предпочтительно экспрессируется ими, где указанный способ включает стадию введения указанному хозяину соединения по п.1, или его фармацевтической композиции.