ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА К β-АМИЛОИДНОМУ ПЕПТИДУ Российский патент 2013 года по МПК C07K16/18 A61K39/395 C12N15/13 C12N15/63 G01N33/563 A61P25/28 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области технологии антител, конкретнее к области гуманизированных антител к бета-амилоидному пептиду.

Уровень техники

Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой нейродегенеративную болезнь, связанную с возрастом, которая в 2006 году поразила 26,6 миллионов человек. Прогноз предполагает, что распространенность увеличится в четыре раза к 2050, к этому времени 1 из 85 человек во всем мире будет жить с этой болезнью (Brookmeyer et al. (2007)). БА проявляется как прогрессирующие когнитивные расстройства, такие как потеря памяти и снижение умственных способностей.

Центральным в патогенезе БА является накопление бета-амилоидного пептида (Абета) в мозге. Абета представляет собой продукт расщепления белка-предшественника амилоида (АРР), который последовательно расщепляется в амилоидогенном пути сначала с помощью β-секретазы, а затем γ-секретазы. Получаются фрагменты Абета различного размера, при этом пептид из 40 аминокислот (Абета₄₀) является наиболее преобладающей формой, и, как полагают, пептид из 42 минокислот, так называемый Абета₄₂, является самой вредной формой. Абета может накапливаться во внеклеточном пространстве мозга, где он агрегирует в многоступенчатом процессе с образованием нейротоксических олигомеров и, в конечном счете, вместе с другими веществами приводит к образованию амилоидных бляшек, которые являются типичным признаком болезни Альцгеймера.

Перспективным клиническим иммунологическим подходом к лечению болезни Альцгеймера является пассивная иммунизация, при которой антитела к Абета вводят субъекту, для того чтобы удалить Абета из мозга. Предлагается три различных механизма для выведения Абета с помощью анти-Абета антител, которые не являются взаимно исключающими: (1) каталитическое превращение фибриллярного Абета в менее токсичные формы (Bard et al. (2000); Bacskai et al. (2001); Frenkel et al. (2000)); (2) опсонизация отложений Абета, приводящая к микроглиальному фагоцитозу (Bard et al. (2000); Bacskai et al. (2002); Frenkel et al. (2000); и (3) стимулирование выхода Абета из мозга в кровообращение (DeMattos et al. (2001)), так называемая гипотеза периферического стока.

Mohajera et al. (2004) и Gaugler et al. (2005) из Университета в Цюрихе сделали мышиные антитела к Абета и исследовали биоактивность моноклональных мышиных анти-Абета антител in vivo.

Однако при введении людям мышиные антитела часто приводят к иммуногенности. Вызванный антиглобулиновый ответ ограничивает клиническую пригодность мышиных антител (Miller et al. (1983); Schroff et al. (1985)).

Следовательно, существует необходимость в новых, неиммуногенных и эффективных антителах для лечения и/или диагностирования расстройств, связанных с Абета, в частности болезни Альцгеймера.

Раскрытие изобретения

Следовательно, главной целью изобретения является предоставление антитела, которое специфически связывается с Абета, в частности с С-концевой частью Абета, и которое хорошо переносится иммунной системой человека.

В первом аспекте изобретение предоставляет изолированное антитело, которое селективно связывается с Абета в его С-концевой области, в частности между аминокислотами с 30 по 40 (SEQ ID NO:26), и является гуманизированным или полностью человеческим. Данное антитело демонстрирует высокое сродство и к Абета₄₂ и к Абета₄₀ и, кроме того, в основном не распознает белок-предшественник амилоида (АРР) in vivo.

Преимущество так называемых гуманизированных антител заключается в их способности вызывать, как правило, минимальный ответ или не вызывать ответ иммунной системы человека, таким образом они могут рассматриваться, как являющиеся низкоиммуногенными или неиммуногенными при применении у человека. Поэтому, в противоположность мышиным антителам, гуманизированные антитела пригодны для терапевтических целей и клинического применения.

Термин "гуманизация" относится к хорошо отработанным способам, которые уменьшают иммуногенность ксеногенных (чужеродных) антител. Гуманизированное антитело генетически разрабатывается так, что в нем присутствует как можно меньше структуры, не относящейся к человеку. Одна стратегия основана на прививке гипервариабельных участков (CDR) ксеногенного антитела на вариабельную легкую цепь VL и вариабельную тяжелую цепь VH человеческого акцепторного каркасного участка. По другой стратегии, каркасный участок ксеногенного антитела видоизменяют относительно каркасного участка человека. В обоих случаях, сохранение функциональности антигенсвязывающих частей является обязательным. Для указанной цели, анализируют трехмерные модели родительских последовательностей и различные концептуальные гуманизированные продукты, например с помощью использования компьютерных программ для молекулярного моделирования, которые хорошо известны специалистам. Данный анализ дает возможность, помимо прочего, установить остатки каркасного участка, вероятно вовлеченные прямо или косвенно в связывание антигена. Во многих случаях небольшое число остатков каркасного участка донора является важным для связывания антигена, так как они вступают в прямой контакт с антигеном, или они оказывают влияние на конформацию отдельных CDR (Davies et al (1990); Chothia et al (1987)). Поэтому, если (изменения) уже не присутствуют, желательно видоизменить соответствующие остатки акцепторного каркасного участка относительно тех остатков донорского каркасного участка, которые установлены как существенные для связывания антигена. Также возможно, что гуманизированные антитела содержат остатки, которые не обнаружены ни в репертуаре зародышевой линии человека in vivo, ни в CDR донора или даже каркасном участке донора.

Степень гуманизации антитела может быть установлена вычислением процента идентичности последовательности каркасного участка гуманизированного антитела относительно первичного человеческого акцепторного каркасного участка, который был использован для создания гуманизированного антитела и который доступен из человеческой библиотеки. Предпочтительно, антитело изобретения содержит каркасный участок с идентичностью, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно (в следующем порядке) по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, и наиболее предпочтительно 95% или даже 100% идентичностью в отношении к каркасному участку, полученному из человеческой библиотеки. В контексте настоящего изобретения термины "определяющие комплементарностъ участки (гипервариабельные участки)" или "CDR" относятся к определяющим комплементарность участкам антитела, которое состоит из антигенсвязывающих петель, как определено Kabat et al. (1991). CDR и остатки каркасного участка настоящего изобретения определены согласно формулировке Kabat (Kabat et al. (1987).

Термин "антитело" при использовании здесь относится к полноразмерным антителам, являющимся, например, моноклональными антителами, и любому антигенсвязывающему фрагменту или его одиночной цепи с достаточной связывающей способностью относительно выбранного антигена. Примеры антигенсвязывающих фрагментов, охваченных настоящим изобретением, включают Fab фрагменты, F(ab')2фрагменты, Fd фрагменты, Fv фрагменты; отдельные домены или dAb фрагменты, выделенные гипервариабельные участки (CDR); комбинацию из двух или более выделенных CDR, которые необязательно могут быть соединены с помощью синтетического линкера, и одиночную цепь вариабельных фрагментов (scFv). "Полноразмерные антитела" включают химерные антитела, в которых антигенсвязывающий вариабельный домен одного происхождения соединен с константным доменом другого происхождения, например, вариабельный домен Fv мышиного антитела с константным доменом Fc человеческого антитела.

Вышеперечисленные фрагменты антител получают с помощью обычных методов, известных специалистам в данной области техники, причем фрагменты подвергают отбору на пригодность аналогичным образом, как интактные антитела.

В настоящем изобретении CDR происходят от моноклонального мышиного антитела 22С4 (Mohajeri et al. (2002), J. Biol. Chem. 277, pp.33012-33017 и Neurodegenerative Dis. 1 (2004), pp.160-167). Указанное мышиное антитело направлено к С-концевой части Абета, конкретнее к эпитопу в пределах аминокислот с 30 по 40 (SEQ ID NO:26).

В предпочтительном варианте осуществления антитело предотвращает олигомеризацию Абета, в частности Абета₄₀ и/или Абета₄₂, посредством связывания с его мишенью.

Настоящее изобретение предоставляет антитело, которое содержит одну или более последовательностей гипервариабельных участков (CDR) с идентичностью, по меньшей мере, 80% относительно последовательности из числа группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6.

Как уже упоминалось, CDR настоящего изобретения, а именно SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6, могут быть привиты на подходящие акцепторные каркасные участки. Термин "каркасные участки" относится к принятым в данной области техники частям вариабельной области антитела, которые находятся между более дивергентными CDR участками. Такие каркасные участки обычно называются каркасными участками с 1 по 4 (FR1, FR2, FR3 и FR4) и обеспечивают каркас для удерживания в трехмерном пространстве; три CDR обнаружены в тяжелой или легкой цепи вариабельной области антитела, так что CDR могут образовывать антигенсвязывающую поверхность. Подходящими акцепторными каркасными участками являются предпочтительно участки происходящих из иммуноглобулинов антигенсвязывающих полипептидов, которые хорошо известны в данной области техники и включают, но не ограничиваются этим, VhH домены, V-NAR домены, Vh домены. Fab, scFv, Bis-scFv, IG верблюда, IfNAR, IgG, Fab2, Fab3, миниантитела, диантитела, триантитела и тетраантитела (см. Holliger, P. и Hudson, P. (2005), Nat. Biotechnol. 23(9), pp.1126-1136). Каркасная последовательность также может быть консенсусной последовательностью последовательности каркасного участка человека.

Антитело выбирают из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, причем антитело может содержать последовательности более чем одного класса или изотипа.

Предпочтительно, антитело содержит каркасный участок с идентичностью, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно (в следующем порядке) по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, и наиболее предпочтительно 95% или даже идентичностью 100% относительно каркасного участка, доступного из человеческой библиотеки.

Антитело настоящего изобретения представляет собой рекомбинантную молекулу, так как CDR могут быть привиты на человеческий каркасный участок, причем полученное антитело содержит нечеловеческие CDR и человеческий или в основном человеческий каркасный участок. Альтернативно, антитело получают из нечеловеческого антитела и его каркасный участок видоизменяют в сторону человеческого антитела. Обе альтернативы включены с помощью термина "доступный из человеческой библиотеки".

В одном варианте настоящего изобретения антитело представляет собой scFv антитело. Антитело scFv может быть или полноразмерным scFv, содержащим VL и VH домены, которые соединены коротким линкерным пептидом, например, линкером, содержащим от 1 до 4 повторов последовательности GGGGS, предпочтительно (GGGGS)₄ пептидом (SEQ ID NO:25), или линкером, как раскрыто в работе Alfthan et al. (1995) Protein Eng. 8:725-731, или просто VL или VH домен, который обладает достаточной связывающей способностью для выбранного антигена. Соединение VL и VH может быть в любой ориентации, VL-линкер-VH или VН-линкер-VL.

В одном варианте каркасный участок scFv является стабильным и растворимым в восстановительной среде. Эти характеристики можно установить с помощью так называемой Системы контроля качества, как раскрыто в WO 01/48017. Стабильность указанных антител предпочтительно составляет, по меньшей мере, фактически половину особенно стабильного лямбда-графта (lambda graft), более предпочтительно, по меньшей мере, почти лямбда-графта и наиболее предпочтительно лучше, чем лямбда-графта. Wörn et al. (2000) описывают начало денатурации лямбда-графта, происходящей около 2,0М GdnHCl. Было показано, что scFv, которые выполнены правильно в Системе контроля качества, также являются стабильными и растворимыми в окислительных условиях. В предпочтительном варианте, растворимость антитела изобретения, как измерено по способу Atha и Ingham (1981), составляет, по меньшей мере, 5 мг/мл, более предпочтительно, по меньшей мере, 10 мг/мл и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 20 мг/мл.

В дополнительном предпочтительном варианте антитело содержит каркасный участок фрагмента вариабельной легкой цепи (V_L), который является идентичным или происходит от последовательностей каркасного участка, включенных в группу, состоящую из SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16. В случае полученной (derived) последовательности, указанная последовательность показывает идентичность, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно (в следующем порядке) по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, и наиболее предпочтительно 95% или даже 100% идентичность относительно последовательности из числа группы, состоящей из SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16.

В дополнительном предпочтительном варианте антитело настоящего изобретения содержит каркасный участок фрагмента вариабельной тяжелой цепи (V_H), который является идентичным или происходит от последовательностей каркасного участка, включенных в группу, состоящую из SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 и SEQ ID NO:23. В случае полученной последовательности, указанная последовательность показывает идентичность, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно (в следующем порядке) по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, и наиболее предпочтительно 95% или даже 100% идентичность с последовательностью из числа группы, состоящей из SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 и SEQ ID NO:23.

Последовательности SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 и SEQ ID NO:23 раскрыты в WO 03/097697. Эти последовательности каркасных участков, происходящие из человеческих иммуноглобулинов, и их характеристики растворимости и стабильности при восстановительных условиях были доказаны в так называемой Системе контроля качества, как раскрыто в WO 01/48017.

Более предпочтительно антитело содержит VH фрагмент SEQ ID NO:7 и VL последовательность SEQ ID NO:17.

Наиболее предпочтительно антитело имеет последовательность, являющуюся идентичной, по меньшей мере, на 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 75%, 80%, 90%, 95% идентичную SEQ ID NO:24. В наиболее предпочтительном варианте антитело настоящего изобретения структурно определяется SEQ ID NO:24. В указанном антителе SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:17 связаны через (GGGGS)4 линкер. Полученное scFv антитело было названо ESBA212.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что последовательности изобретения можно изменить так, что они будут отличаться в аминокислотной последовательности от раскрытых здесь последовательностей, несмотря на сохранение способности селективного связывания с С-концевой частью Абета. Следовательно, ни каркасный участок, ни CDR участки гуманизированного антитела не нуждаются в точном соответствии донорному CDR или акцепторному каркасному участку. Изменения в этом отношении могут быть созданы введением одной или более нуклеотидных замен, вставок или делеций в нуклеотидную последовательность антитела с помощью стандартных методов, таких как сайт-направленный мутагенез и PCR-опосредованный мутагенез. Такие мутации могут быть введены с разными целями, например, для улучшения характеристик связывания, растворимости или стабильности антитела. Антитела изобретения также могут содержать консервативные аминокислотные замены в одном или более несущественных аминокислотных остатках. В другом варианте осуществления мутации могут быть введены случайно по всей или части кодирующей последовательности, например с помощью насыщающего мутагенеза, и получающиеся в результате мутанты могут быть отобраны по их способности связываться с желательной мишенью.

Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных положений, общих (перекрывающихся) для последовательностей, принимая во внимание число пропусков, и длину каждого пропуска, которые нужно ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно осуществить с помощью математического алгоритма, который хорошо известен специалистам в данной области техники. Упоминаемые в данном описании идентичные последовательности были определены с помощью программ BLAST (Basic Local Alignment Search Tools; see Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, DJ. (1990) "Basic local alignment search tool." J Mol. Biol. 215: 403-410), доступных в Интернете. Поиск белков BLAST может быть осуществлен с помощью программы XBLAST (счет =50, длина слова =3) для сравнения аминокислотных последовательностей с белковыми молекулами изобретения. Чтобы получить выравнивания, содержащие разрывы, для сравнительных целей, можно использовать программу Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. При применении программ BLAST и Gapped BLAST могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).

Белковые последовательности настоящего изобретения могут дополнительно использоваться как "запросная последовательность" для проведения поиска в общедоступных базах данных, например, для установления родственных последовательностей. Такие поиски можно выполнить с помощью вышеупомянутых программ XBLAST (версия 2.0).

Гуманизированные или полностью человеческие антитела, включенные в настоящее изобретение, показывают следующие характеристики:

(i) связывание с С-концом Абета, таким образом, связывание и с Абета₄₀, и с Абета₄₂ с высокой и, по существу, одинаковой аффинностью;

(ii) проявление высокой аффинности к олигомерным или мономерным формам Абета;

(iii) в основном отсутствие распознавания белка-предшественника амилоида (АРР) in vivo;

(iv) обладание растворимостью, по меньшей мере, 5 мг/мл, предпочтительно, по меньшей мере, 10 мг/мл и более предпочтительно, по меньшей мере, 20 мг/мл; и

(v) проявление низкой иммуногенности или отсутствие иммуногенности при применении у человека.

Кроме того, антитело предпочтительно показывает, по меньшей мере, одну, более предпочтительно больше, чем одну, наиболее предпочтительно все из следующих характеристик:

(vi) опосредование поглощения фибриллярного Абета микроглией;

(vi) связывание бета-амилоидных бляшек;

(vii) удаление бета-амилоидных бляшек в мозге и/или предотвращение образования амилоидных бляшек в мозге;

(viii) уменьшение токсичности Абета и связанной с этим уязвимости нейронов к эксайтотоксическим событиям, вызванным судорожными припадками;

(ix) проникновение через гематоэнцефалический барьер; и/или

(х) по существу восстановление нормального поведения;

(xi) удаление бета-амилоидных фибрилл в мозге и/или предотвращение образования амилоидных фибрилл в мозге.

Антитело настоящего изобретения по существу не распознает белок-предшественник амилоида (АРР) in vivo. Предпочтительно, аффинность связывания с Абета представляет собой фактор, по меньшей мере, в два, более предпочтительно, по меньшей мере, в 5, даже более предпочтительно, по меньшей мере, в 10, особенно предпочтительно, по меньшей мере, в 50, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, в 100 раз больше по сравнению с аффинностью связывания для АРР.

Таким образом, при введении антитела субъекту, АРР не конкурирует с Абета за связывание, и антитело не препятствует биологии нерасщепленного АРР. Эта особенность является интересной, например, в частности, для диагностических целей и/или медицинского лечения неврологических расстройств, связанных с ненормальным накоплением и/или отложением Абета в центральной нервной системе.

Термин "неврологическое расстройство" при использовании здесь включает, но не ограничивается этим, болезнь Альцгеймера, умеренное когнитивное нарушение, афазию, лобно-височную деменцию, болезнь телец Леви, болезнь Паркинсона, болезнь Пика, болезнь Бинсвангера, церебральную амилоидную ангиопатию, синдром Дауна, мультиинфарктную деменцию, болезнь Хантингтона, болезнь Крейтцфельда-Якоба, комплексное умственное расстройство при СПИДе, депрессию, тревожное расстройство, фобию, неврит лицевого нерва, эпилепсию, энцефалит, рассеянный склероз; нервно-мышечные расстройства, нейроонкологические расстройства, опухоли мозга, нервно-сосудистые расстройства, включая инсульт, нейро-иммунологические расстройства, нейроотологическую болезнь, травму нервной системы, включая повреждение спинного мозга, боль, включая нейропатическую боль, педиатрические неврологические и нейропсихиатрические расстройства, нарушения сна, синдром Туретта, умеренное когнитивное нарушение, сосудистую деменцию, мультиинфарктную деменцию, кистозный фиброз, болезнь Гоше, другие нарушения движения, глаукому и болезнь центральной нервной системы (ЦНС) в общем. Более предпочтительно антитело настоящего изобретения используют при лечении, предотвращении, замедлении прогрессирования или при диагностировании болезни Альцгеймера, инсульта, травмы нервной системы и глаукомы.

В другом аспекте антитело настоящего изобретения является химически модифицированным. Химические модификации могут изменять такие свойства антитела, как стабильность, растворимость, антигенсвязывающая специфичность или аффинность, время полужизни in vivo, цитотоксичность и способность проникновения в ткани. Химические модификации хорошо известны специалистам в данной области. Предпочтительной химической модификацией антитела настоящего изобретения является пегилирование (присоединение полиэтиленгликоля, ПЭГ).

В одном варианте осуществления антитело конъюгировано с терапевтическим средством, например, токсином или химиотерапевтическим соединением. Антитело может быть конъюгировано с радиоизотопом, таким как, но не ограничиваясь этим, ²¹²Bi, ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹²Bi, ²¹²At, ²¹¹Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd и ¹⁸⁸Re, например, для иммунотерапии.

В дополнительном варианте осуществления антитело настоящего изобретения может быть соединено с меткой. Указанная метка может дать возможность колориметрического выявления антитела. Альтернативно, антитело является радиомеченым. Наиболее предпочтительно радиометка представляет собой ⁶⁴Cu.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление диагностического или научного средства, содержащего антитело, раскрытое здесь.

Антитело настоящего изобретения можно использовать при диагностировании или проверке субъекта на амилоидоз или болезнь Альцгеймера или при определении у субъекта риска развития амилоидоза или болезни Альцгеймера.

В дополнительном варианте осуществления изобретение, кроме того, включает диагностический способ, содержащий этап введения эффективного количества антитела настоящего изобретения субъекту, предпочтительно млекопитающему. Способ дополнительно включает этап обнаружения метки.

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение включает метод иммунологического анализа, содержащий антитело, описанное здесь, в котором исследование может быть in vivo или in vitro иммуноанализом. Антитело может быть использовано в жидкой фазе или связанным с твердой фазой. Примеры таких иммунологических анализов включают радиоиммунологические анализы (RIA), проточную цитометрию, вестерн-блоттинг и микрочипы.

Кроме того, изобретение включает набор для анализа, содержащий антитело, раскрытое здесь.

В предпочтительном варианте осуществления антитело настоящего изобретения опосредует поглощение фибриллярного Абета микроглией, тем самым уменьшая уровни Абета in vivo.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитело настоящего изобретения улучшает при введении эффективного количества когнитивное поведение и сохраняет число незрелых нейронов у субъектов с болезнью Альцгеймера.

Более того, настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию для лечения, предотвращения и/или замедления прогрессирования неврологического расстройства или амилоидоза, характеризующегося ненормальным накоплением и/или отложением Абета в центральной нервной системе, в частности болезни Альцгеймера, содержащую антитело, раскрытое здесь.

В дополнительном варианте осуществления изобретение предоставляет способ производства фармацевтической композиции для лечения, предотвращения и/или замедления прогрессирования вышеупомянутых неврологических расстройств, предпочтительно болезни Альцгеймера, содержащий этап комбинирования антитела, раскрытого здесь, по меньшей мере, с одним подходящим фармацевтическим носителем.

Предпочтительно фармацевтические композиции, раскрытые здесь, предотвращают и/или уменьшают эффект накопления Абета в мозге субъекта.

Антитело может быть введено в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем или в комбинации с одним или более дополнительными действующими началами. Действующие начала могут быть небольшими органическими молекулами и/или анти-Абета антителами.

Антитело и/или фармацевтические композиции, раскрытые здесь, могут быть введены разными способами, например, внутривенно, внутрибрюшинно, интраназально, подкожно, внутримышечно, местно или внутрикожно, внутрь черепа, подоболочечно в спинномозговую жидкость. Предпочтительными способами применения являются (в этой последовательности) интраназальное, подкожное, внутривенное, подоболочечное в спинномозговую жидкость и внутричерепное введение.

Как правило, используемые композиции известны квалифицированному специалисту. Например, аэрозольные композиции, такие как назальные спрэи, включают очищенные водные или другие растворы активного вещества с консервантами и изотоническими веществами. Такие композиции предпочтительно устанавливают до значения рН и изотонического состояния, совместимого со слизистыми оболочками носа.

Более того, может быть желательно совместное введение или последовательное введение других веществ. Предпочтительно антитело присутствует в количестве, достаточном для восстановления нормального поведения и/или когнитивных свойств в случае болезни Альцгеймера.

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способы лечения, предотвращения и/или замедления прогрессирования неврологической болезни, как упомянуто выше, включающие этап введения эффективного количества антитела настоящего изобретения субъекту, нуждающемуся в этом.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа пассивной иммунизации млекопитающего, включающего этап введения млекопитающему антитела, раскрытого здесь. Предпочтительно, пассивную иммунизацию проводят в рамках анти-Абета иммунотерапии.

В другом варианте осуществления изобретение представляет изолированную нуклеиново-кислотную последовательность, содержащую последовательность, кодирующую аминокислотные последовательности, заключенные в настоящем изобретении. Указанные нуклеиновые кислоты могут быть или ДНК, или РНК и могут быть или одноцепочечными, или двухцепочечными.

Более того, настоящее изобретение предоставляет клонирующий вектор или вектор экспрессии, содержащий последовательность ДНК, кодирующую полипептид, наиболее предпочтительно антитело, настоящего изобретения.

Кроме того, предоставляется подходящая клетка-хозяин, несущая вектор и/или нуклеиново-кислотную последовательность, содержащую последовательность, кодирующую раскрытые здесь аминокислотные последовательности. Это может быть прокариотическая или эукариотическая клетка, в частности E. coli, дрожжевая, растительная, клетка насекомого или млекопитающего.

Антитело настоящего изобретения можно создать с помощью обычных методов в области рекомбинантной молекулярной биологии. Зная последовательности полипептидов, квалифицированный специалист в данной области техники может сделать соответствующие кДНК, кодирующие полипептиды, посредством генного синтеза.

В другом варианте осуществления предоставляется способ получения антитела настоящего изобретения, включающий культивирование клетки-хозяина, трансформированной ДНК, кодирующей указанное антитело, при условиях, которые делают возможным синтез указанного антитела, и извлечение указанной молекулы из указанной культуры. Предпочтительно указанный способ предоставляет антитело scFv, очищенное (выделенное) из телец включения E. coli, или из периплазмы E. coli, если используемая конструкция scFv содержит сигнальную последовательность, которая направляет полипептид в периплазму. Может быть необходимо включение этапа ренатурации, для того чтобы вновь свернуть антитело в функциональную молекулу.

В дополнительном варианте осуществления изобретение предоставляет способ лечения, включающий этап введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества полинуклеотида, вектора или клетки-хозяина, как описано здесь.

Во втором аспекте настоящее изобретение предоставляет способ диагностирования, включающий этапы:

(i) мечения антитела;

(ii) введения эффективной дозы указанного антитела интраназально или системно субъекту; и

(iii) измерение концентрации и/или обнаружение присутствия меченого антитела в частях тела субъекта.

Антитело является предпочтительно гуманизированным антителом к эпитопу, образованному в пределах аминокислот с 30 по 40 Абета настоящего изобретения, предпочтительно одноцепочечным антителом (scFv). В предпочтительном варианте осуществления антитело метят позитронно-активным изотопом, наиболее предпочтительно ⁶⁴Cu.

Термин "эффективная доза" при использовании здесь относится к количеству, достаточному для достижения или, по меньшей мере, частичного достижения желательного эффекта, например, различимого сигнала. Количества, эффективные для данного применения, будут зависеть от обнаруживающей силы метки (detective strength), массы тела субъекта и протяженности области, которая должна быть проверена.

Предпочтительно субъект является млекопитающим; более предпочтительно субъект является человеком.

Метод диагностической визуализации, позитронно-эмиссионная томография (PET), который предоставляет трехмерное изображение частей тела, основан на регистрации излучения позитронов. Как правило, биомолекула является радиоактивно-меченой, например она включает радиоактивный изотоп. После введения меченой биомолекулы субъекту, как правило, с помощью введения в кровоток, радиоактивно-меченая биомолекула концентрируется в ткани, представляющей интерес. Затем субъекта помещают в визуализирующий сканер, который обнаруживает излучение позитронов.

В одном варианте осуществления субъекту вводят антитело, меченое ⁶⁴Cu, а этап iii) осуществляют, помещая субъекта в визуализирующий сканер и обнаруживая излучение позитронов.

Изобретение, таким образом, включает способ РЕТ-визуализации, содержащий этап введения ⁶⁴Cu-меченого антитела настоящего изобретения субъекту.

Последовательностями настоящего изобретения являются следующие последовательности. (см. в конце описания)

Если не установлено иначе, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют то же самое значение, как правило, понятное среднему специалисту в области техники, к которой относится данное изобретение. Несмотря на то что способы и материалы, сходные или эквивалентные тем, которые описаны здесь, могут быть использованы при применении на практике или проверке настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. В случае конфликта, настоящее подробное описание, включая определения, будет осуществлять контроль. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначаются для ограничения.

Понятно, что различные варианты осуществления, предпочтения и диапазоны можно комбинировать произвольно. Кроме того, в зависимости от конкретного варианта осуществления, некоторые определения, варианты осуществления или диапазоны могут не использоваться.

Краткое описание чертежей

Изобретение будет более понятным и цели, отличные от изложенных выше, станут очевидны, после рассмотрения следующего подробного описания. Такое описание делает ссылки на прилагающиеся рисунки, на которых:

фиг.1 показывает сравнение последовательности вариабельного участка легкой цепи ESBA212 с VL каркасным участком 2.3 (ESBATech), на который были привиты Абета специфические CDR от 22С4;

на фиг.2 показано сравнение последовательности вариабельной тяжелой цепи VH ESBA212 с VH каркасного участка 2.3 (ESBATech);

фиг.3 показывает выравнивание последовательности VH ESBA212 с VH первоначальной VH из мышиного антитела 22С4;

фиг.4 показывает выравнивание последовательности VH ESBA212, 22С4 и каркасного участка;

фиг.5 показывает результаты ex vivo мечения бляшек на мышиной модели БА с помощью ESBA212. Были использованы или парафиновые срезы, или криосрезы (срезы из замороженных тканей) (нефиксированные или пост-фиксированные). Фиг.5А - мышиная модель SwePSI, парафиновый срез; фиг.5В - мышиная модель SwePSI, криосрез; фиг.5С - мышиная модель SweArc, парафиновый срез; фиг.5D - мышиная модель SweArc, криосрез;

фиг.6 описывает результаты ex vivo мечения бляшек в мозге человека с БА с помощью ESBA212. Были использованы или парафиновые срезы, или криосрезы (нефиксированные и пост-фиксированные). Фиг.6А - парафиновый срез; фиг.6В - криосрез, фиксированный ацетоном; фиг.6С - криосрез, необработанный; фиг.6D - криосрез; фиксированный ацетоном, кипяченый в течение 10 мин в нитратном буфере;

фиг.7 показывает ex vivo окрашивание амилоидных бляшек с помощью ESBA212 (фиг.7А) и Тиофлавина S (фиг.7В) на мозговых срезах SwePS1 мышей;

фиг.8 иллюстрирует результаты эксклюзионной хроматографии ESBA212, связанного с FITC-мечеными Абета42 мономерами (фиг.8А), и на фиг.8В контроль, в котором каркасный участок FW2.3 инкубировали с FITC-мечеными Абета42 мономерами;

фиг.9 показывает два Абета42 иммуноблота с использованием гомогенатов мозга трансгенных мышей SwePSI (фиг.9А; дорожка 1: ESBA212, дорожка 2: 6Е10) и ADDL (фиг.9В; дорожка 1: Fw 2.3, дорожка 2: ESBA212, дорожка 3: 6Е10) как антигенов. ESBA212 преимущественно распознает мономеры и слабее триммеры;

фиг.10 - определение аффинности ESBA212 с помощью ELISA (фиг.10А - для Абета40; константа аффинности: 6,26 нМ; и фиг.10В - для Абета42; константа аффинности: 6,31 нМ);

фиг.11 - масс-спектроскопия ESBA212;

фиг.12 представляет спектр FT-IR, показывающий процент разворачивания ESBA212 при разных температурах, в пределах от 25 до 95°С;

фиг.13 - вестерн-блот, показывающий стабильность ESBA212, инкубированного в присутствии (дорожка 1) или отсутствии (дорожка 2) гомогената мозга мыши;

фиг.14 - результат тиофлавин Т-анализа, демонстрирующий, что ESBA212 ингибирует олигомеризацию Абета42 in vitro;

фиг.15 - среднее значение концентраций в сыворотке ESBA212 в течение времени после однократной внутривенной или внутрибрюшинной инъекции;

фиг.16 - обнаружение связанного ESBA212 после интраназального (фиг.16А) или внутривенного (фиг.16В) применения. ESBA212 связывается с амилоидными бляшками в мозге независимо от выбранного способа применения;

фиг.17 - обнаружение связанного ESBA212 в мозге мыши SwePS1 после интраназального применения (фиг.17А), и окрашивание тиофлавином S (фиг.17А), подтверждающее, что ESBA212 связывается с амилоидными бляшками;

фиг.18 - мечение амилоидных бляшек ex vivo ⁶⁴Cu-ESBA212 (фиг.18 В и D) по сравнению с ESBA212 (фиг.18А и С). Фиг.18А и В показывают парафиновые срезы, тогда как фиг.18С и D показывают криосрезы;

фиг.19 - обнаружение связанного ESBA212 и Cu-ESBA212 на срезах мозга мыши (SwePS1) через 24 час и 48 час после интраназального применения. Фиг.19А - ESBA212 после 24 час; фиг.19В - ESBA212 после 48 час; фиг.19С - Cu-ESBA212 после 24 час; и фиг.19D - Cu-ESBA212 после 48 час;

фиг.20 - обнаружение ESBA212 в почке после внутривенного ESBA212 введения;

фиг.21 - дополнительное интраназальное применение, подобное фиг.16А, показывающее Аβ-окрашивание на фиксированных SwePS1 срезах мозга мыши, животное перфузировали 1 час после интраназальной обработки 200 мкг ESBA212;

фиг.21А - окрашивание анти-His антителом;

фиг.21В - контрольное окрашивание 6Е10;

фиг.21C - отрицательный контроль, окрашенный анти-кроличьим антителом, меченным Су3;

фиг.21D - контроль, окрашенный 22 с4 IgG;

фиг.22 - уровни Аβ 40 и 42 в мозге мышей APPswe/PSlΔE9, которых обрабатывали PBS, 22с4 IgG и ESBA212 в течение 3 месяцев;

фиг.22А - растворимая фракция (TBS);

фиг.22В - нерастворимая фракция (GuHCl);

фиг.22С - мембрано-связанная фракция (TBS-Тритон);

фиг.23 - парафиновые срезы мышей, обработанных APPswe/PSlΔE9, окрашенные 6Е10 и оцененные с использованием программного обеспечения ImageJ;

фиг.23А - число бляшек;

фиг.23В - площадь бляшек.

Осуществление изобретения

Пример 1. Создание ESBA212

Антигенсвязывающие части одноцепочечного антитела ESBA212 происходят от мышиного антитела 22С4, идентифицированного в университете Цюриха. Абета-специфическое мышиное IgG антитело 22С4 получили иммунизацией мышей Абета_30-42 и, таким образом, оно является направленным к С-концу Абета. Клонирование доменов VL и VH проводили с помощью RT-ПЦР согласно Burmester и Plückthun (2001). Коротко, мРНК получили от клеток гибридомы, продуцирующих антитело 22С4. Для амплификации доменов VL и VH проводили RT-ПЦР с использованием праймеров, описанных Burmester и Plückthun. Два домена были собраны с помощью SOE-ПЦР (сплайсинг посредством удлинения перекрываний). Затем амплифицированный одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) расщепляли с помощью Sfil, клонировали в подходящий вектор экспрессии и секвенировали. Таким образом был получен мышиный scFv фрагмент, который содержал специфичность к Абета₄₂. Указанный scFv гуманизировали, что приводило к одноцепочечному антителу ESBA212 (см. фиг.1-4 для сравнения последовательностей. Фиг.1 и 2 показывают выравнивание последовательности ESBA212 с каркасным участком 2.3, на который были привиты Абета-специфические CDRs от 22С4).

Плазмиды, кодирующие ESBA212, были введены в подходящий штамм Е. coli (например, BL21) и экспрессировались как тельца включения. Функциональные одноцепочечные антитела получили рефолдингом телец включения и последующей очисткой с помощью гель-фильтрации.

Пример 2. Связывание амилоидных бляшек на срезах тканей

Для того чтобы проверить способны scFv ESBA212 распознать Абета, было выполнено иммуноокрашивание ex vivo тканей мозга, содержащих амилоидные бляшки. Соответственно, использовали срезы ткани мозга от различных трансгенных мышей (SweArc, SwePS1), которые экспрессировали человеческий АРР, приводя к образованию Абета бляшек, а также срезы мозга пациентов с болезнью Альцгеймера.

ESBA212 реагировали с амилоидными бляшками и на криосрезах, и на парафиновых срезах от мышей, не зависимо от использованной модели болезни Альцгеймера у мышей (фиг.5). ESBA212 также окрашивали бляшки на фиксированной ткани человека с болезнью Альцгеймера (фиг.6А). Особенно сильное окрашивание можно было наблюдать вокруг сосудов, что известно как амилоидная ангиопатия. Амилоидная ангиопатия относится к отложению бета-амилоида в небольших и среднего размера сосудах коры головного мозга и мягкой, и паутинной оболочках мозга. Однако ESBA212 не связывается с амилоидными бляшками на человеческих криосрезах, ни на фиксированных, ни на нефиксированных (фиг.6В) ни на пост-фиксированных (фиг.6С, D) срезах.

Разные результаты между человеческими срезами и срезами грызунов можно объяснить тем, что трансгенные мыши сверхэкспрессируют человеческий АРР, и поэтому большое количество различных видов бляшек может быть другим по сравнению с человеком. Güntert et al. (2006) описал, что имеет место ультраструктурное различие между диффузными бляшками на модели трансгенной мыши и мозге человека с БА. В мозге мыши большинство бляшек представляет собой компактные бляшки разных размеров. В коре и гиппокампе пациентов-людей с БА этот тип бляшек встречается только в 10%, тогда как преобладают полые бляшки (~90%) (Güntert et al., 2006). Вследствие этих наблюдаемых различий С-конец может быть доступен в мозге трансгенных мышей, но не доступен в мозге пациентов с БА. Фиксация ткани мозга человека может изменить конформацию амилоидных бляшек некоторым образом так, что подвергается воздействию скрытый в других обстоятельствах С-концевой эпитоп и становится доступным для ESBA212.

Фиг.7 показывает специфическое связывание ESBA212 с амилоидными бляшками на срезах мозга SwePS1, как образец окрашивания ESBA212, совпадающий с образцом тиофлавина S, который является стандартным флуоресцентным красителем, который специфически связывается с отложениями амилоидного белка.

Пример 3. Связывание с мономерами Абета42

С помощью эксклюзионной хроматографии можно видеть, что ESBA212 связывается с FITC-меченым Абета42. ESBA212 совместно инкубировали с FITC-Абета42 и загружали в колонку. ESBA212 и ПТС-Абета42 были элюированы вместе (фиг.8А), как точно перекрывающиеся пик для ESBA212 и пик для ПТС-Абета42, и также показали сдвиг размера 5 кДа по сравнению с одним ESBA212 (данные не показаны), следовательно, представляя связанные FITC-Абета42 (5 кДа). Однако, когда ПТС-Абета42 инкубировали с каркасным участком FW2.3, который содержит тот же самый каркасный участок, как ESBA212, но без Абета-специфических CDR, наблюдались два очевидно отдельных пика, наблюдаемые один для scFv и второй пик для ПТС-Абета42 (фиг.8В).

Пример 4. Связывание с разными конформациями Абета42

Были сделаны Абета42 иммуноблоты для того, чтобы дополнительно охарактеризовать специфичность ESBA212. Соответственно, гомогенаты мозга мышей SwePS1, а также полученные in vitro ADDL (лиганды, производные от амилоида бета, способные к диффузии, протокол по Klein) разделяли на геле в присутствии ДДСNа и переносили на мембрану. ESBA212 и 6Е10 (Абета-специфический IgG в качестве контроля) были использованы для обнаружения Абета. Контрольное антитело 6Е10 распознавало Абета42 мономеры, бета-обломки, тримеры и также полноразмерные АРР. Однако преимущественно ESBA212 распознавало Абета42 мономеры (фиг.9).

Пример 5. Характеристика аффинности in vitro

Свойства связывания ESBA212 были проверены в анализе ELISA, где Абета40 и Абета42, соответственно были использованы в качестве антигенов. 96-луночные планшеты покрывали 5 мкг/мл нейтравидина в буфере для разведения (PBS/0,01% BSA/0,2% Твин-20) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем планшеты 3 раза промывали TBS/0,005% Твин-20. Биотинилированые Абета40 или Абета42 (1 мкг/мл в буфере для разведения) добавили в каждую лунку, и планшет инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Планшеты промывали, как указано выше, и сайты неспецифического связывания блокировали добавлением буфера для разведения. Планшеты инкубировали в течение следующих 1,5 часов при комнатной температуре при встряхивании. После промывки подготовленные разведения ESBA212 от 0 до 500 нМ добавили в трех экземплярах в лунки и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре (КГ) при встряхивании. Планшеты промывали и обнаруживали ESBA212 с помощью очищенных кроличьих поликлональных анти-ESBBA212 антител (1:10000 в буфере для разведения) в течение 1 часа при KT. После промывки меченые пероксидазой хрена анти-кролик IgG (1:4000 в буфере для разведения) использовали для обнаружения предварительно связанных кроличьих антител, a POD использовали как субстрат. Реакцию останавливали добавлением 1 М HCl и снимали показания поглощения при 450 нм.

Показатель ЕС50 можно было вычислить из полученной ESBA212 кривой. Для ESBA212 показатель ЕС50 находился в пределах от 1-15 нМ для Абета₄₀, так же, как и для Абета₄₂ (фиг.10).

Пример 6. Определение массы

Точную массу ESBA212 определили с помощью масс-спектроскопии с электрораспылением. Соответственно, ESBA212 очищали и измеряли в 50% ацетонитрил/0,2% муравьиная кислота (рН2). Масс-спектры (нейтральная масса) подвергли деконволюционному анализу с использованием программного обеспечения MaxEntl.

Масса ESBA212 была определена как 26517 Да (фиг.11).

Пример 7. Определение растворимости PEG-осаждением

Условное насыщение ESBA212 измерили в присутствии полиэтиленгликоля 3000 (PEG3000) согласно способу Atha и Ingham (1981). ESBA212 (20 мг/мл) инкубировали с равными объемами буфера, содержащего разные концентрации PEG3000 (30-50%), дающими в результате конечную концентрацию белка 10 мг/мл и конечную концентрацию PEG 15-25%. Через 30 минут инкубации при комнатной температуре образцы центрифугировали, а концентрацию белка в супернатанте определили по оптической плотности при 280 нм. Условное насыщение вычислили построением кривой концентрация PEG против логарифма концентрации белка, измеренной в супернатанте. Растворимость определили экстраполяцией на 0% PEG.

Была определена растворимость ESBA212 около 20 мг/мл.

Пример 8. Определение термической стабильности

Термическую стабильность ESBA212 определили посредством измерения инфракрасного спектра с Фурье-преобразованием (FT-IR) на спектрометре Bruker Tensor 27, так как температура увеличивалась от 25 до 95°С. ESBA212 давали возможность уравновешиваться при каждой температуре в течение 1-2 минут до снятия спектра.

Температура плавления ESBA212 (50% разворачивания белка) составляла 62,8°С. Однако разворачивание ESBA212 начиналось уже около 40°С (фиг.12).

Пример 9. Предотвращение агрегации Абета in vitro

Было изучено, были ли способны ESBA212 ингибировать образование олигомеризации Абета42. Поэтому исследование с тиофлавином Т было выполнено в растворе. Тиофлавин Т быстро связывается с агрегированными Абета фибриллами, давая начало повышенной эмиссии при 482 нм, по сравнению со свободным красителем (445 нм). Это изменение зависит от агрегированного состояния Абета, так как мономерные или димерные пептиды не вступают в реакцию (LeVine III, 1993).

2,5 мкМ Абета42 инкубировали с или без 2,27 мкМ ESBA212 в присутствии тиофлавина Т и 500 мМ NaCl. Как видно на фиг.14, присутствие ESBA212 очевидно ингибирует олигомеризацию Абета in vitro в течение 3 часов, так как флуоресценция, измеренная при 482 нм, не повышается. Наоборот, когда ESBA212 не были добавлены к раствору, были измерены более высокие значения флуоресценции, указывающие на образование агрегатов Абета.

Пример 10. Характеристика фармакокинетических свойств in vivo

Для определения фармакокинетических свойств ESBA212 АРР-трансгенных мышей, так же как и нетрансгенных однопометных животных, обрабатывали внутривенно или внутрибрюшинно однократной инъекцией ESBA212. В предопределенные временные точки после инъекции отбирали образцы крови ретро-орбитальным методом, количество ESBA212 в сыворотке измеряли с помощью количественного метода ELISA и данные анализировали с помощью программного обеспечения PK-Summit.

Животные: Для фармакокинетических экспериментов использовали модель болезни Альцгеймера на мышах, которая была разработана проф. доктором R.Nitsch (Университет Цюриха). Эти мыши (PrP-APP Sw/Arc 10+) сверх-экспрессируют человеческий АРР695, содержащий обе мутации и Swedish и Arctic в одной конструкции под контролем прион-белкового промотора (Knobloch et al, 2006). Мышей разводили на основе гибридов C57BL/6 и DBA/2, предотвращая появление проблем со здоровьем и разведением. Характеристики данного штамма: i) образование ранних внутриклеточных отложений Абета, которое связано с ухудшенными когнитивными функциями, начиная от возраста 6 месяцев, ii) образование бляшек, начиная от возраста 7 месяцев, и сильное увеличение в течение следующих нескольких месяцев. Такое развитие бета-амилоидных бляшек соответствует тяжелой церебральной амилоидной ангиопатии (САА) (Knobloch et al. 2006).

Для фармакокинетических исследований использовали мышей в возрасте 6 месяцев.

Процедура проведения эксперимента: Фармакокинетические параметры определяли после внутривенной или внутрибрюшинной инъекции ESBA212. В случае внутривенного введения использовали АРР-трансгенных мышей и нетрансгенных однопометных животных. 7 групп по 2 животных получили однократную внутривенную инъекцию 15 мг/кг ESBA212 в PBS, рН 6,5. Кровь отбирали ретро-орбитально в заранее определенные моменты времени (10 и 30 минут, 1, 2, 4, 8, 12, и 24 час) таким образом, что должны были быть отобраны 4 образца на временную точку (исключение: только 2 образца на 10 мин и 24 час). Концентрации ESBA212 в сыворотке измеряли с помощью количественного метода ELISA.

В случае внутрибрюшинного применения ESBA212 использовали только АРР-трангенных мышей. 7 групп по 2 животных получили однократную внутрибрюшинную инъекцию 20 мг/кг ESBA212 в PBS, рН 6,5. Образцы крови отбирали, как описано выше, для внутривенной обработки.

Результаты: после внутривенной инъекции ESBA212 системные параметры фармакокинетики (РК) показали двухфазное выведение. После инъекции наблюдалась фаза распределения (α-элиминация, 0-1 час), а также наблюдалась конечная фаза элиминации (β-элиминация, 8-12 час) (фиг.15). Не наблюдалось значительного различия в α-элиминации (0,26 против 0,23 час) и конечном полупериоде (8,79 против 7,11 час) у трансгенных и нетрансгенных мышей, соответственно (таблица 1). Также другие вычисленные ФК-значения сравнивали у трансгенных и нетрансгенных мышей. Однако наблюдаемый объем распределения (Vd) является довольно высоким (77,69 и 76,72 мл). Это может наводить на мысль, что ESBA212 проникает в ткани очень хорошо и быстро. Наоборот, наблюдались различия в параметрах фармакокинетики, когда ESBA212 применяли внутрибрюшинно. Фаза чистой абсорбции может быть определена с пиком ESBA212 концентрации в сыворотке через 1 час после инъекции. Далее, полупериод распределения был примерно в 5 раз длиннее, чем после внутривенного применения, что могло быть признаком того, что наблюдался депо-эффект при введении внутрибрюшинным путем. Однако вычисленный конечный полупериод был незначительно короче после внутрибрюшинной, чем после внутривенной инъекции. Также было определено очевидное различие в среднем времени удержания (MRT) ESBA212 в организме, которое было примерно в 3 раза длиннее, когда scFv вводили внутрибрюшинным вместо внутривенного пути. Наблюдаемые различия в AUC (площадь под кривой), объеме распределения (Vd) и выведении (CL) между внутривенным и внутрибрюшинным путем введения можно объяснить тем фактом, что животные, обработанные внутрибрюшинно, получили более высокую дозу ESBA212 (20 мг/кг вместо 15 мг/кг). При вычислении ФК-параметров для внутрибрюшинной дозы 15 мг/кг, исходя из значений, полученных для дозы 20 мг/кг, были получены следующие параметры: отсутствовали изменения в абсорбции, распределении и полупериоде выведения, так же как и в MRT. Однако AUC (79,124 мкг-час/мл), Vd (67,52 мл) и CL (7,84 мл/час) были сопоставимы со значениями, полученными после внутривенной инъекции.

Таблица 1 Фармакокинетические параметры после внутривенной внутрибрюшинной инъекции ESBA212     РrР-АРР Sw/Arc (tg) РrР-АРР Sw/Arc (не-tg) РrР-АРР Sw/Arc (tg) Способ применения   В.в. В.в. В.6. Дозировка мг/кг 15 15 20 Полупериод абсорбции час     0.10 Полупериод распределения час 0,26 0,23 1,28 Полупериод выведения час 8,79 7,11 5,84 Площадь под кривой (AUC) мкг-час/мл 80,663 66,292 105,491 Среднее время удержания (MRT) час 1,23 1,72 4,32 Объем распределения (Vd) мл 77,69 76,72 50,62 Выведение (CL) мл/час 6,06 7,38 5,88

Пример 11. Мечение бляшек in vivo

Было исследовано, способны ли ESBA212 связываться с амилоидными бляшками при внутривенном или интраназальном применении.

Соответственно, трансгенных мышей SwePSI обрабатывали 3 раза каждые 24 часа 210 мкг ESBA212 с помощью внутривенного или интраназального способа применения. Через 72 часа после первого применения животных перфузировали с помощью PBS, и мозг анализировали на наличие ESBA212. ESBA212 связывались с амилоидными бляшками в мозге и после внутривенного, и после интраназального применения scFv (Фиг.16). Окрашивание тиофлавином S подтвердило, что ESBA212 действительно связываются с амилоидными бляшками. Последовательные срезы мозга SwePS1 мыши, которая была обработана интраназально ESBA212, показали одинаковые образцы окрашивания для ESBA212 и тиофлавина S (фиг.17).

Пример 12. РЕТ-визуализация с помощью ⁶⁴Cu-меченых ESBA212

⁶⁴Cu-мечение ESBA212: ESBA212 были соединены с хелатирующим агентом СРТА (приблизительно 200 Да макроцикл с 4 N-атомами), который связывается с изотопом (полупериод жизни 64 Cu составляет 12,7 часов). Хелатор присоединялся к остаткам лизина в ESBA212. Так как присоединение было некрепким, не каждый лизин был помечен. С помощью установления массы было показано, что в среднем две СРТА молекулы связывались с каждой молекулой ESBA212.

Пример 13. Мечение бляшек с помощью ⁶⁴Cu-ESBA212 ex vivo

Для того чтобы определить, был ли еще способен 64Cu-ESBA212 связываться с амилоидными бляшками, было выполнено иммуногистохимическое окрашивание на фиксированных и нефиксированных срезах мозга мыши SwePSl. ⁶⁴Cu-мечение не изменяло свойства связывания ESBA212, так как ⁶⁴Cu-ESBA212 все еще был способен связываться с амилоидными бляшками на фиксированных срезах, так же как и на нефиксированных срезах мозга (фиг.18).

Пример 14. Мечение бляшек с помощью ⁶⁴Cu-ESBA212 in vivo

Свойства связывания coldly меченого Cu-ESBA212 были исследованы in vivo с использованием трансгенных мышей SwePSl. Мыши получали интраназально или 210 мкг ESBA212, или 100 мкг Cu-ESBA212. Животных забивали через 24 или 48 часов после применения и исследовали мозг на связывание ESBA212 и Cu-ESBA212, соответственно, с амилоидными бляшками.

Как видно на фиг.19 ESBA212, можно было обнаружить через 24, а также через 48 часов после применения. Те же самые результаты наблюдались для Cu-меченых ESBA212. Следовательно, свойства связывания Cu-ESBA212 не изменялись in vivo по сравнению с ESBA212, как уже было продемонстрировано для мечения ех vivo.

Пример 15. Выведение через почки

Для получения некоторой информации о способе выведения ESBA212 scFv вводили мышам внутривенно. Животных забивали вскоре после этого, и почки исследовали с помощью иммуногистохимических методов.

ESBA212 проникал в первичную мочу в почках и обратно всасывался в проксимальных канальцах, где он разрушался наиболее вероятно посредством лизосомального пути (фиг.20).

Пример 16. Мечение бляшек in vivo

Было выполнено дополнительное исследование, подобное исследованию, проведенному в примере 11, с интраназальным введением.

Трансгенных мышей SwePSl обработали интраназально 200 мкг ESBA212. Животное перфузировали через 1 час после интраназальной обработки. Было выполнено Аβ-окрашивание на фиксированных SwePSl срезах мозга мыши и зарегистрировано следующее:

окрашивание анти-His антитело (фиг.21А),

контроль, окрашенный 6Е10 (фиг.21В),

отрицательный контроль, окрашенный анти-кроличьими антителами, меченными Су3 (фиг.21C),

контроль, окрашенный 22с4 IgG (фиг.21D).

Пример 17.

Мышей APPswe/PSlΔE9 обрабатывали в течение 3 месяцев PBS, 22c4 IgG один раз в неделю и ESBA212 дважды в неделю. В конце периода обработки животных перфузировали, мозг отделяли и делили на две части. Одну часть гомогенизировали и получили несколько экстрактов, и определяли уровни Аβ 40 и 42 в мозге с использованием коммерческого тестового набора ELISA (от компании The Genetics Company). Было обнаружено, что уровни Аβ40 и 42 были увеличены в растворимой фракции (TBS) и уменьшены в нерастворимой фракции (GuHCl). В мембрано-связанной фракции (TBS-Тритон) уровень Аβ40 оставался неизмененным, тогда как уровень Аβ42 был увеличен (см. фиг.22). Это указывает на перераспределение Аβ из нерастворимой фракции в растворимую фракцию.

Другую часть использовали для гистологии. Парафиновые срезы обработанных APPswe/PS1ΔE9 мышей были окрашены 6Е10. Число и площадь бляшек оценивали с помощью программного обеспечения ImageJ.

Эксперимент продемонстрировал, что животные, обработанные ESBA212, показывают значительное уменьшение числа, а также уменьшенный размер амилоидных бляшек (см. фиг.23). Это дополнительно подтверждает мысль, что ESBA212 связывается с Аβ фибриллами и потом разбивает их на мономеры или небольшие олигомеры, что сдвигает равновесие по направлению к растворимым Аβ пулам.

Показанные выше результаты подтверждают открытие, что ESBA212 проникает в мозг после внутривенного и интраназального применения и связывается с Абета бляшками в коре и гиппокампе трансгенных мышей. Более того, APPswe/PS1ΔE9 мыши, обработанные интраназально scFv, показали уменьшенное число и средний размер амилоидных бляшек в коре, а также уменьшенные уровни Аβ42 в нерастворимой фракции экстрактов мозга.

Несмотря на то что сейчас были показаны и описаны предпочтительные варианты осуществления изобретения, отчетливо понятно, что изобретение не ограничивается этим, но может быть иным способом по-разному воплощено и применено на практике в рамках следующей формулы изобретения.

Источники информации

Изобретение раскрывает изолированное антитело, которое селективно связывается с С-концевой частью бета-амилоида (Абета) и является гуманизированным или полностью человеческим. Антитело может представлять собой одноцепочечное антитело (scFv), Fab-фрагмент или F(аb′)₂-фрагмент. Антитело способно предотвращать олигомеризацию Абета. Раскрыты последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело по изобретению, вектор и клетка-хозяин для продукции антитела, а также фармакологическая композиция для лечения неврологических расстройств, в частности болезни Альцгеймера. В изобретении представлены способы диагностики с использованием меченых антител по изобретению и лечения неврологических расстройств, связанных с ненормальным накоплением и/или отложением Абета в центральной нервной системе, путем введения субъекту терапевтически эффективного количества полинуклеотида, вектора или клетки-хозяина. Изобретение позволяет успешно применять антитела по изобретению для терапевтических целей и клинического применения, поскольку в противоположность мышиным антителам являются низко- или неиммуногенными при применении у человека. 8 н. и 17 з.п. ф-лы, 23 ил., 1 табл., 17 пр.

1. Изолированное антитело, которое селективно связывается с С-концевой частью бета-амилоида и является гуманизированным или полностью человеческим, включающее:
(i) последовательность фрагмента вариабельной легкой цепи (V_L) с идентичностью, по меньшей мере, 60% относительно последовательности SEQ ID NO:7;
(ii) последовательность фрагмента вариабельной тяжелой цепи (Vн) с идентичностью, по меньшей мере, 60% относительно последовательности SEQ ID NO:17;
(iii) одну или более последовательностей CDR с идентичностью, по меньшей мере, 80% относительно последовательности из группы, состоящей из SEQ ID NO:I, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6.

2. Антитело по п.1, которое предотвращает олигомеризацию бета-амилоида.

3. Антитело по любому из предшествующих пунктов, представляющее собой одноцепочечное антитело (scFv), Fab-фрагмент или F(ab′)₂-фрагмент.

4. Антитело по п.1, включающее SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:17.

5. Антитело по п.1, имеющее SEQ ID NO:24.

6. Антитело по п.1, являющееся химически модифицированным.

7. Антитело по п.6, связанное с терапевтическим средством.

8. Антитело по п.6, соединенное с меткой, в частности, с ⁶⁴Сu.

9. Антитело по п.6, являющееся пэгилированным.

10. Антитело по п.1, демонстрирующее характеристики:
(i) связывание как с бета-амилоидом₄₀, так и с бета-амилоидом₄₂ с высокой и, по существу, одинаковой аффинностью;
(ii) проявление высокой аффинности к олигомерным или мономерным формам бета-амилоида;
(iii) обладание растворимостью, по меньшей мере, 5 мг/мл, предпочтительно, по меньшей мере, 10 мг/мл и более предпочтительно, по меньшей мере, 20 мг/мл.

11. Антитело по п.10, дополнительно демонстрирующее, по меньшей мере, одну, более предпочтительно больше, чем одну, наиболее предпочтительно все из следующих характеристик:
(iv) опосредование поглощения фибриллярного бета-амилоида микроглией;
(v) связывание бета-амилоидных бляшек;
(vi) удаление бета-амилоидных фибрилл в мозге и/или предотвращение образования амилоидных фибрилл в мозге.

12. Антитело по п.1 для применения в диагностике, или скрининге субъекта на амилоидоз или болезнь Альцгеймера, или определении наличия риска развития у субъекта амилоидоза или болезни Альцгеймера.

13. Антитело по п.12, где диагностику осуществляют посредством РЕТ-визуализации.

14. Антитело по п.1 для применения в лечении неврологического расстройства, в частности болезни Альцгеймера, и/или пассивной иммунизации против болезни Альцгеймера.

15. Фармацевтическая композиция для лечения, предотвращения и/или замедления прогрессирования неврологического расстройства, в частности болезни Альцгеймера, и/или пассивной иммунизации против болезни Альцгеймера, содержащая антитело по любому из пп.1-14.

16. Фармацевтическая композиция по п.15, пригодная для интраназального, подкожного, интратекального, интракраниального или внутривенного введения.

17. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по любому из пп.1-14.

18. Вектор для экспрессии или клонирования, содержащий последовательность по п.17.

19. Клетка-хозяин, продуцирующая антитело по любому из пп.1-14, содержащая последовательность по п.17 или вектор по п.18.

20. Способ диагностирования неврологических расстройств, связанных с ненормальным накоплением и/или отложением Абета в центральной нервной системе, включающий этапы:
(i) мечения антитела по любому из пп.1-14;
(ii) введения эффективной дозы указанного антитела интраназально или системно субъекту; и
(iii) измерение концентрации и/или обнаружение присутствия меченого антитела в частях тела субъекта.

21. Способ по п.20, в котором антитело является меченым ⁶⁴Сu.

22. Способ по 20, в котором антитело является одноцепочечным антителом.

23. Способ по п.20, в котором субъект подвергается РЕТ-визуализации.

24. Способ лечения неврологического расстройства, включающий этап введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела по пп.1-14.

25. Способ лечения неврологических расстройств, связанных с ненормальным накоплением и/или отложением Абета в центральной нервной системе, включающий этап введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества полинуклеотида по п.17, вектора по п.18 или клетки-хозяина по п.19.