ИНГИБИТОР РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ГРИППА А НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА Phallus impudicus Российский патент 2013 года по МПК C12N1/14 A61K36/06 

Изобретение относится к противовирусным средствам, в частности к ингибитору репродукции вируса гриппа человека и птиц типа А, и может быть использовано в медицине, вирусологии и фармакологии.

Вирус гриппа А вызывает инфекционные заболевания верхних дыхательных путей. Ежегодно эпидемии гриппа в мире приводят к 3,5 миллионам случаев тяжелых заболеваний и к 300-500 тыс. случаев со смертельным исходом [CDC 2005. Centers for Disease Control. Prevention and control of influenza recommendations of the advisory committee on immunization practices (ACIP) // MMWR. - 2005. - V.54 (RR08). - P.1-40. Available from URL: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr5408a1.html].

Новые эпидемичные штаммы вируса гриппа А возникают каждые 1-2 года в результате точечных мутаций в двух поверхностных гликопротеинах - гемагглютинине (НА) и нейраминидазе (NA). Используя разнообразие и изменчивость антигенной структуры вирионов, вирус гриппа способен обходить защитные механизмы иммунитета человека и, поэтому длительного иммунитета против вируса нет ни после естественной инфекции, ни после вакцинации. До настоящего времени не существует достаточно эффективных средств предотвращения распространения данной инфекции. В настоящее время борьба с инфекцией, вызываемой вирусом гриппа, основывается на лечении гриппа с применением этиотропных, патогенетических и симптоматических средств. Поиск новых эффективных в отношении гриппа лекарственных веществ является одной из приоритетных задач здравоохранения.

Веселка обыкновенная (Phallus impudicus L.: Pers.) является представителем гастеромицетов, относится к порядку Веселковые (Phallales), семейству Веселковые (Phallaceae), роду Веселка (Phallus). Народное название «чертово яйцо», «громовая стрела» и др. отражают способность гриба из стадии яйца стремительно превратиться в плодовое тело, напоминающее фаллос. Используя математическую модель и анализ, ученые рассчитали, что сила, выталкивающая гриб вверх, такова, что три таких гриба могут поднять массу приблизительно 400 кг [Niksic M., Hadzic I. and Glisic M. Is Phallus impudicus a mycological giant? // Micologist, 2004. - Vol.18. - P.21-22].

В народной медицине гриб издавна использовали как средство против ревматизма и подагры. В традиционной медицине гриб используется как противоопухолевое средство, например применяется вместе с химическими препаратами при раке молочной железы [Kuznecova G., Kuznecovs I., Legina K., Kuznecovs S. Lymphederma prevention and management with Phallus impudicus: six years survey after breast cancer treatment // European Journal of Cancer Supplements, 2007. - Vol. 5. - P. 457; Kuznecova G., Kuznecovs I., Legina K., Kuznecovs S. Phallus impudicus in tromboprophylaxis in breast cancer patients undergoing chemotherapy and hormonal treatment // The Breast. Prima. ry therapy of early breast cancer. 10^th International conference, 2007. - Vol.16. - S56]. Phallus impudicus обладает антиоксидантной активностью [Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Филимонова Т.В., Рожкова З.А., Поединок Н.Л., Трухоновец В.В., Осадчая О.В. Phallus impudicus (L.: Pers.), Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers. и Trametes versicolor (Fr.) Quel. - Перспективные объекты биотехнологии // Успехи медицинской микологии. Под редакцией академика РАЕН Ю.В. Сергеева. Материалы четвертого всероссийского конгресса по медицинской микологии. - М., 2006. - Т.7. - С.220-222].

Известны природные соединения, оказывающие ингибирующее действие на вирус гриппа. Например, известно использование водного экстракта гриба Rozites caperata в качестве антивирусного лекарственного средства белковой природы, препятствующее процессу репликации вируса гриппа типа A [Piraino F. F. The Development of the Antiviral Drug RC 28 from Rozites caperata (Pers.: Fr.) P. Karst. (Agaricomycetideae) // International Journal of Medicinal Mushrooms. Vol.7 (2005), p.356].

Известна антивирусная активность экстракта Ganoderma pfeifferi против вируса гриппа типа А и вируса простого герпеса 1 типа. Основным антивирусным компонентом экстракта были тритерпеноиды: ганодермадиол, луцидодиол, апланоксиновая кислота G [Mothana R.A.A., Awadh Аli N.A., Jansen R., Wegner U., Mentel R., Lindequist U. Antiviral lanostanoid triterpenes from the fungus Ganoderma preifferi // Fitoterapia. - 74 (2003).-P. 177-180].

Известны вещества хиспидин и хисполон, имеющие изопреноидную природу и найденные в этанольном экстракте гриба Inonotus hispidus, которые проявляют антивирусную активность против вируса гриппа типа А и типа В. Антивирусную активность проявляли как экстракты плодовых тел, так и мицелиальные экстракты [Ali N.A.A., Jansen R., Pilgrim H., Liberra K., Lindequist U. Hispolon, a yellow pigment from Inonotus hispidus // Phytochemistry. 1996. - V.41, I.3, P.927-929; Awadh Ali N.A., Mothana R.A.A., Lesnau A., Pilgrim H., Lindequist. Antiviral activity of Inonotus hispidus // Fitoterapia. - 74 (2003). - P.483-485].

Наиболее близким аналогом (прототипом) является препарат из водочной настойки веселки, которую авторы и волонтеры употребляли как профилактическое средство перед эпидемиями гриппа, при простудных заболеваниях, вызывает практически 100%-ный эффект защиты [Бабаянц О.В., Бушулян М.А., Залогина М.А. Phallus impudicus L.: Pers. - Перспективы использования в медицине // Успехи медицинской микологии под редакцией академика РАЕН Ю.В. Сергеева. Материалы третьего всероссийского конгресса по медицинской микологии. М., 2005. - Т.5. - С.240-242].

Однако в вышеуказанном аналоге не приведены дозы препарата (концентрация экстракта из плодовых тел веселки в растворе), а также схема применения препарата, основанная на результатах научных исследований, подтверждающих противогриппозную активность экстракта гриба Phallus impudicus в зависимости от концентрации экстрактивных веществ гриба Phallus impudicus.

Техническим результатом заявленного технического решения является обеспечение возможности получения средства на основе водного экстракта базидиального гриба Phallus impudicus или полисахарида из указанного экстракта, обладающего ингибирующим действием в отношении вируса гриппа типа А.

Указанный технический результат достигается тем, что ингибитор репродукции вируса гриппа А, представляющий собой водный экстракт базидиального гриба Phallus impudicus, получают путем экстракции измельченного гриба водой при соотношении 1:5 с последующим удалением из экстракта нерастворимого осадка.

Измельченный базидиальный гриб Phallus impudicus получают из плодовых тел указанного гриба или из мицелия указанного гриба путем культивирования биомассы из плодового тела гриба, находящегося в стадии яйца, в жидкой питательной среде на основе овсяно-кукурузного отвара.

Ниже приведены примеры 1-2 получения экстрактивных веществ из плодовых тел и мицелия гриба Phallus impudicus.

Пример 1. Получение экстракта из плодовых тел. 12 г измельченного замороженного плодового тела суспендировали в 60 мл стерильной дистиллированной воды и обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе (MSE, Англия) в течение 20 мин при амплитуде 24 мкм. Осадок отделяли центрифугированием на центрифуге J-2-21 (Beckman, США) в течение 20 мин при 10000 об/мин. Готовый экстракт заморозили при -20°С. Содержание сухих веществ составляло 5 мг/мл (образец 09-90).

Пример 2. Получение экстракта из мицелия. Phallus impudicus был выделен в чистую культуру из плодового тела гриба, находящегося в стадии яйца. Биомасса мицелия получена в результате культивирования на овсяно-кукурузном отваре в течение 30 сут в стационарных условиях. 5 г измельченной замороженной биомассы суспендировали в 25 мл стерильной.

Пример 3. Определение противовирусной эффективности образцов гриба Phallus impudicus на культуре клеток

Культура клеток. Для тестирования противовирусной активности препаратов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK, полученных из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Клеточная культура MDCK поступает из лаборатории в виде суспензии с указанной концентрацией. В стерильных условиях суспензию разводили предварительно подогретой до температуры +37°С средой RPMI-1640, содержащей 5% сыворотки крови плодов коровы, до концентрации 1,0-1,5×10⁵ клеток/мл. По 100 мкл суспензии клеток MDCK вносили в 96-луночные планшеты 12-канальной автоматической пипеткой. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре +37°С, 5% СО₂ и 100% влажности на 2-3 сут до образования клеточного монослоя.

Определение токсичности образца. Для определения токсических доз препаратов экстракты разводили в несколько раз и оценивали наличие токсического действия в монослоях культуры клеток MDCK с помощью инвертированного микроскопа. Для этого делали разведения исходного препарата в 5 раз, в 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой RPMI-1640, содержащей 5% сыворотки крови плодов коровы, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре +37°С, 5% СО₂ и 100% влажности на 2 сут. Через 2 сут с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями грибных препаратов.

В опытах по определению противовирусной активности грибных препаратов использовали предварительно определенные максимально переносимые концентрации (МПК).

Определение противовирусной активности образца. В работе использовали вирусы гриппа птиц (штамм A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)) и человека (штамм A/Aichi/2/68 (H3N2)), полученные из отдела «Коллекция микроорганизмов» ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Наработку и титрование вирусов производили на 10-суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Концентрации вируса в вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ) составляли по разным экспериментам от 6,5 до 9,5 lg ЭИД₅₀/мл (50% эмбриональных инфицирующих доз в мл).

В опытах по определению противовирусной активности грибных препаратов готовили разведения ВАЖ каждого вируса от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл выбранного разведения экстракта на среде RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина, и 100 мкл разведенного от 1 до 8 или неразведенного ВАЖ. В случае использования неразведенных грибных препаратов или ВАЖ трипсин вносили до конечной концентрации 2 мкг/мл поддерживающей среды в лунке 96-луночного планшета. Заражение клеточного монослоя проводили по общепринятой методике, при этом для культивирования вирусов использовали поддерживающую среду RPMI-1640 фирмы ООО «Биолот», Санкт-Петербург, содержащую 2 мкг/мл трипсина ТРСK (Sigma, США). Клетки инкубировали 2 сут при температуре +37°С в атмосфере 5% СО₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 сут в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

В качестве контроля использовали:

1. Контроль клеток MDCK, культивируемых в питательной среде RPMI-1640 фирмы ООО «Биолот», Санкт-Петербург, содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСK (Sigma, США).

2. Контроль репродукции вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) и A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) с 1 до 8 разведения с десятикратным шагом без внесения препаратов грибных экстрактов.

В табл.1 представлены результаты определения противовирусной активности образцов на культуре клеток в отношении штамма A/Aichi/2/68 (H3N2) вируса гриппа человека.

Как видно из табл.1, экстракт из плодового тела веселки (09-90) проявил высокий антивирусный эффект в отношении вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2). Индекс нейтрализации данного штамма составил 6,3 lg. При этом наблюдалось 100%-ное подавление репродукции вируса. Экстракт из биомассы гриба, полученной в результате культивирования на питательной среде (09-84), проявил в отношении этого же штамма меньший вируснейтрализующий эффект - 2,3 lg. Это связано с меньшим содержанием сухих веществ в экстракте из мицелия, по сравнению с экстрактом из плодового тела. По результатам экспериментов, эффективная концентрация экстракта из плодового тела для полной нейтрализации вируса гриппа (штамм A/Aichi/2/68 (H3N2)) составила 0,05 мг/мл, в то время как эффективная концентрация экстракта из мицелия для нейтрализации этого же вируса на 2,3 lg составила 0,02 мг/мл.

Таблица 1 Антивирусная активность экстрактов из плодового тела и мицелия Phallus impudicus в отношении вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) Препарат и его разведение Содержание сухих веществ, мг/мл Конечная концентрация сухих веществ препарата в культуральной жидкости, мг/мл Инфекционность вируса (титр ВАЖ) в клетках MDCK (ИД₅₀ в lgТЦД₅₀/50 мкл) Индекс нейтрализации ИД₅₀конт-ИД₅₀опыт (lg) 09-90 экстракт из плод. тела 1:30 5,0 0,05 0,0 6,3 09-84 экстракт из мицелия 1:30 2,0 0,02 4,0 2,3 Контроль вируса - - 6,3 0,0

При всех разведениях полное подавление вируса наблюдалось только у экстракта из мицелия веселки (образец 09-84). Даже в разведении 1:10, когда эффективная концентрация гриба составляла всего 0,067 мг/мл, наблюдался 100%-ный вирусингибирующий эффект, который сохранялся и при разведении 1:30. У других образцов, за исключением образца 09-90, начиная с разведения 1:5 происходило падение ингибирующей способности.

Таким образом, антивирусную активность в отношении вируса гриппа типа А проявляет сложный комплекс биологически активных веществ (БАВ), имеющихся в плодовом теле и в культивируемом мицелии гриба.

Изобретение относится к противовирусным средствам и может быть использовано в медицине, вирусологии и фармакологии. Ингибитор репродукции вируса гриппа А представляет собой водный экстракт базидиального гриба Phallus impudicus, полученный путем экстракции измельченного гриба водой при соотношении 1:5 с последующим удалением из экстракта нерастворимого осадка. Ингибитор обладает высокой активностью против вирусов гриппа человека и птиц типа А. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.

1. Ингибитор репродукции вируса гриппа А, представляющий собой водный экстракт базидиального гриба Phallus impudicus, полученный путем экстракции измельченного гриба водой при соотношении 1:5 с последующим удалением из экстракта нерастворимого осадка.

2. Ингибитор репродукции вируса гриппа А по п.1, отличающийся тем, что измельченный базидиальный гриб Phallus impudicus получают из плодовых тел указанного гриба.

3. Ингибитор репродукции вируса гриппа А по п.1, отличающийся тем, что измельченный базидиальный гриб Phallus impudicus получают из мицелия указанного гриба путем культивирования биомассы из плодового тела гриба, находящегося в стадии яйца, в жидкой питательной среде на основе овсяно-кукурузного отвара.