ИНГИБИТОР РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ГРИППА А НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА Phallus impudicus Российский патент 2013 года по МПК C12N1/14 A61K36/06 

Описание патента на изобретение RU2475529C2

Изобретение относится к противовирусным средствам, в частности к ингибитору репродукции вируса гриппа человека и птиц типа А, и может быть использовано в медицине, вирусологии и фармакологии.

Вирус гриппа А вызывает инфекционные заболевания верхних дыхательных путей. Ежегодно эпидемии гриппа в мире приводят к 3,5 миллионам случаев тяжелых заболеваний и к 300-500 тыс. случаев со смертельным исходом [CDC 2005. Centers for Disease Control. Prevention and control of influenza recommendations of the advisory committee on immunization practices (ACIP) // MMWR. - 2005. - V.54 (RR08). - P.1-40. Available from URL: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr5408a1.html].

Новые эпидемичные штаммы вируса гриппа А возникают каждые 1-2 года в результате точечных мутаций в двух поверхностных гликопротеинах - гемагглютинине (НА) и нейраминидазе (NA). Используя разнообразие и изменчивость антигенной структуры вирионов, вирус гриппа способен обходить защитные механизмы иммунитета человека и, поэтому длительного иммунитета против вируса нет ни после естественной инфекции, ни после вакцинации. До настоящего времени не существует достаточно эффективных средств предотвращения распространения данной инфекции. В настоящее время борьба с инфекцией, вызываемой вирусом гриппа, основывается на лечении гриппа с применением этиотропных, патогенетических и симптоматических средств. Поиск новых эффективных в отношении гриппа лекарственных веществ является одной из приоритетных задач здравоохранения.

Веселка обыкновенная (Phallus impudicus L.: Pers.) является представителем гастеромицетов, относится к порядку Веселковые (Phallales), семейству Веселковые (Phallaceae), роду Веселка (Phallus). Народное название «чертово яйцо», «громовая стрела» и др. отражают способность гриба из стадии яйца стремительно превратиться в плодовое тело, напоминающее фаллос. Используя математическую модель и анализ, ученые рассчитали, что сила, выталкивающая гриб вверх, такова, что три таких гриба могут поднять массу приблизительно 400 кг [Niksic M., Hadzic I. and Glisic M. Is Phallus impudicus a mycological giant? // Micologist, 2004. - Vol.18. - P.21-22].

В народной медицине гриб издавна использовали как средство против ревматизма и подагры. В традиционной медицине гриб используется как противоопухолевое средство, например применяется вместе с химическими препаратами при раке молочной железы [Kuznecova G., Kuznecovs I., Legina K., Kuznecovs S. Lymphederma prevention and management with Phallus impudicus: six years survey after breast cancer treatment // European Journal of Cancer Supplements, 2007. - Vol. 5. - P. 457; Kuznecova G., Kuznecovs I., Legina K., Kuznecovs S. Phallus impudicus in tromboprophylaxis in breast cancer patients undergoing chemotherapy and hormonal treatment // The Breast. Prima. ry therapy of early breast cancer. 10th International conference, 2007. - Vol.16. - S56]. Phallus impudicus обладает антиоксидантной активностью [Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Филимонова Т.В., Рожкова З.А., Поединок Н.Л., Трухоновец В.В., Осадчая О.В. Phallus impudicus (L.: Pers.), Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers. и Trametes versicolor (Fr.) Quel. - Перспективные объекты биотехнологии // Успехи медицинской микологии. Под редакцией академика РАЕН Ю.В. Сергеева. Материалы четвертого всероссийского конгресса по медицинской микологии. - М., 2006. - Т.7. - С.220-222].

Известны природные соединения, оказывающие ингибирующее действие на вирус гриппа. Например, известно использование водного экстракта гриба Rozites caperata в качестве антивирусного лекарственного средства белковой природы, препятствующее процессу репликации вируса гриппа типа A [Piraino F. F. The Development of the Antiviral Drug RC 28 from Rozites caperata (Pers.: Fr.) P. Karst. (Agaricomycetideae) // International Journal of Medicinal Mushrooms. Vol.7 (2005), p.356].

Известна антивирусная активность экстракта Ganoderma pfeifferi против вируса гриппа типа А и вируса простого герпеса 1 типа. Основным антивирусным компонентом экстракта были тритерпеноиды: ганодермадиол, луцидодиол, апланоксиновая кислота G [Mothana R.A.A., Awadh Аli N.A., Jansen R., Wegner U., Mentel R., Lindequist U. Antiviral lanostanoid triterpenes from the fungus Ganoderma preifferi // Fitoterapia. - 74 (2003).-P. 177-180].

Известны вещества хиспидин и хисполон, имеющие изопреноидную природу и найденные в этанольном экстракте гриба Inonotus hispidus, которые проявляют антивирусную активность против вируса гриппа типа А и типа В. Антивирусную активность проявляли как экстракты плодовых тел, так и мицелиальные экстракты [Ali N.A.A., Jansen R., Pilgrim H., Liberra K., Lindequist U. Hispolon, a yellow pigment from Inonotus hispidus // Phytochemistry. 1996. - V.41, I.3, P.927-929; Awadh Ali N.A., Mothana R.A.A., Lesnau A., Pilgrim H., Lindequist. Antiviral activity of Inonotus hispidus // Fitoterapia. - 74 (2003). - P.483-485].

Наиболее близким аналогом (прототипом) является препарат из водочной настойки веселки, которую авторы и волонтеры употребляли как профилактическое средство перед эпидемиями гриппа, при простудных заболеваниях, вызывает практически 100%-ный эффект защиты [Бабаянц О.В., Бушулян М.А., Залогина М.А. Phallus impudicus L.: Pers. - Перспективы использования в медицине // Успехи медицинской микологии под редакцией академика РАЕН Ю.В. Сергеева. Материалы третьего всероссийского конгресса по медицинской микологии. М., 2005. - Т.5. - С.240-242].

Однако в вышеуказанном аналоге не приведены дозы препарата (концентрация экстракта из плодовых тел веселки в растворе), а также схема применения препарата, основанная на результатах научных исследований, подтверждающих противогриппозную активность экстракта гриба Phallus impudicus в зависимости от концентрации экстрактивных веществ гриба Phallus impudicus.

Техническим результатом заявленного технического решения является обеспечение возможности получения средства на основе водного экстракта базидиального гриба Phallus impudicus или полисахарида из указанного экстракта, обладающего ингибирующим действием в отношении вируса гриппа типа А.

Указанный технический результат достигается тем, что ингибитор репродукции вируса гриппа А, представляющий собой водный экстракт базидиального гриба Phallus impudicus, получают путем экстракции измельченного гриба водой при соотношении 1:5 с последующим удалением из экстракта нерастворимого осадка.

Измельченный базидиальный гриб Phallus impudicus получают из плодовых тел указанного гриба или из мицелия указанного гриба путем культивирования биомассы из плодового тела гриба, находящегося в стадии яйца, в жидкой питательной среде на основе овсяно-кукурузного отвара.

Ниже приведены примеры 1-2 получения экстрактивных веществ из плодовых тел и мицелия гриба Phallus impudicus.

Пример 1. Получение экстракта из плодовых тел. 12 г измельченного замороженного плодового тела суспендировали в 60 мл стерильной дистиллированной воды и обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе (MSE, Англия) в течение 20 мин при амплитуде 24 мкм. Осадок отделяли центрифугированием на центрифуге J-2-21 (Beckman, США) в течение 20 мин при 10000 об/мин. Готовый экстракт заморозили при -20°С. Содержание сухих веществ составляло 5 мг/мл (образец 09-90).

Пример 2. Получение экстракта из мицелия. Phallus impudicus был выделен в чистую культуру из плодового тела гриба, находящегося в стадии яйца. Биомасса мицелия получена в результате культивирования на овсяно-кукурузном отваре в течение 30 сут в стационарных условиях. 5 г измельченной замороженной биомассы суспендировали в 25 мл стерильной.

Пример 3. Определение противовирусной эффективности образцов гриба Phallus impudicus на культуре клеток

Культура клеток. Для тестирования противовирусной активности препаратов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK, полученных из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Клеточная культура MDCK поступает из лаборатории в виде суспензии с указанной концентрацией. В стерильных условиях суспензию разводили предварительно подогретой до температуры +37°С средой RPMI-1640, содержащей 5% сыворотки крови плодов коровы, до концентрации 1,0-1,5×105 клеток/мл. По 100 мкл суспензии клеток MDCK вносили в 96-луночные планшеты 12-канальной автоматической пипеткой. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре +37°С, 5% СО2 и 100% влажности на 2-3 сут до образования клеточного монослоя.

Определение токсичности образца. Для определения токсических доз препаратов экстракты разводили в несколько раз и оценивали наличие токсического действия в монослоях культуры клеток MDCK с помощью инвертированного микроскопа. Для этого делали разведения исходного препарата в 5 раз, в 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой RPMI-1640, содержащей 5% сыворотки крови плодов коровы, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре +37°С, 5% СО2 и 100% влажности на 2 сут. Через 2 сут с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями грибных препаратов.

В опытах по определению противовирусной активности грибных препаратов использовали предварительно определенные максимально переносимые концентрации (МПК).

Определение противовирусной активности образца. В работе использовали вирусы гриппа птиц (штамм A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)) и человека (штамм A/Aichi/2/68 (H3N2)), полученные из отдела «Коллекция микроорганизмов» ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Наработку и титрование вирусов производили на 10-суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Концентрации вируса в вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ) составляли по разным экспериментам от 6,5 до 9,5 lg ЭИД50/мл (50% эмбриональных инфицирующих доз в мл).

В опытах по определению противовирусной активности грибных препаратов готовили разведения ВАЖ каждого вируса от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл выбранного разведения экстракта на среде RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина, и 100 мкл разведенного от 1 до 8 или неразведенного ВАЖ. В случае использования неразведенных грибных препаратов или ВАЖ трипсин вносили до конечной концентрации 2 мкг/мл поддерживающей среды в лунке 96-луночного планшета. Заражение клеточного монослоя проводили по общепринятой методике, при этом для культивирования вирусов использовали поддерживающую среду RPMI-1640 фирмы ООО «Биолот», Санкт-Петербург, содержащую 2 мкг/мл трипсина ТРСK (Sigma, США). Клетки инкубировали 2 сут при температуре +37°С в атмосфере 5% СО2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 сут в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

В качестве контроля использовали:

1. Контроль клеток MDCK, культивируемых в питательной среде RPMI-1640 фирмы ООО «Биолот», Санкт-Петербург, содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСK (Sigma, США).

2. Контроль репродукции вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) и A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) с 1 до 8 разведения с десятикратным шагом без внесения препаратов грибных экстрактов.

В табл.1 представлены результаты определения противовирусной активности образцов на культуре клеток в отношении штамма A/Aichi/2/68 (H3N2) вируса гриппа человека.

Как видно из табл.1, экстракт из плодового тела веселки (09-90) проявил высокий антивирусный эффект в отношении вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2). Индекс нейтрализации данного штамма составил 6,3 lg. При этом наблюдалось 100%-ное подавление репродукции вируса. Экстракт из биомассы гриба, полученной в результате культивирования на питательной среде (09-84), проявил в отношении этого же штамма меньший вируснейтрализующий эффект - 2,3 lg. Это связано с меньшим содержанием сухих веществ в экстракте из мицелия, по сравнению с экстрактом из плодового тела. По результатам экспериментов, эффективная концентрация экстракта из плодового тела для полной нейтрализации вируса гриппа (штамм A/Aichi/2/68 (H3N2)) составила 0,05 мг/мл, в то время как эффективная концентрация экстракта из мицелия для нейтрализации этого же вируса на 2,3 lg составила 0,02 мг/мл.

Таблица 1 Антивирусная активность экстрактов из плодового тела и мицелия Phallus impudicus в отношении вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) Препарат и его разведение Содержание сухих веществ, мг/мл Конечная концентрация сухих веществ препарата в культуральной жидкости, мг/мл Инфекционность вируса (титр ВАЖ) в клетках MDCK (ИД50 в lgТЦД50/50 мкл) Индекс нейтрализации ИД50конт-ИД50опыт (lg) 09-90 экстракт из плод. тела 1:30 5,0 0,05 0,0 6,3 09-84 экстракт из мицелия 1:30 2,0 0,02 4,0 2,3 Контроль вируса - - 6,3 0,0

При всех разведениях полное подавление вируса наблюдалось только у экстракта из мицелия веселки (образец 09-84). Даже в разведении 1:10, когда эффективная концентрация гриба составляла всего 0,067 мг/мл, наблюдался 100%-ный вирусингибирующий эффект, который сохранялся и при разведении 1:30. У других образцов, за исключением образца 09-90, начиная с разведения 1:5 происходило падение ингибирующей способности.

Таким образом, антивирусную активность в отношении вируса гриппа типа А проявляет сложный комплекс биологически активных веществ (БАВ), имеющихся в плодовом теле и в культивируемом мицелии гриба.

Похожие патенты RU2475529C2

название год авторы номер документа
ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ СУХОГО ЭКСТРАКТА ПЛОДОВОГО ТЕЛА КСИЛОТРОФНОГО БАЗИДИОМИЦЕТА Bjerkandera adusta 2015
  • Мазуркова Наталья Алексеевна
  • Ибрагимова Жанна Борисовна
  • Филиппова Екатерина Игоревна
  • Трошкова Галина Павловна
  • Макаревич Елена Викторовна
  • Костина Нина Егоровна
  • Проценко Мария Анатольевна
  • Шишкина Лариса Николаевна
  • Власенко Вячеслав Александрович
RU2580296C1
ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ШТАММА НЕМАТОФАГОВОГО ГРИБА Duddingtonia flagrans F-882 2011
  • Теплякова Тамара Владимировна
  • Косогова Татьяна Алексеевна
  • Мазуркова Наталья Алексеевна
  • Ибрагимова Жанна Борисовна
  • Гашникова Наталья Матвеевна
  • Ананько Григорий Григорьевич
  • Булычев Леонид Егорович
  • Ставский Евгений Александрович
RU2475531C2
ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ СУХОГО ЭКСТРАКТА ПЛОДОВОГО ТЕЛА БАЗИДИОМИЦЕТА Coprinus comatus 2015
  • Мазуркова Наталья Алексеевна
  • Ибрагимова Жанна Борисовна
  • Филиппова Екатерина Игоревна
  • Макаревич Елена Викторовна
  • Костина Нина Егоровна
  • Шишкина Лариса Николаевна
  • Горбунова Ирина Александровна
RU2584751C1
ИНГИБИТОР РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ГРИППА А НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА Laetiporus sulphureus 2011
  • Теплякова Тамара Владимировна
  • Косогова Татьяна Алексеевна
  • Мазуркова Наталья Алексеевна
  • Шишкина Лариса Николаевна
  • Кабанов Алексей Сергеевич
  • Пучкова Лариса Ивановна
  • Сергеев Александр Николаевич
RU2475530C2
Водорастворимый пигмент меланин из базидиального гриба Inonotus obliquus, обладающий противовирусной активностью 2022
  • Теплякова Тамара Владимировна
  • Маркович Наталья Алексеевна
  • Гашникова Мария Петровна
  • Гашникова Наталья Матвеевна
  • Мазуркова Наталья Алексеевна
  • Мазурков Олег Юрьевич
  • Макаревич Елена Викторовна
  • Проценко Мария Анатольевна
RU2800446C1
ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ МЕЛАНИНА 2011
  • Теплякова Тамара Владимировна
  • Пучкова Лариса Ивановна
  • Косогова Татьяна Алексеевна
  • Булычев Леонид Егорович
  • Шишкина Лариса Николаевна
  • Мазуркова Наталья Алексеевна
  • Гашникова Наталья Матвеевна
  • Балахнин Сергей Маркович
  • Кабанов Алексей Сергеевич
  • Казачинская Елена Ивановна
  • Афонина Вероника Сергеевна
RU2480227C2
ШТАММ БАКТЕРИЙ Serratia plymuthica, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСОВ ГРИППА ТИПА А (ЕГО ВАРИАНТЫ) 2013
  • Пучкова Лариса Ивановна
  • Афонина Вероника Сергеевна
  • Андреева Ирина Сергеевна
  • Селиванова Марина Александровна
  • Мазуркова Наталья Алексеевна
  • Макаревич Елена Викторовна
  • Соловьянова Надежда Алексеевна
RU2551316C1
ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ НУКЛЕАЗЫ БАКТЕРИЙ РОДА SERRATIA 2014
  • Пучкова Лариса Ивановна
  • Ибрагимова Жанна Борисовна
  • Мазуркова Наталья Алексеевна
  • Андреева Ирина Сергеевна
RU2580242C2
ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ ИЗ Alchemilla vulgaris L. 2015
  • Мазуркова Наталья Алексеевна
  • Кукушкина Татьяна Абдулхаиловна
  • Филиппова Екатерина Игоревна
  • Ибрагимова Жанна Борисовна
RU2580304C1
ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ СУХОГО ЭКСТРАКТА ЛИШАЙНИКА Cetraria islandica 2015
  • Мазуркова Наталья Алексеевна
  • Седельникова Нелля Васильевна
  • Филиппова Екатерина Игоревна
  • Макаревич Елена Викторовна
  • Костина Нина Егоровна
  • Кукушкина Татьяна Абдулхаиловна
RU2580305C1

Реферат патента 2013 года ИНГИБИТОР РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ГРИППА А НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА Phallus impudicus

Изобретение относится к противовирусным средствам и может быть использовано в медицине, вирусологии и фармакологии. Ингибитор репродукции вируса гриппа А представляет собой водный экстракт базидиального гриба Phallus impudicus, полученный путем экстракции измельченного гриба водой при соотношении 1:5 с последующим удалением из экстракта нерастворимого осадка. Ингибитор обладает высокой активностью против вирусов гриппа человека и птиц типа А. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.

Формула изобретения RU 2 475 529 C2

1. Ингибитор репродукции вируса гриппа А, представляющий собой водный экстракт базидиального гриба Phallus impudicus, полученный путем экстракции измельченного гриба водой при соотношении 1:5 с последующим удалением из экстракта нерастворимого осадка.

2. Ингибитор репродукции вируса гриппа А по п.1, отличающийся тем, что измельченный базидиальный гриб Phallus impudicus получают из плодовых тел указанного гриба.

3. Ингибитор репродукции вируса гриппа А по п.1, отличающийся тем, что измельченный базидиальный гриб Phallus impudicus получают из мицелия указанного гриба путем культивирования биомассы из плодового тела гриба, находящегося в стадии яйца, в жидкой питательной среде на основе овсяно-кукурузного отвара.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2013 года RU2475529C2

БАБАЯНЦ О.В
И ДР
Phallus impudicus L.: PERS
- перспективы использования в медицине
Успехи медицинской микологии
Материалы третьего всероссийского конгресса по медицинской микологии
- М., 2005, т.5, с.240-242
US 20050163800 А1, 28.07.2005
JP 55157517 А 08.12.1980
Способ получения полисахаридов, обладающих противоопухолевым действием 1976
  • Киро Асано
  • Цуеси Сайто
  • Хиромицу Танака
  • Сатору Эномото
SU786855A3
БАБИЦКАЯ В.Г
И ДР
Phallus impudicus (L.: Pers.),

RU 2 475 529 C2

Авторы

Теплякова Тамара Владимировна

Косогова Татьяна Алексеевна

Мазуркова Наталья Алексеевна

Макаревич Елена Викторовна

Ставский Евгений Александрович

Даты

2013-02-20Публикация

2011-03-14Подача