СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОАФФИННЫХ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ Российский патент 2013 года по МПК C07K16/00 C07K16/06 G01N33/53 

Область техники

Изобретение относится к области иммунологии, биотехнологии и медицинской диагностики, в частности касается способа получения высокоаффинных поликлональных антител. Использование антител, полученных в соответствии со способом настоящего изобретения, позволяет значительно повысить чувствительность и специфичность методов иммуноанализа, а также эффективность диагностики, прогнозирования и послеоперационного мониторинга целого ряда заболеваний.

Предшествующий уровень техники

Применяемые в настоящее время методы иммунологического анализа основываются на анализе продукта реакции двух иммунных агентов: антигена, определяющего анализируемое вещество, и узнающего его антитела, обладающего значительной специфичностью/избирательностью по отношению к антигену. Антитело обычно является тетрамером, состоящим из двух тяжелых цепей (каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон или мю) и двух легких цепей (каппа или лямбда), каждая из которых представлена в сыворотке тысячами различных вариантов, отличающихся структурой антиген-связывающего участка (вариабельного района), образующегося в результате рекомбинации ДНК в клетках иммунной системы. Каждый антиген-связывающий участок индивидуального антитела распознает фрагмент первичной или пространственной структуры индивидуального антигена (эпитоп) или одновременно нескольких антигенов, попадающих в организм из окружающей среды. Иммунизация антигеном лабораторных животных (таких как мышь, кролик, коза, верблюд и.т.п.) приводит к появлению в их сыворотке крови антиген-специфичных антител, образующихся в результате пролиферации клеток, производящих цепи антиген-связывающих иммуноглобулинов. Сыворотка крови таких лабораторных животных (т.н. антисыворотка) содержит десятки типов поликлональных (т.е. связывающихся с различными участками антигена) антиген-специфичных антител, преимущественно относящихся к иммуноглобулинам G (А.Ройт, Дж.Брюсстофф, Д.Мейл. Иммунология - М.: Мир, 2000).

Очистка антиген-специфичных антител из антисыворотки позволяет количественно анализировать присутствие антигена в сложных белковых смесях с использованием методов иммуноанализа. При этом после добавления антител к содержащему антиген образцу, проводится разрушение неспецифических комплексов антигена и антитела с компонентами образца отмывкой хаотропными или другими буферами, а количество оставшихся комплексов антиген-антитело определяется с помощью аналитических тестов, основанных на использовании: 1) конъюгатов антител с ферментом, активность которого приводит к последующему изменению окраски смеси в результате добавления в систему хромогенного субстрата фермента (Ausubel F.M. et al (eds). Short protocols in molecular biology. 1995, p.10-40. J. Willey & Sons Inc.); 2) конъюгатов антитела с ДНК-репортером, амплификация которого позволяет количественно оценить количество связавшегося с антителом антигена в результате ПЦР (Sikes H.D., Jenison R., Bowman C.N. Antigen detection using polymerization-based amplification. 2009. Lab Chip, 9, 653-656).

Антисыворотки, полученные после иммунизации лабораторных животных антигеном, содержат как высокоаффинные антитела к антигену (константа аффинности, K_a>10⁷ л/моль), так и антитела со средней и низкой аффинностью, составляющие 90% выработанных антител (Notkins A.L. Polyreactivity of antibody molecules. 2004. Trends in Immunology, 25, 174-9). Поскольку современные методы очистки поликлональных антител не позволяют полностью удалить низко- и среднеаффинные антитела из антисыворотки, их присутствие в препаратах антител приводит к резкому снижению чувствительности и специфичности подавляющего большинства иммунологических тестов.

Единственный способ удаления низкоаффинных антител из антисыворотки, описанный в литературе, позволяет получать поликлональные антитела со средней константой аффинности 1,5×10⁷ л/моль (Shimizu F. et al. Separation of anti-dinitrophenyl antibodies according to affinity by fractionated elution from immunoadsorbent using thyocyanate. 1978. Res. Exp. Med. (Berl.) 173, 165-71). Способ включает следующие стадии:

1) нанесение антисыворотки на сорбент, содержащий иммобилизованный антиген, использовавшийся для иммунизации животных, количество которого находится в молярном избытке к количеству высокоаффинных антител;

2) последовательную отмывку колонки растворами 0.5 М, 2 М и 3 М роданида калия (хаотропного агента, частично разрушающего внутримолекулярные и межмолекулярные водородные и ионные связи антигена и антитела);

3) удаление хаотропного агента диализом.

Основным недостатком данного способа является то, что при нанесении антисыворотки на сорбент с иммобилизованным антителом в условиях избытка антигена, с сорбентом связываются все антиген-специфичные антитела, образовавшиеся в результате иммунизации, что резко затрудняет последующее удаление низко- и среднеаффинных антител.

Настоящее изобретение направлено на преодоление этого недостатка известных способов очистки поликлональных антител.

Краткое описание изобретения

Первый аспект настоящего изобретения предусматривает способ получения высокоаффинных поликлональных антител.

Предложенный способ включает следующие стадии:

а) нанесение раствора антител на аффинный сорбент с иммобилизованным антигеном при молярном избытке антиген-специфичных антител к антигену;

б) удаление белков и низкоаффинных антител путем промывки сорбента буфером;

в) удаление связавшихся с сорбентом среднеаффинных антител умеренно хаотропным агентом;

г) элюцию с сорбента высокоаффинных антител сильным хаотропным агентом;

д) удаление хаотропного агента;

е) при необходимости удаление агрегатов антител.

Согласно изобретению в качестве антител используют антисыворотку, иммуноглобулины или аффинно очищенные антитела. Иммуноглобулины получают с помощью преципитации, ультрафильтрации или гель-фильтрации или используют коммерчески доступные иммуноглобулины. Аффинно очищенные антитела получают с помощью аффинной хроматографии или используют коммерчески доступные аффинно-очищенные антитела.

Согласно изобретению в качестве антигена используют интактный природный или рекомбинантный полипептид или его фрагмент или химически синтезированный пептид, конъюгированный с белком-носителем или денатурированный природный или рекомбинантный полипептид или его фрагмент.

Согласно изобретению молярный избыток антиген-специфичных антител к антигену составляет более 10:1, предпочтительно 50:1, что в среднем соответствует 50 мл антисывортки на 3-5 нмоль иммобилизованного антигена.

Согласно изобретению в качестве хаотропного агента используют LiCl, MgCl₂ или глицин; предпочтительно на стадии в) используют 1 М LiCl, а на стадии г) - 5 М LiCl.

Согласно изобретению хаотропный агент удаляют с помощью гель-фильтрации, ультрафильтрации или диализа, предпочтительно удаление хаотропного агента и удаление агрегатов антител проводят в одну стадию с помощью гель-фильтрации.

Второй аспект настоящего изобретения предусматривает высокоаффинные антитела, полученные согласно предложенному способу, имеющие константу аффинности более 10⁷ л/моль, предпочтительно 10⁹ л/моль или более.

Третий аспект настоящего изобретения предусматривает применение высокоаффинных антител, полученных согласно предложенному способу, для иммуноанализа, в частности для иммуноферментного анализа, иммунофлуоресцентного анализа, иммуно-ПЦР, Вестерн блоттинга и дот блоттинга, иммуногистохимического анализа и иммунопреципитации.

Далее изобретение будет раскрыто более подробно со ссылкой на отдельные иллюстративные примеры и фигуры.

Перечень фигур

Фиг.1 показывает результаты очистки антител к денатурированному антигену AKR1B10:

1А - профиль элюции, полученный в процессе аффинной хроматографии антисыворотки с использованием ступенчатой элюции антител раствором LiCl (ОЕ - относительные единицы);

1Б - профиль гель-фильтрации объединенных фракций, полученных при элюции аффинной колонки 5 М LiCl (ОЕ - относительные единицы).

Фиг.2 показывает результаты разделения объединенных фракций пиков, показанных на Фиг.1А, электрофорезом в 10% денатурирующем полиакриламидном геле. Номера над дорожками соответствуют: 1 - антителам, полученным после элюции аффиного сорбента 1 М LiCl; 2 - антителам, полученным после элюции аффинного носителя 5 М LiCl; 3 - антителам, полученным после гель-фильтрации объединенных фракций первого (минорного) пика на Фиг.1; 4 - антителам, полученным после гель-фильтрации объединенных фракций второго (мажорного) пика, на Фиг.1Б; 5 - антителам, нанесенным в дорожку 4 с добавлением в буфер нанесения 50 мМ дитиотреитола (для разделения тяжелых и легких цепей антител); 6 - набору белковых стандартов молекулярного веса.

Фиг.3 показывает результаты Вестерн блоттинга тотальных белковых экстрактов аденокарциномы (Т) и нормальной ткани (N) толстой кишки человека с использованием антител к белку AKR1B10, полученных способом настоящего изобретения (А) и коммерческих антител к тому же антигену (Б). Слева указано положение стандартов молекулярного веса в кДа.

Фиг.4 показывает результаты Вестерн блоттинга тотальных белковых экстрактов аденокарциномы (Т) и нормальной ткани (N) толстой кишки человека с использованием антител к экстрацеллюлярной части белка ЕрСАМ, полученных способом настоящего изобретения (А) и коммерческих антител к тому же антигену (Б). Слева указано положение стандартов молекулярного веса в кДа.

Фиг.5 показывает результаты дот блоттинга указанных количеств очищенного рекомбинантного белка ЕрСАМ с использованием антител к его экстрацеллюлярной части, полученных способом настоящего изобретения (А) и коммерческих антител к тому же антигену (Б). Слева указано положение стандартов молекулярного веса в кДа.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является повышение аффинности антиген-специфичных поликлональных антител.

Поставленная задача решается с помощью способа получения высокоаффинных поликлональных антител.

Предложенный способ включает следующие стадии:

а) нанесение раствора антител на аффинный сорбент с иммобилизованным антигеном при молярном избытке антиген-специфичных антител к антигену;

б) удаление белков сыворотки и низкоаффинных антител путем промывки сорбента буфером;

в) удаление связавшихся с сорбентом среднеаффинных антител путем его промывки умеренно хаотропным агентом;

г) элюцию с сорбента высокоаффинных антител хаотропным агентом;

д) удаление хаотропного агента;

е) при необходимости удаление агрегатов антител.

Согласно изобретению в качестве антител можно использовать антисыворотку, иммуноглобулины или аффинно очищенные антитела.

Антисыворотку можно получить путем иммунизации антигеном лабораторных животных, таких как мышь, кролик, коза, верблюд и.т.п. (Cooper H.M., Paterson Y. Production of polyclonal antisera. 2001. Curr. Protoc. Immunol. Chapter 2: Unit 2.4.).

Альтернативно можно использовать коммерчески доступные антисыворотки.

Иммуноглобулины можно получить с помощью высаливания сульфатом аммония (натрия), преципитации (например, с использованием полиэтиленгликоля или каприловой кислоты), ультрафильтрации или гель-фильтрации, а также аффинной хроматографии (в последнем случае используют сорбенты с иммобилизованными белками А или G или тиофильную адсорбционную хроматографию) (BD Biosciences Clontech. Purification of immunoglobulins. 1998.; Vijayalakalashmi MA. Antibody purification methods. 1998. Applied. Biochem. Biotechnol. 75, 93-102.)

Альтернативно можно использовать коммерчески доступные иммуноглобулины.

Аффинно очищенные антитела можно получить с помощью аффинной хроматографии, которая позволяет разделять сложные смеси на основе специфического взаимодействия белка с его лигандом (в данном случае с антигеном, иммобилизованным на сорбенте). При этом компоненты смеси, прочно не связавшиеся с сорбентом, удаляют промывкой буфером, а антитела элюируют кислыми (рН менее 2.5) или щелочными (рН более 10) хаотропами (Fitzgerald J, Leonard P, Darcy E, O′Kennedy R. Immunoaffinity chromatography. 2011. Methods Mol Biol. 681, 35-59).

Альтернативно можно использовать коммерчески доступные аффинно-очищенные антитела.

Согласно изобретению в качестве антигена можно использовать интактный природный или рекомбинантный полипептид или его фрагмент или химически синтезированный пептид, конъюгированный с белком-носителем или денатурированный природный или рекомбинантный полипептид или его фрагмент.

Согласно изобретению иммобилизация антигена на сорбенте может осуществляться в результате взаимодействия его амино-, карбоксильных или тиольных групп с активированными группами сорбента (например, взаимодействия аминогрупп антигена с активированными бромцианом гидроксильными группами сорбента), взаимодействия окисленных перйодатом олигосахаридных остатков природного антигена с гидразидными или гидроксиламиновыми остатками сорбента, а также адгезии антигена на микрочастицы (Kalia J., Raines R.T. Advances in Bioconjugation. 2010. Curr. Org. Chem. 14, 138-147).

Согласно изобретению молярный избыток антиген-специфичных антител к иммобилизованному на сорбенте антигену составляет более 10:1, предпочтительно 50:1, что соответствует 50 мл антисывортки на 3-5 нмоль иммобилизованного антигена (в зависимости от иммунного ответа используемого лабораторного животного и иммуногенности антигена). При использовании в качестве раствора антител иммуноглобулинов или аффинно-очищенных антител используют соответствующий молярный эквивалент. При расчете необходимых для нанесения на сорбент количеств антисыворотки (или фракций иммуноглобулинов или очищенных другими способами антител), следует исходить из того, что количество антиген-специфичных антител составляет в среднем 10% от общего количества иммуноглобулинов антисыворотки или их очищенной фракции, тогда как высокоаффинные антитела в среднем составляют 10-20% от количества антиген-специфичных антител (Reddy S.T. et al. Monoclonal antibodies isolated without screening by analyzing the variable-gene repertoire of plasma cells. 2010. Nat. Biotechnol. 28, 965-71). В случае низкой иммуногенности антигена, использовавшегося для иммунизации, количество антиген-специфичных антител в препарате антисыворотки или фракции иммуноглобулинов или очищенных другими способами антител может быть предварительно оценено методом иммуноферментного анализа.

Использование правильно рассчитанного избытка антител к иммобилизованному антигену позволяет минимизировать связывание низко- и среднеаффинных антител с сорбентом в результате конкуренции этих антител с высокоаффинными антителами. Снижение этого соотношения приводит к связыванию с сорбентом средне- и низкоспецифичных антител, что значительно затрудняет их последующее удаление, поскольку часть таких антител не удаляется умеренно хаотропными агентами (например, в результате образования сильных гидрофобных связей с эпитопом антигена). Использование более высоких соотношений антиген-специфичных антител к антигену понижает выход высокоспецифичных антител, поскольку они начинают конкурировать друг с другом. Кроме того, наиболее аффинные антитела в этом случае невозможно элюировать с сорбента, не избежав их необратимой денатурации.

Согласно изобретению в качестве хаотропного агента можно использовать любой хаотропный агент (преимущественно LiCl, MgCl₂ или глицин), т.е. вещество, которое частично или полностью разрушает трехмерную структуру макромолекул в результате дестабилизации внутримолекулярных водородных, гидрофобных или ионных связей. Состав хаотропных агентов в каждом случае определяется эмпирически: для дестабилизации водородных связей используются растворы, увеличивающие дипольный момент растворителя (например, 2-8 М мочевина и 2-6 М гуанидинхлорид), разрыв гидрофобных связей достигается в результате применения детергентов (например, 1% SDS или 1% дезоксихолата натрия), тогда как для дестабилизации ионных связей наиболее часто используются 0,1 М глицин-Na, рН 10,0 (экранирование положительных зарядов), а также 0,1 М глицин с добавлением соляной кислоты (рН 2, 3) и 1 М уксусная кислота (экранирование отрицательных зарядов). Для экранирования зарядов обоих типов и одновременной дестабилизации водородных связей применяются 3-5 М растворы LiCl, MgCl₂, KCl, KI и роданида калия. Хаотропность агента может быть изменена в результате уменьшения или увеличения его концентрации (для растворов солей и детергентов) или рН (для щелочных и кислых хаотропов), что позволяет получать «умеренные» и «сильные» хаотропные агенты (Dimitrov J.D., Lacroix-Desmazes, Kaveri S.V., Vassiliev T.L. Insight into the mechanism of the acquired antibody auto-reactivity. 2008. Autoimmun. Rev., 7, 410-414).

Согласно изобретению на стадии отмывки среднеаффинных антител предпочтительно используют 1 М LiCl, а на стадии элюции высокоаффинных антител предпочтительно применяют раствор 5 М LiCl. Использование этих хаотропов позволяет наиболее мягко (т.е. в отсутствие необратимой денатурации) экранировать ионные связи и одновременно разрушить водородные связи в составе комплексов антиген-антитело, что позволяет получать практически интактные ренатурированные антитела с нативной трехмерной структурой (согласно методу кругового дихроизма и оценки константы аффинности).

Согласно изобретению хаотропный агент после элюции антител можно удалить с помощью гель-фильтрации, ультрафильтрации или диализа (Janson J-C. Protein purification: principles, high resolution methods, and applications. 2011. Wiley series in methods of biochemical analysis, p.1-269).

Согласно изобретению предпочтительно одновременное удаление хаотропного агента и агрегатов антител (которые имеют меньшую активность по сравнению с индивидуальными антителами вследствие частичной денатурации входящих в их состав антител) с помощью гель-фильтрации. При использовании ультрафильтрации или диализа одновременное удаление хаотропа и агрегатов антител становится невозможным, поскольку эти методы позволяют удалять лишь вещества с низким молекулярным весом.

Настоящее изобретение также предусматривает полученные способом настоящего изобретения высокоаффинные антитела, имеющие константу аффинности более 10⁷ л/моль, предпочтительно 10⁹ л/моль или более. Оценка аффинности полученных способом настоящего изобретения антител к белку AKR1B10 показала, что их средняя константа аффинности (10⁹ л/моль) возрастает почти в сто раз по сравнению с исходной антисывороткой (2×10⁷ л/моль) и коммерческими препаратами (3×10⁷ л/моль) (Табл.1). Таким образом, способ настоящего изобретения позволяет заметно повысить аффинность поликлональных антител в результате их конкуренции с низко- и среднеаффинными антиген-специфичными антителами при нанесении антисыворотки на сорбент. Количество антител, полученных по способу настоящего изобретения, в среднем составляет 2-3% от общего количества антиген-специфичных антител, содержащихся в антисыворотке (что соответствует 1 мг антител на 50 мл антисыворотки). При этом полученные препараты не содержат примесных белков (Фиг.2).

Оценка специфичности антител (т.е. отсутствие их перекрестного взаимодействия с другими антигенами) методом Вестерн блоттинга показала, что при использовании полученных способом настоящего изобретения антител к двум различным антигенам (денатурированному белку AKR1B10 и денатурированному фрагменту белка ЕрСАМ) в тотальных белковых экстрактах толстой кишки выявлялись только полипептиды ожидаемого размера (36 кДа и 35 кДа соответственно) при полном отсутствии кросс-реактивности антител с другими белками, тогда как препараты коммерческих антител к тем же антигенам в тех же условиях выявляли несколько полос, ни одна из которых не соответствовала ожидаемому размеру (Фиг.3-4). Этот результат демонстрирует гораздо более высокую специфичность антител, полученных в соответствии со способом настоящего изобретения, по сравнению с коммерческими аналогами.

Настоящее изобретение также предусматривает применение высокоаффинных антител, полученных согласно предложенному способу, для иммуноанализа (в частности, иммуноферментного анализа, иммунофлуоресцентного анализа, иммуно-ПЦР, Вестерн блоттинга и дот блоттинга, иммуногистохимическиого анализа и иммунопреципитации; Ausubel F.M. et al (eds). Short protocols in molecular biology. 1995, p.10-40. J.Willey & Sons Inc.).

Значительное преимущество использования антител, полученных способом настоящего изобретения, продемонстрировано в экспериментах, показавших, что такие антитела позволяют более чем в сто раз повысить чувствительность дот блоттинга по сравнению с антителами, полученными по стандартным протоколам (Фиг.5). При этом использование антител, полученных по способу настоящего изобретения, позволяет детектировать 10 пкг чистого белка-антигена по хемолюминесценции пятна, тогда как предельная чувствительность теста с использованием коммерческих антител составляет лишь 1 нг.

Сравнение результатов детекции антигена в сложных белковых смесях методом Вестерн блоттинга позволяет сделать вывод о том, что чувствительность данного теста в случае использования антител, полученных способом настоящего изобретения, более чем в тысячу раз превышает результаты, полученные с использованием коммерческих аналогов (по результатам сканирования полос на Фиг.3-4). Более высокая специфичность антител, полученных по способу настоящего изобретения, является следствием удаления низко- и среднеспецифичных антител, которые во многих случаях являются полиреактивными.

Наконец, расчеты показывают, что использование антител, полученных по способу настоящего изобретения, для иммуноферментного анализа в сэндвич-формате (одного из наиболее чувствительных и популярных иммунохимических методов) позволит повысить чувствительность теста в десять тысяч и более раз. Это связано с тем, что чувствительность анализа пропорциональна произведению констант аффинности захватывающих и детектирующих антител, используемых для специфической иммобилизации содержащегося в анализируемой смеси антигена и его количественной детекции соответственно.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Данное изобретение подробно проиллюстрировано ниже со ссылками на конкретные примеры, представляющие собой его наиболее предпочтительные воплощения. Для описываемых экспериментов использовались два рекомбинантных белка человека: полноразмерный белок AKR1B10 и экстрацеллюлярный фрагмент белка ЕрСАМ, включающий аминокислотные остатки 24-265. Очистка антител к обоим антигенам проводилась по одному и тому же протоколу, который может быть использован для очистки антител к любому белковому антигену.

Пример 1. Иммобилизация денатурированного белка AKR1B10 на носителе

Денатурация антигена

К раствору, содержащему 6 наномоль (200 мкг) антигена в 150 мкл PBS, добавляли SDS (конечная концентрация 2%) и DTT (конечная концентрация 100 mM), после чего проводили денатурацию антигена (5 мин, 95°С). Антиген переводили в буфер для иммобилизации (0,1 М NaHCO₃, 0,5M NaCl, 0,1% SDS, pH 8,3) путем гель-фильтрации на колонке HiTrap Desalting Column (GE Healthcare, USA).

Иммобилизация антигена

0,2 г CNBr-сефарозы (Sepharose 4 Fast Flow, GE Healthcare) активировали в соответствии с рекомендациями производителя. Полученные 0,7 мл активированного носителя инкубировали с 200 мкг денатурированного антигена в течение ночи при комнатной температуре. Несвязанный антиген удаляли промывкой буфером для иммобилизации, а оставшиеся свободными активированные группы сорбента блокировали 0,5М Tris-HCl, pH 8 в течение ночи при 4°С согласно методике производителя. Сорбент промывали буфером (0,1М Tris-HCl pH 8, 0,5 М NaCl), а затем раствором, содержащим 0,1 М уксусную кислоту и 0,5 М NaCl.

Пример 2. Иммуноаффинная очистка антител к денатурированному белку AKR1B10

0,4 мл суспензии CNBr-сефарозы, содержащей 3,2 наномоля (110 мкг) иммобилизованного антигена, помещали в колонку Tricorn 5/20 column (GE Healthcare, США) и уравновешивали 5 мл PBS. На колонку наносили 50 мл антисыворотки, содержащей в среднем 50 мг (300 наномолей) антител к антигену (молярное соотношение антител к антигену 1:100). Скорость нанесения антисыворотки на носитель составляла 50 мкл/мин. После нанесения антисыворотки на колонку ее промывали: 1) 12,5 мл PBS; 2) 2 мл 1 М LiCl в буфере, содержащем 10 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ pH 7,2; 3) 6 мл 5 М LiCl в том же буфере. Содержащие белок объединенные фракции, полученные при промывке аффинной колонки 1 М LiCl, объединяли и концентрировали до объема 250 мкл с использованием устройства для ультрафильтрации Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Units (10 kDa, Millipore, США). Объединенные фракции, полученные при промывке аффинной колонки 5 М LiCl, обрабатывали аналогично.

Пример 3. Гель-фильтрация антител к денатурированному белку AKR1B10

На колонку Superdex 200 (10/30, GE Healthcare, США), уравновешенную PBS, последовательно наносили объединенные фракции, полученные в примере 2, после промывки колонки 1 М LiCl и 5 М LiCl. Фракции, соответствующие пикам интактных, мономерных антител, объединяли и концентрировали с использованием устройства для ультрафильтрации Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Units (10 kDa, Millipore, США).

Пример 4. Характеризация очищенных антител: оценка их выхода, чистоты, аффинности и специфичности

Количество антител в объединенных фракциях пика, полученного после элюции антител с аффинного сорбента 5 М LiCl, определяли методом Брэдфорд с использованием коммерческого набора (Bio-Rad, США). Результаты анализа показали, что количество антител, полученных по способу настоящего изобретения, в среднем составляет 2-3% от общего количества антиген-специфичных антител, содержащихся в антисыворотке (что соответствует 1 мг антител на 50 мл антисыворотки).

Гомогенность образцов, полученных в примере 3, оценивали с использованием электрофореза в 10%-ном денатурирующем полиакриламидном геле, показавшем полное отсутствие в препарате примесных белков (Фиг.2).

Оценка аффинности антител проводилась путем измерения их константы диссоциации по стандартному протоколу (Friguet В. et al. Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complex by enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Immunological Methods, 1985, 77, 305-19). Результаты анализа приведены в Табл.1.

Результаты измерения константы аффинности антител к белку AKR1B10.

Табл.1 Источник антител Константа аффинности По способу настоящего изобретения 10⁹ л/моль Антитела антисыворотки 2×10⁷ л/моль Коммерческие антитела 3×10⁷ л/моль

Оценка специфичности антител проводилась методом Вестерн блоттинга по стандартным протоколам (Ausubel F.M. et al (eds). Short protocols in molecular biology. 1995, p.10-40. J.Willey & Sons Inc.) с использованием полученных способом настоящего изобретения антител к денатурированному белку AKR1B10 и денатурированному фрагменту белка ЕрСАМ в тотальных белковых экстрактах толстой кишки. Проведенный анализ выявил присутствие только полипептидов (антигенов) ожидаемого размера (36 кДа и 35 кДа соответственно) при полном отсутствии кросс-реактивности антител с другими белками. В то же время препараты коммерческих антител к тем же антигенам в тех же условиях выявляли несколько полос, ни одна из которых не соответствовала ожидаемому размеру антигена (Фиг.3-4).

Сравнение чувствительности иммуноанализа антигена с использованием антител, полученных способом настоящего изобретения, с коммерческими аналогами осуществляли методами Вестерн блоттинга и дот блоттинга по стандартным протоколам (Ausubel F.M. et al (eds). Short protocols in molecular biology. 1995, p.10-40. J.Willey & Sons Inc.). Эксперименты показали, что антитела, полученные способом настоящего изобретения, позволяют:

1) повысить чувствительность Вестерн блоттинга антигена в сложных белковых смесях более чем в тысячу раз по сравнению с коммерческими антителами (по результатам сканирования полос, приведенных на Фиг.3-4);

2) повысить чувствительность дот блоттинга чистого антигена более чем в сто раз по сравнению с коммерческими антителами (по результатам анализа интенсивности хемилюминесценции пятен, приведенных на Фиг.5).

Все патенты, публикации, научные статьи и другие документы и материалы, цитируемые или упоминаемые здесь, включены в настоящее описание, как если бы каждый из этих документов был включен индивидуально или приведен здесь в его полном виде. Представленное выше подробное описание изобретения и его конкретных воплощений, приведенное в Примерах со ссылкой на фигуры, предназначено исключительно для более полного уяснения сущности заявленного изобретения, но не для его ограничения. Специалисту будет ясно, что могут быть сделаны различные изменения, которые, тем не менее, будут соответствовать сущности и объему настоящего изобретения, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.

Изобретение раскрывает способ получения высокоаффинных поликлональных антител. Способ включает стадии: а) нанесение раствора антител на аффинный сорбент с иммобилизованным антителом при молярном избытке антиген-специфических антител к антигену; б) удаление белков и низкоаффинных антител; в) удаление связавшихся среднеаффинных антител умеренно хаотропным агентом, таким как LiCl, MgCl₂, глицин, г) элюции высокоаффинных антител хаотропным агентом, д) удаление последнего и е) при необходимости удаление агрегатов антител. Способ обеспечивает получение антител, аффинность и специфичность которых значительно превосходят аффинность и специфичность поликлональных антител, известных из уровня техники. Применение антител, полученных способом по изобретению, позволяет заметно увеличить чувствительность и специфичность методов иммуноанализа. 12 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Способ получения высокоаффинных поликлональных антител, включающий следующие стадии:
а) нанесение раствора антител на аффинный сорбент с иммобилизованным антигеном при молярном избытке антигенспецифичных антител к антигену;
б) удаление белков и низкоаффинных антител путем промывки буфером;
в) удаление связавшихся среднеаффинных антител умеренно хаотропным агентом;
г) элюцию высокоаффинных антител хаотропным агентом;
д) удаление хаотропного агента;
е) при необходимости удаление агрегатов антител.

2. Способ по п.1, где в качестве антител используют антисыворотку, иммуноглобулины или аффинно-очищенные антитела, находящиеся в молярном избытке к антигену.

3. Способ по п.2, где иммуноглобулины получают с помощью преципитации, ультрафильтрации или гель-фильтрации или используют коммерчески доступные иммуноглобулины.

4. Способ по п.2, где аффинно очищенные антитела получают с помощью аффинной хроматографии или используют коммерчески доступные аффинно-очищенные антитела.

5. Способ по п.1, где в качестве антигена используют интактный природный или рекомбинантный полипептид или его фрагмент или химически синтезированный пептид, конъюгированный с белком-носителем.

6. Способ по п.1, где в качестве антигена используют денатурированный природный или рекомбинантный полипептид или его фрагмент.

7. Способ по п.1, где молярный избыток антигенспецифических антител к антигену составляет более 10:1, предпочтительно 50:1.

8. Способ по п.7, где молярный избыток антигенспецифических антител к антигену находится в диапазоне 50 мл антисыворотки на 3-5 нмоль иммобилизованного антигена.

9. Способ по п.1, где в качестве хаотропного агента используют LiCl, MgCl₂ или глицин.

10. Способ по п.9, где в качестве хаотропного агента на стадии в) используют 1 М LiCl.

11. Способ по п.9, где в качестве хаотропного агента на стадии г) используют 5 М LiCl.

12. Способ по п.1, где хаотропный агент удаляют с помощью гель-фильтрации, ультрафильтрации или диализа.

13. Способ по п.1, где удаление хаотропного агента и удаление агрегатов антител проводят в одну стадию с помощью гель-фильтрации.