СРЕДСТВА И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО НЕЙРОТОКСИНА Российский патент 2015 года по МПК C07K16/12 C07K16/06 C12P21/08 C12P21/02 G01N33/537 

Настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином, или антителу, которое специфически связывается с эпитопом, состоящим из пептида, имеющего аминокислотную последовательность, как показано на любой из SEQ ID NO:1-16. Более того, настоящее изобретение относится к способу получения полипептида нейротоксина, содержащему стадии контакта раствора, содержащего смесь протеолитически процессированных, частично процессированных и/или непроцессированных полипептидов нейротоксинов, с агентом, который специфически связывается с непроцессированными или частично процессированными полипептидами нейротоксинами, но не с процессированными полипептидами нейротоксинами, в условиях, которые допускают связывание указанного агента с непроцессированными или частично процессированными полипептидами нейротоксинами, посредством чего формируется комплекс антиген-агент, и удаления образовавшегося комплекса антиген-агент, посредством чего получается раствор, содержащий процессированный полипептид нейротоксин, свободный от непроцессированного или частично процессированного полипептида нейротоксина. Настоящее изобретение также относится к применению вышеуказанного антитела для отделения протеолитически процессированных полипептидов нейротоксинов от непроцессированных или частично процессированных полипептидов нейротоксинов. Настоящее изобретение относится к способу получения лекарственного средства, содержащему стадии вышеуказанного способа и следующую стадию формирования протеолитически процессированных полипептидов нейротоксинов в качестве лекарственного средства. Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей протеолитически процессированный полипептид нейротоксин, получаемый вышеуказанным способом.

Clostridium botulinum и Clostridium tetani продуцируют высокоактивные ней-ротоксины, то есть ботулинический токсин (BoNTs) и столбнячный токсин (TeNT), соответственно. Эти клостридиальные нейротоксины (CNTs) специфически связываются с нервными клетками и нарушают выделение нейротрансмиттеров. Каждый токсин синтезируется в виде неактивного непроцессированного одноцепочечного белка, массой около 150 кДа. Посттрансляционная обработка включает образование дисульфидных мостиков и ограниченный протеолиз (одноцепочечный разрыв) посредством бактериальной протеазы (протеаз). Активный двухцепочечный нейротоксин состоит из двух цепей, N-терминальной легкой цепи, массой около 50 кДа, и тяжелой цепи, массой около 100 кДа, связанных дисульфидным мостиком. CNTs структурально состоят из трех доменов, то есть каталитической легкой цепи, тяжелой цепи, охватывающей транслокационный домен (N-терминальную половину), и связывающего рецептор домена (С-терминальная половина), смотрите Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49.

Clostridium botulinum секретирует семь антигенно различных серотипов, обозначенных А-G, ботулинического нейротоксина (BoNT). Все серотипы вместе с родственным столбнячным нейротоксином (TeNT), секретируемым Clostridium tetani, представляют собой Zn²⁺-эндопротеазы, которые блокируют синаптический экзоцитоз, путем расщепления SNARE белков. CNTs вызывают атрофический паралич мышц, наблюдаемый при ботулизме и столбняке, смотрите Fischer 2007, PNAS 104, 10447.

Несмотря на его токсические эффекты, комплекс ботулинического токсина применялся в качестве терапевтического средства при большом числе заболеваний. Ботулинический токсин серотипа А был одобрен для применения на людях в Соединенных штатах Америки в 1989, а именно для лечения косоглазия, блефароспазма и других заболеваний. Он коммерчески доступен в качестве белкового препарата ботулинического токсина А, например, под торговым названием BOTOX (Allergan Inc) и под торговым названием DYSPORT (Ipsen Ltd). При терапевтическом применении комплекс вводится непосредственно в подлежащую лечению мышцу. При физиологическом pH токсин высвобождается из белкового комплекса, и достигается желаемый фармакологический эффект. Усовершенствованный BoNT/A препарат, свободный от комплексообразующих белков, доступен под торговым названием XEOMIN (Merz Pharmaceuticals GmbH). Эффект ботулинического токсина является лишь временным, что является причиной того, что может потребоваться повторное введение ботулинического токсина для поддержания терапевтического эффекта.

Клостридиальные нейротоксины уменьшают силу произвольного сокращения мышц и представляют собой эффективное средство лечения косоглазия, фокальной дистонии, включая цервикальную дистонию, и доброкачественной эссенциальной блефароспазмы. Кроме того, как было показано, они уменьшают гемифациальный спазм и фокальную спастичность, и, более того, эффективны при широком ряде других случаев, таких как нарушения в работе желудочно-кишечного тракта, гипергидроз и косметическая коррекция морщин, смотрите Jost 2007, Drugs 67, 669.

Для получения клостридиальных нейротоксинов особенно важное значение имеет очищение нейротоксина, содержащего ферментационный раствор. В связи с этим, как правило, применяются различные стадии осаждения и экстракции, сопровождаемые стадией концентрации и следующими отдельными хроматографическими стадиями, для того чтобы получить очищенный нейротоксин, смотрите DasGupta 1984, Toxicon 22, 415; Sathyamoorthy 1985, J Biol Chemistry 260, 10461. В настоящее время доступные препараты нейротоксина содержат, в дополнение к желательному активному (процессированному) нейротоксину, протеолитически непроцессированный предшественник и/или частично процессированный поли-пепитд нейротоксин. Протеолитически непроцессированный предшественник или частично процессированный полипепитд отличается от активного (процессированного) полипептида нейротоксина последовательностью только некоторых аминокислот. Поэтому их едва можно различить по их химическим и физическим свойствам. С другой стороны, доля протеолитически непроцессированного предшественника и/или частично процессированного полипептида нейротоксина от общей доли белка все еще является значительной в таких препаратах. Указанная доля обусловлена биологической системой, и определяется биосинтезом и условиями процесса ферментации. Таким образом, количество нежелательного протеолитически непроцессированного предшественника и/или частично процессированного полипептида нейротоксина в препаратах нейротоксина предопределено, и, в настоящее время, его довольно сложно уменьшать.

Средства и способы уменьшения количества непроцессированных и/или частично процессированных полипептидов нейротоксинов и, таким образом, улучшения качества препаратов нейротоксина являются весьма желательными, но еще не доступными.

Таким образом, техническая задача, которая решается посредством настоящего изобретения, может быть сформулирована как обеспечение средств и способов усовершенствования получения полипепитдов нейротоксинов в соответствии с вышеуказанными требованиями. Данная техническая задача решается посредством вариантов выполнения настоящего изобретения, охарактеризованных в формуле изобретения, как указано ниже.

Настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с эпитопом, состоящим из пептида, имеющего аминокислотную последовательность, как показано на любой из SEQ ID NO:1-16.

Термин ″антитело″, как применяется в настоящем изобретении, охватывает моноклональное антитело, поликлональное антитело, одноцепочечное антитело, человеческое, гуманизированное, приматизированное или химерное антитело, биспецифическое антитело, синтетическое антитело, химически или ферментативно модифицированные производные, фрагмент любого из указанных антител или аптамеры, состоящие из нуклеиновы кислот природного происхождения и/или химически модифицированных нуклеиновых кислот. Фрагменты указанных антител включают F(ab)₂, F(ab), Fv или scFv фрагменты или химически или ферментативно модифицированные производные любого из этих фрагментов. Антитело по настоящему изобретению должно специфически связываться с эпитопом, состоящим из вышеупомянутого пептида, если указанный пептид содержится частично процессированным или непроцессированным полипептидом нейротоксином.

Термин ″эпитоп″, согласно настоящему изобретению, относится к антигенной детерминанте, которая распознается антителом по настоящему изобретению. Она состоит из пептида, имеющего аминокислотную последовательность, как показано на любой из SEQ ID NO:1-16. Согласно настоящему изобретению вышеупомянутые эпитопы представляют собой пептиды, которые фланкируются сайтами расщепления для ферментов процессинга нейротоксина или которые охватывают сайт расщепления (сайты), смотрите таблицы 1 и 2, приведенные ниже. Согласно настоящему изобретению эпитоп содержится протеолитически непроцессированным полипептидом нейротоксином или частично процессированным полипептидом нейротоксином. Частично процессированный полипептид нейротоксин может либо представлять собой легкую цепь полипептида нейротоксина, удлиненную пептидными последовательностями, как показано на любой из SEQ ID NO:1-8, либо тяжелую цепь полипептида нейротоксина, удлиненную пептидными последовательностями, как показано на любой из SEQ ID NO:1-8. Благодаря присутствию указанного эпитопа, непроцессированные или частично процессированные полипепитды нейротоксины могут специфически связываться антителом.

Таблица 1: Аминокислотные последовательности эпитопов и полипептидов полной длины серотипов нейротоксина

Таблица 2: Аминокислотные последовательности, включающие сайты расщепления серотипов нейротоксина

Термин ″специфически связывается″ означает, что антитело по настоящему изобретению не вступает в значительной степени в перекрестную реакцию с другими эпитопами либо на указанных частично процессированных, либо на указанных непроцессированных полипептидах нейротоксинах, или на других полипептидах в общем. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения, антитело по настоящему изобретению не вступает в перекрестную реакцию с указанным активным полностью процессированным полипептидом нейротоксином. Специфичность эпитопа является важным отличительным признаком антитела по настоящему изобретению Специфичность антитела в отношении частично процессированного или непроцессированного нейротоксина по сравнению с процессированным нейротоксином должна составлять, согласно настоящему изобретению, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%. Специфическое связывание можно протестировать различными хорошо известными методиками, включая, например, конкурентные исследования. Другим важным отличительным признаком является чувствительность к антителу. Чувствительность, согласно настоящему изобретения, должна быть такой, чтобы связывалось по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% процессированного нейротоксина, содержащегося образцом. Чувствительность может быть протестирована хорошо известными методиками. Специалисты в данной области техники смогут определить рабочие и оптимальные условия анализа для каждого определения, путем выполнения обычной экспериментальной работы. Обычные методики для изучения связывания включают радиоиммуноанализ, твердофазный иммуноферментный анализ ELISA, равновесный диализ, изотермическую микрокалориметрию, BIACORE^® анализы (поверхностный плазмонный резонанс, SPR) или другие способы на основе поверхностного поглощения. BIACORE^® SPR система измеряет взаимодействие антитело-антиген. Ответ SPR отражает изменение массовой концентрации на поверхности детектора, так как аналиты связываются или диссоциируют. На основании SPR, BIACORE^® измерения в реальном масштабе времени позволяют контролировать взаимодействия сразу после того как они происходят, смотрите BIAapplications Handbook, версия АВ (переиздано в 1998), BIACORE^® code No: BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, версия АВ (переиздано в 1998), BIACORE^® code No: BR-1001-84. Свойства связывания, такие как чувствительность антитела по настоящему изобретению, могут, в принципе, быть определены посредством изучений связывания с применением иммобилизованного антигена (лиганда), помещенного на сенсорную поверхность. Антитело, подлежащее тестированию (аналит), представляют в виде подвижной фазы, то есть в виде раствора. В некоторых случаях антиген прикрепляется непосредственно к поверхности через связывание с другой иммобилизованной молекулой, которая упоминается как захватывающая молекула. Когда антитело вводится в виде дискретного импульса по поверхности с иммобилизованными антигенами, можно выделить, по существу, три фазы: (i) связывание антитела с антигеном в ходе ввода образца; (ii) равновесное или установившееся состояние в ходе введения образца, когда скорость связывания антитела сбалансирована диссоциацией из комплекса антитело-антиген; (iii) диссоциация антитела с поверхности в ходе течения буфера. Будет понятно, что такой анализ может быть осуществлен альтернативным образом с иммобилизованными антителами, подлежащими исследованию, и раствором, содержащим антиген, в качестве подвижной фазы. Фазы связывания и диссоциации обеспечивают информацию о кинетике взаимодействия аналит-лиганд (k_a и k_d, скорости образования и диссоциации комплекса, k_d/k_a=K_D). Равновесная фаза обеспечивает информацию об аффинности взаимодействия аналит-лиганд (K_D). Согласно настоящему изобретению антитело по настоящему изобретения имеет KD менее 0.5 мкМ, согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения менее 0.05 мкМ и согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения менее 0.02 мкМ.

Согласно настоящему изобретению антитело может быть получено путем применения способов, которые описываются, например, в Harlow and Lane ″Antibodies, A Laboratory Manual″, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Моноклональные антитела могут быть получены согласно способам, первоначально описанным в Kohler 1975, Nature 256, 495, и Galfre 1981, Meth Enzymol 73, 3. Указанные методики содержат слияние миеломных клеток мышей с клетками селезенки, полученными у иммунизированных млекопитающих. Антитела могут быть далее усовершенствованы с помощь методик, хорошо известных в данной области техники. Например, поверхностный плазмонный резонанс, как применяется в системе BIACORE^®, может применяться для увеличения эффективности фаговых антител, которые связываются с вышеупомянутым эпитопом внутри протеолитически непроцессированного полипептида нейротоксина, смотрите Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7, 97; Malmborg 1995, J. Immunol Methods 183, 7.

Согласно настоящему изобретению антитело в соответствии с антителом по настоящему изобретению, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, получают путем применения олигопептида, содержащего вышеупомянутый эпитоп. Такой олигопептид может быть получен синтетически или посредством рекомбинантной экспрессии. Альтернативно, антитело по настоящему изобретению может быть получено путем применения непроцессированного или частично процессированного полипептида нейротоксина природного происхождения. В последнем случае необходимо понимать, что полученные антитела должны быть далее протестированы на специфичность в отношении непроцессированного и/или частично процессированного полипептида(ов) нейротоксина. Согласно следующему варианту выполнения настоящего изобретения, моноклональное антитело по настоящему изобретению получают путем применения частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксина, который может быть обработан детергентом, для того чтобы создать иммунологически доступный эпитоп. Однако будет понятно, что в случае, когда антитело должно быть направлено против конформационного эпитопа, никакая такая обработка детергентом не должна быть осуществлена. Согласно следующему варианту выполнения настоящего изобретения, средства стимуляции иммунитета, такие как гемоцианин лимфы улитки (KLH), также могут применяться в таком способе, особенно при применении синтетического олигопептида.

Антитело согласно настоящему изобретению может применяться, например, для аффинной хроматографии, иммунопреципитации и иммунолокализации частично процессированного и/или непроцессированного полипептида нейротоксина, а также для контроля присутствия указанного полипептида в образцах или в рекомбинантных организмах.

Согласно настоящему изобретению частично процессированный и/или не-процессированный полипептид нейротоксина происходит из Clostridium sp.. В другом варианте выполнения настоящего изобретения он происходит из Clostridium botulinum, выбранного из группы, состоящей из Clostridium botulinum АТСС 3502, Clostridium botulinum АТСС 3502 - Hall штамм. Первичная структура указанного непроцессированного полипептида нейротоксин из Clostridium botulinum раскрывается в Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49.

Clostridium spp., как упоминается в настоящем изобретении, относится к роду грамположительных формирующих эндоспоры облигатных анаэробных бактерий, которые принадлежат типу Firmicutes. Клостридиальные нейротоксины могут продуцироваться фенотипически и генетически различными клостридиями, принадлежащими видам Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium barati и Clostridium tetani. Clostridium botulinum, как поменяется в настоящем изобретении, представляет собой вид палочковидной грамположительной облигатной анаэробной бактерии, которая продуцирует, помимо нейротоксинов, овальные субтерминальные эндоспоры, и, как правило, обнаруживается в почве.

Кроме того, в следующем варианте выполнения настоящего изобретения указанное антитело связывается с полипептидным носителем. Согласно антителу по настоящему изобретению указанный полипептидный носитель выбирается из группы, состоящей из: FC-связывающего белка, белка А и белка G, и антитела, которое специфически связывается с антителом по настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению это, например, может быть антитело, которое является специфическим в отношении видов. Такое антитело специфически связывается с FC частью или F(ab) антитела по изобретению. Согласно другому варианту антитела по настоящему изобретению указанный полипептидный носитель представляет собой белок А из Staphylococcus aureus. Согласно настоящему изобретению указанный полипептидный носитель может применяться для выделения антитела по настоящему изобретению.

Более того, в следующем варианте выполнения антитела по настоящему изобретению, указанное антитело связывается с матрицей. Согласно настоящему изобретению указанная матрица представляет собой твердую матрицу.

Термин ″связывание″, как применяется в настоящем изобретении, относится к любому типу соединения между антителом и матрицей, до тех пор, пока указанное соединение существенно не мешает связыванию антитела с частично процессированным и/или непроцессированным полипептидом нейротоксином. Указанное соединение может быть получено путем взаимодействий, включая непрямые или прямые, необратимые или обратимые, физические и химические, электростатические и/или ковалентные связи. Согласно настоящему изобретению антитело ковалентно связывается с матрицей, либо напрямую, либо через линкерную молекулу.

Термин ″матрица″, как применяется согласно настоящему изобретению, относится к трехмерной структуре или пространственному расположению, способным к связыванию антигена или антитела. Хорошо известные матрицы содержат полипептиды, стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, полиэтиленгликоль (ПЭГ), декстран, нейлон, амилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит. Твердая матрица согласно настоящему изобретению представляет собой полисахаридную матрицу, выбранную из группы, состоящей из: сефарозы, сефадекса; агарозы, сефацели, микроцеллюлозы и шариков альгината. В другом варианте выполнения настоящего изобретения указанная твердая матрица может состоять из стеклянных шариков и/или полипептидных матриц.

Антитело может связываться с указанной матрицей через линкер, включая низкомолекулярные соединения, пептидные линкерные молекулы и шарики. Матрица может иметь фактически любую возможную структурную конфигурацию или расположение, до тех пор, пока связанное антитело способно связываться с его антигеном. Таким образом, матрица может быть сферической, как в шарике, или цилиндрической, как во внутренней поверхности пробирки, или внешней поверхности прута. Альтернативно, поверхность может быть искривленной или плоской, такой как лист, индикаторная полоска и т.д. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения указанные подложки включают шарики полистирола.

Вышеуказанная матрица согласно настоящему изобретению имеет по меньшей мере один сайт связывания для антитела по настоящему изобретению. Согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения, указанная матрица имеет дополнительные сайты связывания для следующих антител, которые распознают другие эпитопы. Согласно настоящему изобретению указанные эпитопы представляют собой другие эпитопы, которые допускают специфическое связывание частично процессированного и/или непроцессированного полипептида нейротоксина. Следующие антитела, иммобилизованные на матрице, также охватывают антитела, которые распознают бактериальные полипептиды, отличные от полипептидов нейротоксинов. Такие следующие антитела, содержащиеся матрицей, могут применяться для удаления дальнейших нежелательных полипептидов и, таким образом, в целях дальнейшей очистки препарата нейротоксина. Однако должно быть понятно, что согласно следующему аспекту настоящего изобретения процессированный нейротоксин не должен специфически связываться антителами, иммобилизованными на матрице.

Вышеупомянутое антитело по настоящему изобретению подходит для получения процессированного полипептида нейротоксина, потому что оно специфически связывается с охарактеризованным выше эпитопом, таким образом, обеспечивая возможность связывания частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксин и дальнейшего отделения его от активного процессированного полипептида нейротоксина. Антитело, которое способно к связыванию и удалению нежелательного частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, избегает, согласно настоящему изобретению, взаимодействия с активным процессированным полипептидом нейротоксином, который сохраняет свою биологическую активность. Благодаря настоящему изобретению возможно очищение нейротоксина, при котором на активность желательного активного полипептида воздействие по существу не оказывается. Специалист в данной области техники знает, что ″активность″ появляется только после протеолитического расщепления непроцессированного полипептида предшественника нейротоксина, даже, несмотря на то, что указанный непроцессированный предшественник может осуществлять некоторые биологические функции. Таким образом, ″протеолитически процессированный полипептид нейротоксин″, согласно настоящему изобретению, является биологически активным полипептидом нейротоксином. Термин ″биологически активный″, как применяется в настоящем изобретении, относится к способности полипептида нейротоксина к связыванию последовательности рецептора, интернализации, транслокации через эндосомальную мембрану в цитозоль и/или эндопротеолитическому расщеплению одного или более белков, которые участвуют в слиянии синаптических везикул с мембраной.

Необходимо понимать, что определения и примеры терминов, приведенные выше, применяются, с учетом необходимых поправок, для всех объектов и вариантов выполнения настоящего изобретения, далее раскрытых в описании настоящего изобретения, если иного не указано.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения антитела, которое специфически связывается с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином, где указанный способ содержит стадии:

а) контакта поликлональной антисыворотки из не принадлежащего к человеческому роду животного, которое было иммунизировано с применением пептидного иммуногена, содержащего аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:25, с пептидом, имеющим SEQ ID NO:25, в условиях, которые допускают образование комплекса, содержащего вышеупомянутый пептид и антитело, которое специфически связывается с непроцессированным или частично процессированным полипептидом нейротоксином;

b) удаления комплекса, сформировавшегося на стадии а), из антисыворотки; и

c) высвобождения антитела, которое специфически связывается с непроцессированным или частично процессированным полипептидом нейротоксином, из указанного комплекса.

Термин ″пептидный иммуноген″, как применяется в настоящем изобретении, относится к олигопептиду, имеющему аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:25, который вводится некоторым образом, позволяющим вызывать иммунный ответ в не принадлежащем к человеческому роду животном. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения указанный иммуноген, кроме того, содержит KLH, и, согласно еще одному варианту выполнения настоящего изобретения, указанный KLH связан через цистеин и, согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения, через С-терминальный цистеин, с пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:25, через линкер сложный эфир N-[гамма-малеимидобутирилокси]сукцинимида (GMBS). В области техники хорошо известно как связать KLH с пептидом с помощью линкерной молекулы, такой как GMBS, и это также описывается в приведенных ниже примерах. В другом варианте выполнения настоящего изобретения не принадлежащее к человеческому роду животное представляет собой млекопитающее, в вариантах выполнения настоящего изобретения крысу, мышь, кролика, овцу или козла. До осуществления способа по настоящему изобретению не принадлежащее к человеческому роду животное, которое должно стать источником поликлональной антисыворотки, иммунизируют, применяя вышеупомянутый пептидный иммуноген. В области техники хорошо известно как иммунизировать не принадлежащее к человеческому роду животное, и это также описывается в приведенных ниже примерах. В результате указанной иммунизации не принадлежащее к человеческому роду животное продуцирует поликлональные антитела против пептидного иммуногена.

Поликлональная антисыворотка может быть получена из не принадлежащего к человеческому роду животного с помощью различных методик. В вариантах выполнения настоящего изобретения ее получают из крови, сыворотки или плазмы стандартными способами, хорошо известными в данной области техники и описанными в приведенных ниже примерах. Термин ″поликлональная антисыворотка″, таким образом, включает очищенную и частично очищенную сыворотку указанного животного. Такая указанная антисыворотка представляет собой исходный материал для вышеупомянутого способа. В дополнение к желательному антителу (или антителам), которые специфически связываются с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином, поликлональная антисыворотка может содержать дополнительные антитела, которые не специфически связываются с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином. Эти антитела отделяют от желательных специфических антител посредством контакта антисыворотки с пептидом, также имеющим аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:25. Согласно настоящему изобретения указанный пептид иммобилизован на носителе, что подробно описывается в настоящем описании. В результате указанного контакта формируется комплекс пептида и специфических антител, который затем может быть удален из поликлональной сыворотки. Специфические антитела затем могут быть высвобождены из удаленного комплекса. Подходящие методики высвобождения антител из таких комплексов приведены в описании настоящего изобретения.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения указанный способ, кроме того, содержит перед стадией а) стадии:

i) контакта указанной поликлональной антисыворотки из не принадлежащего к человеческому роду животного, которое было иммунизировано с применением пептидного иммуногена, содержащего аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:25, со следующими пептидами захвата SLD, LDK и YNK, в условиях, которые допускают формирование комплексов захваты, содержащих неспецифические антитела, содержащиеся поликлональной антисывороткой, и пептиды захвата; и

ii) удаления комплексов захваты из поликлональной антисыворотки.

При осуществлении основополагающих исследований по настоящему изобретению поликлональную антисыворотку приводили в действие против ботулинического нейротоксина типа A (BoNT/A), применяя линкерный пептид, связанный с KLH, в качестве иммуногена (антилинкерный пептид scBoNT/A-сыворотка), исследования проводили на козлах. Даже после аффинного очищения сыворотка проявляла перекрестную реакционную способность в отношении процессированного BoNT/A при Вестерн-блот анализе. Было продемонстрировано, что перекрестная реакционная способность зависит от распознавания трипептидов (SLD, LDK и YNK), которые встречаются в линкерном пептиде, а также в легкой и тяжелой цепях процессированного BoNT/A. Вторую порцию козлиной иммуносыворотки очистили с помощью двухступенчатой аффинной хроматографии, удаляя антитела с перекрестной реакционной способностью в отношении трипептидов. Вторая антилинкерный пептид scBoNT/A-сыворотка не показала никакой перекрестной реакционной способности в отношении процессированного BoNT/A при Вестерн-блот анализе. Согласно настоящему изобретению трипептиды могут применяться для аффинного очищения в форме производных, как показано на любой из SEQ ID No. 26-28.

В вариантах выполнения способа по настоящему изобретению стадии а)-с) осуществляются посредством аффинной хроматографии.

Аффинная хроматография, как применяется в настоящем изобретении, относится к способу разделения молекул в подвижной фазе на основе их различной аффинности по отношению к стационарной фазе, применяемой в хроматографии. Согласно настоящему изобретению указанный способ относится к селективной адсорбции и последующему отделению соединения от иммобилизованного лиганда. Согласно другому варианту выполнения настоящего изобретения указанный способ предназначен для высокоспецифического и эффективного очищения белков и родственных соединений, применяя соответствующие селективные лиганды на четковидных и пористых матрицах для связывания желательных соединений, которые могут затем быть удалены при мягких условиях. Указанный способ основывается на высокоспецифическом взаимодействии, таком как взаимодействие между антигеном и антителом, ферментом и субстратом или рецептором и лигандом. В другом варианте выполнения настоящего изобретения аффинная хроматография осуществляется в виде колоночной хроматографии. Аффинная хроматография, как подробно описано выше, представляет собой, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, иммуноабсорбционную хроматографию, хроматографию гидрофобных взаимодействий (HIC), обращено-фазную хроматографию и, в другом варианте выполнения настоящего изобретения, иммуноаффинную хроматографию с применением связывающего агента, который, в вариантах выполнения настоящего изобретения, представляет собой антитело по настоящему изобретению. Стационарная фаза, как упоминается в настоящем изобретении, состоит из вышеупомянутого агента в качестве твердой матрицы. Указанный агент, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, связывается с полипептидным носителем, связанным с твердой матрицей, и, в другом варианте выполнения настоящего изобретения, связывается с белком А, связанным с твердой матрицей.

В следующем варианте выполнения настоящего изобретения стадии i) и ii) осуществляются посредством аффинной хроматографии..

Настоящее изобретение также относится к способу идентификации антитела, которое специфически связывается с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином, содержащему стадии:

a) определения связалось ли антитело с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:25; и

b) определения связалось ли антитело с пептидом, имеющим следующие аминокислотные последовательности SLD, LDK и YNK,

где антитело, которое связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:25, но не с пептидами, имеющими следующие аминокислотные последовательности SLD, LDK и YNK, идентифицируется как антитело, которое специфически связывается с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином.

Термин ″обнаружение″, как применяется в соответствии со способом идентификации антитела, охватывает хорошо установившиеся методики определения связывания антитела с данным пептидом, такие как методики иммуноблоттинга (Вестерн-блот или Дот-блот методики), аффинную хроматографию, способы на основе поверхностного плазмонного резонанса (BIACORE^® анализы) и тому подобное. Должно быть понятно, что согласно настоящему изобретению вышеупомянутое связывание антитела с пептидом или пептидами является специфическим связыванием (то есть, связыванием без перекрестной реакционной способности).

Согласно настоящему изобретению вышеупомянутый способ идентификации антитела осуществляется для моноклональных антител. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения способ применяется для скрининга гибридомных клеточных линий и последующего продуцирования моноклональных антител, которые специфически связываются с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином. В другом варианте выполнения настоящего изобретения способ может применяться для скрининга поликлональных антител, например пептидных антител, которые специфически связываются с непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом нейротоксином. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения способ может применяться для подтверждения специфичности антитела, полученного способом по настоящему изобретению, описанным в описании настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к антителу, которое может быть получено вышеупомянутым способом. В одном варианте выполнения настоящего изобретения антитело представляет собой поликлональное антитело. В следующем варианте выполнения настоящего изобретения указанное антитело связано с твердой подложкой

Антитело по настоящему изобретению, согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения, позволяет обнаружить частично процессированный и/или непроцессированный полипептид нейротоксин с высокой чувствительностью и специфичностью, в одном варианте выполнения настоящего изобретения с пределом обнаружения 50-80 пг/мл, в другом варианте выполнения настоящего изобретения с пределом обнаружения 69 пг/мл.

В принципе, вышеупомянутое антитело может применяться для удаления частично процессированного и/или непроцессированного полипептида нейротоксина из процессированного полипептида нейротоксина или для обнаружения частично процессированного и/или непроцессированного BoNT/A в образце.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения полипептида нейротоксина, содержащего стадии:

a) контакт раствора, содержащего смесь процессированных и частично процессированных и/или непроцессированных полипептидов нейротоксинов, с агентом, который специфически связывается с непроцессированными или частично процессированными полипептидами нейротоксинами, но не с процессированными полипептидами нейротоксинами, в условиях, которые допускают связывание указанного агента с непроцессированными или частично процессированными полипептидами нейротоксинами, при этом формируются комплекс с агентом, и

b) удаление сформировавшегося на стадии а) комплекса с агентом, при этом получают раствор, содержащий процессированный полипептид нейротоксин, свободный от непроцессированного или частично процессированного полипептида нейротоксина.

Термин ″контакт″, как применяется в описании настоящего изобретения, относится к приведению по меньшей мере двух различных соединений в физическую близость, так чтобы обеспечить физическое и/или химическое взаимодействие указанных соединений. Согласно способу по настоящему изобретению, указанные два различных соединения представляют собой, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, агент, который специфически связывается с частично процессированным или непроцессированным полипептидом нейротоксином, которые содержатся в растворе. Контакт, согласно его значению по настоящему изобретению, осуществляется при условиях и в течение времени, которые достаточны для обеспечения взаимодействия агента и частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксина. Указанное взаимодействие должно приводить к связыванию частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксина с агентом, при этом формируется комплекс антиген-агент. Как изложено в описании настоящего изобретения, указанное взаимодействие включает различные виды связывания, такие как непрямое и прямое, необратимое и обратимое. Подходящие условия допускают специфическое связывание агента и раствора. Они хорошо известны специалистам в данной области техники, и указанные условия могут зависеть от агента и раствора, применяемого в способе, и определяются незамедлительно. Более того, время, достаточное для обеспечения взаимодействия, также может быть незамедлительно определено специалистом в данной области техники. Условия для антител в качестве агентов раскрываются в приведенных ниже примерах.

Раствор, как применяется в настоящем изобретении, относится к любой системе растворителей, содержащей полипептид нейротоксин и частично процессированные и/или непроцессированные полипептиды нейротоксины. Система растворителей, кроме того, содержит растворитель. Охватываемые растворители, в различных вариантах выполнения настоящего изобретения, представляют собой воду, водные буферные системы, органические растворители и ионные жидкости. В одном варианте выполнения настоящего изобретения применяется водная система растворителей. Более того, система растворителей, в дополнения к полипептиду нейротоксину и растворителю, может также содержать дополнительные молекулы, включая дополнительные бактериальные полипептиды.

Термин ″агент″, как применяется в настоящем изобретении, относится к соединению, которое способно специфически связываться с частично процессированным или непроцессированным полипептидом нейротоксином. Подходящие соединения содержат полипептиды, пептиды, антитела и органические химические молекулы. В одном варианте выполнения настоящего изобретения агент представляет собой полипептид, пептид или антитело, как определено в описании настоящего изобретения. Указанный агент, в следующем варианте выполнения настоящего изобретения, имеет по меньшей мере один сайт связывания для частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксина. В другом варианте выполнения настоящего изобретения указанный агент имеет дополнительные сайты связывания для дополнительных антител, которые способны специфически связываться с агентом. В еще одном варианте выполнения настоящего изобретения, агент представляет собой антитело по настоящему изобретению, как определено выше. Более того, в следующем варианте выполнения настоящего изобретения, агент может содержать различные антитела по настоящему изобретению. Например, согласно настоящему изобретению возможно, что антитело по настоящему изобретению, которое специфически связывается с частично процессированным полипептидом нейротоксином, в качестве агента применяется в комбинации с антителом по настоящему изобретению, которое специфически связывается с непроцессированным полипептидом нейротоксином. Альтернативно, агент согласно настоящему изобретению может содержать два или более различных антител по изобретению, где каждое антитело специфически связывается с различными эпитопами, присутствующими в частично процессированном и непроцессированном полипептиде нейротоксине.

В одном варианте выполнения способа по настоящему изобретению, агент иммобилизован на матрице, как изложено в настоящем изобретении. В следующем варианте выполнения настоящего изобретения иммобилизация достигается путем ковалентного прямого или непрямого связывания агента с матрицей.

Термин ″специфическое связывание″, как применяется в настоящем изобретении, относится к связыванию агента с частично процессированным и/или непроцессированным полипептидом нейротоксином без перекрестной реакции с другими нейротоксинами, белками клетки-хозяина или другими пептидами, полипептидами и другими соединениями. Специфическое связывание может быть проверено различными хорошо известными методиками. В этом отношении данный термин относится к определениям, приведенным выше в отношении антитела по настоящему изобретению, которые применяются с необходимыми поправками.

Термин ″комплекс с агентом″, как применяется в настоящем изобретении, относится к связи агента с частично процессированным или с непроцессированным полипептидом нейротоксином. Однако комплекс, кроме того, может содержать дополнительные молекулы. Согласно одному варианту выполнения настоящего изобретения, комплекс может содержать молекулы, которые стабилизируют комплекс или которые улучшают очищение комплекса, например, обеспечивая взаимодействие комплекса с другими молекулами, или которые усиливают осаждение комплекса. Дополнительные молекулы, содержащиеся в комплексе, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, охватывают вторичные антитела, которые специфически связываются с агентом или с комплексом как таковым. Указанные вторичные антитела могут затем также связываться следующими антителами или взаимодействовать с молекулами, такими как полипептидные носители, не напрямую или напрямую. Должно быть понятно, что комплекс может также содержать дополнительные бактериальные полипептиды, или другие молекулы, содержащиеся раствором.

Термин ″удаление″ комплекса антиген-агент, как применяется в описании настоящего изобретения, относится к отделению входящего в комплекс частично процессированного и входящего в комплекс непроцессированного полипептида нейротоксина от раствора, содержащего активный процессированный нейротоксин. В одном варианте выполнения настоящего изобретения, указанное удаление осуществляется посредством аффинной хроматографии, например, применяя иммуномикроноситель или с помощью иммунопреципитации.

В результате удаления частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина способ по настоящему изобретению обеспечивает активный процессированный полипептид нейротоксин в высокоочищенной форме. Термин ″высокоочищенная форма″, как применяется в описании настоящего изобретения, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, относится к активному процессированному полипептиду нейротоксину, свободному от обнаруживаемых количеств частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксина и, в другом варианте выполнения настоящего изобретения, к активному процессированному полипептиду нейротоксину, также свободному от обнаруживаемых количеств других примесей. В одном варианте выполнения настоящего изобретения, обнаруживаемое количество частично процессированного или непроцессированного нейротоксина составляет менее 2.5%, менее 1% или, в другом варианте выполнения настоящего изобретения, менее 0.1%. В следующем варианте выполнения настоящего изобретения активный процессированный полипептид нейротоксин типа А, как упоминается в настоящем изобретении, при восстанавливающих условиях показывает обнаруживаемую одиночную связь при 100 кДа, и обнаруживаемую одиночную связи при 50 кДа, но никакой связи при 150 кДа, где, как правило, встречаются частично процессированные или непроцессиро-ванные полипептиды нейротоксины типа А, при анализе, например, с помощью SDS-PAGE. Должно быть понятно, что другие полипептидные примеси также могут быть определены с помощью SDS PAGE. Кроме того, должно быть понятно, что другие серотипы активных процессированных нейротоксинов могут быть проанализированы соответствующим образом.

Способ по настоящему изобретению, где указанный полипептид нейротоксин выбирается из группы, состоящей из:

a) полипептида нейротоксина BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G или TeNT, и

b) полипептида нейротоксина, имеющего аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 40% идентична аминокислотной последовательности полипептида нейротоксина а).

Термин ″нейротоксин″, как применяется в настоящем изобретении, относится к антигенно различным серотипам ботулинических нейротоксинов, то есть BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, и к столбнячному нейротоксину (TeNT). В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный BoNT/A имеет аминокислотную последовательность как показано на SEQ ID NO:17, BoNT/B имеет аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:18, BoNT/C1 имеет аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:19, BoNT/D имеет аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:20, BoNT/E имеет аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:21, BoNT/F имеет аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:22, BoNT/G имеет аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:23, и TeNT имеет аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:24.

В следующем варианте выполнения способа по настоящему изобретению указанный полипептид нейротоксин представляет собой вариант одного из вышеупомянутых полипептидов нейротоксинов, который имеет последовательность, которая содержит по меньшей мере одно аминокислотное замещение, добавление и/или удаление по отношению к любой из SEQ ID NO 17-24. В другом варианте выполнения настоящего изобретения указанный вариант полипептида нейротоксина имеет аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 40% идентична аминокислотной последовательности BoNT/A (SEQ ID NO:17), BoNT/B (SEQ ID NO:18), BoNT/C1 (SEQ ID NO:19), BoNT/D (SEQ ID NO:20), BoNT/E (SEQ ID NO:21), BoNT/F (SEQ ID NO:22), BoNT/G (SEQ ID NO:23) или TeNT (SEQ ID NO:24). В другом варианте выполнения настоящего изобретения полипептид нейротоксин имеет аминокислотную последовательность, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичную аминокислотной последовательности BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G или TeNT. Термин ″идентичная″, как применяется в описании настоящего изобретения, относится к идентичности последовательностей, охарактеризованной как определение идентичности аминокислотных последовательностей, когда последовательности выравниваются, таким образом, что достигается наивысшая степень совпадения, и которая может быть вычислена, применяя опубликованные методики и способы на основе компьютерных программ, таких как, например, BLASTP, BLASTN, FASTA, Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403. Значения процента идентичности, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, вычисляются по всей аминокислотной последовательности. Ряд программ на основе различных алгоритмов доступен специалистам в данной области техники для сравнения различных последовательностей. В этом отношении, алгоритмы Нидльмана-Вунша (Needleman-Wunsch) или Смита-Уотермана (Smith-Waterman) дают особенно надежные результаты. Для осуществления выравнивания последовательностей могут использоваться программы PileUp (1987, J Mol Evolution 25, 351; Higgins 1989 CABIOS 5, 151) или программы Gap и Best-Fit (Needleman and Wunsch 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith and Waterman 1981, Adv Appl Math 2, 482), которые являются частью программного обеспечения GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Значения идентичности последовательностей, упомянутые выше в процентах (%), определяются, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, применяя программу GAP для всей области последовательности, при следующих установочных параметрах: вес гэпа (Gap Weight): 50, вес длины (Length Weight): 3, среднее совпадение (Average Match): 10.000 и среднее несовпадение (Average Mismatch): 0.000, которые, если иного не указано, должны всегда применяться в качестве стандартных установочных параметров для выравнивания последовательностей.

Необходимо понимать, что вышеупомянутые варианты должны, согласно настоящему изобретению, сохранять биологические свойства нейротоксинов. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что полная биологическая активность достигается только после протеолитической активации, даже, несмотря на то, что существует вероятность того, что непроцессированный предшественник может выполнять некоторые биологические функции, будучи частично активным. ″Биологические свойства″, как применяется в описании настоящего изобретения, относятся к (а) связыванию рецептора, (b) интернализации, (с) транслокации через эндосомальную мембрану в цитозоль, и/или (d) эндопротеолитическому расщеплению белков, участвующих в слиянии мембраны и синаптических визикул. In vivo анализы для оценки кул. In vivo анализы для оценки биологической активности включают анализ LD50 мышей и ex vivo анализ правого или левого купола диафрагмы мышей, как описано в Pearce LB, Borodic GE, First ER, MacCallum RD (1994) (Measurement of botulinum toxin activity: evaluation of the lethality assay. Toxicol Appl Pharmacol 128: 69-77) и Dressier D, Lange M, Bigalke H (2005) (The mouse diaphragm assay for detection of antibodies against botulinum toxin type B. Mov Disord 20:1617-1619). Биологическая активность, в общем, выражается в мышиных единицах (MU). Как применяется в настоящем изобретении, 1 MU представляет собой количество нейротокси-ческого компонента, которое убивает 50% конкретной мышиной популяции после внутрибрюшинной инъекции, то есть i.p. LD 50 мышей (Schantz & Kauter, 1978). В следующем варианте выполнения настоящего изобретения, варианты могут представлять собой нейротоксины, имеющие улучшенные или измененные биологические свойства, например, они могут содержать сайты расщепления, которые усовершенствованы для распознавания ферментами, или могут быть улучшены для связывания с рецептором, или любые другие свойства, описанные выше. Можно допустить, что идея настоящего изобретения основывается на присутствии одного, двух или более сайтов расщепления между легкой и тяжелой цепью полипептида нейротоксина, тогда как природа сайта(ов) расщепления и конкретная аминокислотная последовательность между ними не имеет значения, так как агент является специфическим для частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксина. Соответственно, другим вариантом выполнения настоящего изобретения является замещение сайтов распознавания протеаз и линкерного пептида между тяжелой и легкой цепью полипептида нейротоксина или фланкирующих последовательностей, окружающих сайт расщепления (в случае одиночного сайта расщепления).

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, полипептид нейротоксин согласно способу по настоящему изобретению может представлять собой химерную молекулу. В такой указанной химерной молекуле, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, отдельные домены могут быть замещены. Соответственно, в другом варианте выполнения настоящего изобретения, часть тяжелой цепи нейротоксина замещена частью FC домена антитела.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения, полипептид нейротоксин, полученный согласно способу по настоящему изобретению, может применяться для аналитических инструментов, включая ELISA, антигены для ELISA и контрольные стандарты.

Для получения нейротоксина, кроме того, также свободного от других примесей, дополнительные стадии очистки, хорошо известные в данной области техники, могут быть добавлены к вышеупомянутому способу по настоящему изобретению и поясняются далее.

Как следует из вышеприведенного одного варианта выполнения способа по настоящему изобретению, указанный способ осуществляется с помощью аффинной хроматографии.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения, специфический иммуноабсорбер получают для иммуноаффинной хроматографии следующим образом:

- синтезируют специфический олигопептид (представленный любой из последовательностей SEQ ID NO:1-16 или 25) непроцессированного или частично процессированного полипептида предшественника, в частности, получают синтетический олигопептид;

- осуществляют конъюгацию пептида с подходящим носителем для иммунизации (включая гемоцианин, BSA, липополисахариды или другое), в частности, связывание олигопептида с полипептидным носителем;

- иммунизируют животных, в целях продуцирования поли- или моноклональных антител, в частности, иммунизируют кроликов или козлов, в целях продуцирования поликлональных антител, и иммунизируют мышей, в целях продуцирования моноклональных антител (по меньшей мере десять животных необходимо иммунизировать, чтобы получить аффинное антитело);

- гибридомные клеточные линии генерируют для получения моноклональных антител;

- очищают антитела с помощью обычной и аффинной хроматографии (в случае последней, олигопептид будет связываться с носителем), в частности, антитела очищают, применяя, например, белок А или G, и/или через олигопептид, связанный с носителем (последний применялся для иммунизации), или с помощью пептидной аффинной хроматографии для удаления неспецифических антител после аффинной хроматографии

- расщепляют специфические антитела на Fab фрагменты, в частности, специфические антитела обрабатывают протеазой, такой как папаин, для того, чтобы получить соответствующие Fab фрагменты;

- Fab фрагменты характеризуют по их свойствам связывания перед последующими применениями;

- антитела связывают с матрицей колонки, такой как активированная сефароза, в частности, специфические Fab фрагменты связывают с активными группами сцепления материала носителя;

- иммуноабсорбер (в колонке) промывают и уравновешивают, применяя подходящую буферную систему;

- непроцессированный или частично процессированный полипептид предшественник нейротоксина специфически связывается с иммуноабсорбером, тогда как активный процессированный полипептид нейротоксин проходит через колонку неизмененным (без связывания), и его собирают.

В другом варианте выполнения способа по настоящему изобретению в дополнение осуществляется эксклюзионная хроматография. При эксклюзионной хроматографии, как применяется в настоящем изобретении, частицы разделяются по их размеру, то есть по их гидродинамическому объему. Подвижная фаза представляет собой либо водный раствор, применяемый для переноса образца (гель-фильтрационная хроматография), либо органический растворитель (гель-проникающая хроматография). Стационарная фаза представляет собой либо гелевую среду (полиакриламид, декстран или агароза) и фильтр при низком давлении, либо диоксид кремния, либо среду на основе сшитого полистирола при более высоком давлении. В еще одном варианте выполнения настоящего изобретения указанная эксклюзионная хроматография осуществляется в виде колоночной хроматографии. В следующем варианте выполнения способа по настоящему изобретению указанная эксклюзионная хроматография осуществляется с помощью применения молекулярных сит с различным размером пор, таких как активированный уголь, силикагель, цеолит.

Способ по настоящему изобретению, в другом варианте выполнения настоящего изобретения, кроме того, содержит ионообменную хроматографию.

Ионообменная хроматография, как применяется в настоящем изобретении, разделяет молекулы на основе различий между общим зарядом белков и родственных соединений. Она применяется для очищения белков, для очищения олигонуклеотидов, пептидов или других заряженных молекул. Такие молекулы могут присутствовать в растворе, используемом в способе очищения, в качестве загрязнений. Белок или родственное соединение, представляющее интерес, в данной случае нейротоксин, должны иметь заряд, противоположный заряду функциональной группы, прикрепленной к смоле, для того, чтобы связывание было возможно. Так как это взаимодействие является ионным, связывание должно происходить в условиях низко ионной силы. Элюирование достигается путем повышения ионной силы для разрушения ионного взаимодействия, или путем изменения pH белка. В одном варианте выполнения способа по настоящему изобретению указанная обменная хроматография осуществляется в виде колоночной хроматографии.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения обменная хроматография, как применяется в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой ионообменную хроматографию.

Ионообменная хроматография, как применяется в настоящем изобретении, в следующем варианте выполнения настоящего изобретения, осуществляется в виде катионной и/или анионной хроматографии. В анионообменной хроматографии, как применяется в настоящем изобретении, поверхностный заряд растворенных веществ (белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, эндотоксины), которые связываются, будет фактически негативным, таким образом, для достижения связывания специфического белка, кислотность среды (pH) должна быть близка к или выше изоэлектрической точки (pl) этого белка. Смолы, как правило применяемые в анионообменной хроматографии, представляют собой Q-смолу (Q-сефароза), четвертичный амин и смолу DEAE (диэтиламиноэтан). В общем, ионообменная смола представляет собой нерастворимую матрицу из небольших шариков, имеющих заряженную поверхность, как например, искусственный цеолит. Различные типы смол могут отличаться по их функциональным группам, включая сильнокислотные смолы (группы сульфоновой кислоты, например, натрия полистиролсульфонат или поли(2-акриламидо-2-метилпропансульфоновая кислота) (AMPS)), сильноосновные смолы (четвертичные аминогруппы, например, триметиламмониевые группы, например, поли(акриламидо-N-пропилтриметиламмония хлорид) (АРТАС)), слабокислотные смолы (главным образом группы карбоновых кислот), слабоосновные смолы (первичные, вторичные и/или третичные аминогруппы, например, полиэтиленамин). Также существуют специализированные типы смол, которые отличаются, включая хелатирующие смолы (иминодиуксусная кислота, тиомочевина).

В катионообменной хроматографии, как применяется в настоящем изобретении, поверхностный заряд растворенных веществ (белков, пептидов, нуклеиновых кислот, эндотоксинов), которые связываются, является фактически позитивным, таким образом, для достижения связывания специфического белка кислотность среды (pH) должна быть близка к или ниже изоэлектрической точки (pl) этого белка. Смолы, в общем применяемые в катионообменной хроматографии, представляют собой S-смолу, сульфатные производные; и СМ смолы, происходящие из карбоксилатов ионы.

В одном варианте выполнения способа по настоящему изобретению, указанная ионообменная хроматография осуществляется перед и/или после аффинной хроматографии. В другом варианте выполнения способа по настоящему изобретению, указанная ионообменная хроматография, как применяется в настоящем изобретении, осуществляется перед аффинной хроматографии по настоящему изобретению.

Благодаря таким мерам, можно в дальнейшем избежать и уменьшить риск потенциальной перекрестной реакционной способности или неспецифического связывания в ходе аффинной хроматографии.

Способ по настоящему изобретению позволяет получать активный процессированный нейротоксин, свободный от непроцессированного или частично процессированного полипептида предшественника и, таким образом, получать более высокие количества активного процессированного полипептида нейротоксина.

Настоящее изобретение фактически относится к применению антитела по настоящему изобретению для отделения активного процессированного нейротоксина от его непроцессированного или частично процессированного полипептида предшественника. В одном варианте выполнения настоящего изобретения, антитело по настоящему изобретению применяется для отделения непроцессированного или частично процессированного полипептидного предшественника нейротоксина от активного процессированного полипептида нейротоксина в растворе, содержащем смесь указанных полипептидов, и, таким образом, для получения активного процессированного полипептида нейротоксина, свободного от непроцессированного или частично процессированного полипептида предшественника нейротоксина, что подробно раскрывается в описании настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к способу получения лекарственного средства, содержащему стадии вышеупомянутого способа и дополнительную стадию получения протеолитически процессированного полипептида нейротоксина в виде лекарственного средства.

Термин ″лекарственное средство″, как применяется в настоящем изобретении, относится к фармацевтической композиции, содержащей биологически активный (протеолитически процессированный) полипептид нейротоксин, в качестве фармацевтически активного соединения, где фармацевтическая композиция может применяться для лечения человека и не только, в случае различных заболеваний или нарушений, при терапевтически эффективной дозе.

Фармацевтическая компзиция, как применяется в настоящем изобретении, содержит биологически активный (протеолитически процессированный) полипептид нейротоксин по настоящему изобретению и, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, один или более фармацевтически приемлемых носителей. Активный нейротоксин может присутствовать в жидкой или лиофилизованной форме. В одном варианте выполнения настоящего изобретения, указанное соединение может присутствовать вместе с глицерином, белковыми стабилизаторами (например, альбумин человеческой сыворотки (HAS)) или небелковыми стабилизаторами.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения фармацевтическая композиция вводится местно. Как правило, лекарственное средство вводится внутримышечно, подкожно (около желез). Однако, в зависимости от природы и образа действия соединения, фармацевтическая композиция может также вводиться другими путями.

Соединение, то есть биологически активный (протеолитически процессированный) полипептид нейротоксин, представляет собой активный ингредиент композиции, и, в одном варианте выполнения настоящего изобретения, вводится в виде обычных лекарственных форм, полученных путем комбинации лекарственного вещества со стандартными фармацевтическими носителями согласно обычным методикам. Эти методики могут включать смешивание, гранулирование и прессование, или растворение ингредиентов, как необходимо для желательного препарата. Очевидно, что форма и характер фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя определяется количеством активного ингредиента, с которым он будет объединен, маршрутом ведения и другими хорошо известными переменными факторами.

Носитель (носители) должен (должны) быть приемлемым (приемлемыми), в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции, и не быть пагубным (пагубными) для его реципиента. Применяемый фармацевтический носитель может включать твердое вещество, гель или жидкость. Примеры твердых носителей представляют собой лактозу, белую трубочную глину, сахарозу, тальк, желатин, агар, пектин, гуммиарабик, стеарат магния, стеариновую кислоту и тому подобное. Примеры жидких носителей представляют собой фосфат-буферизованный физиологический раствор, сироп, масло, воду, эмульсии, различные типы смачивающих средств и тому подобное. Подобным образом, носители или разбавители могут включать материал для задержки высвобождения, хорошо известный в данной области техники, такой как глицерил моностеарат или глицерил дистеарат, сам по себе или в комбинации с воском. Указанные подходящие носители содержат упомянутые выше и хорошо известные в данной области техники носители, смотрите, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Разбавитель (разбавители) выбирается (выбираются) таким образом, чтобы не оказывалось влияние на биологическую активность комбинации. Примеры таких разбавителей представляют собой дистиллированную воду, физиологический раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Ханка. Кроме того, фармацевтическая композиция или препарат могут также включать другие носители, адъюванты или нетоксичные, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы и тому подобное.

Терапевтически эффективная доза относится к количеству соединения, применяемого в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, которое предотвращает, уменьшает или лечит симптомы, сопутствующие заболеванию или состоянию, перечисленным в описании настоящего изобретения. Терапевтическая эффективность и токсичность соединения могут быть определены стандартными фармацевтическими методиками на клеточных культурах или экспериментальных животных, например ED 50 (терапевтически эффективная доза для 50% популяции) и LD 50 (летальная доза для 50% популяции). Отношение доз для терапевтического и токсического эффектов представляет собой терапевтический индекс и может быть выражено как отношение LD 50/ED 50.

Режим введения доз будет определен лечащим врачом и зависит от других клинических факторов. Как хорошо известно в области медицины, дозы для любого пациента зависят от многих факторов, включая массу пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединение, которое будут вводить, пол, время и маршрут введения, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, которые вводят в то же самое время. Прогресс можно контролировать с помощью периодической оценки.

Фармацевтические композиции и препарата, упомянутые в настоящем изобретении, вводятся по меньшей мере один раз в целях лечения или уменьшения или профилактики заболевания или состояния, перечисленных в описании настоящего изобретения. Однако указанные фармацевтические композиции могут вводиться более одного раза.

Конкретные фармацевтические композиции получают хорошо известным в области фармацевтики образом, и они содержат по меньшей мере одно активное соединение, упомянутое выше, в смеси с или в виде другой ассоциации с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Для создания таких конкретных фармацевтических композиций, активное соединение (соединения), как правило, смешивают с носителем или разбавителем. Полученные препараты должны быть адаптированы к способу введения. Рекомендации в отношении применяемых доз должны быть указаны в назначениях или инструкциях по использованию, для того чтобы допустить регулирование дозы в зависимости от конкретного реципиента.

Лекарственное средство по настоящему изобретению может, в следующем варианте выполнения настоящего изобретения, содержать лекарственные вещества в дополнение к биологически активному (протеолитически процессированному) полипептиду нейротоксину, которые добавляются в фармацевтическую композицию в ходе ее получения. Наконец, необходимо понимать, что получение фармацевтической композиции происходит при GMP стандартизованных условиях или тому подобному, для того чтобы обеспечить качество, фармацевтическую безопасность и эффективность лекарственного средства.

Настоящее изобретение, в общем, обеспечивает композицию, содержащую протеолитически процессированный полипептид нейротоксин, получаемый способом по настоящему изобретению.

Термин ″композиция″ относится к любой композиции, полученной в твердой, жидкой, аэрозольной (или газообразной) форме. Указанная композиция содержит соединение по настоящему изобретению при необходимости вместе с подходящими вспомогательными соединениями, такими как разбавители или носители, или дополнительные ингредиенты. В этом отношении, согласно настоящему изобретению, существуют различия между вспомогательными соединениями, то есть соединениями, которые не вносят свой вклад в эффекты, вызываемые соединением по настоящему изобретению, при применении композиции по ее назначению, и дополнительными соединениями, то есть соединениями, которые вносят свой вклад в дополнительный эффект или модулируют эффект соединения по настоящему изобретению. Подходящие разбавители и/или носители зависят от назначения, для которого будет применяться композиция, и других ингредиентов. Специалист в данной области техники может определить такие подходящие разбавители и/или носители без промедления. Примеры подходящих носителей и/или разбавителей раскрываются в настоящем изобретении.

Согласно следующему объекту настоящего изобретения вышеупомянутая композиция представляет собой лекарственное средство, которое подробно описано в описании настоящего изобретения. В одном варианте выполнения настоящего изобретения лекарственное средство может применяться для профилактики и/или лечения по меньшей мере одного из следующих заболеваний и нарушений: сильное произвольное сокращение мышц, фокальная дистония, включая цервикальную, краниальная дистония и существенная блефароспазма, гемифациальный спазм и фокальная спастичность, нарушения в работе желудочно-кишечного тракта, гипергидроз и косметическая коррекция морщин, в следующем варианте выполнения настоящего изобретения также раскрываются: блефароспазма, ороманди-булярная дистония, а именно спазм мышц, открывающих рот, спазм мышц, закрывающих рот, бруксизм, синдром Мейжа, лингвальная дистония, апраксия век, цервикальная дистония, антеколлис, ретроколлис, латероколлис, тортиколлис, фарингеальная дистония, ларингеальная дистония, спазматическая дисфония/аддукторный тип, спазматическая дисфония/абдукторный тип, спазматическая одышка, дистония конечностей, дистония рук, дистония определенного действия, графоспазм, спазм музыканта, спазм игрока в гольф, дистония ног, аддукция бедра, абдукция бедра, сгибание коленного сустава, разгибание коленного сустава, сгибание ноги в голеностопном суставе, разгибание ноги в голеностопном суставе, эквиноварусная деформация стопы, дистония стоп деформационного типа, стриарный палец, сгибание пальца, распрямление пальца, аксиальная дистония, синдром ″Пизанской башни″, синдром ″двигающегося пупка″, сегментальная дистония, гемидистония, генерализованная дистония, X-сцепленный синдром ″паркинсонизм-дистония″ (Lubag), дистония при кор-тико-базальной дегенерации, тардивная дистония, дистония при спинально-церебеллярной атаксии, дистония при болезни Паркинсона, дистония при болезни Хантингтона, дистония при болезни Галлервордена-Шпатца, ДОФА-индуцированная дискинезия/ДОФА-индуцированная дистония, тардивная дискинезия/тардивная дистония, пароксимальная дискинезия /дистония, велопалатинная миоклония, вызванная кинезиогенным действием, некинезиогенным действием, миоклоническая миокимия, ригидность, мышечные судороги, наследственное дрожание подбородка, парадоксальная активность челюстных мышц, гемимастикаторные спазмы, гипертрофическая бронхиальная миопатия, гипертрофия жевательных мышц, гипертрофия передней большеберцовой мышцы, нистагм, надъядерный паралич взора с осциллопсией, эпилепсия парциальная непрерывная, планирование операции при спастической кривошеи, абдукторный паралич голосовых связок, не поддающаяся лечению мутационная дисфония, дисфункция верхнего пищеводного сфинктера, гранулема голосовых связок, болезнь Жиль де ля Туретта с заиканием, миоклония среднего уха, защитное закрытие гортани, постларингэктомия, потеря речи, защитный птоз, дисфункция сфинктера одди с заворотом век, псевдоахалазия, нонахалазия, эзофагеальные двигательные дисфункции, вагинизм, тремор при послеоперационной иммобилизации, дисфункция мочевого пузыря, детрузорно-сфинктерная диссинергия, спазм сфинктера мочевого пузыря, гемифациальный спазм, реиннервационная дискинезия, косметическое применение против гусиных лапок, ассиметрия лица со сморщенностью, впадины на подбородочной мышцы, синдром негибкого человека, гиперплазия предстательной железы при столбняке, ожирение, лечение косоглазия при инфантильном церебральном параличе, сопутствующий синдром смешанного паралича, после операции по отделению сетчатки, после операции при катаракте, косоглазие, связанное с миозитом и афакией, миопатическое косоглазие, диссоциированное вертикальное отклонение, в качестве дополнения к хирургическому лечению косоглазия, сходящееся косоглазие, расходящееся косоглазие, ахалазия, анальные трещины, гиперактивность желез внешней секреции, синдром Фрей, синдром ″крокодиловых слез″, гипергидроз, аксиллярная пальмарная плантарная ринорея, относительная гиперсаливация при инсульте, при болезни Паркинсона, спастические состояния при амиотрофномм латеральном склерозе, аутоиммунные процессы при энцефалите и миелите, рассеянный склероз, поперечный миелит, синдром Девика, вирусные инфекции, бактериальные инфекции, паразитические инфекции, грибковые инфекции, полушарный инфаркт при постинсультном синдроме при наследственном спастическом парапарезе, инфаркт ствола головного мозга, инфаркт спинного мозга, системная травма центральной нервной системы, полушарное поражение, поражение ствола головного мозга, поражение спинного мозга, кровотечение в центральной нервной системе, внутримозговое кровотечение, субарахноидальное кровотечение, субдуральное кровотечение, интраспинальное кровотечение, при неоплазии, полушарные опухоли, опухоли стволовой части мозга, опухоли спинного мозга. Подробности и симптомы раскрываются, например, в Jost 2007, Drugs 67(5), 669 или Dressier 2000 in Botulinum Toxin Therapy, Thieme Verlag, Stuttgart, New York.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения композиция представляет собой косметическую композицию, которая может быть получена таким образом, как описано для фармацевтической композиции выше. Для косметической композиции, подобным образом, предусматривается, что соединение по настоящему изобретению применяется в, по существу, очищенной форме. Косметические композиции, согласно следующему варианту выполнения настоящего изобретения, вводятся внутримышечно.

В еще одном варианте выполнения настоящего изобретения, косметические композиции, содержащие нейротоксин, могут быть получены в виде раствора против морщин.

Все источники, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящий документ посредством ссылки, в полном объеме, включая часть, конкретно упомянутую в описании настоящего изобретения.

На чертежах показано следующее:

Фиг. 1: схема обычного хроматографического очищения полипептида нейротоксина.

Фиг. 2: Схема хроматографического очищения биологически активного (протеолитически процессированного) полипептида нейротоксина и отделения его частично процессированного или непроцессированного полипептидного предшественника согласно настоящему изобретению.

Фиг. 3: Вестерн-блот анализ, с применением антитела, которое специфически распознает SEQ ID NO:25 и которое было получено согласно способу по настоящему изобретению. Размер связей указан в кДа. Отдельные полосы объясняются в примерах.

Следующие примеры иллюстрируют изобретению, но не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Получение иммуногена и антител

Получение иммуногенов

1. Линкерный пептид-иммуноген I: Пептид с последовательностью NH₂-TKSLDKGYNK-C-COOH получили с помощью внешнего источника и затем соединили линкером GMBS с белком-носителем KLH.

2. Линкерный пептид-иммуноген II: а) активация яичного альбумина; 2.18 мг сульфо-smcc (сульфосукцинимидил-4(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат) растворили в 50 мкл DMSO. Затем добавили 2.5 мл раствора яичного альбумина, содержащего 7.5 мг/мл яичного альбумина (буфер: 5 мМ фосфата натрия; 0.9% NaCl), и раствор инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, при вращении. Замену буфера осуществили, применяя PD10 колонки, активированный яичный альбумин элюировали в 3.5 мл буфера, содержащего 10 мМ фосфата натрия; 0.9% NaCl. b) соединение пептида с яичным альбумином; 8 мг пептида Ac-DKGYNC-ОН растворили в 250 мкл H₂O и 2.5 мкл 500 мМ ТСЕР HCL (трис[2-карбоксиэтил]фосфин HCL) и затем нейтрализовали с помощью 1 мМ NaOH. Наконец, добавили активированный яичный альбумин, и реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре, в течение 4.4 часов, при вращении. Посредством добавления 10 мМ раствора цистеина блокировали оставшиеся реакционноспособные остатки, при инкубации в течении 1 часа, при вращении. Осуществили диализ, применяя 10 мМ фосфата натрия; 0.9% NaCl.

Иммунизация

Антисыворотку получили посредством иммунизации.

1) Антилинкерный пептид scBoNT/A-сыворотка I: В качестве иммуногена применялся линкерный пептид-иммуноген I, который был соединен с помощью линкера GMBS с белком-носителем KLH. Двух козлов иммунизировали, каждого подкожно, сначала с помощью 300 мкг декапептидного иммуногена в адъюванте Фрейдшема, и, наконец, иммунизировали 4 раза с периодичностью в две недели, применяя 100 мкг иммуногена в неполном адъюванте Фрейдшема. Через 49, 63, 77 и 84 дня собрали антисыворотку. Аффинную хроматографию осуществили, применяя сыворотку, собранную при последнем спуске крови на 84 день.

2) Антилинкерный пептид scBoNT/A-сыворотка II: В качестве иммуногена применялся линкерный пептид-иммуноген II, который был соединен линкером SMCC с белком-носителем яичным альбумином. Двух кроликов иммунизировали, каждого интрадермально, сначала с помощью 300 мкг линкерного пептида-иммуногена II в адъюванте Фрейдшема и, наконец, иммунизировали пять раз с периодичностью в две недели, применяя 150 мкг линкерного пептида-иммуногена II в Монтаниде ISA 206. Аффинную хроматографию осуществили, применяя сыворотку, собранную при спуске крови на 60-ый день или 110-ый день, соответственно.

Двухстадийная аффинная хроматография сыворотки

1. Создание матрицы: В ходе двухстадийной аффинной хроматографии были получены две различные иодацетильные матрицы UltraLink, содержащие различные пептиды.

С одной стороны, пептиды с перекрестной реакционной способностью SLD, LDK и YNK были представлены в форме следующих пептидов Ас-ELDKYN-C-COOH (SEQ ID NO:26), NH₂-NISLDL-C-COOH (SEEQ ID NO:27) и NH₂-YYNKF-C-COOH (SEQ ID NO:28), и были соединены с матрицей, применяя общее описание, приведенное ниже. С другой стороны, линкерный пептид (SEQ ID NO:25) был соединен с матрицей, применяя общее описание, приведенное ниже, в форме следующей производной: Ас-TKSLDKGYNKA-C-COOH.

Общее описание:

Связывающий буфер: 50 мМ Трис, 5 мМ EDTA-Na, pH 8.5. Приготовление объема буфера, равного 20-ти кратному объему иодацетильного геля (UI-traLink^® lodoacetyl Gel), который должен применяться.

L-цистеин HCL; Промывочный раствор: 1 мМ хлорида натрия (NaCl).

Колонка, опорожняемая самотеком, или спин-колонка, которая может быть накрыта как сверху, так и снизу.

Получение пептидного или белкового образца

Растворение пептида в связывающем буфере.

Связывание с иодацетильным гелем (UltraLink^® lodoacetyl Gel):

1. Когда нижняя крышка помещена на колонку, опорожняемую самотеком, добавляют желательное количество суспензии иодацетильного геля (UltraLink^® lodoacetyl Gel), давая возможность гелю осесть в течение 15 минут.

2. Сливают жидкость из набитой колонки и промывают/уравновешивают иодацетильный гель (UltraLink^® lodoacetyl Gel) связывающим буфером, объем которого равен пяти объемам слоя геля, путем добавления на вершину слоя геля, позволяя ему стекать через колонку. При этом гелевому слою не позволяют высыхать.

3. Устанавливают нижнюю крышку и добавляют полученный образец, содержащий сульфгидрил.

Около 1 мл раствора образца может быть добавлено на мл иодацетильного геля (UltraLink^® lodoacetyl Gel).

4. Устанавливают верхнюю крышку и смешивают колонку при комнатной температуре в течение 15 минут.

5. Устанавливают колонку вертикально и инкубируют при комнатной температуре, в течение 30 минут, без смешивания.

6. Затем удаляют верхнюю и нижнюю крышки, и позволяют раствору стекать.

7. Промывают колонку связывающим буфером, объем которого равен трем объемам слоя геля.

Блок-неспецифические сайты связывания на геле.

1. Устанавливают нижнюю крышку на колонку.

2. Получают раствор 50 мМ L-цистеина HCL в связывающем буфере, и добавляют в колонку 1 мл этого раствора на каждый миллилитр геля.

3. Устанавливают верхнюю крышку и смешивают 15 минут при комнатной температуре, затем инкубируют реакционную смесь без смешивания в течение еще 30 минут при комнатной температуре.

2. Двухстадийная аффинная хроматография: Очищаемую сыворотку прежде всего отделяют от крови.

Неочищенную сыворотку помещают на первую колонку, содержащую трипептиды, способные к перекрестным реакциям. Способные к перекрестным реакциям антитела связываются с трипептидами и отделяются от неочищенной сыворотки. Фильтрат этой первой колонки помещают на вторую колонку, содержащую связанный линкерный пептид. Антитела, специфические к линкерному пептиду, связываются с линкерным пептидом. Анти-линкерный пептид scBoNT/A антитела низкой аффинности удаляются с колонки путем промывания PBS буфером в строгих условиях (0.5 М NaCl). Затем связанные высокоаффинные антилинкерный пептид scBoNT/A антитела элюируют и концентрируют. Этот концентрат соответствует применяемой анти-линкерный пептид scBoNT/A сыворотке.

Пример 2: Тест и проверка специфичности антитела

Реагенты для анализа ELISA:

Буфер для сенсибилизации поверхностей: 0.005 М - 1М Трис; 0.9% NaCl, предпочтительно 0.01 М-0.2 М Трис; 0.9% NaCl, pH=8.5.

Фиксирующее антитело: антилинкерный пептид scBoNT/A-сыворотка.

Буфер для блокировки и разбавления антиела: 0.5% - 5% BSA в 0.01 М фосфате натрия; 0.9% NaCl, pH=7.4.

Буфер для образца: 0.5%-5% BSA в 0.005 М-1 М фосфате натрия; 0.1-0.5 М NaCl; 0.01%-1% Твин 20, предпочтительно 1%-3% BSA в 0.005-0.1 М фосфате натрия; 0.15 М-0.4 М NaCl; 0.05% - 0.5% Твин 20, pH=7.4.

Промывочный буфер: 0.01 М фосфат натрия; 0.9% NaCl; 0.05% Твин 20, pH=7.4.

Детекционное антитело: моноклональное антитело против BoNT/A.

Вторичное антитело: поликлональное антитело против мышиного IgG (H&L), конъюгированное с пероксидазой.

Субстрат: коммерчески доступный ТМВ.

2. Реагенты для Вестерн-блот анализа:

Коммерчески доступный буфер для денатурации образца.

Коммерчески доступный SDS гель.

MES подвижный буфер (SDS PAGE): коммерчески доступный. PVDF мембрана: коммерчески доступная.

Буфер для блоттинга (Вестерн-блот): коммерчески доступный.

Образец: Ботулинический нейротоксин А с двухцепочечным BoNT/A и scBoNT/A.

Первичное антитело: анти-линкерный пептид scBoNT/A сыворотка.

Вторичное антитело: поликлональное ослиное антитело против козлиного IgG (H&L), конъюгированное с щелочной фосфатазой.

Буфер для блокировки и разбавления антитела: 0.5%-5% BSA в 0.01 М-0.1 М Трис; 0.9% NaCl; 0.05%-5% Твин 20, pH=7.4.

Промывочный буфер: 0.01 М-0.1 М Трис; 0.9% NaCl; 0.05%-5% Твин 20, pH=7.4.

Трис буфер: 0.025 М Трис, pH=8.0. Субстрат: коммерчески доступный BCIP/NBT.

а) Специфичность антисыворотки в отношении BoNT/B и BoNT/E: Для определения специфичности антисыворотки в отношении BoNT/B и BoNT/E анализируют скорость восстановления веществ, применяя анализ ELISA. Микротитровальные планшеты инкубируют со 100 мкл/лунка буфера для сенсибилизации поверхности, содержащего 0.5 мкг анти-линкерный пептид scBoNT/A-сыворотка/мл, в течение 16 часов, при комнатной температуре, и затем трижды промывают промывочным буфером. На микротитровальные планшеты добавляют 200 мкл/лунка блокирующего раствора и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. scBoNT/A антиген (серийно разбавленный в буфере для образца; концентрация в пг/мл) применяется в качестве калибровочного стандарта, микротировальные планшеты инкубируют со 100 мкл/лунка калибровочного стандарта. BoNT/B или BoNT/B или BoNT/E, соответственно, разбавляют в буфере для образца и наносят на микротитровальный планшет, при объеме 100 мкл/лунка. Оба вещества наносятся в избытке, применяется разбавление 200 нг/мл. Образцы и стандарты инкубируют в течение 2 часов при 37°C. Микротитровальные планшеты трижды промывают промывочным буфером. Добавляют 100 мкл детекционного буфера/лунка и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем микротитровальные планшеты трижды промывают промывочным буфером. Затем инкубируют со 100 мкл/лунка вторичного антитела в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем микротитровальные планшеты трижды промывают промывочным буфером.

Реакция обнаружения начинается при добавлении 100 мкл субстрата/лунка. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре реакцию останавливают путем добавления 50 мкл 2 М H₂SO₄/лунка, и определяют поглощение при 450 нм. Концентрации BoNT/b и BoNT/E вычисляют путем стандартизации для определения специфичности. Путем вычисления скорости восстановления может быть определена специфичность анти-линкерный пептид scBoNT/A-сыворотки в отношении серотипов В и Е. Чем ниже скорость восстановления, тем ниже реакционная способность к перекрестным реакциям и тем выше специфичность сыворотки в отношении scBoNT/A.

b) Специфичность анти-линкерный пептид scBoNT/A-сыворотки в отношении двухцепочечного BoNT/A: Для определения специфичности антисыворотки в отношении активированного двухцепочечного BoNT/A осуществили иммуногистологическое обнаружение с помощью Вестерн блоттинга. NT образец (по меньшей мере 50 нг scBoNT/A, количество двухцепочечного BoNT/A зависит от применяемого образца) отделяется при восстанавливающих условиях, с помощью SDS-PAGE, в соответствии с его молекулярной массой в scBoNT/A, LC и НС (двухцепочечный-BoNT/A). Белки затем блотируют на PVDF мембрану. Мембрана блокируется с помощью 20 мл блокирующего буфера в течение 1 часа при комнатной температуре.

Удаляют блокирующий буфер и добавляют 20 мл раствора первичного антитела, содержащего 0.005 мкг/мл антилинкерный пептид scBoNT/A сыворотки. Первичное антитело инкубируют всю ночь при 4°C.Удаляют раствор, содержащий антитело, и мембрану трижды промывают в течение 30 минут, применяя 20 мл промывочного буфера при 37°C. Затем мембрану инкубируют в течение 3 часов, при комнатной температуре, с 20 мл вторичного антитела при концентрации 0.4 мкг/мл. Удаляют раствор вторичного антитела, и мембрану трижды промывают в течение 30 минут, применяя 20 мл промывочного буфера при 37°C. Дополнительно мембрану промывают один раз, применяя 20 мл 25 мМ Трис буфера, в течение 5 минут, при комнатной температуре.

Реакция обнаружения осуществляется посредством добавления субстрата. Субстрат инкубируют в течение 15 минут, и цветную реакцию останавливают путем добавления воды. Специфичность определяют по окрашиванию полосы scBoNT/A при 150 кДа. Специфичность антилинкерный пептид scBoNT/A сыворотки определяли, когда обнаруживалась только специфическая полоса при 150 кДа, но не полоса, специфичная для двухцепочечного BoNT/A, при 100 кДа (НС) и 50 кДа (LC). На Фиг. 3 полоса 3 показывает специфичность для scBoNT/A 150 кДа препарата BoNT/A (NT образец, смотрите выше). Никакие полосы не проявляются при 100 кДа или 50 кДа, распознается только scBoNT/A. Для сравнения, полоса 4 относится к смеси частично процессированного и непроцессированного scBoNT/A, и полоса 5 показывает нерасщепляемый scBoNT/A контроль. Буферный контроль показан на полосе 2.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложено поликлональное или моноклональное антитело, которое специфически связывает эпитоп, состоящий из пептида TKSLDKGYNK нейротоксина Clostridium, и получено путем применения олигопептида с упомянутым эпитопом. Раскрыт способ получения антитела, специфичного к протеолитически непроцессированному и/или частично процессированному ботулиническому нейротоксину типа А. Поликлональную антисыворотку, полученную иммунизацией иммуногеном TKSLDKGYNKА, смешивают с указанным пептидом. Удаляют образовавшийся комплекс пептида и антитела из антисыворотки. Отделяют антитело из указанного комплекса. Описано поликлональное антитело, полученное указанным способом, образующее комплекс с TKSLDKGYNKА. Предложено применение антител для отделения или обнаружения протеолитически частично процессированного и/или непроцессированного полипептида. Описан способ получения протеолитически процессированного полипептида ботулинического нейротоксина типа А. Раствор со смесью протеолитически процессированного, частично процессированного и/или непроцессированного полипептида ботулинического нейротоксина типа А смешивают с антителом с образованием комплексов антитела с протеолитически частично процессированным и/или непроцессированным полипептидом. Удаляют образовавшийся комплекс полипептида и антитела из раствора. Раскрыт способ получения лекарственного средства, в котором используют способ получения протеолитически процессированного полипептида ботулинического нейротоксина типа А с последующим формированием упомянутого раствора в качестве лекарственного средства. Использование изобретения обеспечивает отделение протеолитически частично процессированного и/или непроцессированного полипептида ботулинического нейротоксина типа А, что может найти применение в получении лекарственных композиций ботулинического нейротоксина типа А. 7 н. и 9 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Поликлональное или моноклональное антитело, которое специфически связывает эпитоп, состоящий из пептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 из нейротоксина Clostridium, где антитело получено путем применения олигопептида, содержащего упомянутый эпитоп.

2. Антитело по п. 1, где указанный эпитоп содержится в протеолитически непроцессированном или частично процессированном полипептиде ботулинического нейротоксина типа А.

3. Способ получения антитела, которое специфически связывается с протеолитически непроцессированным и/или частично процессированным полипептидом ботулинического нейротоксина типа А, содержащий стадии:
а) контакта поликлональной антисыворотки из не принадлежащего к человеческому роду животного, которое было иммунизировано с применением пептидного иммуногена, содержащего аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:25, с пептидом, имеющим SEQ ID NO:25, в условиях, которые допускают образование комплекса, содержащего вышеупомянутый пептид и антитело, которое специфически связывается с протеолитически непроцессированным или частично процессированным полипептидом ботулинического нейротоксина типа А;
b) удаления комплекса, сформировавшегося на стадии а), из антисыворотки; и
c) высвобождения антитела, которое специфически связывается с непроцессированным или частично процессированным полипептидом ботулинического нейротоксина типа А, из указанного комплекса.

4. Способ по п. 3, где указанный способ, кроме того, содержит перед стадией а) стадии:
i) контакта указанной поликлональной антисыворотки из не принадлежащего к человеческому роду животного, которое было иммунизировано с применением пептидного иммуногена, содержащего аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID NO:25, со следующими пептидами захвата SLD, LDK и YNK, в условиях, которые допускают формирование комплексов захвата, содержащих неспецифические антитела, содержащиеся поликлональной антисывороткой, и пептиды захвата; и
ii) удаления комплексов захвата из поликлональной антисыворотки.

5. Способ по п. 3, где указанный иммуноген, кроме того, содержит KLH.

6. Способ по п. 5, где указанный KLH связывается с пептидом, имеющим SEQ ID NO:25, через линкер сложный эфир N-[гамма-малеимидобутирилокси]сукцинимида (GMBS).

7. Способ по п. 3, где стадии а) - с) осуществляются посредством аффинной хроматографии.

8. Способ по любому из пп. 4-7, где стадии i) и ii) осуществляются посредством аффинной хроматографии.

9. Антитело, образующее комплекс с пептидом, имеющим SEQ ID NO:25, полученное способом по любому из пп. 3-8, где антитело является поликлональным антителом.

10. Антитело по любому из пп. 1, 2 или 9, где указанное антитело связано с твердой подложкой.

11. Применение антитела по любому из пп.1, 2, 9 или 10 для отделения протеолитически частично процессированного и/или непроцессированного полипептида ботулинического нейротоксина типа А от протеолитически процессированного полипептида ботулинического нейротоксина типа А.

12. Применение антитела по любому из пп. 1, 2, 9 или 10 для обнаружения протеолитически частично процессированного и/или непроцессированного ботулинического нейротоксина типа А в образце.

13. Способ получения протеолитически процессированного полипептида ботулинического нейротоксина типа А, содержащий стадии:
a) контакта раствора, содержащего смесь протеолитически процессированного и частично процессированного и/или непроцессированного полипептида ботулинического нейротоксина типа А, с антителом по пп. 1, 2, 9 или 10, в условиях, которые допускают связывание указанного антитела с непроцессированными и/или частично процессированными полипептидами ботулинического нейротоксина типа А, при этом формируются комплексы, содержащие указанное антитело и частично процессированный или непроцессированный полипептид ботулинического нейротоксина типа А, и
b) удаления указанных комплексов, сформировавшихся на стадии а), при этом получают раствор, содержащий протеолитически процессированный полипептид ботулинического нейротоксина типа А, свободный от непроцессированного и/или частично процессированного полипептида ботулинического нейротоксина типа А.

14. Способ по п. 13, где стадии а) и b) осуществляются посредством аффинной хроматографии.

15. Способ по п. 13 или 14, где указанный способ, кроме того, содержит ионообменную хроматографию.

16. Способ получения лекарственного средства, содержащий стадии способа по любому из пп. 13-15 и следующую стадию формирования упомянутого раствора, содержащего протеолитически процессированный полипептид ботулинического нейротоксина типа А, свободный от непроцессированного или частично процессированного полипептида ботулинического нейротоксина типа А, в качестве лекарственного средства.