СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЭНДОМЕТРИОЗА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ У КРЫС Российский патент 2024 года по МПК A61B17/00 G09B23/28 A61K31/07 A61P3/02 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для лечения эндометриоза в эксперименте у крыс.

Распространенность эндометриоза среди пациенток репродуктивного возраста варьирует от 2 до 10%, у инфертильных женщин эндометриоз подтверждается в 50% случаев. В настоящее время более 190 миллионов женщин репродуктивного возраста и девочек-подростков во всем мире страдают эндометриозом [Becker С.М., Bokor A., Heikinheimo О. et al., ESHRE Endometriosis Guideline Group.ESHRE guideline: endometriosis. Hum Reprod Open. 2022 Feb 26; 2022(2): hoac009. doi: 10.1093/hropen/hoac009]. Многогранность патогенетических механизмов развития заболевания, вариабельность клинической симптоматики, а также отсутствие единой концепции терапии эндометриоза, диктуют необходимость поиска новых направлений коррекции данной патологии.

Таким образом, необходимо дальнейшее изучение патогенеза заболевания и разработка альтернативных методов патогенетически обоснованного медикаментозного лечения.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств лечения эндометриоза, возможность избежать использования гормональных средств и побочных эффектов, ассоциированных с их применением.

Указанный технический результат достигается в способе лечения эндометриоза в эксперименте у крыс, в котором на основании экспериментальной модели хирургически индуцированного эндометриоза у крыс линии Wistar выполняют пероральное введение ретинола в дозировке 10 мг/кг ежедневно в течение 21 дня.

Среди групп лекарственных препаратов, применяемых в качестве медикаментозной терапии наружного генитального эндометриоза (НГЭ), наиболее эффективной для купирования эндометриоз-ассоциированного болевого синдрома является гормономодулирующая терапия. Согласно гайдлайну ESHRE «Эндометриоз», 2022 год, [Becker C.M, Bokor А, Heikinheimo О, et al. ESHRE Endometriosis Guideline Group.ESHRE guideline: endometriosis. Hum Reprod Open. 2022 Feb 26;2022(2): hoac009. doi: 10.1093/hropen/hoac009], рекомендуется назначение следующих групп препаратов - прогестагенов, антигестагенов, комбинированных оральных контрацептивов, агонистов гонадотропин-рилизинг гормона (аГнРГ), антагонистов ГнРГ, внутриматочной системы с левоноргестрелом (LNG-IUS), подкожного имплантата с этоногестрелом, даназола и ингибиторов ароматазы (например, летрозола). Все вышеперечисленные гормональные методы лечения приводят к клинически значимому уменьшению болевого синдрома по сравнению с плацебо (при использовании визуальных аналоговых шкал для оценки дисменореи и хронической тазовой боли), однако имеют ряд побочных эффектов, а также ограничены по длительности применения метода. Хирургический способ лечения эндометриоза долгие годы рассматривался в качестве «золотого стандарта» терапии заболевания, однако, за последние годы взгляд на проблему несколько изменился. Хирургический и медикаментозный методы не противопоставляются, а лишь дополняют друг друга [Vercellini P., Frattaruolo М.Р., Somigliana Е., Jones G.L, Consonni D., Alberico D., Fedele L. Surgical versus low-dose progestin treatment for endometriosis-associated severe deep dyspareunia II: effect on sexual functioning, psychological status and health-related quality of life. Hum Reprod 2013; 28: 1221-1230], однако частота рецидивов заболевания эндометриоза даже при комбинированном лечении по-прежнему остается высокой. Вышесказанное обосновывает необходимость более углубленное изучение механизмов патогенеза заболевания с целью разработки альтернативных методов терапии эндометриоза.

Известно, что в развитии эндометриоза принимают участие неэффективная эстрогензависимая воспалительная реакция, «прогестеронорезистентность», ангиогенез, гиперпролиферация, сниженный апоптоз и оксидативный стресс [Ярмолинская, М.И. Генитальный эндометриоз. Различные грани проблемы / М.И. Ярмолинская, Э.К. Айламазян. - Санкт-Петербург: Эко-Вектор, 2017. - 615 с.]. Согласно литературным данным [Pierzchalski K., Taylor R.N., Nezhat С. et al. Retinoic acid biosynthesis is impaired in human and murine endometriosis // Biol. Reprod. 2014. Vol.91. No. 4. P. 84. DOI: 10.1095/biolreprod.l 14.119677], роль ретинола в патогенезе эндометриоза заключается в ингибировании пролиферации эндометриоидных кист яичников, модулировании синтеза провоспалительных цитокинов, способности уменьшать размеры эндометриоидных гетеротопий.

Доказана роль ретинола как антиоксиданта в подавлении прогрессирования оксидативного стресса. Он способствует повышению активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы, инактивирующих свободные радикалы, и снижению уровня малонового диальдегида, участвующего в метаболизме арахидоновой кислоты и индуцирующего оксидативный стресс. Вышеупомянутые маркеры оксидативного стресса наблюдаются как в сыворотке крови, так и в перитонеальной жидкости у пациенток с НГЭ [Mier-Cabrera J, Aburto-Soto Т, Burrola-Mendez S, et al. Women with endometriosis improved their peripheral antioxidant markers after the application of a high antioxidant diet. Reprod Biol Endocrinol. 2009 May 28; 7:54. doi: 10.1186/1477-7827-7-54].

Использование лабораторных животных, а именно крыс, рассматривается в качестве наиболее целесообразного способа разработки новых методов диагностики и терапии заболевания. Все изменения, происходящие в организме лабораторных животных, как физиологические, так и при наличии эндометриоза, сходны с таковыми у человека, что позволяет рационально использовать полученные результаты и обоснованно внедрять их в клиническую практику.

Заявляемый способ основан на экспериментальных исследованиях на 21 половозрелой самке крыс линии Wistar в возрасте от 10 до 12 недель, массой 220±50 г. При реализации эксперимента соблюдены все общие требования «Правил лабораторной практики в Российской Федерации», утвержденные приказом Министерства здравоохранения РФ No 199н от 01.04.2016 г. и положения «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», положениями Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Washington D.C., 2011). Все лабораторные животные были выведены из ФГУП «Питомник лабораторных животных "Рапполово" и содержались в одинаковых условиях вивария ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» с соблюдением всех правил (маркировка всех особей, постоянный санитарный контроль, стандартный рацион питания, свободный доступ к воде и пище, автоматический режим освещения «день-ночь»). За 2 недели до начала эксперимента все животные подвергались карантинизации.

До начала проведения эксперимента, после окончания сроков карантинизации, в течение 14 дней проводилась оценка эстрального цикла у крыс путем забора влагалищных мазков с последующим микроскопическим исследованием после фиксации материала и окраски метиленовым синим. Все особи, включенные в эксперимент, находились в фазе эструса.

Создание экспериментальной модели проводилось в 3 этапа.

Первый этап - моделирование,

Анестезиологическое пособие осуществлялось с применением золазепама гидрохлорида 100 в дозировке 30 мг/кг внутримышечно. Антибактериальная профилактика инфекционных осложнений проводилась с помощью внутримышечного введения цефтриаксона 50 мг/кг с последующим пролонгированием курса терапии в послеоперационном периоде на 3 дня.

В ходе хирургического вмешательства после обработки операционного поля проводилась срединная лапаротомия протяженностью 2 см. После осуществления оперативного доступа, осмотра органов брюшной полости, выполнялось выделение правого рога матки и правого яичника. Чуть выше места бифуркации (+3 мм) проводилась перевязка правого маточного рога. После перевязки брыжейки яичника произведено иссечение правого рога матки и правого яичника соответственно. Маточный рог погружали в теплый физиологический раствор. Слева после проведения перевязки брыжейки яичника выполнялась овариоэктомия. Далее из иссеченного маточного рога после продольного разреза выполнялось формирование имплантатов размером 3×3 мм. Фиксация имплантатов проводилась справа и слева на париетальную брюшину передней брюшной стенки в области бифуркации сосудов, эндометрием к сосудам, миометрием - в брюшную полость. После выполнения тщательного гемостаза и ревизии брюшной полости, выполнялось послойное ушивание послеоперационной раны.

После оперативного вмешательства эстрогенный фон создавался с помощью внутримышечных инъекций масляного раствора этинилэстрадиола в дозе 50 мкг/кг на следующий день после овариоэктомии и далее дважды в неделю до момента окончания эксперимента.

На втором этапе, через 14±2 дня после первого оперативного вмешательства, проводилась лапароскопия для подтверждения формирования модели и оценки стартовых размеров эндометриоидных гетеротопий. Площадь эндометриоидных гетеротопий оценивалась по формуле площади эллипса: S=A*B*π, где S - площадь гетеротопий (мм2), А - продольный размер (мм), В -поперечный размер (мм), π - 3,14.

После рандомизации было сформировано 3 группы:

Первая группа животных А (основная) (n=5) получала ежедневно перорально ретинола пальмитат, Ретиноиды АО (Россия), в дозировке 10 мг/кг/день.

Вторая группа В - контрольная (n=4), лечение не получала.

Третья группа С - группа сравнения (n=5), ежедневно перорально получала диеногест в дозе 1 мг/кг.

На 21-е сутки лечения лабораторных животных выводили из эксперимента. После вскрытия проводили визуальную оценку формирования эндометриоидных гетеротопий в местах имплантации. Имплантированные ткани замеряли в двух плоскостях, иссекали из окружающих тканей и фиксировали в нейтральном 10% формалине для последующего гистологического исследования.

Размеры эндометриоидных гетеротопий до начала терапии заболевания варьировали в пределах от 16 мм² до 40 мм². Средняя площадь гетеротопий в группе А до начала терапии составила 33,3 мм²±6,78 мм². Спустя 3 недели после ежедневного перорального применения ретинола отмечалась полная резорбция очагов эндометриоза, что подтверждается результатами гистологического исследования. В группе животных С, получавших диеногест, средняя площадь эндометриоидных гетеротопий до начала терапии составила 41,16 мм²±12,1 мм². После завершения лечения полная резорбция наблюдалась в 70% случаях, в 30% отмечалось уменьшение размеров эндометриоидных гетеротопий до 12,14 мм²±4,18 мм². В контрольной группе В исходная средняя площадь эндометриоидных гетеротопий составила 28,14±6,11 мм² через 3 недели площадь эндометриоидных гетеротопий увеличилась до 45,78 мм²±11,5 мм².

Полученный после выведения животных из эксперимента материал подвергался фиксации в течение 24 часов в 10% нейтральном забуференном формалине. Гистологическую проводку материала осуществляли с использованием автоматической станции Histo-Tek VP1, далее образцы заливали в парафиновые блоки и готовили гистологические срезы толщиной 4 мкм, полученные микросрезы окрашивали гематоксилином и эозином. При световой микроскопии выявляли наличие эндометриоидной гетеротопий в инфильтратах, определяли реактивные и патологические воспалительные изменения. Световую микроскопию проводили на микроскопе Olympus СХ3 (Olympus, Япония) при увеличении ×100200, ×400.

Выполнено гистологическое исследования образцов эндометриоидных гетеротопий в трех группах.

Способ иллюстрируется фиг. 1-2, где:

на фиг. 1 - эндометриоидная киста с десквамированным эпителием, клеточным детритом и нейтрофильными лейкоцитами в просвете в контрольной группе животных В. Г-Э, ×100.

на фиг. 2 - Эндометриоидная киста с эктазией просвета и перифокальным продуктивным воспалением в группе С после лечения. Г-Э, ×100

В основной группе А (после лечения ретинолом) отмечена полная резорбция очагов эндометриоза, гетеротопий не выявлены. Визуализировались фрагменты шовного материала с умеренным перифокальным продуктивным воспалением. В 30% случаев фрагменты имплантированной матки со вторичными изменениями, представленные соединительнотканным рубцом с перифокальными кровоизлияниями.

Во всех образцах контрольной группы В присутствовали поперечно -полосатые мышцы с шовным материалом, в 89% выявлены сформированные эндометриоидные гетеротопий в виде "кист" (фиг. ), выстланные эндометриодноподобным эпителием, в 11% случаев - участками шовного материала со скоплением гигантских многоядерных клеток, местами с перифокальным воспалением. В 50% случаев отмечена гиперваскуляризация эндометриоидных гетеротопий. В 25% случаев определялась экссудативная инфильтрация и плазмоцитарная инфильтрация.

В группе сравнения С, получавших диеногест, в 30% выявлена эндометриоидная гетеротопия с единичными кистами (фиг. 2), однако визуально размеры очагов на фоне лечения имели достоверную тенденцию к уменьшению, в 70% произошла резорбция эндометриоидных гетеротопий.

Полученные результаты продемонстрировали высокую эффективность ретинола в терапии хирургически индуцированного эндометриоза у крыс (полная резорбция эндометриоидных гетеротопий по результатам гистологического исследования) и являются основанием для дальнейшего продолжения экспериментальных исследований с целью оценки наиболее эффективных минимальных доз, длительности терапии и возможности применения ретинола в клинической практике у больных эндометриозом. Пример осуществления способа.

При заборе мазков у крыс №4, №8 и №11 весом 220, 218 и 222 грамма была подтверждена фаза эструса. После выполнения анестезии и подготовки операционного поля, осуществлялась лапаротомия с помощью срединного вертикального разреза. Далее произведен осмотр органов брюшной полости, яичников и маточных рогов, выполнена правосторонняя овариоэктомия с резекцией правого маточного рога и левосторонняя овариоэктомия. Из иссеченного правого маточного рога созданы имплантаты размерами 3×3 мм. Фиксация имплантатов проводилась справа и слева на париетальную брюшину передней брюшной стенки в области бифуркации сосудов, эндометрием к сосудам, миометрием - в брюшную полость. В течение 3-х дней проводилась а/б терапия цефтриаксоном 50 мг/кг. На следующий день после оперативного вмешательство вводился масляный раствор этинилэстрадиола в дозировке 50 мкг/кг, далее дважды в неделю до окончания эксперимента. Через 14 дней после оперативного вмешательства выполнена лапароскопия с оценкой площади эндометриоидных гетеротопий до начала терапии. У крысы №4 площадь эндометриоидного очага составила 22,1 мм², у крысы №8 - 30,6 мм², №11 - 36,4 мм². Далее в течение 21 дня крыса №4 получала ретинол в дозировке 10 мг/кг, крыса №8 - терапию не получала, крысе №11 осуществлялось введение диеногеста в дозировке 1 мг/кг. Через 3 недели производилось выведение животных из эксперимента, с повторной оценкой площади эндометриоидных гетеротопий после терапии и гистологическим исследованием полученных образцов. У крысы №4 отмечалась полная резорбция эндометриоидных имплантатов, у крысы №8 площадь гетеротопий составила 38,3 мм² (отмечен достоверный рост), у крысы №11 - 15,8 мм² (уменьшение размеров гетеротопий в 2,3 раза).

Способ позволяет расширить арсенал средств лечения эндометриоза, дает возможность избежать использования гормональных средств и побочных эффектов, ассоциированных с их применением, имеет высокую эффективность, подтвержденную полной резорбцией эндометриоидных гетеротопий.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для лечения эндометриоза в эксперименте у крыс. На основании экспериментальной модели хирургически индуцированного эндометриоза у крыс линии Wistar выполняют пероральное введение ретинола в дозировке 10 мг/кг ежедневно в течение 21 дня. Способ расширяет арсенал средств лечения эндометриоза, обеспечивает полную резорбцию очагов эндометриоза, позволяет избежать применения гормональных препаратов и ассоциированных с их приемом побочных эффектов, проводить исследования по выявлению наиболее эффективных минимальных доз, длительности терапии у больных эндометриозом. 2 ил., 1 пр.

Способ лечения эндометриоза в эксперименте у крыс, заключающийся в том, что на основании экспериментальной модели хирургически индуцированного эндометриоза у крыс линии Wistar выполняют пероральное введение ретинола в дозировке 10 мг/кг ежедневно в течение 21 дня.