НОВЫЕ СОСТАВЫ, КОТОРЫЕ СТАБИЛИЗИРУЮТ ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ И ИНГИБИРУЮТ ИХ ОСАЖДЕНИЕ Российский патент 2013 года по МПК A61K47/48 A61K47/12 A61K39/09 A61P31/04 

Область изобретения

Настоящее изобретение в общем относится к области иммунологии, бактериологии, приготовления вакцин, стабильности белков и к разработке процессов изготовления. Более конкретно, изобретение относится к новым составам, которые ингибируют (подавляют) осаждение иммуногенных композиций.

Уровень техники

Специалистам в области биофармацевтики известно, что повышение стабильности иммуногенной композиции (например, белкового иммуногена, конъюгата полисахарид-белок) является необходимой и чрезвычайно желательной целью в частности, иммуногенная композиция для введения пациенту должна быть свежей, профессионально приготовленной и иметь привлекательный внешний вид. Любые изменения стабильности и/или физического внешнего вида иммуногенной композиции, в частности изменение цвета, помутнение или потемнение, могут вызвать у пациента или потребителя недоверие к продукту. Кроме того, поскольку многие иммуногенные составы упаковывают в контейнеры для многократного применения, необходимо обеспечивать одинаковое содержание активного ингредиента (в частности, конъюгата полисахарид-белок) в каждой дозе (например, в мутном растворе дозы могут иметь неравномерный состав). При этом иммуногенная композиция должна сохранять активность в течение всего "ожидаемого" срока хранения, причем любое превращение иммуногенной композиции в неактивную или иную нежелательную форму (например, в агрегат) снижает общую концентрацию продукта.

В некоторых литературных источниках высказано предположение, что стабильность конкретной иммуногенной композиции (такой, как, например, белковый иммуноген или конъюгат полисахарид-белок) по меньшей мере частично зависит от специфичного белка или белка-носителя (Ho et al., 2001; Но et al., 2002, Bolgiano et al., 2001). Так, например, анализ стабильности полисахаридов менингококка типа С (MenC) и полисахаридов Haemophilus influenzae типа b (Hib), конъюгированных с токсоидом столбняка (tetanus токсоид, ТТ) или с белком-носителем CRM₁₉₇, показал, что профиль стабильности этих препаратов зависит от белка-носителя (Но et al., 2002). В другом исследовании (Но et al., 2001) анализировали конъюгаты MenC-CRM₁₉₇ двух различных производителей (Но et al., 2001), при этом конъюгаты MenC-CRM₁₉₇ отличались способом конъюгации и длиной цепи полисахарида конъюгата (оба имели один и тот же белок-носитель CRM₁₉₇). Кроме того, результаты этого исследования показали, что такие факторы, как способ конъюгации (например, восстановительное аминирование - прямое или при помощи химической промежуточной группы), количество участков конъюгации, длина цепи полисахарида, рН, буфер, добавляемый для хранения, температура хранения и циклы замораживания/оттаивания, также оказывают влияние на стабильность иммуногенной композиции.

Таким образом, для получения безопасного, стабильного, надежного и экономичного продукта при разработке состава для иммуногенной композиции необходимо учитывать множество факторов. Такие факторы включают, в частности, но без ограничения, химическую стабильность иммуногенной композиции (например, гидролиз сахаридов, деполимеризация полисахаридов, протеолиз или фрагментация белков), физическую/температурную стабильность иммуногенной композиции (например, агрегация, осаждение, адсорбция), совместимость иммуногенной композиции с системой для хранения/укупорки, взаимодействие между иммуногенной композицией и неактивными ингредиентами (например, буферами, солями, наполнителями, криопротекторами), способ получения, лекарственную форму (например, лиофилизированная, жидкая), условия окружающей среды во время транспортировки, хранения и применения (например, температура, влажность, сдвигающие усилия) и продолжительность периода времени между изготовлением и применением.

Специалисты предполагают, что силиконовое масло, которое вызывает изменения вторичной и третичной структуры белков,1 может, быть ответственным за агрегацию/осаждение, наблюдаемые в некоторых белковых фармацевтических препаратах (Jones et al., 2005). Так, например, некоторые сообщения, опубликованные в 1980-х годах, указывали, что выделение силиконового масла из одноразовых пластмассовых шприцев может служить причиной агрегации инсулина человека (Chantelau and Berber, 1985; Chantelau et. al., 1986; Chantelau, 1989, Bernstein, 1987; Baldwin, 1988; Collier и Dawson, 1985), Chantelau et al. (1986) наблюдали, что после отбора (с использованием силиконизированного одноразового шприца) трех или более доз препарата инсулина из флакона, содержащего 10 доз, содержимое флакона начинало мутнеть вследствие загрязнения силиконовым маслом, что приводило к агрегации и дезактивации инсулина (Chantelau et al., 1986). Пародоксально, но силиконовое масло является необходимым компонентом для пластмассовых шприцев, поскольку оно служит для смазки резинового поршня и способствует перемещению поршня в цилиндре шприца (т.е. силиконовое масло облегчает возможность введения препарата при помощи шприца).

Однако силиконовое масло применяют не только в шприцах: его используют также в качестве покрытия для стеклянных флаконов для минимизации адсорбции белка, в качестве смазки для предотвращения слеживания резиновых пробок в процессе заполнения флаконов, в качестве смазки, необходимой для обработки стеклянной и эластомерной крышки, и в качестве смазки, облегчающей прохождение иглы через резиновую пробку. Кроме того, силиконизация шприцев, стеклянных флаконов, резиновых пробок и т.п. не является надежно контролируемым или стандартизованным процессом, поэтому существует высокая степень колебаний содержания силиконового масла от одной партии продукта к другой.

Поэтому в данной области техники существует постоянная потребность в составах, которые повышают стабильность и ингибируют осаждение иммуногенных композиций.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение в широком смысле относится к новым составам, которые стабилизируют иммуногенные композиции и ингибируют их осаждение. Более конкретно, некоторые варианты реализации настоящего изобретения представляют собой новые составы, которые ингибируют осаждение иммуногенных композиций, содержащихся в контейнерах. Один конкретный вариант реализации изобретения представляет собой новые составы, которые стабилизируют иммуногенные композиции в условиях взаимодействия с силиконовым маслом, а также под действием сдвигающих усилий, тряски при транспортировке и т.п.

Некоторые варианты реализации настоящего изобретения представляют собой составы, которые стабилизируют конъюгат полисахарид-белок, при этом указанный состав содержит (1) буферный солевой раствор, причем pKa буфера оставляет от примерно 3.5 до примерно 7.5, (2) поверхностно-активный агент и (3) один или более конъюгатов полисахарид-белок. В одном конкретном варианте реализации изобретения состав, содержащий конъюгат полисахарид-белок, находится в контейнере. В некоторых вариантах реализации изобретения контейнер выбирают из одного или более элементов из группы, включающей флакон, пробку флакона, крышку флакона, стеклянную крышку, резиновую крышку, пластмассовую крышку, шприц, пробку шприца, поршень шприца, колбу, мензурку, мерный цилиндр, ферментер, биореактор, шланг, трубку, мешок, банку, ампулу, баллон и одноразовую ручку. В некоторых вариантах реализации изобретения контейнер является силиконизированным.

В некоторых вариантах реализации изобретения буферный солевой раствор составов имеет рН от 5.5 до 7.5. В других вариантах реализации изобретения буфер является фосфатным, сукцинатным, гистидиновым или цитратным. В некоторых вариантах реализации буфер представляет собой сукцинатный буфер с конечной концентрацией от 1 мМ до 10 мМ и рН от 5.8 до 6.0. В одном конкретном варианте реализации конечная концентрация сукцинатного буфера составляет 5 мМ. В других вариантах реализации изобретения соль в буферном солевом растворе включает хлорид магния, хлорид калия, хлорид натрия или их сочетание. В одном конкретном варианте реализации изобретения соль в буферном солевом растворе представляет собой хлорид натрия.

В другом варианте реализации поверхностно-активный агент указанных составов выбран из группы, включающей полисорбат, 20 (Tween™20), полисорбат 40 (Tween™40), полисорбат 60, (Tween™60), полисорбат 5, (Tween™65), полисорбат 80 (Tween™80), полисорбат 85 (Tween™85), Triton™ N-101, Triton™ Х-100, окстоксинол 40, ноноксинол-9, триэтаноламин, полипептид триэтаноламинолеата, полиоксиэтилен-660-гидроксистеарат (PEG-15, Solutol Н15), полиоксиэтилен-35-рицинолеат (Cremophor EL™), соевый лецитин и полоксамер. В одном конкретном варианте реализации поверхностно-активный агент представляет собой полисорбат 80. В другом варианте реализации конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна по меньшей мере от 0.01% до 10% мас./об. состава. B других вариантах реализации изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна 0.01% мас/об. состава. В следующих вариантах реализации изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна 0.05% мас./об. состава. В другом варианте реализации конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна 0.1% мас./об. состава. В некоторых других вариантах реализации изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна 1.0% мас./об. состава. В следующих вариантах реализации изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна 10.0% мас/об. состава.

В другом варианте реализации конъюгат полисахарид-белок включает один или более полисахаридов пневмококка. В некоторых вариантах реализации изобретения указанные один или более полисахаридов пневмококка представляют собой полисахарид S. pneumoniae серотипа 4, полисахарид pneumoniae серотипа 6 В, полисахарид S. pneumoniae серотипа 9V, полисахарид S. pneumoniae серотипа 14, полисахарид S pneumoniae серотипа 18С, полисахарид S. pneumoniae серотипа 19F, полисахарид S. pneumoniae серотипа 23F, полисахарид S. pneumoniae сеортипа 1, полисахарид S. pneumoniae серотипа 3, полисахарид S. pneumoniae серотипа 5, полисахарид S. pneumoniae серотипа 6A, полисахарид S. pneumoniae серотипа 7F и полисахарид S. pneumoniae серотипа 19A. В некоторых вариантах реализации изобретения белок в составе, содержащем конъюгат полисахарид-белок, выбран из группы, включающей CRM₁₉₇, токсоид столбняка, токсоид холеры, токсоид коклюша, термолабильный токсоид (LT) Е. coli, пневмолизиновый токсоид, поверхностный белок А пневмококков (PspA), белок адгезин А пневмококков (PsaA), пептидазу С5а из стрептококка, белок D Haemophilus influenzae, яичный альбумин, гемоцианин лимфы улитки (keyhole limpet haemocyanin, KLH), альбумин сыворотки крупного рогатого скота (bovine serum albumin, BSA) и очищенное белковое производное туберкулина (purified protein derivative of tuberculin, PPD).

В одном конкретном варианте реализации изобретения состав, содержащий конъюгат полисахарид-белок, представляет собой состав 7-валентного пневмококкового конъюгата (7vPnC), содержащий полисахарид S. pneumoniae серотипа 4, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 6В, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 9V, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полипептид, полисахарид S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, и полисахарид S. pneumoniae серотипа 23F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇.

В другом конкретном варианте реализации состав, содержащий конъюгат полисахарид-белок, представляет собой 13-валентный пневмококковый конъюгатный (13vPnC) состав, содержащий полисахарид S. pneumoniae серотипа 4, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 6В, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 9V, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 18C, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 23F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 1, конъюгированный с полипептидом, CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 3, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 5, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 6А, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 7F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇ и полисахарид S. pneumoniae серотипа 19A, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇.

В других вариантах реализации изобретения состав содержит также один или более полисахаридов менингококка, один или более антигенных белков менингококка или их сочетание. В следующих вариантах реализации изобретения состав содержит также один или более полисахаридов стрептококка, один или более антигенных белков стрептококка или их сочетание.

В некоторых других вариантах реализации изобретения состав содержит также один или более адъювантов. Примеры пригодных адъювантов приведены ниже.

Другие варианты реализации изобретения представляют собой препараты, которые стабилизируют состав пептидазы стрептококка С5а (SCP) и которые содержат (1) буферный солевой раствор, причем pKa буфера составляет примерно от 3.5 до примерно 6.5, (2) поверхностно-активный агент и (3) пептидазу стрептококка С5а. В одном конкретном варианте реализации изобретения состав SCP находится в контейнере. В некоторых вариантах реализации изобретения контейнер выбирают из одного или более элементов из группы, включающей флакон, пробку флакона, крышку флакона, стеклянную крышку, резиновую крышку, пластмассовую крышку, шприц, пробку шприца, поршень шприца, колбу, мензурку, мерный цилиндр, ферментер, биореактор, шланг, трубку, мешок, банку, ампулу, баллон и одноразовую ручку.

В других вариантах реализации изобретения буферный солевой раствор состава имеет рН от 5.5 до 7.5. В следующих вариантах реализации изобретения буфер является сукцинатным, гистидиновым, фосфатным или цитратным. В одном конкретном варианте реализации буфер представляет собой суцинатный буфер с конечной концентрацией от 1 мМ до 10 мМ и рН от 5.8 до 6.0. В другом конкретном варианте реализации конечная концентрация сукцинатного буфера составляет 5 мМ. В следующих вариантах реализации изобретения соль в буферном солевом растворе включает хлорид магния, хлорид калия, хлорид натрия или их сочетание.

В некоторых вариантах реализации изобретения поверхностно-активный агент в составах выбирают из группы, включающей полисорбат 20 (Tween™20), полисорбат 40 (Tween™40), полисорбат 60 (Tween™60), полисорбат 65 (Tween™65), полисорбат 80 (Tween™80), полисорбат 85 (Tween™85), Triton™ N-101, Triton™ X-100, окстоксинол 40, ноноксинол-9, триэтаноламин, полипептид триэтаноламинолеата, полиоксиэтилен-660-гидроксистеарат (PEG-15, Solutol H15), полиоксиэтилен-35-рицинолеат (Cremophor EL™), соевый лецитин и полоксамер. В одном конкретном варианте реализации изобретения поверхностно-активный агент представляет собой полисорбат 80. В некоторых вариантах реализации изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна от 0.01% до 10% мас./об. состава. В следующих вариантах реализации изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна 0.01% мас./об состава. В других вариантах реализации изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна 0.05% мас./об. состава. В следующих вариантах реализации изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна 0.1% мас./об. состава. В другом варианте реализации конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна 1.0% мас./об. состава. В еще одном варианте реализации конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна 10.0% мас./об. состава.

В некоторых других вариантах реализации изобретения состав SCP содержит также один или более полипептидов, которые выбирают из группы, включающей полипептид стрептококка, полипептид пневмококка, полипептид менингококка и полипептид стафилококка. В следующих вариантах реализации изобретения состав SCP содержит также один или более полисахаридов, выбранных из группы, включающей полисахарид стрептококка, полисахарид пневмококка, полисахарид менингококка и полисахарид стафилококка.

В другом варианте реализации состав содержит также один или более адъювантов. Примеры пригодных адъювантов приведены ниже.

Другой вариант реализации изобретения представляет собой составы, которые ингибируют индуцируемое силиконом осаждение конъюгата полисахарид-белок, находящегося в силиконизированном контейнере, при этом указанный состав содержит (1) буферный солевой раствор, причем буфер имеет pKa примерно от 3.5 до примерно 7.5, (2) соль алюминия и (3) один или более конъюгатов полисахарид-белок. В некоторых вариантах реализации изобретения силиконизированный контейнер выбран из одного или более элементов из группы, включающей флакон, пробку флакона, крышку флакона, стеклянную крышку, резиновую крышку, пластмассовую крышку, шприц, пробку шприца, поршень шприца, колбу, мензурку, мерный цилиндр, ферментер, биореактор, шланг, трубку, мешок, банку, ампулу, баллон и одноразовую ручку.

В некоторых вариантах реализации изобретения буферный солевой раствор в составах имеет pH от 5.5 до 7.5. В других вариантах реализации изобретения буфер в составах является фосфатным, сукцинатным, гистидиновым или цитратным. В следующих вариантах реализации буфер представляет собой сукцинатный буфер с конечной концентрацией от 1 мМ до 10 мМ и рН от 5.8 до 6.0. В одном конкретном варианте реализации конечная концентрация сукцинатного буфера составляет 5 мМ. В следующих вариантах реализации изобретения соль в буферном солевом растворе включает хлорид магния, хлорид калия, хлорид натрия или их сочетание. В одном конкретном варианте реализации соль в буферном солевом растворе представляет собой хлорид натрия.

В других вариантах реализации изобретения соль алюминия представляет собой гидроксид алюминия, фосфат алюминия или сульфат алюминия. В одном конкретном варианте реализации изобретения соль алюминия представляет собой фосфат алюминия.

В некоторых других вариантах реализации изобретения состав содержит также полисорбат 80 (Tween™80). В одном конкретном варианте реализации изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна по меньшей мере, 0.01% до 10% мас./об. состава.

В другом варианте реализации конъюгат полисахарид-белок содержит один или более полисахаридов пневмококка. В некоторых вариантах реализации изобретения указанные один или более полисахаридов пневмококка представляют собой полисахарид S. pneumoniae серотипа 4, полисахарид S. pneumoniae серотипа 6В, полисахарид S. pneumoniae серотипа 9V, полисахарид S. pneumoniae серотипа 14, полисахарид S. pneumoniae серотипа 18С, полисахарид S. pneumoniae серотипа 19F, полисахарид S. pneumoniae серотипа 23F, полисахарид S. pneumoniae сеортипа 1, полисахарид S. pneumoniae серотипа 3, к полисахарид S. pneumoniae серотипа 5, полисахарид S. pneumoniae серотипа 6А, полисахарид S. pneumoniae серотипа 7F и полисахарид S. pneumoniae серотипа 19A.

В некоторых вариантах реализации изобретения белок состава, содержащего конъюгат полисахарид-белок, выбран из группы, включающей CRM₁₉₇, токсоид столбняка, токсоид холеры, токсоид коклюша, термолабильный токсоид (LT) Е. coli, пневмолизиновый токсоид, поверхностный белок А пневмококков (PspA), белок пневмококков адгезин А (PsaA), пептидазу С5а из стрептококка, белок D Haemophilus influenzae, яичный альбумин, гемоцианин лимфы улитки (keyhole limpet haemocyanin, KLH), альбумин сыворотки крупного рогатого скота (bovine serum albumin, BSA) и очищенное белковое производное туберкулина (purified protein derivative of tuberculin, PPD).

В одном конкретном варианте реализации изобретения состав, содержащий конъюгат полисахарид-белок, представляет собой состав, содержащий 7-валентный пневмококковый конъюгат (7vPnC), содержащий полисахарид S. pneumoniae серотипа 4, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 6B, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 9V, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полипептид, полисахарид S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированный CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, и полисахарид S. pneumoniae серотипа 23F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇.

В другом конкретном варианте реализации состав, содержащий конъюгат полисахарид-белок, представляет особой состав, содержащий 13-валентный пневмококковый конъюгат (13vPnC), содержащий полисахарид S. pneumoniae серотипа 4, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 6В, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 9V, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 23F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 1, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 3, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 5, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 6А, конъюгированный, с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 7F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, и полисахарид S. pneumoniae серотипа 19А, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇.

В следующих вариантах реализации изобретения состав содержит также один или более полисахаридов менингококка, один или более антигенных белков менингококка или их сочетание.

В другом варианте реализации состав содержит также один или более полисахаридов стрептококка, один или более антигенных белков стрептококка или их сочетание.

В некоторых других вариантах реализации изобретения состав содержит также один или более адъювантов. Примеры пригодных адъювантов приведены ниже.

Другие варианты реализации настоящего изобретения представляют собой составы, которые ингибируют индуцируемое силиконом осаждение состава пептидазы стрептококка (SCP) С5а, находящегося в силиконизированном контейнере, при этом указанный состав содержит (1) буферный солевой раствор, причем буфер имеет pKa примерно от 3.5 до примерно 6.5, (2) соль алюминия и (3) пептидазу стрептококка С5а. В некоторых вариантах реализации изобретения в качестве контейнерного средства выбирают один или более элементов из группы, включающей флакон, пробку флакона, крышку флакона, стеклянную крышку, резиновую крышку, пластмассовую крышку, шприц, пробку шприца, поршень шприца, колбу, мензурку, мерный цилиндр, ферментер, биореактор, шланг, трубку, мешок, банку, ампулу, баллон и одноразовую ручку.

В другом варианте реализации буферный солевой раствор состава имеет рН от 5.5 до 7.5. В других вариантах реализации изобретения буфер является сукцинатным, гистидиновым, фосфатным или цитратным. В некоторых вариантах реализации буфер представляет собой сукцинатный буфер с конечной концентрацией от 1 мМ до 10 мМ и рН от 5.8 до 6.0. В другом варианте реализации соль в буферном солевом растворе включает хлорид магния, хлорид калия, хлорид натрия или их сочетание.

В некоторых других вариантах реализации изобретения состав содержит также полисорбат 80 (Tween™80). В одном конкретном варианте реализации изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна от 0.01% до 10% мас./об. состава.

В следующих вариантах реализации изобретения состав SCP содержит также один или более полипептидов, которые выбирают из группы, включающей полипептид стрептококка, полипептид пневмококка, полипептид менингококка и полипептид стафилококка.

В некоторых других вариантах реализации изобретения состав SCP содержит также один или более полисахаридов, которые выбирают из группы, включающей полисахарид стрептококка, полисахарид пневмококка, полисахарид менингококка и полисахарид стафилококка.

В еще одном варианте реализации состав содержит также один или более адъювантов. Примеры пригодных адъювантов приведены ниже.

Другие варианты реализации изобретения представляют собой составы, которые стабилизируют композицию белка N. meningitides 2086, при этом указанный состав содержит (1) буферный солевой раствор, причем буфер имеет pKa примерно от 3.5 до примерено 6.5, (2) поверхностно-активный агент и (3) белок N. meningitides 2086. Примеры белков N. meningitidis 2086 приведены далее. Водном конкретном варианте реализации изобретения композиция белка N. meningitidis 2086 находится в контейнере. В некоторых вариантах реализации изобретения в качестве контейнерного средства выбирают один или более элементов из группы, включающей флакон, пробку флакона, крышку флакона, стеклянную крышку, резиновую крышку, пластмассовую крышку, шприц, пробку шприца, поршень шприца, колбу, мензурку, мерный цилиндр, ферментер, биореактор, шланг, трубку, мешок, банку, ампулу, баллон и одноразовую ручку.

В других вариантах реализации изобретения буферный солевой раствор состава имеет рН от 5.5 до 7.5. В других вариантах реализации изобретения буфер является сукцинатным, гистидиновым, фосфатным или цитратным. В одном конкретном варианте реализации буфер представляет собой сукцинатный буфер с конечной концентрацией от 1 мМ до 10 мМ и рН от 5.8 до 6.0. В другом конкретном варианте реализации конечная концентрация сукцинатного буфера составляет 5 мМ. В следующих вариантах реализации изобретения соль в буферном солевом растворе включает хлорид магния, хлорид калия, хлорид натрия или их сочетание.

В некоторых вариантах реализации изобретения поверхностно-активный агент в составах выбирают из группы, включающей полисорбат 20 (Tween™20), полисорбат 40 (Tween™40), полисорбат 60 (Tween™60), полисорбат 65 (Tween™65), полисорбат 80 (Tween™80), полисорбат 85 (Tween™85), Triton™ N-101, Triton™ X-100, окстоксинол 40, ноноксинол-9, триэтаноламин, полипептид триэтаноламинолеата, полиоксиэтилен-660-гидроксистеарат (PEG-15, Solutol Н15), полиоксиэтилен-35-рицинолеат (Cremophor EL™), соевый лецитин и полоксамер. В одном конкретном варианте реализации изобретения поверхностно-активный агент представляет собой полисорбат 80. В некоторых вариантах реализации изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна от 0.01% до 10% мас./об. состава. В следующих вариантах реализации изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна 0.01% мас./об. состава. В других вариантах реализации изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна 0.05% мас./об. состава. В следующих вариантах реализации изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна 0.1% мас./об. состава. В другом варианте реализации конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна 1.0% мас./об. состава. В еще одном варианте реализации конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна 10.0% мас./об. состава.

В некоторых других вариантах реализации изобретения композиция белка N. meningitidis 2086 содержит также один или более полипептидов, которые выбирают из группы, включающей полипептид стрептококка, полипептид пневмококка, полипептид менингококка и полипептид стафилококка. В следующих вариантах реализации изобретения композиция белка N. meningitidis 2086 содержит также один или более полисахаридов, которые выбирают из группы, включающей полисахарид стрептококка, полисахарид пневмококка, полисахарид менингококка и полисахарид стафилококка.

В другом варианте реализации состав содержит также один или более адъювантов. Примеры пригодных адъювантов приведены ниже.

Другие варианты реализации настоящего изобретения представляют собой составы, которые ингибируют индуцируемое силиконом осаждение композиции белка N. meningitidis 2086, находящиеся в силиконизированном контейнере, при этом указанный состав содержит (1) буферный солевой раствор, причем буфер имеет pKa примерно от 3.5 до примерно 6.5, (2) соль алюминия и (3) белок N. meningitidis 2086. В некоторых вариантах реализации изобретения контейнер выбран из одного или более элементов из группы, включающей флакон, пробку флакона, крышку флакона, стеклянную крышку, резиновую крышку, пластмассовую крышку, шприц, пробку шприца, поршень шприца, колбу, мензурку, мерный цилиндр, ферментер, биореактор, шланг, трубку, мешок, банку, ампулу, баллон и одноразовую ручку.

В другом варианте реализации буферный солевой раствор состава имеет рН от 5.5 до 7.5. В других вариантах реализации изобретения буфер является сукцинатным, гистидиновым, фосфатным или цитратным. В некоторых вариантах реализации буфер представляет собой сукцинатный буфер с конечной концентрацией от 1 мМ до 10 мМ и рН от 5.8 до 6.0. В другом варианте реализации соль в буферном солевом растворе включает хлорид магния, хлорид калия, хлорид натрия или их сочетание.

В некоторых других вариантах реализации изобретения состав содержит также полисорбат 80 (Tween™80). В одном конкретном варианте реализации изобретения конечная концентрация полисорбата 80 в составе равна от 0.01% до 10% мас./об. состава.

В следующих вариантах реализации изобретения композиция белка N. meningitidis 2086 содержит также один или более полипептидов, выбранных из группы, включающей полипептид стрептококка, полипептид пневмококка, полипептид менингококка и полипептид стафилококка.

В некоторых других вариантах реализации изобретения композиция белка N. meningitidis 2086 содержит также один или более полисахаридов, которые выбирают из группы, включающей полисахарид стрептококка, полисахарид пневмококка, полисахарид менингококка и полисахарид стафилококка.

В еще одном варианте реализации состав содержит также один или более адъювантов. Примеры пригодных адъювантов приведены ниже.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из приведенного ниже подробного описания, вариантов реализации изобретения и формулы изобретения.

Краткое описание фигур

На фигуре 1 показана стабильность составов пептидазы стрептококка (SCP) С5а (набранных в шприцы) до и после аккуратного перемешивания (60 циклов в минуту) в горизонтальном орбитальном шейкере. Данные, показанные на фигуре 1А, представляют стабильность SCP в течение двух дней без добавления Tween™80 (т.е. 0%), а данные на фигуре 1В - стабильность SCP в течение двух дней с добавлением 0.025% Tween™80. Буферы, применяемые в составах, показанных на фигуре 1А и 1В, представляют собой сукцинатный буферный раствор (SBS), фосфатный буферный раствор (PBS) и трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS).

На фигуре 2 показана общая потеря антигенности 13vPnC, приготовленного с AlPO₄ (0.25 мг/мл) и набранного в шприц BD Hypak, спустя два часа, восемь часов и двадцать четыре часа после перемешивания со скоростью 500 об/мин при температуре 2-8°С.

На фигуре 3 показана общая потеря антигенности 13vPnC, приготовленного с AlPO₄ (0.25 мг/мл) и набранного в несиликонизированный шприц, спустя два часа, восемь часов и двадцать четыре часа после перемешивания со скоростью 500 об/мин при температуре 2-8°С.

На фигуре 4 показана общая потеря антигенности 13vPnC, приготовленного с AlPO₄ (0.25 мг/мл) и набранного в шприц Vetter, спустя два часа, восемь часов и двадцать четыре часа после перемешивания со скоростью 500 об/мин при температуре 2-8°С.

На фигуре 5 показана общая потеря антигенности 13vPnC, приготовленного с AlPO₄ (0.25 мг/мл) и набранного в шприц Schott TopPac, спустя два часа, восемь часов и двадцать четыре часа после перемешивания со скоростью 500 об/мин при температуре 2-8°С.

На фигуре 6 показана общая потеря антигенности 13vPnC, пригтовленного с добавлением (фиг.6А) и без добавления (фиг.6В) AlPO₄ (0.25 мг/мл) и набранного в шприц BD из спеченного стекла, спустя два часа, восемь часов и двадцать четыре часа после перемешивания со скоростью 500 об/мин при температуре 2-8°С.

На фигуре 7 показана общая с потеря антигенности 13vPnC, полученного с добавлением (фиг.7А) и без добавления (фиг.7В) AlPO₄ (0.25 мг/мл) и набранного в шприц BünderGlas PS2, спустя два часа, восемь часов и двадцать четыре часа после перемешивания со скоростью 500 об/мин при температуре 2-8°C.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение связано с существующей в данной области насущной потребностью в улучшении стабильности иммуногенных композиций, в частности конъюгатов полисахарид-белок и белковых иммуногенов. Таким образом, настоящее изобретение в широком смысле относится к новым составам, содержащим поверхностно-активный агент и/или соль алюминия, которые стабилизируют иммуногенные композиции и ингибируют их осаждение. Более конкретно, настоящее изобретение связано с существующей в данной области потребностью в составах, ингибирующих образование частиц (например, агрегацию, осаждение) и стабилизирующих иммуногенные композиции, которые обрабатывают, создают, составляют, изготавливают и/или хранят в контейнерах, в частности в ферментаторах, биореакторах, флаконах, колбах, мешках, шприцах, резиновых пробках, трубках и т.п.

Как указано выше в разделе "Уровень техники", на стабильность иммуногенных композиций оказывают влияние различные факторы, включающие, среди прочего, химическую стабильность иммуногенной композиции, физическую/термическую стабильность иммуногенной композиции, совместимость иммуногенной композиции с системой контейнера/крышки, взаимодействия между иммуногенной композицией и неактивными ингредиентами (например, с буферами, солями, наполнителями, криопротекторами), способы изготовления, лекарственную форму, условия окружающей среды во время транспортировки, хранения и применения (например, температура, влажность, сдвигающие усилия) и длительность периода времени между изготовлением и применением.

Стабильность иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению можно легко определить стандартными способами, которые хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области техники. Так, например, иммуногенную композицию исследуют на стабильность, агрегацию, иммуногенность, образование частиц, потерю (концентрации) белка и т.п. различными методами, включая, в частности, но без ограничения, определение рассеивания света, оптической плотности, скорости седиментации при центрифугировании, седиментационного равновесия при центрифугировании, кругового дихроизма (circular dichroism, CD), анализа Лоури, анализа методом бицинхониновой кислоты (bicinchoninic кислота, ВСА), связывания антитела и т.п.

Как подробно описано в настоящем тексте, настоящее изобретение связано с неожиданными и удивительными результатами, которые показывают, что состав, содержащий иммуногенную композицию, который включает поверхностно-активный агент, в частности Tween™80, существенно повышает стабильность и ингибирует осаждение иммуногенной композиции. Так, например, согласно настоящему изобретению наблюдали (см., в частности, пример 2), что тринадцативалентный пневмококковый конъюгат (13vPnC), приготовленный в буферном солевом растворе и набранный в шприц для одноразовой дозы, начинает осаждаться из раствора в течение десяти минут при 2-8°С после легкого перемешивания при помощи горизонтального орбитального шейкера. (Горизонтальный орбитальный шейкер использовали для моделирования типичных условий процесса изготовления, транспортировки и хранения иммуногенной композиции 13vPnC). Однако неожиданно оказалось, что 13vPnC, приготовленный в буферном солевом растворе с добавлением 0.001% Tween™80 и набранный в шприц для одноразовой дозы, и после легкого перемешивания при 2-8°С остается стабильным в течение двадцати пяти дней без видимых признаков осаждения (данные не показаны). Таким образом, полученные данные указывают на то, что добавление поверхностно-активного агента (например, Tween™80) в состав иммуногенной композиции повышает стабильность иммуногенной композиции.

Результаты второго исследования стабильности 13vPnC дополнительно подтвердили, что добавление поверхностно-активного агента в состав существенно повышает стабильность 13vPnC. Так, например, стабильность (определяемую по изменению антигенности 13vPnC) состава 13vPnC с 0.05% Tween™80 (таблица 1) и без Tween™80 (0.0%, таблица 1) измеряли в течение двух часов. Как показано в таблице 1, антигенность существенно уменьшилась в полисахаридах тринадцати серотипов (полученных без Tween™80) согласно анализам, проведенным в течение двух часов. Состав 13vPnC, содержащий 0.05% Tween™80 (таблица 1), напротив, показал высокую стабильность антигенности при проведении анализов в течение двух часов. Кроме того, согласно наблюдениям 13vPnC, приготовленный в стеклянных колбах объемом 250 мл с 0.01% Tween™80 или 0.05% Tween™80, может выдерживать значительные сдвигающие усилия, которые вызывает интенсивное встряхивание составов в течение тридцати минут при 2-8°С, с небольшей потерей или без потери антигенности (например, см. пример 2, таблицу 2).

В других экспериментах (пример 3) показано, что стабильность состава иммуногенной пептидазы стрептококка (SCP) С5а существенно повышалась при добавлении поверхностно-активного агента, в частности Tween™80. Так, например, как показано на фигуре 1А, после двух дней встряхивания составов SCP (55 мкг/мл), приготовленных с 5 мМ сукцинатным буфером (рН 6.0), 10 мМ фосфатным буфером (рН 7.0. и 7.4) или 10 мМ трис-буфером (рН 7.5), концентрация SCP существенно уменьшилась (например, более, чем на 90%). Однако, как показано на фигуре 1В, добавление 0.025% Tween™80 в составы SCR c сукцинатным, фосфатным и трис-буфером перед встряхиванием в течение двух дней полностью ингибировало потерю, которую наблюдали на фигуре 1А.

Иммуногенную композицию 13vPnC согласно настоящему изобретению можно получить также с добавлением или без добавления адъюванта, в частности фосфата алюминия (AlPO₄). Так, в отдельных сериях экспериментов (пример 4) иммуногенные композиции 13vPnC получали в 5 мМ сукцинатном буфере (рН 5.8) с 0.85% NaCl и AlPO₄ (0.25 мг алюминия/мл) без добавления поверхностно-активного агента (например, состав не содержал Tween™80).

В этих экспериментах иммуногенную композицию 13vPnC (полученную в присутствии AlPO₄) набирали в различные силиконизированные и несиликонизированные контейнеры (например, см. таблицу 3) и путем перемешивания при 2-8°С имитировали условия транспортировки и применения. В этих экспериментах наблюдали (пример 4), что контейнер с более высоким содержанием силикона давал более высокую степень образования частиц в 13vPnC и более высокий процент потери антигенности 13vPnC. Анализ частиц методом инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) показал, что частицы состояли из белка и силикона (данные не показаны) и что примерно 85% 13vPnC было связано с AlPO₄, в то время как остальные 15% представляли собой свободные частицы 13vPnC (не связанные с AlPO₄) в растворе.

В другом эксперименте со сравнением иммуногенных композиций 13vPnC, которые получили с добавлением или без добавления AlPO₄, которыми заполнили идентичные шприцы, наблюдали, что в тестируемых шприцах 13vPnC, полученный без AlPO₄, терял больше антигенности, чем 13vPnC с AlPO₄ (например, см. фиг.6 и фиг.7).

Таким образом, объектом настоящего изобретения являются новые составы, которые стабилизируют и ингибируют аггрегацию или осаждение иммуногенных композиций, в частности конъюгатов полисахарид-белок (например, 13vPnC) и белковых иммуногенов (например, пептидазы стрептококка С5а, белка N. meningitidis с открытой рамкой считывания (ORF) 2086), под действием различных факторов, которые оказывают влияние на стабильность иммуногенных композиций (например, сдвигающие усилия, перемешивание при транспортировке, взаимодействие с силиконовым маслом, адсорбция, способы изготовления, температура, влажность, длительность периода времени между изготовлением и применением т.п.).

В некоторых вариантах реализации изобретение представляет собой состав, который стабилизирует конъюгат полисахарид-белок, при этом указанный состав содержит буферный солевой раствор, причем буфер имеет pKa примерно от 3.5 до примерно 7.5, поверхностно-активный агент и один или более конъюгатов полисахарид-белок. В некоторых вариантах реализации изобретения состав, содержащий конъюгат полисахарид-белок, находится в контейнере. В другом варианте реализации изобретение представляет собой состав, который стабилизирует пептидазу стрептококка (SCP) С5а, при этом указанный состав содержит буферный солевой раствор, причем буфер имеет pKa примерно от 3.5 до примерно 6.5, поверхностно-активный агент и пептидазу стрептококка С5а. В некоторых вариантах реализации изобретения состав SCP находится в контейнере. В другом варианте реализации изобретение представляет собой состав, который стабилизирует композицию белка N. meningitidis 2086,, при этом указанный состав содержит буферный солевой раствор, причем буфер имеет pKa примерно от 3.5 до примерно 7.5, поверхностно-активный агент и белок N. meningitidis 2086. В некоторых вариантах реализации изобретения состав находится в контейнере.

В некоторых других вариантах реализации изобретение представляет собой состав, который ингибирует индуцируемое силиконом осаждение конъюгата полисахарид-белок, находящегося в силиконизированном контейнере, при этом указанный состав содержит буферный солевой раствор, причем буфер имеет pKa примерно от 3.5 до примерно 7.5, соль алюминия и один или более конъюгатов полисахарид-белок. В другом варианте реализации изобретение представляет собой состав, который ингибирует индуцируемое силиконом осаждение пептидазы стрептококка (SCP) С5а, находящийся в силиконизированном контейнере, при этом указанный состав содержит буферный солевой раствор, причем буфер имеет pKa примерно от 3.5 до примерно 6.5, соль алюминия и пептидазу стрептококка С5а. В некоторых других вариантах реализации изобретение представляет собой состав, который ингибирует индуцируемое силиконом осаждение белка N. meningitidis 2086, находящийся в силиконизированном контейнере, при этом указанный состав содержит буферный солевой раствор, причем буфер имеет pKa примерно от 3.5 до примерно 7.5, соль алюминия и белок N. meningitidis 2086.

В следующих вариантах реализации изобретение представляет собой состав, который оптимизирует стабильность антигена и процент связывания с адъювантной солью алюминия (например, AlPO₄) белка N. meningitidis 2086, при этом указанный состав содержит буферный солевой раствор, причем буфер имеет pKa примерно от 3.5 до примерно 7.5, поверхностно-активный агент, соль алюминия и белок N. meningitidis 2086. В некоторых вариантах реализации изобретения состав находится в контейнере.

Используемые в данном описании термины "осаждение", "осаждать" "образование частиц", "помутнение" и "агрегация" могут быть взаимозаменяемыми и относятся к физическому взаимодействию или химическое реакции, которые приводят к "агрегации" конъюгата полисахарид-белок или белкового (или полипептидного) иммуногена. Процесс агрегации (например, агрегации белка) хорошо известен (однако недостаточно хорошо объяснен) и описан в литературе. На него часто оказывают влияние многочисленные физико-химические факторы, включая теплоту, давление, рН, перемешивание, сдвигающие нагрузки, замораживание-оттаивание, дегидратацию, тяжелые металлы, фенольные соединения, силиконовое масло, денатурирующие вещества и т.п.

Как определено далее, "конъюгат полисахарид-белок", "пневмококковый конъюгат", "7-валентный пневмококковый конъюгат (7vPnC)", "13-валентный пневмококковый конъюгат (13vPpC)", "иммуногенная композиция пептидазы стрептококка (SCP) С5а" и "иммуногенная композиция белка N. meningitidis 2086" согласно настоящему изобретению включают жидкие составы, замороженные жидкие составы и твердые (например, сублимированные и лиофилизированные) составы.

А. Поверхностно-активные агенты

Как указано выше, настоящее изобретение относится к составам, стабилизирующим иммуногенные композиции и ингибирующие их агрегацию под действием различных факторов, которые оказывают влияние на стабильность иммуногенных композиций (например, сдвигающие усилия, перемешивание в процессе транспортировки, взаимодействие с силиконовым маслом, адсорбция, способы изготовления, температура, влажность, длительность периода времени между изготовлением и применением и т.п.). В некоторых вариантах реализации изобретения представляет собой составы, содержащие поверхностно-активный агент.

Сурфактант (или поверхностно-активный агент) в общем случае определяют как (а) молекулу или соединение, содержащие гидрофильную группу или часть и липофильную (гидрофобную) группу или часть и/или (б) молекулу, вещество или соединение, которые снижают или уменьшают поверностное натяжение раствора. В данном описании термин "поверхностно-активный агент" согласно настоящему изобретению относится к молекуле или соединению, которые снижают поверхностное натяжение состава иммуногенной композиции.

Поверхностно-активный агент, применяемый в составе согласно настоящему изобретению, может представлять собой любой поверхностно-активный агент или любую комбинацию поверхностно-активных агентов, которые стабилизируют описанную здесь иммуногенную композицию и ингибируют ее агрегацию. При этом поверхностно-активные агенты согласно настоящему изобретению включают, в частности, но без ограничения, полисорбат 20 (Tween™20), полисорбат 40 (Tween™40), полисорбат 60 (Tween™60), полисорбат 65 (Tween™65), полисорбат 80 (Tween™80), полисорбат 85 (Tween™85), Triton™ N-101, Triton™ X-100, окстоксинол 40, ноноксинол-9, триэтаноламин, полипептид триэтаноламинолеата, полиоксиэтилен-660-гидроксистеарат, (PEG-15, Solutol Н15), полиоксиэтилен-35-рицинолеат (Cremophor EL™), соевый лецитин, полоксамер, гексадециламин, октадециламин, сложные эфиры октадециловых аминокислот, лизолецитин, диметилдиоктадециламмоний бромид, метоксигексадецилглицерин, плюрониловые полиолы, полиамины (например, пиран, декстрансульфат, поли IC, карбопол), пептиды (например, мурамилпептид и -дипептид, диметилглицин, тафтсин), масляные эмульсии, минеральные гели (например, фосфат алюминия) и иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS).

Специалист в данной области сможет легко определить пригодный поверхностно-активный агент или комбинацию поверхностно-активных агентов путем измерения поверхностного натяжения конкретного состава иммуногенной композиции в присутствии и в отсутствие соответствующих поверхностно-активных агентов. В качестве альтернативы, поверхностно-активный агент исследуют качественными методами (например, при помощи визуального контроля образования частиц) или количественными методами (например, по рассеянию света, скорости осаждения при центрифугировании, оптической плотности, антигенности) по его способности уменьшать, ингибировать или предотвращать агрегацию иммуногенной композиции.

Б. Контейнеры

В некоторых вариантах реализации изобретение относится к составам иммуногенных композиций, находящимся в контейнерах. В данном описании термин "контейнер" включает согласно настоящему изобретению любой объект, который используют для того, чтобы "содержать", "вмещать", "смешивать", "перемешивать", "дозировать", "вводить", "переносить", "распылять" и т.п. иммуногенную композицию в процессе исследования, обработки, разработки, составления, изготовления, хранения и/или введения. Так, например, контейнеры согласно настоящему изобретению включают, в частности, но без ограничения, обычную лабораторную стеклянную посуду, колбы, мензурки, мерные цилиндры, ферментаторы, биоректоры, системы трубок, трубки, мешки, банки, флаконы, крышки флаконов (например, резиновая пробка, резьбовой колпачок), ампулы, шприцы, пробки шприцев, поршни шприцев, резиновые крышки, пластмассовые крышки, стеклянные крышки и т.п. Контейнер согласно настоящему изобретению не ограничивается одним материальным исполнением и включает такие материалы, как, например, стекло, металлы (например, сталь, нержавеющая сталь, алюминий и т.п.) и полимеры (например, термопласты, эластомеры, термопластичные эластомеры).

Для специалистов в данной области очевидно, что приведенный выше список контейнеров не является исчерпывающим, а служит только в качестве общей информации о разнообразии контейнеров, которые применяют для того, чтобы "содержать", "вмещать", "смешивать", "перемешивать", "дозировать", "вводить", "переносить", "распылять" и т.п. иммуноген или иммуногенную композицию в процессе исследования, обработки, разработки, составления, изготовления, хранения и/или введения композиции. Контейнеры, которые также можно применять согласно настоящему изобретению, перечислены опубликованных каталогах продавцов и изготовителей, в частности United States Plastic Corp. (Лима, Огайо), VWR™ (Вест Честер, Пенсильвания), BD Biosciences (Франклин Лейке, Нью-Джерси), Fisher Scientific International Inc. (Хэмптон, Нью-Хэмпшир) и Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури).

Таким образом, особое преимущество новых составов согласно настоящему изобретению заключается в том, что они стабилизируют и ингибируют осаждение иммуногенных составов, находящихся в контейнерах, на различных стадиях исследования, обработки, разработки, составления, изготовления, хранения и/или введения композиции. Новые составы согласно настоящему изобретению не только стабилизируют иммуногенные композиции при физических/термических нагрузках (например, температура, влажность, сдвигающие нагрузки и т.п.), но также повышают стабильность и ингибируют осаждение иммуногенных композиций под действием негативных факторов или воздействий, в частности несовместимости иммуногенной композиции с системой контейнер/укупорка (например, силиконизированный контейнер).

Таким образом, новые составы согласно настоящему изобретению особенно полезны для стабилизации иммуногена (т.е. конъюгата полисахарид-белок, белкового или полипептидного антигена) против осаждения, идуцируемого силиконовым маслом, и осаждения, описанного выше. Так, например, параллельно рассматриваемая родственная заявка США №60/795,098, от 26 апреля 2006 г., включенная в данное описание посредством ссылки, описывает агрегацию иммуногенных композиций в присутствии силиконового масла в таких контейнерных средствах, как шприцы, стеклянные флаконы, резиновые пробки и т.п., при этом добавление поверхностно-активного агента в контейнерное средство предотвращает агрегацию таких иммуногенных композиций, индуцированную силиконовым маслом.

В. Адъюванты и фармацевтические носители/наполнители

В некоторых вариантах реализации изобретения в иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению вводят адъювант. Адъювант представляет собой вещество, которое при введении вместе с иммуногеном или антигеном усиливает иммунную реакцию. Известно, что некоторые цитокины или лимфокины проявляют иммуномодулирующую активность и поэтому их можно применять в качестве адъювантов, включая, в частности, но без ограничения, интерлейкины 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (см., например, патент, США №5,723,127), 13, 14, 15, 16, 17 и 18 (и его мутантные формы), интерфероны α, β и γ, колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GMCSF, см., например, патент США №5,078,996 и инвентарный номер Американской коллекции типовых культур 39900), колониестимулирующий фактор моноцитов (MCSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (GCSF) и факторы некроза опухоли α и β (TNF). Другие адъюванты, которые можно применять в данном изобретении, включают хемокины, включая, в частности, но без ограничения, МСР-1, MIP-1α, MIP-1β и RANTES.

B некоторых вариантах реализации изобретения адъюванты, используемые для усиления иммунной реакции состава иммуногенной композиции, включают, в частности, но без ограничения, MPL™ (3-O-деацилированный монофосфорильный липид A; Corixa, Гамильтон, Монтана), описанный в патенте США №4,912,094, который включен в настоящее описание посредством ссылки. Для применения в качестве адъювантов пригодны также синтетические аналоги липида А или соединения аминалкильных глюкозаминовых фосфатов (AGP), их производные или аналоги, которые поставляются Corixa (Гамильтон, Монтана) и которые описаны в патенте США №6,113,918, включенном в данное описание посредством ссылки. Один из таких AGP представляет собой 2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]этил-2-деокси-4-O-фосфоно-3-O-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоил]-2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]-b-D-глюкопиранозид, известный также как 529 (ранее известен как RC529). Этот адъювант 529 получают в водной форме или в форме стабильной эмульсии (RC529-SE).

Другие адъюванты включают минеральное масло и водные эмульсии, соли алюминия (квасцы), в частности гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.п., амфиген, авридин, L121/сквален, D-лактид-полилактид/гликозид, плюрониловые полиолы, мурамил-дипептид, убитую вакцину Bordetella, сапонины, в частности Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Фрамингем, Массачусетс), описанный в патенте США №5,057,540, который включен в данное описание посредством ссылки, и образующиеся из них частицы, в частности иммуностимулирующие комплексы (immunostimulating complexes, ISCOMS), ISCOMATRIX (CSL Limited, Парквилль, Австралия), описанные в патенте США №5,254,339, Mycobacterium tuberculosis, бактериальные липополисахариды, синтетические полинуклеотиды, в частности олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG (патент США №6,207,646, который включен в данное описание посредством ссылки), IC-31 (Intercell AG, Вена, Австрия), описанные в Европейских патентах №№1,296,713 и 1,326,634, коклюшный токсин (pertussis toxin, РТ) или термолабильный токсин (heat-labile toxin, LT) E. coli, в частности LT-K63, LT-R72, РТ-K9/G129; см., например, Международные патентные публикации №№ WO 93/13302 и WO 92/19265, которые включены в данное описание посредством ссылки.

В качестве адъювантов (и белков-носителей) можно применять также холерные токсины и их мутанты, включая описанные в Международной патентной заявке № WO 00/18434 (в которых глутаминовую кислоту в 29 позиции последовательности аминокислот заменяют другой аминокислотой (отличной от аспарагиновой кислоты), предпочтительно - гистидином). Аналогичные токсины или мутанты СТ описаны в Международной патентной заявке № WO 02/098368 (где изолейцин в 16 позиции последовательности аминокислот заменяют другой аминокислотой отдельно или в сочетании с заменой серина в 69 позиции аминокислот на другую аминокислоту и/или где валин в 72 позиции последовательности аминокислот заменяют на другую аминокислоту). Другие токсины СТ описаны в опубликованной Международной патентной заявке № WO 02/098369 (где аргинин в 25 позиции последовательности аминокислот заменяют на другую аминокислоту, и/или аминокислоту инсерцируют в 49 позицию последовательности аминокислот, и/или две аминокислоты инсерцируют в позиции 35 и 36 последовательности аминокислот).

В некоторых вариантах реализации изобретения составы иммуногенных композиций содержат фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте реализации изобретения фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой стерильную воду, воду для инъекций, стерильный изотонический солевой раствор или биологический буфер. Полисахарид-белковые конъюгаты и/или белковые иммуногены смешивают с такими разбавителями или носителями обычным образом. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" в данном описании включает любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, бактерицидные и противогрибковые агенты, изотонические и агенты, замедляющие всавсывание, и т.п., совместимые с введением в организм человека или иного позвоночного. Выбор соответствующего носителя является очевидным для специалистов в данной области техники и в большой степени зависит от способа введения.

Примеры наполнителей, которые могут присутствовать в составе иммуногенной композиции, включают консерванты, химические стабилизаторы и суспендирующие или диспергирующие агенты. Обычно стабилизаторы, консерванты и т.п. оптимизируют, чтобы определить наилучший состав для обеспечения эффективности при введении соответствующему реципиенту (например, человеку). Примеры консервантов включают хлорбутанол, сорбат калия, сорбиновую кислоту, диоксид серы, пропилгаллат, парабены, этилваниллин, глицерин, фенол и парахлорфенол. Примеры стабилизирующих ингредиентов включают казаминовые кислоты, сахарозу, желатин, феноловый красный, N-Z амин, монокалиевый дифосфат, лактозу, лактальбумин гидролизат и сухое молоко.

В некоторых вариантах реализации изобретения состав иммуногенной композиции изготавливают, например, в форме жидкостей, порошков, аэрозолей, таблеток, капсул, таблеток или капсул с энтеросолюбильным покрытием или суппозиториев для введения человеку. При этом составы иммуногенных композиций могут включать также, в частности, но без ограничения, суспензии, растворы, эмульсии на масляных или водных основах, пасты и имплантируемые формы с замедленным высвобождением или биологически разлагаемые формы.

Иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению не ограничиваются выбором традиционных физиологически приемлемых носителей, разбавителей и наполнителей, в частности растворителей, буферов, адъювантов или других ингредиентов, используемых в фармацевтических препаратах описанного выше типа. Специалистам в данной области техники известен порядок приготовления этих фармацевтически приемлемых композиций из вышеописанных компонентов, имеющих соответствующую величину рН, изотоничность, стабильность и другие традиционные характеристики.

Г. Иммуногены

В некоторых вариантах реализации состав, содержащий конъюгат полисахарид-белок, согласно настоящему изобретению содержит один или более полисахаридов пневмококка. В других вариантах реализации изобретения состав, содержащий конъюгат полисахарид-белок, содержит один или более полисахаридов стрептококка. В следующих вариантах реализации изобретения состав, содержащий конъюгат полисахарид-белок, содержит один или более полисахаридов менингококка. В некоторых других вариантах реализации изобретения состав, содержащий конъюгат полисахарид-белок, содержит комбинацию одного или нескольких полисахаридов пневмококка, одного или нескольких полипептидов пневмококка, одного или нескольких полисахаридов стрептококка, одного или нескольких полипептидов стрептококка, одного или нескольких полисахаридов менингококка и/или одного или нескольких х полипептидов менингококка.

Термин "полисахарид" в данном описании включает любой антигенный фрмагмент сахара (или антигенную единицу), который обычно используют для получения иммуногенных и бактериальных вакцин, включая, в частности, но без ограничения, "сахарид", "олигосахарид", "полисахарид", "липосахарид", "липоолигосахарид (LOS)", "липополисахарид (LPS)", "гликозилат", "гликоконъюгат" и т.п.

В одном конкретном варианте реализации изобретения один или несколько полисахаридов пневмококка представляют собой полисахарид S. pneumoniae серотипа 4, полисахарид S. pneumoniae серотипа 6B, полисахарид S. pneumoniae серотипа 9V, полисахарид S. pneumoniae серотипа 14, полисахарид S. pneumoniae серотипа 18C, полисахарид S. pneumoniae серотипа 19F, полисахарид S. pneumoniae серотипа 23F, полисахарид S. pneumoniae серотипа 1, полисахарид S. pneumoniae серотипа 3, полисахарид S. pneumoniae серотипа 5, полисахарид S. pneumoniae серотипа 6A, полисахарид S. pneumoniae серотипа 7F и полисахарид S. pneumoniae серотипа 19A.

В некоторых вариантах реализации изобретения состав, содержащий конъюгат полисахарид-белок, представляет собой состав, содержащий 7-валентный пневмококковый конъюгат (7vPnC), содержащий полисахарид S. pneumoniae серотипа 4, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 6В, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 9V, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇ полипептид, полисахарид S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, и полисахарид S. pneumoniae серотипа 23F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇.

В некоторых других вариантах реализации состав, содержащий конъюгат полисахарид-белок, представляет собой состав, содержащий 13-валентный пневмококковый конъюгат (13vPnC), содержащий полисахарид S. pneumoniae серотипа 4, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 6В, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 9V, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 18С, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 19F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 23F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 1, конъюгированны, с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 3, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 5, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 6А, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S. pneumoniae серотипа 7F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, и полисахарид S. pneumoniae серотипа 19А, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇.

Полисахариды получают стандартными способами, известными специалистам в данной области техники. Так, например, полисахариды капсулы согласно настоящему изобретению получают из серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F Streptococcus pneumoniae, при этом каждый серотип выращивают в среде на основе сои, а затем отдельные полисахариды очищают путем центрифугирования, осаждения, ультрафильтрации и колоночной хроматографии. Аналогично, полисахариды стрептококка (например, один или более полисахаридов (или олигосахаридов) из β-гемолитического Streptococcus, в частности Streptococcus группы A, Streptococcus группы В, Streptococcus группы С и Streptococcus группы G) и сахариды менингококка (например, липоолигосахарид (LOS) N. meningitidis или липополисахарид (LPS)) получают из клинически подходящих серотипов или серогрупп, используя обычные методики и способы, известные специалистам в данной области. Затем очищенные полисахариды подвергают химической активации (например, путем восстановительного аминирования), в результате чего получают сахариды, способные вступать в реакцию с белком-носителем. После активации каждый полисахарид капсулы отдельно конъюгируют с белком-носителем (например, CRM₁₉₇), в результате чего получают гликоконъюгат (или, в качестве альтернативы, все полисахариды капсулы конъюгируют с одним белком-носителем), и изготавливают в виде лекарственной формы.

Химическую активацию полисахаридов и последующее конъюгирование с белком-носителем (т.е. получение конъюгата полисахарид-белок) осуществляют известными способами (см., например, патенты США №4,673,574 и 4,902,506).

Белки-носители предпочтительно представляют собой белки, которые являются нетоксичными и нереактогенными и которые могут быть получены в достаточном количестве и с достаточной чистотой. Белки-носители должны соответствовать требованиям стандартных процедур конъюгирования. В одном конкретном варианте реализации настоящего изобретения CRM₁₉₇ используют в качестве белка-носителя.

CRM₁₉₇ (Wyeth, Сэнфорд, Северная Каролина) представляет собой нетоксичный вариант (т.е., токсоид) токсина дифтерии, выделенный из культур штамма С7 Corynebacterium diphtheria (β197), выращенного в среде на основе казаминовых кислот и экстракта дрожжей. CRM₁₉₇ очищают путем ультрафильтрации, осаждения сульфатом аммония и ионообменной хроматографии. В качестве альтернативы, CRM₁₉₇ получают рекомбинантными методами в соотвествии с патентом США №5,614,382, который включен в настоящее описание посредством ссылки. Другие токсоиды дифтерии также подходят для использования в качестве белков-носителей.

В других вариантах реализации изобретения белок-носитель согласно настоящему изобретению является энзиматически неактивной пептидазой стрептококка (SCP) С5а (например, один или более вариантов SCP описаны в патенте США 6,951,653, патенте США 6,355,255 и патенте США 6,270,775).

Другие подходящие белки-носители включают неактивированные токсины бактерий, в частности токсоид столбняка, токсоид коклюша, токсоид холеры (например, СТ Е29Н, описанный в Международной патентной заявке WO 2004/083251), Е. coli LT, Е. coli ST и экзотоксин А из Pseudomonas aeruginosa. Можно также использовать белки наружных мембран бактерий, в частности комплекс "с" наружной мембраны (outer membrane complex c, ОМРС), порины, белки, связывающие трансферрин, пневмолизин, поверхностный белок А пневмококков (PspA), белок адгезин пневмококка (PspA) или белок Haemophilus influenzae D. В качестве белков-носителей можно использовать также другие белки, в частности яичный альбумин, гемоцианин лимфы улитки (keyhole limpet hemocyanin, KLH), альбумин сыворотки крупного рогатого скота (bovine serum albumin, BSA) или очищенное белковое производное (purified protein denvative, PPD) туберкулин.

После конъюгирования полисахарида капсулы с белком-носителем конъюгаты полусахарид-белок очищают (обогащают по содержанию конъюгата полисахарид-белок) различными способами. Эти способы включают операции концентрирования/диафильтрации, осаждения/элюирования, колоночной хроматографии и глубокой фильтрации.

После очистки отдельных гликоконъюгатов их смешивают, в результате чего получают иммуногенную композицию согласно настоящему изобретению. Конъюгаты полисахарид-белок согласно настоящему изобретению можно получить способами, известными специалистам в данной области техники. Так, например, для изготовления композиции можно получить 13 отдельных пневмококковых конъюгатов в физиологически приемлемой среде. Примеры таких сред включают, в частности, но без ограничения, воду, буферный солевой раствор, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и растворы декстрозы.

В других вариантах реализации изобретение представляет собой составы, которые стабилизируют иммуногенную композицию пептидазы стрептококка (SCP) С5а, при этом указанные составы содержат буферный солевой раствор, причем буфер имеет pKa примерно от 3.5 до примерно 6.5, поверхностно-активный агент и пептидазу стрептококка С5а. Пептидаза С5а представляет собой чрезвычайно консервативную сериновую протеазу, которую экспрессируют все β-гемолитические стрептококки (например, стрептококковые группы A, B, C и G). Так, например, последовательность нуклеотидов кодирующая пептидазу C5a стрептококков группы В (Group В streptococci, GBS), на 98% идентична последовательности нуклеотидов, кодирующей пептидазу С5а стрептококков группы A (Group A streptococci, GAS). При этом в некоторых вариантах реализации изобретения иммуногенная композиция против инфекции, вызванной β-гемолитическими стрептококками, содержит иммуноген (или антиген) пептидазы С5а.

В одном конкретном варианте реализации пептидаза С5а согласно настоящему изобретению представляет собой пептидазу стрептококка С5а, не обладающую ферментативной активностью (например, один или более вариантов SCP, описанных в патенте США №6,951,653, патенте США №6,355,255 и патенте США №6,270,775, каждый из которых включен в данное описание посредством ссылки). В другом конкретном варианте реализации SCP, применяемую в новых составах иммуногенных композиций согласно настоящему изобретению, клонируют из стрептококков группы В. В другом варианте реализации осуществляют генетические мутации последовательности SCP стрептококков группы В, в результате чего она становится ферментативно неактивной (см., например, патенты США №№6,951,653, 6,355,255 и 6,270,775) и экспрессируют в виде рекомбинантного белка в Е. coli.

В следующем варианте реализации изобретение представляет собой составы, которые стабилизируют иммуногенную композицию белка N. meningitidis 2086, при этом указанные составы содержат буферный солевой раствор, причем буфер имеет pKa примерно от 3.5 до примерно 7.5, поверхностно-активный агент и белок N. meningitidis 2086. Белки N. meningitidis 2086 кодирует последовательность нуклеиновых кислот - открытая рамка считывания (open reading frame (ORF)), которая определяется как "ORF 2086" (см., например, Международную публикацию № WO 03/063766 А2 (Международную патентную заявку № PCT/US02/32369), Международную публикацию № WO 04/094596 А2 (Международную патентную заявку № PCT/US04/011901) и Международную публикацию № WO 04/065603 А2 (Международную патентную заявку № PCT/US04/000800), каждая из которых включена в данное описание посредством ссылки). В следующем варианте реализации настоящее изобретение представляет собой составы, которые оптимизируют стабильность антигена и процент связывания белка N. meningitidis 2086 с солью алюминия, которую применяют в качестве адъюванта (например, AlPO₄), при этом указанные составы содержат буферный солевой раствор, причем буфер имеет pKa примерно от 3.5 до примерно 7.5, поверхностно-активный агент, соль алюминия и белок N. meningitidis 2086.

Все патенты и публикации, упоминаемые в данном описании, включены в него посредством ссылки.

Д. Примеры

Все приведенные ниже примеры (за исключением описанных подробно) реализованы при помощи стандартных методик, которые хорошо известны и широко применяются специалистами в данной области техники. Все примеры приведены в целях иллюстрации и их не следует рассматривать как ограничение в какой-либо степени области данного изобретения.

Пример 1

Иммуногенные составы, содержащие 0.001%-0.05% Tween™80, стабилизируют иммуноген и предотвращают его агрегацию.

Конъюгат полисахарид-белок, используемый в данном примере, представлял собой тринадцативалентный конъюгат полисахарида пневмококка (13vPnC), содержащий капсулярные полисахариды S. pneumoniae серотипов 4, 6В, 9V, 18С, 19F, 14, 23F, 1, 3, 5, 6А, 7F и 19A, каждый из которых конъюгировали с CRM₁₉₇. Полисахариды капсулы получили стандартными методами, которые известны специалистам в данной области техники. Вкратце, каждый серотип полисахарида пневмококка выращивали в среде на основе сои, затем отдельные полисахариды очистили способами центрифугирования, осаждения, ультрафильтрации и колоночной хроматографии. Очищенные полисахариды подвергли химической активации для конъюгирования, и каждый полисахарид отдельно конъюгировали с полипептидным белком-носителем CRM₁₉₇, в результате чего получали гликоконъюгат и готовили лекарственную форму.

Химическую активацию полисахаридов и последующее конъюгирование с белком-носителем осуществили известными способами (см., например, патент США №4,673,574 и 4,902,506). CRM₁₉₇ (Wyeth, Сэнфорд, Северная Каролина) представляет собой нетоксичный вариант (т.е. токсоид) токсина дифтерии, выделенный из культур штамма Corynebacterium diphtheria С7 (β197), выращенного в казаминовых кислотах и среде на основе экстракта дрожжей. CRM₁₉₇ очищают путем ультрафильтрации, осаждения сульфата аммония и ионообменной хроматографии.

Описанные ниже эксперименты по определению антигенности проводили путем смешивания образцов 13vPnC c одной из тринадцати антисывороток (Ab), специфичных в отношении каждого серотипа полисахарида, и определения иммунных комплексов путем измерения рассеяния света в системе Array® 360 (Beckman Coulter, Inc; Фуллертон, Калифорния). Затем результаты измерения светорассеяния для каждого из тринадцати серотипов сравнивали со стандартной кривой и обозначали как антигенность (мкг/мл).

Шприцы (BD Hypak SCF™) и пробки шприцев (BD Hypak SCF™) приобрели в BD Biosciences (Франклин-Лейкс, Нью-Джерси). Прозрачные флаконы из боросиликатного стекла (VWR TraceClean™, 40 мл) с крышками, снабженными прокладками из Teflon®, приобрели в VWR™ (Вест Честер, Пенсильвания). Полисорбат 80 (Tween™80) приобрели в J.T.Baker (Mallinckrodt Baker, Inc.; Филлипсбург, Нью-Джерси). Буферный солевой раствор содержал сукцинатный буфер (5 мМ) и NaCl (0.85%) и имел рН 5.8

Приготовили 13vPnC (общий объем 500 мл) с различными концентрациями поверхностно-активного агента (Tween™80, 0.001%, 0.005%, 0.01% и 0.05%, масса/объем) следующим образом: в химический стакан из стекла Pyrex® объемом один литр добавили 0.85% солевого раствора (150 мМ NaCl), а затем - 50 мМ сукцинатного буфера (конечная концентрация 5 мМ) и 13vPnC. Конечная концентрация конъюгата каждого серотипа составляла 4.4 мкг/мл (кроме серотипа 6В, концентрация которого составляла 8.8 мкг/мл). После этого состав 13vPnC разлили в пять отдельных стеклянных флаконов (50 мл во флакон), добавили в каждый флакон 0.0%, 0.001%, 0.005%, 0.01% или 0.05% Tween™80 (масса/объем) и профильтровали каждый раствор через фильтр Durapore® 0.22 мкм (Millipore; Биллерика, Массачусетс). Затем 0.65 мл каждого раствора набрали в отдельный стеклянный шприц BD HYPAK™ SCF™ объемом 3 мл с серыми пробками w4432 (BD Medical Pharmaceutical Systems; Франклин Лейкс, Нью-Джерси) и поместили шприцы в горизонтальный орбитальный шейкер (60 циклов в минуту) на 100 часов при температуре от 2°С до 8°С.

Согласно результатам визуального контроля (данные не показаны) 13vPnC, полученный при отсутствии Tween™80 (т.е. 0.0%), начинал осаждаться из раствора в течение десяти минут при температуре 2-8°С после слабого перемешивания в горизонтальном орбитальном шейкере. В отличие от этого 13vPnC, полученный с добавлением 0.001%, 0.005%, 0.01% или 0.05% Tween™80, после слабого перемешивания при температуре 2-8°С был стабилен до двадцати пяти дней без видимых признаков осаждения (данные не показаны). Эти результаты демонстрируют, что добавление поверхностно-активного агента (например, Tween™80) в состав иммуногенной композиции повышает стабильность указанной иммуногенной композиции.

Второй эксперимент по определению стабильности 13vPnC дополнительно подтвердил, что добавление поверхностно-активного агента в состав существенно повышает стабильность 13vPnC. В этом эксперименте приготовили 13vPnC с добавлением и без добавления 0.05% Tween™80. 13vPnC без Tween™80 (т.е. 0.0%) готовили следующим образом: в химический стакан из стекла Pyrex® объемом один литр добавили 0.85% солевого раствора (150 мМ NaCl), а затем - 50 мМ сукцинатного буфера (конечная концентрация 5 мМ) и 13vPnC, получив общий объем 500 мл. Состав 13vPnC с 0,05% Tween™80 (т.е. 0.0%) получили следующим образом: в химический стакан из стекла Pyrex® объемом один литр добавили 0.85% солевого раствора (150 мМ NaCl), а затем - 50 мМ сукцинатного буфера (конечная концентрация 5 мМ), 0,05% Tween™80 и 13vPnC, получив общий объем 500 мл. Конечная концентрация конъюгата каждого серотипа в 500 мл состава была равна 4.4 мкг/мл (за исключением серотипа 6В, концентрация которого составляла 8.8 мкг/мл). Составы объемом 500 мл гомогенизировали при помощи гомогенизатора с ротором/статором при скорости 6,000 об/мин (2-8°С) влечение 120 минут. В процессе гомогенизации возникала поверхность раздела жидкость-воздух (с воздушными пузырьками).

Стабильность состава 13vPnC с 0.05% Tween™80 (таблица 1) и без Tween™80 (таблица 1) определяли в течение двух часов следующим образом: из составов с 0.0% и 0.05% Tween™80 отбирали образцы (20-30 мл) на нулевой, тридцатой и сто двадцатой минутах. Образцы разбавляли в отношении 1:2 в разбавителе для белков (белковый разбавитель Array® 360 (№ по каталогу 663630); Beckman Coulter Inc; Фуллертон, Калифорния) и исследовали антигенность всех тринадцати серотипов 13vPnC (см. таблицу 1) при помощи системы Array® 360.

Как показано в таблице 1, в данном исследовании имело место существенное снижение антигенности полисахаридов тринадцати серотипов (приготовленных без Tween™80) в течение двух часов. При этом очень важно отметить, что состав 13vPnC, содержащий 0.05% Tween™80 (таблица 1), продемонстрировал высокую стабильность без снижения антигенности при проведении его анализа в течение двух часов.

Таблица 1 Определение стабильности 13vPnC, полученного с добавлением и без добавления Tween™80 13vPnC без Tween80   13vPnC c 0.05% Tween80 Серотип Антигенность 0 минут Антигенность 30 минут Антигенность 120 минут Серотип Антигенность 0 минут Антигенность 30 минут Антигенность 120 минут 1 4.8 мкг/мл 4.2 мкг/мл 2.4 мкг/мл 1 5.1 мкг/мл 5.0 мкг/мл 5.2 мкг/мл 3 4.8 мкг/мл 4.1 мкг/мл 1.7 мкг/мл 3 5.0 мкг/мл 5.0 мкг/мл 5.2 мкг/мл 4 5.8 мкг/мл 5.0 мкг/мл 3.1 мкг/мл 4 6.1 мкг/мл 6.1 мкг/мл 6.2 мкг/мл 5 3.4 мкг/мл 3.0 мкг/мл 2.0 мкг/мл 5 3.6 мкг/мл 3.6 мкг/мл 3.7 мкг/мл 6А 4.9 мкг/мл 3.8 мкг/мл 1.3 мкг/мл 6A 5.4 мкг/мл 5.4 мкг/мл 5.6 мкг/мл 6В 10.0 мкг/мл 5.6 мкг/мл 1.4 мкг/мл 6B 10.6 мкг/мл 10.6 мкг/мл 10.5 мкг/мл 7F 4.7 мкг/мл 3.4 мкг/мл 1.0 мкг/мл 7F 5.3 мкг/мл 5.2 мкг/мл 5.3 мкг/мл 9V 5.6 мкг/мл 4.7 мкг/мл 2.5 мкг/мл 9V 6.1 мкг/мл 6.1 мкг/мл 6.2 мкг/мл 14 7.6 мкг/мл 6.4 мкг/мл 3.0 мкг/мл 14 8.2 мкг/мл 8.3 мкг/мл 8.3 мкг/мл 18C 5.6 мкг/мл 4.4 мкг/мл 1.7 мкг/мл 18C 6.2 мкг/мл 6.1 мкг/мл 6.2 мкг/мл 19A 6.4 мкг/мл 4.5 мкг/мл 1.9 мкг/мл 19A 6.8 мкг/мл 6.8 мкг/мл 6.8 мкг/мл 19F 5.4 мкг/мл 2.6 мкг/мл 0.0 мкг/мл 19F 6.1 мкг/мл 6.2 мкг/мл 6.0 мкг/мл 23F 4.5 мкг/мл 2.8 мкг/мл 0.9 мкг/мл 23F 5.2 мкг/мл 5.2 мкг/мл 5.2 мкг/мл

Затем определили стабильность состава 13vPnC/Tween™80 под действием высоких сдвигающих нагрузок. В этом эксперименте 100 мл композиции 13vPnC (4.4 мкг/мл серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 8.8 мкг/мл серотипа 6В, 5 мМ сукцинатного буфера, 150 мМ NaCl и 0.25 мг/мл AlPO₄) добавили в три стеклянные колбы объемом 250 мл, содержащие 0.0%, 0.01% или 0.05% Tween™80. После этого три указанные колбы встряхивали для перемешивания в течение тридцати минут (2-8°С) во встряхивателе (Vortex-Genie® 2; Scientific Industries, Inc.; Богемия, Нью-Йорк), в результате чего при максимальной скорости осаждения получали поверхность раздела воздух-жидкость. Через тридцать минут из каждой колбы отобрали образцы по 10-30 мл, разбавили в отношении 1:2 разбавителем для белков Array® 360 и определили антигенность тринадцати серотипов при помощи системы Array® 360.

Как видно из приведенной ниже таблицы 2, 13vPnC, не содержащий Tween™80 (0.0%), после встряхивания продемонстрировал снижение антигенности в среднем на 20%. 13vPnC,c полученный с добавлением 0.01% Tween™80, продемонстрировал снижение антигенности в пределах 2-10% (в среднем 8%), a 13vPnC, полученный с 0.05% Tween™80, имел уменьшение антигенности в пределах 0-8% (в среднем 3%). Таким образом, данные, представленные в таблице 2, показывают, что 13vPnC, полученный с добавлением 0.01% или 0.05% Tween™80, был гораздо более устойчив к действию сдвигающих нагрузок, чем 13vPnC, полученный без добавления Tween™80.

Таблица 2 Стабилизирующий эффект tween™80 к действию сдвигающих нагрузок Серотип Антигенность 0.0% tw80 Антигенность 0.0% tw80 + встряхивание Антигенность 0.01% tw80 Антигенность 0.01% tw80 + встряхивание Антигенность 0.05% tw80 Антигенность 0.05% tw80 + встряхивание 1 4.7 мкг/мл 3.6 мкг/мл 4.8 мкг/мл 4.3 мкг/мл 4.7 мкг/мл 4.6 мкг/мл 3 4.6 мкг/мл 3.4 мкг/мл 4.7 мкг/мл 4.2 мкг/мл 4.7 мкг/мл 4.4 мкг/мл 4 5.5 мкг/мл 4.4 мкг/мл 5.9 мкг/мл 5.4 мкг/мл 5.9 мкг/мл 5.6 мкг/мл 5 3.2 мкг/мл 2.5 мкг/мл 3.5 мкг/мл 3.2 мкг/мл 3.3 мкг/мл 3.3 мкг/мл 6А 4.3 мкг/мл 3.6 мкг/мл 4.6 мкг/мл 4.5 мкг/мл 4.7 мкг/мл 4.8 мкг/мл 6В 9.7 мкг/мл 7.7 мкг/мл 10.2 мкг/мл 9.6 мкг/мл 10.2 мкг/мл 10.1 мкг/мл 7F 4.6 мкг/мл 3.5 мкг/мл 5.4 мкг/мл 5.0 мкг/мл 5.4 мкг/мл 5.3 мкг/мл 9V 5.3 мкг/мл 4.1 мкг/мл 5.7 мкг/мл 5.1 мкг/мл 5.6 мкг/мл 5.3 мкг/мл 14 6.8 мкг/мл 5.4 мкг/мл 7.3 мкг/мл 6.7 мкг/мл 7.4 мкг/мл 6.8 мкг/мл 18С 4.1 мкг/мл 3.4 мкг/мл 4.5 мкг/мл 4.3 мкг/мл 4.5 мкг/мл 4.5 мкг/мл 19A 5.1 мкг/мл 4.2 мкг/мл 5.5 мкг/мл 5.3 мкг/мл 5.6 мкг/мл 5.4 мкг/мл 19F 4.8 мкг/мл 3.6 мкг/мл 5.2 мкг/мл 4.9 мкг/мл 5.2 мкг/мл 5.1 мкг/мл 23F 3.0 мкг/мл 2.4 мкг/мл 3.4 мкг/мл 3.3 мкг/мл 3.5 мкг/мл 3.4 мкг/мл

Пример 2

Составы, содержащие поверхностно-активный агент, стабилизируют пептидазу стрептококка С5А и предотвращают ее агрегацию

Пептидазу стрептококка (SCP) С5а, используемую в данном примере, экспрессировали и очистили следующим образом. SCP экспрессировали по технологии рекомбинантной ДНК в Е. coli, используя систему, индуцируемую арабинозой. При этом следовали стандартным протоколам для Е. coli с использованием ростовой среды строго определенного состава и с последующим лизисом клеток. Рекомбинантную SCP очистили от растворимой фракции лизата клеток путем насыщения сульфатом аммония до 60% (примерно 3 М) при перемешивании в течение 12-24 часов. Насыщенный лизат центрифугировали, надосадочную жидкость отделили и загрузили в фениловую колонку с сефарозой для гидрофобного взаимодействия. Затем связанный материал элюировали 1 М сульфатом аммония, 20 мМ Tris-Cl, pH 7.5, сконцентрировали и подвергли диафильтрации с фосфатно-солевым буфером (PBS), рН 7.4. Очищенную рекомбинантную SCP (rSCP) разбавили PBS с рН 7.4 до ~10 мг/мл и пропустили через фильтр Posidyne, чтобы удалить эндотоксин, а затем подвергли конечной фильтрации (0.2 мМ), чтобы обеспечить стерильность, и хранили в замороженном состоянии (-25°С).

Затем приготовили состав очищенной SCP (55 мкг/мл) с 0.025% Tween™80 или без Tween™80 (0.0%) в следующих буферах: 5 мМ сукцинатный буфер с рН 6.0, 10 мМ фосфатный буфер с рН 7.0, 10 мМ фосфатный буфер с 7.4 или 10 мМ буфер трис с рН 7.5 и набрали в отдельные шприцы BD Hypak SCF™. Шприцы поместили в горизонтальный орбитальный шейкер при 2-8°С, встряхивали при скорости 180 циклов в минуту в течение двух дней и опредилили концентрацию белка SCP путем анализа модифицированным методом Лоури.

Как показано на фигуре 1, стабильность SCP при добавлении в состав Tween™80 существенно возрастала. Так, например, через два дня встряхивания в орбитальном шейкере состав SCP, приготовленный без Tween™80 (фиг.1А), показал существенное уменьшение (в частности, более 90%) концентрации SCP во всех испытанных буферах. При этом, как показано на фигуре 1В, добавление 0.025% Tween™80 в буферные составы SCP перед помещением их в орбитальный шейкер на два дня полностью ингибировало потерю SCP, которую можно наблюдать на фигуре 1А.

Определяли стабильность при хранении состава SCP/Tween™80 (0.025%) в течение восьми и шести недель при 25°С и 37°С соответственно (данные не показаны). Вкратце, приготовили SCP (200 мкг) в сукцинатном или фосфатном буфере следующим образом: сукцинатный буфер (5 мМ, рН 6.0) или фосфатный буфер (15 мМ, рН 7.4), 0.9% NaCl и 0.025% Tween™80. Стабильность составов SCP/Tween™80 определяли при помощи эксклюзионной ВЭЖХ, модифицированного метода Лоури по определению суммарного содержания белка и визуального контроля осаждения. Это исследование показало, что составы SCP/Tween™80 (во всех буферах) были абсолютно стабильны при 25°С и 37°С в течение всего периода определения стабильности (т.е. до восьми недель и шести недель соответственно).

Пример 3

Влияние силиконизированных контейнеров на стабильность 13vPNC

Предшествущие эксперименты показали (данные не представлены), что иммуногенные композиции 13vPnC осаждаются и/или образуют агрегаты при заполнении ими готовых для использования шприцев (для однократной дозы) Becton Dickinson® (BD) Hypak типа 1 из боросиликатного стекла, обработанных силиконом Dow Corning® медицинской марки DC 360 и незакрытых не содержащими латекса (хлорбутиловыми) пробками West 4432/50 и колпачками EZ West 7025/65 (синтетическая изопренбромбутиловая смесь; West Pharmaceutical®, Лайонвилль, Пенсильвания). Для этих экспериментов приготовили 13vPnC в 5 мМ сукцинатном буфере, содержащем 0.85% NaCl и 4.4 мкг/мл S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F и 8.8 мкг/мл S. pneumoniae серотипа 6В с добавлением или без добавления в качестве адъюванта 0.25 мг/мл фосфата алюминия. В результате получили, что при отсутствии AlPO₄ частицы 13vPnC были легковидимыми, в то время как в присутствии AlPO₄ частицы 13vPnC были существенно более мелкими и обнаруживались гораздо сложнее.

В данном примере исследовали ряд компонентов контейнеров и средств укупорки (т.е. контейнеров), чтобы определить, какие компоненты вызывают образование частиц 13vPnC или вносят вклад в их образование. Испытуемые контейнеры включали шприцы, пробки и флаконы, указанные далее в таблице 3. Пробки BD и West, указанные в таблице 3, силиконизировали, используя способ Губера или Джара. Способ силиконизации по Губеру является более управляемым, и он обеспечивает выход 30-60 мкг силикона на 1 см² поверхности пробки, в то время как способ силиконизации по Джару позволяет получать 150-300 мкг силикона на 1 см² поверхности пробки. В соответствии с теоретическими расчетами примерно 15% площади поверхности пробки контактирует с продуктом в шприце, поэтому можно предположить, что в случае способов Губера и Джара из пробок можно экстрагировать от 4.5 до 9 мкг и от 22.5 до 45 мкг силикона соответственно.

Материалы

Силикон представлял собой медициское силиконовое масло Dow Corning® 360 Medical Fluid с вязкостью 1000 сантистокс (партия №0001846266). 7vPnC приготовили в 5 мМ сукцинатном буфере, содержащем 0.85% NaCl и 4.4 мкг/мл S. pneumoniae серотипов 4, 9, 14, 18С, 19F и 23F и 8.8 мкг/мл S. pneumoniae серотипа 6В с добавлением и без добавления 0.25 мг/мл фосфата алюминия. 13vPnC приготовили в 5 мМ сукцинатном буфере, содержащем 0.85% NaCl и 4.4 мкг/мл S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F и 8.8 мкг/мл S. pneumoniae серотипа 6В с добавлением и без добавления 0.25 мг/мл фосфата алюминия. Одновалентный S. pneumoniae серотипа 6В приготовили (5 мМ сукцинатный буфер, содержащий 0.85% NaCl, без фосфата алюминия) с концентрацией 61 мкг/мл, чтобы имитировать общую концентрацию сахаридов составов 13vPnC.

Методы

7vPnC и 13vPnC приготовили, как описано выше, и 35 мл соответствующего состава поместили в прозрачную колбу Nalgene® объемом 250 мл. В каждую колбу Nalgene® поместили компоненты контейнеров, указанные в таблице 3. Затем колбы Nalgene® поместили в орбитальный шейкер Labline® и вращали в течение ночи со скоростью 50 об/мин. Результаты представлены в таблице 3.

Внешний вид. Колбы Nalgene®, содержащие компоненты контейнерных средств, облучали флуоресцентным излучением в лабораторных условиях. Отклонение луча света, проходящего через образцы, позволяет обнаруживать частицы (эффект Тинделя).

Определение содержания белка. Общее содержание белка и количество белка, связанного с алюминием, определяли, измеряя общую концентрацию белка в приготовленной иммуногенной композиции и белка, связанного с алюминиевой гранулой, соответственно (аликвоту иммуногенной композиции центрифугировали и повторно суспендировали гранулу в солевом растворе). Анализ проводили методом анализа белка по Лоури, модифицированного Пирсом (№ по каталогу 23240), используя в качестве стандарта альбумин сыворотки крупного рогатого скота.

Результаты

В первой серии экспериментов иммуногенные композиции 13vPnC приготовили без добавления AlPO₄ и привели их в контакт с рядом контейнеров, указанных ниже в таблице 3. Из полученных результатов (таблица 3) очевидно, что компоненты контейнеров, обработнные силиконовым маслом, вызывают образование частиц белого цвета. В присутствии несиликонизированных пробок Daikyo® (Daikyo Seiko, Ltd., Япония) и флаконов Schott (Schott North America Inc; Ливан, Пенсильвания), напротив, не было обнаружено никаких частиц.

Таблица 3 Влияние различных компонентов контейнеров на состояние 13vPnc, приготовленной без добавления AlPO₄ Компоненты контейнерных средств Количество добавленных компонентов контейнерных средств Внешний вид (визуальный контроль) Контрольный образец - 13vPnC без добавления AlPO₄ 0 Частицы отсутствуют Серые силиконизированные пробки WWD для шприцев BD Hypak BSCF 1-3 мл 4432/50 10 Частицы Серые силиконизированные методом Губера пробки WWD для шприцев BD Hypak BSCF 1-3 мл 4432/50 10 Частицы Готовые для стерилизации пробки West 890 10 Частицы Серые силиконизированные пробки 1000 WWD для шприцев BD Hypak BSCF 1-3 мл W4416/50 10 Частицы Пробки Helvoet 6213 10 Частицы Пробки для флаконов Daikyo (притертые пробки D777-1 В2-40 F451) 10 Частицы отсутствуют Цилиндры для шприцев BD Hypak BSCF 1-3 мл LLA EZGTC W7025/65 4 Частицы Пробки Hypak NSCF 1-3 мл 4023/50 В2-40 Daikyo 10 Частицы отсутствуют Зажимные колпачки W7025/65 EZ IITC шприцев E-Z 10 Частицы отсутствуют Стеклянные ампулы Schott 2 мл, 13 mm, тип 1 4 Частицы отсутствуют Силиконовое масло (Dow Chemical, медицинская марка 360) 500 мкл (1.43%) Частицы Шприцы Schott ТорРас 4 Частицы отсутствуют

В качестве модели для 13vPnC выбрали одновалентный серотип 6В S. pneumoniae и приготовили его в концентрациеи 61.6 мкг/мл (без добавления AlPO₄), чтобы имитировать общую концентрацию сахаридов в составе 13vPnC. Силикон (Dow Corning, медицинская марка 360) добавили к аликвотам приготовленного одновалентного 6В в пределах от 2 ppm (промилле) до 100 ppm. Смеси поместили в орбитальный шейкер Labline® на два часа при скорости 50 об/мин. Как указано ниже в таблице 4, наличие волокничтых частиц белого цвета наблюдали при всех концентрациях силикона (Si).

Таблица 4 Влияние концентрации силикона на образование частиц Концентрация силикона Внешний вид (визуальный контроль) 2 ppm (1 мкл Si на 500 мл состава) Волокнообразные частицы белого цвета 5 ppm (2.5 мкл Si на 500 мл состава) Волокнообразные частицы белого цвета 10 ppm (5 мкл Si на 500 мл состава) Волокнообразные частицы белого цвета 15 ppm (7.5 мкл Si на 500 мл состава) Волокнообразные частицы белого цвета 20 ppm (10 мкл Si на 500 мл состава) Волокнообразные частицы белого цвета 100 ppm (2 мкл Si на 20 мл состава) Волокнообразные частицы белого цвета

Определили также содержание силикона в составах 13vPnC (без добавления AlPO₄). Концентрацию силикона определяли методом плазменной эмиссионной спектроскопии при постоянном токе (данные не показаны). В этом эксперименте объединили содержимое 25 шприцев и провели экстракцию двумя порциями по 50 мл смеси циклогексана и изопропилового спирта. Экстракты объединили и выпарили. Осадок солюбилизировали и провели анализ методами, применяемыми для определения содержания силикона на резиновых пробках. Результаты показали, что из каждого шприца путем экстракции можно получить от 15.8 до 19.0 мкг силикона. Это количество соответствует содержанию силикона от 2.7% до 3.3%.

B отдельной серии экспериментов, для которой 13vPnC приготовили с добавлением AlPO₄ и привели в контакт с теми же компонентами контейнеров, которые указаны в таблице 3, установили, что силикон и "свободный" белок (13vPnC) в растворе ответственны за образование частиц (данные не показаны). Анализ частиц методом ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) также показал, что частицы состоят из белка и силикона (данные не представлены). На основании этих экспериментов определили, что примерно 85% 13vPnC связано с AlPO₄, в то время как остальные 15% представляли собой свободный (не связанный с AlPO₄) 13vPnC в растворе. В отличие от этого 100% 7vPnC, приготовленного с добавлением AlPO₄, было связано с AlPO₄ (данные не показаны).

Чтобы определить влияние свободного белка-полисахарида на образование частиц, 25, мл, 7vPnC и 13vPnC разделили на аликвоты и перенесли в 50 мл центрифужную пробирку. Образцы центрифугировали в течение 10 минут при скорости 3,000 об/мин, затем осторожно экстрагировали надосадочную жидкость и перенесли в колбу Nalgene®. Десять силиконизированных пробок (пробки 4432) добавили в каждую колбу и поместили в орбитальный шейкер при скорости 50 об/мин. После тщательного визуального контроля установили, что надосадочная жидкость 7vPnC не содержала частиц, оставаясь прозрачной и бесцветной. При этом в надосадочной жидкости во время четвертого часа наблюдения появились признаки образования частиц (данные не показаны). Такие результаты позволяют предположить, что свободный белок-полисахарид в растворе в комбинации с силиконом ответственен за образование частиц.

Для дополнительной оценки вклада свободного белка-полисахарида, находящегося в растворе, образование частиц, выбрали S. pneumoniae одновалентных серотипов 4 и 6В из-за их высокой и низкой степени связывания с алюминием соответственно. Приготовили составы этих двух моновалентных серотипов с концентрацией белка от 25 мкг/мл до 200 мкг/мл в отсутствие и в присутствии AlPO₄. Десять силиконизированных пробок (пробки 4432) поместили в каждый состав, а затем поместили в орбитальный шейкер при скорости 50 об/мин. Как показано ниже в таблице 5, нитеобразные частицы белого цвета наблюдали в обоих одновалентных серотипах при всех концентрациях белка при отсутствии AlPO₄. Однако в присутствии AlPO₄ частицы обнаружили при более низких концентрациях серотипа 4 (100 мкг/мл), чем серотипа 6В (200 мкг/мл) (данные не показаны).

Таблица 5 Влияние концентрации белка на образование частиц   Внешний вид (визуальный контроль) без AlPO₄ с AlPO₄ 25 мкг/мл 6В Волокнообразные частицы белого цвета Частицы отсутствуют 50 мкг/мл 6В Волокнообразные частицы белого цвета Частицы отсутствуют 75 мкг/мл 6В Волокнообразные частицы белого цвета Частицы отсутствуют 100 мкг/мл 6В Волокнообразные частицы белого цвета Частицы отсутствуют 200 мкг/мл 6В Волокнообразные частицы белого цвета Волокнообразные частицы белого цвета 25 мкг/мл типа 4 Волокнообразные частицы белого цвета Частицы отсутствуют 50 мкг/мл типа 4 Волокнообразные частицы белого цвета Частицы отсутствуют 75 мкг/мл типа 4 Волокнообразные частицы белого цвета Частицы отсутствуют 100 мкг/мл типа 4 Волокнообразные частицы белого цвета Волокнообразные частицы белого цвета 200 мкг/мл типа 4 Волокнообразные частицы белого цвета Волокнообразные частицы белого цвета

Пример 4

Алюминиевые адъюванты ингибируют образование частиц 13vPnC в присутствии силиконизированных контейнеров

Как указано выше в примере 3, иммуногенная композиция 13vPnC является жидкой, при этом указанный состав содержит 4.4 мкг/мл S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F и 8.8 мкг/мл типа 6В в 5 мМ сукцинатном буфере (рН 5.8) и 0.85% NaCl и его можно приготовить также с добавлением или без добавления адъюванта (например, алюминиевого адъюванта). 13vPnC также можно приготовить с добавлением или без добавления адъюванта, в частности 0.25 мг алюминия/мл фосфата алюминия (AlPO₄). В примере 3 при визуальном контроле наблюдали, что в 13vPnC, полученном без добавления AlPO₄ и помещенном в шприцы BD Hypak SCF™ (закрытые поршнями Hypak) имеет место образование частиц, при этом дальнейшие исследования показали, что указанные частицы в некоторой степени являются результатом взаимодействия комплекса белок-полисахарид с силиконом. В следующем примере определяли взаимодействие шприцев (и штоков) различных поставщиков с составами 13vPnC, имитируя при помощи перемешивания (как описано ниже) условия транспортировки и применения.

Материалы

13vPnC приготовили в 5 мМ сукцинатном буфере, содержащем 0.85% NaCl и 4.4 мкг/мл of S. pneumoniae серотипов 1, 3, 4, 5, 6А, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F и 23F и 8.8 мкг/мл of S. pneumoniae серотипа 6В, с добавлением и без добавления 0.25 мг/мл фосфата алюминия. Испытанные контейнеры указаны в таблице 6.

Таблица 6 Контейнерные средства     Контейнерные средства Описание 1 Шприцы Vetter типа 1 из необработанного стекла Длинный объемом 1 мл 2 Шпирицы Schott ТорРас® Пластмассовые шприцы 3 Шприцы BD Baked типа 1 из необработанного стекла 0.1 мг силикона/цилиндр 4 Шприцы BD Baked типа 1 из необработанного стекла 0.04 мг силикона/цилиндр 5 Шприцы BD типа 1 из необработанного стекла для составов высокой вязкости Шприцы 2.25 мл,, силикон 12500 сантистоксов 6 Шприцы BD типа 1 из необработанного стекла для составов высокой вязкости Шприцы 1.0 мл, силикон 12500 сантистоксов 7 Шприцы BünderGlas PS2 типа 1 из необработанного стекла 0 056 мг силикона/цилиндр 8 Шприцы BünderGlas PS4 и типа 1 из необработанного стекла 0 14 мг, силикона/цилиндр   1 Штоки West 4023/50 Flurotec® В2-40 Штоки Flurotec® 2 Штоки West 4023/50 Flurotec® В2-40 Штоки Flurotec®   1 13vPnC с AlPO₄ в шприцах BD Hypak со штоками West 4432, готовыми к употреблению, и колпачками 7025/65 EZ Позитивный контроль, высокое содержание силикона 2 13vPnC c AlPO₄ в несиликонизированных шприцах со штоками West 4023/50 Flurotec® В2-40 Негативный контроль, без обработки силиконом

Методы

Состав и процедура заполнения. В приведенной ниже таблице 7 указана рецептура состава 13vPnC при объеме 24 литра. Вкратце, вначале в стеклянный лабораторный стакан добавили 0.85% солевой раствор, затем 5 мМ сукцинатный буфер (рН 5.8) далее - последовательно каждый из конъюгатов серотипов S. pneumoniae. После этого состав осторожно перемешали мешалкой и профильтровали через фильтр Millipore® 0.22 мкм. Для состава, приготавливаемого с AlPO₄, добавили AlPO₄ (конечная концентрация - 0.25 мг/мл) и осторожно перемешали состав. Затем заполнили тестируемые шприцы (0.58 мл/шприц) и установили штоки.

Имитация условий транспортировки путем перемешивания. Для перемешивания образцов использовали цифровой встряхиватель на несколько пробирок марки VWR® (№ по каталогу 14005-826). Шприцы, заполненные 13vPnC, помещали горизонтально, закрепляли двумя опорными пластинами встряхивателя и перемешивали со скоростью 500 об/мин с паузами при 2-8°С в течение двадцати четырех часов.

Нефелометрия. Специфичную антигенность серотипов определяли при помощи нефелометрического анализа, используя типоспецифические антитела. Для 13vPnC с AlPO₄ фосфат алюминия солюбилизировали добавлением 1N NaOH. Раствор сразу нейтрализовали добавлением 1 М лимонной кислоты. Для 13vPnC без AlPO₄ операции солюбилизации и нейтрализации не проводили. В процессе анализа, который проводили с использованием нефелометра Beckman Array 360, измеряли скорость изменения интенсивности рассеяния света комплексом антитело-антиген, образовавшимся в образце.

Таблица 7 Составы 13vPnC Компонент Объем загрузки (л) Объемная концентр. (мг/мл) Требуемая концентр. (мкг/мл) Объем 13vPnC с AlPO₄ (мл) Объем 13vPnC без AlPO₄ (мл) Серотип 1 2.000 0.506 4.4 17.39 17.39 Серотип 3 2.000 0.256 4.4 34.38 34.38 Серотип 4 2.000 0.530 4.4 16.60 16.60 Серотип 5 2.000 0.515 4.4 17.09 17.09 Серотип 6А 2.000 0.519 4.4 16.96 16.96 Серотип 6В 2.000 0.489 8.8 35.99 35.99 Серотип 7F 2.000 0.500 4.4 17.60 17.60 Серотип 9V 2.000 0.521 4.4 16.89 16.89 Серотип 14 2.000 0.518 4.4 16.99 16.99 Серотип 18С 2.000 0.509 4.4 17.29 17.29 Серотип 19А 2.000 0.511 4.4 17.22 17.22 Серотип 19F 2.000 0.520 4.4 16.92 16.92 Серотип 23F 2.000 0.511 4.4 17.22 17.22 Сукцинатный буфер в 0.85% солевом растворе, рН 5.8 2.000 50.0 5000 200.0 200.0 AlPO₄ 2.000 3.250 250 153.85 Не установлено Солевой раствор 2.000 Не установлено Не установлено 1387.62 1541.46

РЕЗУЛЬТАТЫ

В данном исследовании шприцы от различных поставщиков с разным содержанием силикона (таблица 6) подвергли испытанию при регулируемом перемешивании. Общую антигенность каждого серотипа определяли при помощи нефелометрического анализа в образцах до и после перемешивания. Расчетная потеря антигенности (в процентах) после перемешивания показана на фигурах 2-7.

Перед проведением исследования оптимизировали условия перемешивания исходя из потери антигенности двух контрольных образцов: (1) наихудший вариант контрольного образца (образец положительного контроля, высокое содержание силикона; фиг.2) и (2) наилучший вариант контрольного образца (образец отрицательного контроля, отсутствие силикона; фиг.3). Затем условия оптимизировали таким образом, чтобы потеря антигенности была достаточно низкой для образца положительного контроля, но обнаруживалась для образца отрицательного контроля. Это необходимо для того, чтобы перемешивание не было слишком слабым, чтобы вызывать осаждение в шприцах, или слишком сильным, чтобы осаждение могло быть вызывано факторами, отличными от взаимодействия с силиконом (например, сдвигающими нагрузками). Таким образом, перемешивание при скорости 500 об/мин (с паузами) в течение двадцати четырех часов выбрали как наиболее подходящий режим перемешивания, а температуру 2-8°С и горизонтальное положение - для имитации условий транспортировки и применения в реальном времени.

Результаты исследования можно обобщить следующим образом: наибольшие потери антигенности 13vPnC, полученного с AlPO₄, имели место в шприцах с более высоким содержанием силикона (данные не показаны). Так, например, из шприцев, указанных в таблице 6, шприц BD Hypak (контрольный образец 1), шприц BD из спеченного стекла (шприц 3, 0.1 мг силикона), шприц BD для составов высокой вязкости (шприц 5) и шприц BünderGlas PS4 (шприц 8, 0.14 мг силикона) содержали один или более серотипов 13vPnC с потерей антигенности, превышающей 10%. Наименьшие потери антигенности 13vPnC, приготовленного с добавлением AlPO₄, имели место в шприцах с более низким содержанием силикона. Так, например, шприцы Vetter (фиг.4) и пластмассовые шприцы Schott ТорРас (фиг.5) были наиболее близки к несиликонизированным шприцам (фиг.2), при этом оба они показали незначительную потерю антигенности для 13vPnC, приготовленного с добавлением AlPO₄.

Влияние фосфата алюминия на стабилизацию 13vPnC и ингибирование образования частиц в присутствии силиконизированных шприцов определяли в экспериментах с использованием 13vPnC, полученного с добавлением и без добавления 0.25 мг/мл AlPO₄, при этом указанные шприцы представляли собой шприцы BD из спеченного стекла с низким содержанием силикона (шприц 4 в таблице 6) и шприцы PS2 BünderGlas с низким содержанием силикона (шприц 7 в таблице 6). Шприцы BD из спеченного стекла с низким содержанием силикона (0.04 мг силикона/цилиндр) обычно вызывали потерю антигенности менее 10% для серотипов 13vPnC, приготовленных с AlPO₄ (фиг.6А), в то время как потери антигенности для серотипов 13vPnC, приготовленных без AlPO₄ (фиг.6В), составляли от 5% (серотип 1) до примерно 50% (серотип 23F). Шприцы PS2 BünderGlas с низким содержанием силикона (0.056 мг силикона/цилиндр) вызывали потерю антигенности менее 5-8% (в зависимости от серотипа) для 13vPnC, полученного с AlPO₄ (фиг.7А), при этом потери антигенности для серотипов 13vPnC, полученных без AlPO₄ (фиг.7В), составляли примерно от 5% до примерно 30% (в зависимости от серотипа).

Таким образом, эти данные, взятые вместе, указывают, что: (1) потеря антигенности 13vPnC была большей в шприцах с более высоким содержанием силикона и (2) 13vPnC, полученный без AlPO₄, имел большие потери антигенности, чем 13vPnC с AlPO₄ во всех испытанных шприцах.

Пример 5

Составы, содержащие поверхностно-активный агент, оптимизируют связывание антигенных белков менингококка с адъювантами из солей алюминия.

Рекомбинантный липидированный белок N. meningitidis 2086 (rLP2086), использованный в данном примере, экспрессировали и очистили следующим образом. rLP2086 экспрессировали по технологии рекомбинантных ДНК в Е. coli, используя нативную лидерную последовательность. При этом следовали стандартным протоколам для Е. coli с использованием ростовой среды строго определенного состава и с последующим лизисом клеток. Рекомбинантный липидированный белок N. meningitidis 2086 очистили от мембранного осадка 50 мМ трис-HCl/5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA)/1% саркозила с рН 8. Этот экстракт в саркозиле откорректировали 1% цвиттергентом 3-14 (Z3-14) и дважды подвергли диализу при 30-кратном избытке 50 мМ трис-HCl/5 мМ EDTA/1% Z3-14. Диализный экстракт rLP2086 осадили 90% этанолом для удаления остаточного саркозила и солюбилизировали 50 мМ трис-HCl/5 мМ EDTA/1% Z3-14 с рН 8. Нерастворимый материал удалили при помощи центрифугирования, надосадочную жидкость пропустили через анионообменную хроматографическую колонку, a rLP2086 отобрали в несвязанную фракцию. Затем несвязанный материал дважды подвергли диализу при 30-кратном избытке 25 мМ NaAc/1% Z3-14 с рН 45 и пропустили через катионообменную хроматографическую колонку. rLP2086 элюировали градиентом NaCl 0-0.3 М и хранили в замороженном состоянии (-25°С).

Затем приготовили очищенный rLP2086 со 150 мМ NaCl, 0.020% Tween™80, 0.25 мг Al/мл AlPO₄ в следующих буферах: 10 мМ фосфатный буфер с рН 7.0 и 5 мМ сукцинатный буфер с рН 6.0. В таблице 8 приведено сравнение процента связывания белка с адъювантом AlPO₄.

Таблица 8 Связывание rLP2086 с адъювантом Буфер Общая концентрация белка (мкг/мл) Белок, связанный с AlPO₄ (%) 10 мМ фосфатный буфер с рН 7.0, содержащий 150 мМ NaCl, 0.02% полисорбата 80 и 0.25 мг Al/мл AlPO₄ 400 68 120 82 5 мМ сукцинатный буфер с рН 6.0, содержащий 150 мМ NaCl, 0.02% полисорбата 80 и 0.25 мг Al/мл AlPO₄ 400 81 120 100

ЛИТЕРАТУРА

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к биофармацевтике, и может быть использована для приготовления вакцин. Для этого состав, стабилизирующий конъюгат полисахарид-белок, содержит: (1) буферный солевой раствор, причем указанный буфер имеет рКа примерно от 3,5 до примерно 7,5, (2) полисорбат 80 в конечной концентрации, равной 0,001% до 0,05% мас./об. указанного состава, и (3) один и более конъюгатов полисахарид-белок, содержащих один и более полисахаридов пневмококка. Группа изобретений также относится к шприцу, заполненному вышеуказанным составом. Использование данного состава позволяет повысить стабильность иммуногенных композиций, а также ингибировать их осаждение. 2 н. и 26 з.п. ф-лы, 8 табл., 7 ил., 5 пр.

1. Состав, стабилизирующий конъюгат полисахарид-белок, при этом указанный состав содержит (1) буферный солевой раствор, причем указанный буфер имеет рКа примерно от 3,5 до примерно 7,5, (2) полисорбат 80 в конечной концентрации, равной 0,001 до 0,05% мас./об. указанного состава, и (3) один или более конъюгатов полисахарид-белок, содержащих один или более полисахаридов пневмококка.

2. Состав по п.1, отличающийся тем, что указанный состав, содержащий конъюгат полисахарид-белок, находится в контейнере, выбранном из одного или более из группы, включающей флакон, пробку флакона, крышку флакона, стеклянную крышку, резиновую крышку, пластмассовую крышку, шприц, пробку шприца, поршень шприца, колбу, мензурку, мерный цилиндр, ферментер, биореактор, шланг, трубку, мешок, банку, ампулу, баллон и одноразовую ручку.

3. Состав по п.2, отличающийся тем, что указанный контейнер является силиконизированным.

4. Состав по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный буферный солевой раствор содержит хлорид натрия.

5. Состав по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что рН указанного буферного солевого раствора равен от 5,5 до 7,5.

6. Состав по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанным буфером является фосфатный, сукцинатный, гистидиновый или цитратный буфер.

7. Состав по п.6, отличающийся тем, что указанным буфером является сукцинатный буфер.

8. Состав по п.7, отличающийся тем, что конечная концентрация указанного сукцинатного буфера равна от 1 мМ до 10 мМ, а рН равен от 5,8 до 6,0.

9. Состав по п.8, отличающийся тем, что конечная концентрация указанного сукцинатного буфера равна 5 мМ.

10. Состав по п.8, отличающийся тем, что рН указанного сукцинатного буфера равен 5,8.

11. Состав по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный состав также содержит один или более полисахаридов менингококка, один или более антигенных белков менингококка или их сочетание.

12. Состав по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный состав также содержит один или более полисахаридов стрептококка, один или более антигенных белков стрептококка или их сочетание.

13. Состав по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный состав, содержащий конъюгат полисахарид-белок, представляет собой 7-валентный пневмококковый состав, содержащий 7-валентный конъюгат пневмококка (7vPnC), содержащий полисахарид S.pneumoniae серотипа 4, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 6В, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 9V, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇ полипептид, полисахарид S.pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 18С, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 19F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, и полисахарид S.pneumoniae серотипа 23F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇.

14. Состав по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный состав, содержащий конъюгат полисахарид-белок, представляет собой состав, содержащий 13-валентный конъюгат пневмококка (13vPnC), содержащий полисахарид S.pneumoniae серотипа 4, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 6В, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 9V, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 18С, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 19F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 23F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 1, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 3, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 5, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 6А, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 7F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, и полисахарид S.pneumoniae серотипа 19А, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇.

15. Состав по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный состав также содержит один или несколько адъювантов.

16. Состав по п.15, отличающийся тем, что указанный адъювант представляет собой фосфат алюминия.

17. Состав по п.1, отличающийся тем, что указанный состав содержит (1) буферный солевой раствор, причем указанный буфер имеет рКа примерно от 3,5 до примерно 7,5, (2) полисорбат 80 в конечной концентрации от 0,001 до 0,05% мас./об. указанного состава и (3) один или более конъюгатов полисахарид-белок, содержащих один или несколько полисахаридов пневмококка.

18. Состав по п.17, отличающийся тем, что указанный состав также содержит один или несколько адъювантов.

19. Состав по п.18, отличающийся тем, что указанным адъювантом является фосфат алюминия.

20. Состав по п.19, отличающийся тем, что указанный фосфат алюминия содержится в концентрации около 0,25 мг/мл.

21. Состав по п.1, отличающийся тем, что указанный состав стабилизирует конъюгат полисахарид-белок, при этом указанный состав содержит
(i) буферный солевой раствор, при этом указанным буферным солевым раствором является сукцинатный буфер, конечная концентрация которого равна от 1 мМ до 10 мМ, а рН равен от 5,8 до 6,0;
(ii) полисорбат 80, конечная концентрация которого в указанном составе равна от 0,01 до 0,05% мас./об. указанного состава;
(iii) 13-валентный конъюгат пневмококка (13vPnC), содержащий полисахарид S.pneumoniae серотипа 4, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 6В, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 9V, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 18С, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 19F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 23F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇ полисахарид S.pneumoniae серотипа 1, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 3, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 5, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 6А, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 7F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, и полисахарид S.pneumoniae серотипа 19А, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇.

22. Состав по п.21, отличающийся тем, что конечная концентрация указанного сукцинатного буфера равна 5 мМ.

23. Состав по п.21, отличающийся тем, что указанный буферный солевой раствор содержит хлорид натрия.

24. Состав по п.23, отличающийся тем, что конечная концентрация указанного хлорид натрия равна 150 мМ.

25. Состав по любому из пп.21-24, отличающийся тем, что указанный состав также содержит адъювант, при этом указанным адъювантом является фосфат алюминия.

26. Состав по п.1, отличающийся тем, что указанный состав стабилизирует конъюгат полисахарид-белок, при этом указанный состав содержит (1) буферный солевой раствор, содержащий хлорид натрия, при этом указанным буферным солевым раствором является сукцинатный буфер, конечная концентрация которого равна около 5 мМ, а рН равен от 5,8;
(ii) полисорбат 80, конечная концентрация которого в указанном составе равна от 0,01 до 0,05% мас./об. указанного состава;
(iii) 13-валентный конъюгат пневмококка (13vPnC), содержащий полисахарид S.pneumoniae серотипа 4, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 6В, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 9V, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S, pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 18С, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 19F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 23F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 1, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 3, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 5, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇ полисахарид S.pneumoniae серотипа 6А, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, полисахарид S.pneumoniae серотипа 7F, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇, и полисахарид S.pneumoniae серотипа 19А, конъюгированный с полипептидом CRM₁₉₇;
(iv) адъювант, содержащий фосфат алюминия в конечной концентрации около 0,25 мг/мл.

27. Шприц, заполненный составом по любому из пп.1, 17-26.

28. Шприц по п.27, причем указанный шприц силиконизирован.