СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2013 года по МПК G09B23/28 A61K31/675 A61K31/7076 A61P35/00 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, точнее к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для ингибирования злокачественного процесса под влиянием химиотерапии в сочетании с циклическим аденозин-3'-5'-монофосфатом (цАМФ).

Изобретение основано на развитии открытия СССР, диплом №158 от 23.05.75 г. и включает разработку способа получения противоопухолевого эффекта при проведении экспериментальной химиотерапии совместно с цАМФ. Учитывая разнообразные неспецифические формы системного действия опухоли, актуальным является поиск путей коррекции и обратимости нарушений патологических процессов.

Хорошо известно, что цАМФ представляет собой универсальный «передатчик» регуляторных воздействий гормонов и медиаторов, превращающих межклеточные сигналы, поступающие из внешней или внутренней среды, во внутриклеточные.

Известна гипотеза, выдвинутая в 1985 и подтвержденная в 1996 г., о гормонально-субстратно-нуклеотидных системах (A.M.Бабский, Ю.С.Стефанов, М.Н.Кондрашова, И.В.Шестаковская «Субстратно-гормональная система янтарная кислота - катехоламины. Новые данные». Сб. научных статей «Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. Пущино, 1996, с.14-21), которая основана на экспериментально установленной связи концентрации циклических нуклеотидов с механизмами пускового действия катехоламинов (адреналина, норадреналина) в реализации ЯК-зависимого эффекта стимуляции дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях печени и мозга. Так как катехоламины являются аллостерическими стимуляторами сукцинатдегидрогеназы (СДГ), авторы указывают не только на прямую, но и обратную связь ЯК -катехоламины - цАМФ, как сигнальной молекулы для включения рецепторов плазматической мембраны в реализации энергообразующих процессов и адаптивной регуляции патологических процессов при действии ионизирующей радиации, гипоксии и при физическом истощении.

Вместе с тем, указывается на опосредованное влияние цАМФ и его производных на дифференцировку клеток в культуральных средах различных опухолей и утрату клетками способности к ретрансплантации (Н.А.Федоров и др. «Циклические нуклеотиды и их аналоги в медицине», М., Медицина, 1990 г.), а также способность циклических нуклеотидов опосредовать иммуногенез, который при действии цитостатиков подавляется.

Принимая во внимание доступность цАМФ к ключевым механизмам энергообразующих процессов, дифференцировки и пролиферации, опосредованного через различные факторы экспрессии генов, а также адаптивной регуляции в условиях патологических процессов, возникает необходимость продвижения технологий сопроводительной терапии в клинической и экспериментальной онкологии.

Среди клинических работ известен способ лечения рака молочной железы путем введения в качестве лекарственного средства раствора натриевой соли цАМФ (RU 2071771 C1, 20.01.1997). Сублингвальный путь введения микроконцентраций цАМФ с предварительным определением чувствительности к препарату являлись основными условиями противоопухолевого влияния у больных РМЖ III-IV стадии.

Механизм такого терапевтического воздействия изучен недостаточно, что требует проведения экспериментальных исследований, а следовательно, разработки нового адекватного способа воздействия на животных-опухоленосителей, отличительные свойства которого должны быть обоснованы совокупностью элементов доказательной базы. Это - показатели объема опухоли, продолжительности жизни животных, клеточные критерии энергетического метаболизма (цикл Кребса и гликолиз) и пролиферативной активности иммунокомпетентных клеток, тестами интоксикации, а также определением сигнальных критериев симптомокомплексов ответных интегральных адаптационных реакций организма: стресса, тренировки, спокойной и повышенной активации, т.е. признаков объективизации лечебного эффекта цАМФ.

Из работ экспериментального характера наиболее близко к разрабатываемому нами способу изучение введения аденозин-3'-фосфата, структурного аналога метаболита аденозин-5'-фосфата, через подавление активности трансформированной моноаминоксидазы (Хужамбердиев З.М., Романова Л.А. «Нарушения и пути нормализации дезаминирования некоторых азотистых соединений в печени животных-опухоленосителей» - Вопросы медицинской химии. 1973, т.19, с.415). Введение препарата животным с перевивными опухолями повышало резистентность организма к развитию злокачественного процесса и продлевало им жизнь. Это экспериментальное исследование выбрано нами в качестве прототипа. Однако в данной работе не учитывалась возможность разработки пролонгированного мультидозового режима введения, способствующего поддержанию уровня цАМФ в организме, а также не использовали введения цитостатиков, как фактора специфического лечения рака. Обоснованием использования С-45 является то, что эта общепринятая универсальная модель имеет длительный исторический срок применения в экспериментальной онкологии, так как адекватно отражает условия канцерогенеза, не внося специфических изменений в гормональный (как модели рака яичников, молочной железы и др.) или иммунный гомеостаз (лимфосаркома Плисса). Вместе с тем, злокачественный рост С-45 сопровождается мультисистемным влиянием, нарушая межуровневые связи, искажая согласованный характер деятельности систем, вызывая десинхроноз. В данном способе предлагается сочетание специфического химиопрепарата и неспецифического фактора патогенетической терапии цАМФ с учетом его универсальных свойств регуляции клеточного метаболизма и синхронизации медиаторно-гормональных и энергетических функций.

Целью изобретения является разработка способа повышения неспецифической противоопухолевой резистентности и достижения противоопухолевого эффекта при экспериментальной химиотерапии опухолей поздних сроков развития на модели саркомы 45.

Поставленная цель достигается тем, что белым беспородным крысам с перевивной саркомой 45 по достижению объема опухоли около 3 см³ производят внутрибрюшинное введение циклофосфана в дозе 50 мг/кг на 1-е, 5-е, 10-е и 15-е сутки между 15 и 16 часами в сочетании с ежедневным введением интрагастрально 0,001% раствора циклического аденозин-3'-5'-монофосфата в количестве 1,0 мл три раза в день с интервалом 2 часа, начиная с 10 часов утра. Контроль эффективности воздействия сочетания указанных препаратов осуществляется по показателям объемов опухолей с оценкой достоверности межгрупповых различий и определения кинетики роста. Непосредственные результаты дополняются показателями сроков жизни животных от начала лечения.

Изобретение «Способ лечения опухолей в эксперименте» является новым, так как оно неизвестно из уровня медицины, а именно в экспериментальной онкологии при химиотерапии опухоли циклофосфаном в сочетании с регуляторным влиянием на клеточный метаболизм циклического аденозин-3'-5'-монофосфата.

Новизна изобретения заключается, во-первых, в цАМФ модулированном эффекте противоопухолевого и цитотоксического влияния циклофосфана при опухолях больших объемов, а во-вторых, в пролонгированном режиме биологически значимого управляющего воздействия на ключевые процессы митохондриальной энергетики и пролиферативной активности лимфоцитов, участвующих в механизмах формирования антистрессорных адаптационных реакций и повышения противоопухолевой резистентности.

Изобретение «Способ лечения опухолей в эксперименте» является промышленно применимым, так как может быть использовано в здравоохранении в общей лечебной сети, а также в экспериментальной и клинической онкологии для повышения эффективности лечения злокачественных опухолей, функциональной реабилитации и улучшения качества жизни.

«Способ лечения опухолей в эксперименте» осуществляется следующим образом: белым беспородным крысам с привитой в подкожную клетчатку тазовой области спины саркомой 45, достигшей объема около 3 см³, вводят интрагастрально ежедневно утром в 10 часов, а затем в 12 и 14 часов дня 0,001% раствор циклического аденозин-3'-5'-монофосфата в количестве 1,0 мл, предварительно разведенного и сохраняемого в стерильном флаконе при +4С. Введение осуществляется тонким (d=1,5 мм) желудочным зондом, соединенным с туберкулиновым шприцем. Параллельно осуществляют внутрибрюшинное введение раствора циклофосфана в дозе 50 мг/кг на 1-е, 5-е, 10-е, и 15-е сутки эксперимента между 15 и 16 часами.

Как отмечалось ранее, при достижении С-45 объема 0,75-1,0 см³ не наблюдается спонтанного рассасывания опухоли (менее 1% случаев) и именно с таких размеров опухолевого узла обычно рекомендуется начинать терапию. Наши эксперименты были начаты после достижения опухолью объемов, в 3 раза превышающем стандартные показатели.

Как следует из первичного материала, эффективность модулированной цАМФ химиотерапии ЦФ выразилась достоверным ослаблением кинетики роста: при практически одинаковых исходных объемах опухолей в первой (ЦФ+цАМФ) и второй группах животных (ЦФ) после окончания лечения выявилась регрессивная динамика С-45, более выраженная в группе с цАМФ (табл.1).

Таблица 1 Динамика показателей объема саркомы 45 и продолжительность жизни животных с момента начала и до окончания химиотерапии в сочетании с введением цАМФ Группы животных Исходный объем опухоли (перед началом лечения) (см³) Объем опухоли после окончания лечения (см³) Средние сроки жизни животных от начала лечения (сутки) I (основная группа, ЦФ+цАМФ), n=15 2,99±0,81 1,96±0,35* 85,4±20,6 II (группа сравнения, ЦФ), n=15 2,95±0,78 2,6±0,54 66,2±22,8 Примечание: * - уменьшение объема опухоли после окончания лечения относительно исходных значений достоверно (р<0,05).

Средние значения объема опухоли в основной группе уменьшились к моменту окончания лечения в 1,3 раза. Дополнительным критерием кинетики роста служила разница между величиной прироста опухоли, которая составила в основной группе ΔХ_ср=-1,03 см³, а в группе сравнения ΔХ_ср=-0,35 см³, т.е. коэффициент их соотношения ΔX_cpI/ΔХ_срII, равный 3,0, четко подтверждал улучшение непосредственного противоопухолевого эффекта при сочетании ЦФ+цАМФ.

Вторым важным оценочным параметром, принятым в экспериментальной онкологии, служили показатели продолжительности жизни от момента начала терапии вплоть до летального исхода. По данным таблицы 1 можно видеть, что продолжительность жизни животных-опухоленосителей, получавших дополнительно цАМФ, составила в среднем 85,4 суток с максимумом 15 недель. В группе сравнения средние значения показателя снижались на 30% с максимумом 12 недель. Следовательно, эффективность предлагаемого способа нашла четкое отражение и в показателях продолжительности жизни.

Опосредуемые цАМФ эффекты выявились на уровне клеточных систем организма. Во-первых, важным аргументом в пользу включения механизма обратной связи цАМФ-реализации ЯК-зависимого эффекта стимуляции дыхания и окислительного фосфорилирования стало повышение активности СДГ в лимфоцитах крови. Цитохимическое исследование уровня активности ключевых дегидрогеназ цикла Кребса и гликолиза, находящихся в реципрокных взаимоотношениях, позволило определить параметры распределения популяций лимфоцитов по содержанию гранул формазана (табл.2).

При использовании цАМФ уровень СДГ в 1,7 раза превышал уровень α-глицеро-фосфатдегидрогеназы (α-ГФДГ), что свидетельствовало о значительном усилении энергопродукции цикла Кребса на фоне снижения интенсивности гликолиза. Аналогичная закономерность проявилась и в межгрупповом отношении. Активация СДГ, как отражение ЯК-зависимого эффекта стимуляции дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий, в группе с применением ЦФ и цАМФ в 1,7 раза была больше, чем при введении только ЦФ.

Определение отношения индексов активности СДГ по J_a к J₀, демонстрирующих объемы популяции лимфоцитов крови, заполненные гранулами формазана, и популяции опустошенных ферментативно-интактных клеток - «нуллеров» в 1,5 раза, превышало показатели группы сравнения. Значительно слабее реагировал α-ГФДГ-субпопуляционный состав лимфоцитов, свидетельствуя о низком уровне гликолиза, хотя абсолютные значения К J_a/J₀ в группе с введением ЦФ и цАМФ были заметно выше, чем одного ЦФ.

Таблица 2 Активность дегидрогеназ лимфоцитов крови у крыс с С45 на момент завершения химиотерапии и введения цАМФ Группы животных СДГ в гранулах, М±m α-ГФДГ в гранулах, М±m J_a/J₀ СДГ α-ГФДГ I (основная группа ЦФ+цАМФ), n=15 10,63±0,63^1,2 6,20±0,72 1,04±0,05^1,2 0,69±0,004 II (группа сравнения, ЦФ), n=15 6,27±1,01^1,2 3,67±0,52 0,70±0,03^1,2 0,59±0,03 Примечание. Различия статистически достоверны: ¹ - между внутригрупповыми уровнями СДГ и α-ГФДГ (р<0,01, р<0,05); ² - между I и II группами (р<0,01).

Учитывая, что лимфоциты представляют 100% диплоидные клетки и служат своеобразным контролем для определения пролиферативной активности, нами был осуществлен методом проточной цитометрии автоматический анализ частоты выявления фаз клеточного деления G₁, G₂, S. Первичные данные по каждой группе (основной и сравнения) были подвергнуты обработке с выявлением скорости пролиферации (аналог частоты выявления S-фазы) (СП) и индекса пролиферации, представляющего собой сумму S+G₂ (ИП).

Судя по результатам анализа (табл.3), при сочетании ЦФ и цАМФ скорость пролиферации уменьшается в 3,7 раза по отношению к таковой при введении только ЦФ. Достоверно снижается и индекс пролиферации, отражающий сумму долей популяции лимфоцитов в фазах S и G.

Таким образом, можно констатировать, что при сравнительно большем объеме опухоли после введения ЦФ в лимфоцитах крови подопытных животных значительно страдают энергетические и пластические ресурсы, компенсируемые усилением скорости и индекса пролиферации, т.е. стимуляцией диплоидного цикла.

Таблица 3 Пролиферативная активность лимфоцитов крови крыс с С-45 поздних сроков развития после проведения химиотерапии (ЦФ) с использованием цАМФ Группы животных Скорость пролиферации (S) Индекс пролиферации (S+G₂) I основная группа (ЦФ+цАМФ), n=15 0,27±0,03** 0,53±0,13* II группа сравнения (ЦФ), n=15 0,97±0,22 0,99±0,20 Примечание. Достоверные статистические различия между I и II группой: * - по индексу пролиферации (р<0,05); ** - по скорости пролиферации (р<0,05).

Введение цАМФ, как регулятора клеточного метаболизма, достоверно снижает напряжение пролиферативных процессов лимфоцитов и увеличивает наработку макроэргических субстратов и дыхание митохондрий, обеспечивая выполнение их специфических функций.

Помимо исследования некоторых параметров клеточного гомеостаза в доказательную базу вошли данные по состоянию общих адаптационных реакций. До введения препаратов в обеих группах животных с исходно большими объемами опухолей были идентифицированы разные типы реакций: тренировка (45%), спокойная (10%), повышенная (5%) активация и стресс (40%). После окончания 4-кратного введения ЦФ ситуация в контрольной группе существенно изменилась и доминирующим типом стал хронический стресс (92%), а коэффициент соотношения антистрессорных реакций и стресса (К^AC/_С) снизился до 0,1, т.е. в 15 раз. Относительное содержание лимфоцитов в формуле крови при этом было $$\overline{x}=\mathrm{20,8}\%$$ . В структуре адаптационных реакций у крыс с цАМФ уменьшилось не только количество случаев выявления стресса до 12%, т.е. в 7,7 раза, но и его глубина, что отражал уровень лимфоцитов - $$\overline{x}=\mathrm{28,2}\%$$ . При этом К^AC/_С увеличился до 7,3 (Р<0,001), что указывало на высокое антистрессорное влияние цАМФ.

Кроме того, определение тестов интоксикации по Яблучанскому и Каль-Каифу свидетельствовало о повышении до уровня значений, соответствующих норме, на момент окончания лечения в группе при сочетании ЦФ и цАМФ до 50%, а при введении только ЦФ обнаруживались единичные значения этих показателей - в сумме 16,7%.

Технико-экономическая эффективность «Способа лечения злокачественных опухолей в эксперименте» заключается в том, что добавление в схему противоопухолевого лечения одного из ведущих регуляторов клеточного метаболизма - цАМФ - способствует реализации механизмов защиты, в первую очередь - клеточных систем энергообеспечения, программы клеточной пролиферации, дезинтоксикационных систем, смягчению стресса более высоких уровней реактивности, что отражает повышение неспецифической противоопухолевой резистентности, усиление действия цитостатиков при опухолях поздних сроков развития.

Использование данного способа имеет ряд преимуществ: наличие лабораторно-клинических параллелей в изменениях организма при экспериментальных опухолях поздних сроков развития и местно-распространенных процессах различной локализации у людей с сопутствующей патологией и системными нарушениями гомеостаза, а также простота, отсутствие противопоказаний, доступность применения цАМФ, как фактора клеточной регуляции, не только при химиотерапии, но и других видах противоопухолевого лечения для достижения ингибирования системного действия опухоли, обратимости нарушений патологических процессов и повышения противоопухолевой резистентности.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для изучения вопросов ингибирования злокачественного процесса. Изобретение заключается в том, что белым беспородным крысам с перевивной саркомой 45, по достижению объема опухоли около 3 см³, производят внутрибрюшинное введение циклофосфана в дозе 50 мг/кг на 1-е, 5-е, 10-е и 15-е сутки эксперимента между 15 и 16 часами. В сочетании с этим производят ежедневное интрагастральное введение раствора циклического аденозин-3'-5'-монофосфата в дозе 0,01 мг три раза в день с интервалом в 2 часа, начиная с 10 часов утра. Способ обеспечивает повышение неспецифической противоопухолевой резистентности, усиление действия цитостатика на опухоль поздних сроков развития, ингибирование системного действия опухоли, в частности, в специфических условиях проведения эксперимента. 3 табл.

Способ лечения злокачественных опухолей в эксперименте, включающий химиотерапию, отличающийся тем, что белым беспородным крысам с перевивной саркомой 45 по достижению объема опухоли около 3 см³ производят внутрибрюшинное введение циклофосфана в дозе 50 мг/кг на 1-е, 5-е, 10-е и 15-е сутки эксперимента между 15 и 16 ч и в сочетании с этим производят ежедневное интрагастральное введение раствора циклического аденозин-3'-5'-монофосфата в дозе 0,01 мг три раза в день с интервалом в 2 ч, начиная с 10 ч утра.