КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ГЕПАТОПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2013 года по МПК A61K38/06 A61P1/16 

Изобретение относится к химико-фамацевтической промышленности для получения средств, обладающих гепатопротективной активностью.

По данным Всемирной организации здравоохранения количество больных с различными видами гепатобилиарной патологии на планете превышает 2 миллиарда человек (Мировая статистика здравоохранения, 2010). Более 50% россиян страдают нарушениями работы печени, причем каждый четвертый имеет ожирение органа, а в 25% случаев в хронических заболеваниях печени виновно злоупотребление алкоголем (данные Всероссийского эпидемиологического исследования).

Как известно, фармакотерапия - основной метод лечения заболеваний печени, причем при различной ее патологии необходим длительный прием препаратов-гепатопротекторов (В.Т.Ивашкин и соавт. 2003. Федеральное руководство по использованию лекарственных средств, 2010). Эффективный гепатопротектор - препарат, который, действуя на основные звенья патогенеза многих заболеваний печени, способен максимально восстановить поврежденные гепатоциты (структуру и функцию), ускорить рост здоровых клеток, предотвратить развитие фиброза и защитить гепатоциты в дальнейшем от воздействия повреждающих факторов. В результате нормализуются многочисленные функции печени (улучшается липидный и белковый обмен и др.).

Сегодня гепатопротекторы с успехом применяют для патогенетической терапии острых, хронических (персистирующего, активного) гепатитов, цирроза печени и жирового гепатоза токсической, лекарственной и алкогольной этиологии (А.И.Венгеровский и соавт., 2005. Федеральное руководство по использованию лекарственных средств, 2010).

Поэтому разработка новых эффективных методов лекарственного лечения и профилактики заболеваний печени - актуальная проблема современной фармакологии и клинической медицины.

Известен гепатопротектор адеметионин (гептрал), оказывающий холеретическое, холекинетическое и антиоксидантное действие, донатор метальных групп, обеспечивающий окислительно-восстановительный механизм клеточной детоксикации. Его широко применяют при лечении различных заболеваний печени (токсические поражения печени, алкогольный стеатоз, хронический гепатит, цирроз печени и др.). Однако препарат имеет и довольно широкий спектр побочных действий, что ограничивает его применение (Федеральное руководство по использованию лекарственных средств, 2010).

Исходя из изложенного возникает необходимость изыскания новых средств, в том числе и пептидной природы.

Задачей настоящего изобретения является получение средства пептидной природы, обладающего гепатопротективной активностью.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала лекарственных средств, обладающих гепатопротективной активностью с низким уровнем токсичности и не имеющих побочных действий.

Поставленная задача решена следующим образом.

Предложена композиция, облададающая гепатопротективной активностью, которая состоит из смеси пептидов H-Lys-Asp-Glu-OH, Н-Asp-Glu-Pro-OH и H-Asp-Glu-Leu-OH, взятых в весовом соотношении (1-8):(1-8):(1-8).

Предложено также применение вышеуказанной композиция для получения лекарственного средства, обладающего гепатопротективной активностью, при этом средство может быть выполнено в виде таблетки, при этом таблетки могут быть подъязычные, пролонгированного действия и покрыты оболочкой; или в виде капсул; или в виде спрея назального или и капель назальных; или в виде аэрозоля подъязычного или орального; или в виде порошка; или в виде раствора для внутривенного и внутримышечного введения; или в виде лиофилизата для приготовления раствора; или в виде капель для приема внутрь.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез пептидов

Получение трипептида лизил-асппартил-глутаминовой кислоты (Н-Lys-Asp-Glu-OH).

Z-Lys (Z)-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)₂: 19 г (30 ммоль) Boc-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)₂ растворяли в 200 мл TFA, через час упаривали, остаток растворяли в 500 мл сухого DMF и прибавляли порциями Na₂CO₃ до прекращения выделения CO₂. Осадок отфильтровывали, промывали 100 мл DMF, прибавляли 3.33 мл (30 ммоль) N-метилморфолина и 15.36 г (30 ммоль) Z-Lys(Z)-ONSu и оставляли при комнатной температуре на 15 часов. Реакционную смесь упаривали, образовавшийся сиропообразный остаток растворяли в 300 мл этилацетата и промывали последовательно: 2% серной кислотой, водой до нейтральной реакции 5% раствором соды и снова водой. Этилацетат упаривали и к маслообразному остатку прибавляли 500 мл изопропилового спирта, выдерживали 2 часа при +4°С, осадок отфильтровывали, промывали изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Выход 21.6 г (90%) продукта.

H-Lys-Asp-Glu-OH: 21.6 г (27 ммоль) соединения Z-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)₂, полученного, как описано выше, растворяют при нагревании в 0.5 л ледяной уксусной кислоты, добавляют 50 мл воды и гидрируют в присутствии 5 г палладиевого катализатора. Катализатор отфильтровывают и растворители упаривают. Кристаллизуют из смеси уксусная кислота-этанол. При необходимости продукт очищают ионообменной хроматографией на колонке с SP-сефадексом, наносят в воде, смывают 0.04 М пиридин-ацетатным буфером (рН 5.4). Фракции, содержащие искомое соединение, упаривают. Сиропообразный остаток растворяют в 300 мл воды, упаривают до половины объема, обрабатывают активированным углем и лиофилизируют. Получают 8.95 г (85%). Чистота продукта по данным ВЭЖХ более 95%.

В спектре ПМР:

Lys - 3.76 (α -СН); 1.72 (β -СН₂); 1.36, 1.52 (γ - СН₂); 2.74 (ε -СН₂); 8.11 (NH₂)

Asp - 4.63 (α -СН); 2.71, 2.54 (β -СН₂); 8.68 (NH)

Glu - 4.19(α -СН); 1.98, 1.78 (β-СН₂); 2.28 (γ -СН₂); 8.31 (NH)

Получение трипептида аспартил-глутамил-пролина (H-Asp-Glu-Pro-OH)

Z-Asp(OBu^t)-GIu(OBu^t)-OH · DCHA: 25.3 г (100 ммоль) H-Glu(OBu^t)-OH растворяли (суспендировали) в метаноле, добавляли 50 мл 40% Triton В в метаноле и после полного растворения упаривали в вакууме. Остаток растворяли в 300 мл диметилформамида, упаривали на четверть и прибавляли 42.0 г (100 ммоль) Z-Asp(OBu^t)-ONSu. Через 12 часов (контроль - ТСХ в системе хлороформ: метанол: уксусная кислота - 9:1:0.5 «Б») реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в этилацетате, промывали последовательно 2% серной кислотой, водой, сушили над Na₂SO₄, упаривали. Остаток растворяли в 150 мл эфира, прибавляли 20 мл (100 ммоль) дициклогексиламина и оставляли при комнатной температуре до полного выпадения осадка. Осадок отфильтровывали, промывали эфиром, высушивали на воздухе. Выход 60 г (87%) хроматографически однородного вещества.

H-Asp-Glu-Pro-OH. 28 г (40 ммоль) Z-Asp(OBu^t)-GlU(OBu^t)-OH · DCHA суспендировали в 500 мл этилацетата, промывали 2% серной кислотой, водой, сушили над Na₂SO₄, осушитель отфильтровывали, фильтрат упаривали, остаток растворяли в 150 мл диметилформамида, охлаждали до -25°С, к охлажденному раствору добавляли 4.4 мл (40 ммоль) N-метилморфолина и 5.2 мл (40 ммоль) изо-бутилхлорформиата, выдерживали при -20°С в течение 15 минут и добавляли охлажденный до -25°С раствор 5.6 г (44 ммоль) N-гидроксисукцинимида 25°С в 50 мл диметилформамида. Через 30 минут добавляли раствор 10.6 г (44 ммоль) H-Pro-OBzl · HCl и 5 мл N-метилморфолина в 50 мл диметилформамида и оставляли при комнатной температуре на ночь. Далее реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в этилацетате и промывали обычным способом. Этилацетат упаривали, остаток упаривали с толуолом. Образовавшееся масло растворяли в TFA, выдерживали в течение часа, упаривали, остаток обрабатывали смесью эфир - гексан 1:1, выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре смесью эфир - гексан 1:1 гексаном, сушили в эксикаторе над щелочью.

Полученный продукт растворяли в смеси этанол - вода - уксусная кислота (600:100:100) и гидрировали над 5% Pd/С. Катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали. Остаток переосаждали из уксусной кислоты изопропиловым спиртом, фильтровали, промывали на фильтре изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Выход 12.2 г (85%). Чистота по данным ВЭЖХ более 95%.

В спектре ПМР:

Asp - 4.13 (α -СН); 2.79, 2.66 (β -СН₂); 8.14 (NH₂)

Glu - 4.59 (α -СН); 1.93, 1.72 (β -СН₂); 2.36 (γ -СН₂); 8.67 (NH).

Pro - 4.23 (α -CH); 2.14, 1.84 (β-СН₂); 1.90 (γ -СН₂); 3.63 (δ -СН₂).

Получение трипептида аспартил-глутамил-лейцина (H-Asp-Glu-Leu-OH)

Boc-Glu(Bzl)-Leu-OBzl: К раствору 26.6 г (78 ммоль) Boc-Glu(Bzl)-OH в 200 мл диметилформамида и 8.65 мл N-метилморфолина, охлажденному до -15 С, прибавляли 10.4 мл (80 ммоль) изобутилхлорформиата смесь перемешивали при этой температуре 20 минут и прибавляли охлажденный до -15 С раствор 30.5 г (78 ммоль) H-Leu-OBzl*Tos, рН которого предварительно был доведен до 8.5-9.0. Через час растворители упаривали, остаток растворяли в 500 мл этилацетата и промывали последовательно 400 мл 2% раствором серной кислоты, водой, 5% раствором соды и водой. Органический слой отделяли и этилацетат упаривали. Остаток кристаллизовали из смеси эфир-гексан (1:1). Получили 37.8 г (90%) хроматографически однородного вещества.

Boc-Asp(Bzl)-Glu(Bzl)-Leu-OBzl: 27 г (50 ммоль) Boc-Glu(Bzl)-Leu-OBzl растворяли в 100 мл хлороформа и к полученному раствору прибавляли 100 л трифторуксусной кислоты. Смесь выдерживали при комнатной температуре 2 часа и растворители упаривали. Остаток растворяли в 200 мл диметилформамида и порциями прибавляли соду до окончания выделения CO₂. Осадок отфильтровывали, промывали 50 мл диметилформамида, в фильтрате выводили рН до 8.5 и охлаждали до -20°С (раствор 1).

Одновременно к раствору 16.5 г (50 ммоль) Boc-Asp(Bzl)-OH в 100 мл диметилформамида прибавляли 5.6 мл N-метилморфолина, смесь охлаждали до -20°С и приливали 6.5 мл (50 ммоль) изобутилхлорформиата. Смесь выдерживали при этой температуре 30 минут (раствор 2).

Сохраняя охлаждение, оба раствора смешивали и оставляли перемешиваться до достижения комнатной температуры (примерно 2 часа). Растворители упаривали, остаток растворяли в 300 мл этилацетата и последовательно промывали 2% раствором серной кислоты, водой, 5% раствором соды, водой и растворитель упаривали. После кристаллизации из эфира получили 32.4 г (87%) хроматографически однородного вещества.

14.9 г (20 ммоль) защищенного трипептида Boc-Asp (Bzl)-Glu(Bzl)-Leu(Bzl) растворяли в 50 мл хророформа и к полученному раствору прибавляли 50 мл трифторуксусной кислоты. Смесь выдерживали 1 час при комнатной температуре и растворители упаривали. Остаток растворяли в 300 мл 80% уксусной кислоты и гидрировали над 5% Pd/C при комнатной температуре. После окончания реакции катализатор отфильтровывли, промывали на фильтре уксусной кислотой и растворители упаривали. К остатку приливали 200 мл изопропилового спирта. Выпавший осадок отфильтровывали, сушили в вакууме над КОН. Получили 7 г (93%) продукта с чистотой по данным ВЭЖХ более 95%.

В спектре ПМР:

Asp - 4.13 (α -СН); 2.81, 2.65 (β -СН₂); 8.15 (NH₂)

Glu - 4.34 (α -СН); 1.94, 1.80 (β -СН₂); 2.30 (γ -СН₂); 8.58 (NH)

Leu - 4.19 (α -СН); 1.52 (β -СН₂); 1.53, 1.62 (γ -СН₂); 0.83 (δ -СН₃); 0.89 (δ -СН3); 8.22 (NH).

Пример 2. Получение композиции

В реактор, снабженный якорной мешалкой, наливают 8 л воды для инъекций. Затем открывают вентиль для подачи в реактор стерильного азота и барботируют воду в течение 5 минут. После этого в реактор последовательно загружают по 30 г субстанции каждого из пептидов, входящих в композицию, при постоянном перемешивании и барботаже раствора азотом. Перемешивание ведут до полного растворения (в случае необходимости к раствору могут быть добавлены вспомогательные вещества). Полученный раствор доводят до объема 10 л водой для инъекций и пропускают через стерилизующий фильтр. В асептических условиях осуществляют розлив в сосуды и раствор лиофилизируют. Таким образом получают субстанцию композиции, готовую для получения лекарственных форм.

Пример 3. Получение лекарственных форм композиции

5 г субстанции растворяют при перемешивании и барботаже азотом в 1 л воды для инъекций. Проводят стерилизующую фильтрацию полученного раствора и в асептических условиях осуществляют под азотом его розлив в ампулы емкостью 2 мл по 1 мл в ампулу. Заполненные ампулы запаивают под азотом.

В другом варианте кассеты с ампулами помещают в сублимационную камеру, где замораживают до температуры минус 40°С со скоростью замораживания 5-10°С/ч, а затем подвергают высушиванию в вакууме. Ампулы с полученной сухой лиофилизированной формой препарата запаивают под азотом.

Пример 4. Изучение токсичности пептидной композиции

Общее токсическое действие пептидной композиции проверяли в соответствии с требованиями («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005)) острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой токсичности.

Исследования острой токсичности проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 210-260 г. Препарат вводили животным однократно в дозах 0.6 мг/кг, 3 мг/кг и 6 мг/кг в стерильном физиологическом растворе. Животным контрольной группы вводили физраствор в том же объеме.

Исследование подострой токсичности проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 210-260 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат в дозах 600 мкг/кг и 3 мг/кг. Животным контрольной группы вводили тот же объем физиологического раствора. До введения препарата и на 30, 60 и 90 сутки после начала эксперимента у животных исследовали показатели крови. Определяли количество эритроцитов, гемоглобина, тромбоцитов, ретикулоцитов, лейкоцитов и скорость осаждения эритроцитов. Кроме того, определяли общее содержание белка по методу Лоури и состав электролитов.

При изучении острой токсичности показано, что однократное введение исследуемой композиции в дозе 6 мг/кг (превышение предполагаемой терапевтической дозы в 10 раз) не вызывает токсических реакций.

Изучение подострой токсичности также не выявило побочных эффектов при длительном применении препарата.

Пример 5. Исследование биологической активности новой композиции

Исследования выполнены на белых нелинейных крысах-самцах массой 210-260 г по методикам, описанным в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005).

У крыс моделировали острый токсический гепатит подкожным введением тетрахлорметана (CCl₄, четыреххлористый углерод; по 4 мл/кг 50% масляного раствора) в течение 4 суток. Как известно, CCl₄ - классический гепатотропный яд, который широко используют в эксперименте для моделирования острого токсического гепатита; он, в частности, вызывает интенсивное перекисное (пероксидное) окисление липидов (ПОЛ) бислоя клеточных мембран гепатоцитов (А.С.Саратиков, А.И.Венгеровский, 1995; А.И.Венгеровский и соавт., 2005).

В подопытных группах животным вводили внутрибрюшинно (в/б) новую смесь пептидов (пептидая композиция; в дозах 100 и 600 мкг/кг), а также препарат сравнения гептрал (адеметионин, лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного и внутримышечного введения; Hospira S.p.A., Италия) за 1 час до введения CCl₄ 1 раз в сутки в течение 7 суток.

В контрольной группе крысы получали в/б только изотонический раствор натрия хлорида (NaCl) в эквиобъемном количестве.

Забор печени для морфологического (светооптического) исследования и крови для биохимического анализа производили как до, так и на 5-е, 7-е и 10-е сутки исследования.

Забор печени для морфологического (светооптического) исследования и крови для биохимического анализа производили как до, так и на 8-е и 10-е сутки исследования.

В гепаринизированной плазме крови крыс определяли (с учетом рекомендаций В.В.Меньшикова /ред./, 1987):

- активность аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы оптимизированным УФ-методом Международной федерации клинической химии и лабораторной медицины (IFCC);

- активность щелочной фосфатазы - кинетическим оптимизированным стандартным методом Германского общества клинической химии (DGKC);

- активность α-амилазы - энзиматическим кинетическим тестом (субстрат EPS-G7);

- концентрацию общего белка измеряли биуретовым методом;

- концентрацию альбумина - фотометрическим тестом с бромкрезоловым зеленым;

- содержание мочевины - уреазным кинетическим УФ-методом;

- концентрацию креатинина - кинетическим тестом Яффе без депротеинизации;

- содержание холестерина и триглицеридов - энзиматическими колориметрическими методами.

Все вышеперечисленные показатели определяли с помощью стандартных коммерческих наборов реагентов фирмы "DiaSys" (Германия).

Концентрацию общего и непрямого (свободного) билирубина измеряли по методу Йендрашика-Грофа наборами реагентов фирмы "Эко-сервис" (РФ).

Измерения проводили на биохимическом анализаторе "Targa ВТ 3000" (Biotecnica Instruments, Италия).

Определение концентрации продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и оснований Шиффа) и витаминов-антиоксидантов (ретинола и α-токоферола) проводили по УФ-поглощению гексановых и метанольных экстрактов (О.Е.Колесова, А.А.Маркин, 1985). Измерения проводили на спектрофлуориметре "Hitachi 650-60" (Япония) и спектрофотометре "Beckman DU-7" (США).

Осуществляли забор кусочков печени для морфологического исследования, которое проводили стандартными методами световой микроскопии. Для светооптического исследования кусочки печени фиксировали 10% нейтральным формалином, затем приготовленные гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином и проводили микроскопическое исследование.

Исследование гепатопротекторного действия пептидной композиции на модели острого токсического гепатита, вызванного тетрахлорметаном (CCl₄, четыреххлористый углерод)

Было установлено, что в контрольной группе гепатотоксин CCl₄ (подкожное введение по 4 мл/кг в течение 4 суток) вызывал гибель 22% (7 крыс из 32) животных (табл.1). Пептидная композиция в дозе 100 мкг/кг достоверно не уменьшала летальности крыс, а в дозе 600 мкг/кг значимо (р<0,005) снижала ее до 0%.

Препарат сравнения гепатопротектор гептрал в дозе 100 мг/кг уменьшал летальность животных до 15%, но недостоверно (р>0,005).

По выраженности действия в отношении летальности композиция (600 мкг/кг) значимо превосходила гептрал (100 мг/кг) на 15% (р<0,05).

Таблица 1 Изменение летальности крыс с токсическим CCl₄-гепатитом под влиянием пептидной композиции и препарата сравнения гепатопротектора гептрала Вещество Число крыс Летальность, % Контроль 32 22 ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (100 мкг/кг) 20 20 ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (600 мкг/кг) 29 0^*# Гептрал (100 мг/кг) 27 15 Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем и гептралом соответственно (точный метод Фишера): * или ^# - р<0,05.

Установлено, что у животных контрольной группы ССl₄ вызывал на 5-10-е сутки исследования развитие синдрома эндогенной интоксикации, в том числе гиперферментемии. Так, например, на 5-е сутки активность α-амилазы в плазме крови значимо (р<0,001) увеличивалась в 1,3 раза по сравнению с группой интактных крыс и на 10-е сутки превышала исходный уровень (здесь и далее имеется в виду уровень у интактных животных) в 1,1 раза (р<0,001) (табл.2).

Пептидная композиция в дозе 100 мкг/кг достоверно не изменяла активность α-амилазы в плазме крови, а в дозе 600 мкг/кг, начиная с 5-х суток исследования, значимо (р<0,05) уменьшала этот показатель в 1,1-1,2 раза.

Препарат сравнения гептрал в дозе 100 мг/кг на 5-7-е сутки достоверно не влиял на активность α-амилазы, значимо (р<0,05) уменьшая ее лишь на 10-е сутки в 1,2 раза. По выраженности действия в отношении активности α-амилазы плазмы крови пептидная композиция (600 мкг/кг) значимо превосходила гептрал (100 мг/кг) на 7-10-е сутки в 1,1 раза (р<0,05).

Выявлено, что у животных контрольной группы CCl₄ вызывал на 5-10-е сутки исследования развитие синдрома цитолиза. Так, например, на 5-е сутки активность в плазме крови аминотрансфераз - аспартатаминотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) - значительно увеличивалась в 5,0 и 4,2 раза (р<0,001) соответственно по сравнению с группой интактных крыс, причем и на 10-е сутки она превышала исходный уровень в 2,3 и 1,5 раза соответственно (р<0,001) (табл.2).

Пептидная композиция в дозе 100 мкг/кг достоверно не изменяла активность ACT и АЛТ в плазме крови, а в дозе 600 мкг/кг с 5-х суток исследования значимо (р<0,001) уменьшала этот показатель в 1,3-2,3 и 1,5-1,8 раза соответственно, снижая его к 10-м суткам до исходного уровня.

Препарат сравнения гептрал в дозе 100 мг/кг также с 5-х суток исследования значимо (р<0,001) уменьшал активность ACT и АЛТ в 1,2-2,3 и 1,3-1,9 раза соответственно, также снижая ее к 10-м суткам практически до исходного уровня.

По выраженности действия в отношении активности ACT и АЛТ плазмы крови пептидная композиция (600 мкг/кг) значимо превосходила гептрал (100 мг/кг) на 5-е сутки в 1,1 и 1,2 раза соответственно (р<0,05).

Обнаружено, что у животных контрольной группы ССl₄ вызывал на 5-10-е сутки исследования развитие синдрома холестаза. Так, например, на 5-е сутки активность щелочной фосфатазы (ЩФ - основной показатель синдрома холестаза) в плазме крови значимо (р<0,001) увеличивалась в 2,4 раза по сравнению с группой интактных крыс и на 10-е сутки превышала исходный уровень в 1,3 раза (р<0,001) (табл.2).

Пептидная композиция в дозе 100 мкг/кг достоверно не изменяла активность ЩФ в плазме крови, а в дозе 600 мкг/кг с 5-х суток исследования значимо (р<0,001) уменьшала этот показатель в 1,4-1,6 раза, снижая его к 10-м суткам до исходного уровня.

Препарат сравнения гептрал в дозе 100 мг/кг также с 5-х суток исследования значимо (р<0,001) уменьшал активность ЩФ в 1,3-1,4 раза, также снижая ее к 10-м суткам до исходного уровня.

По выраженности действия в отношении активности ЩФ плазмы крови композиция (600 мкг/кг) значимо превосходила гептрал (100 мг/кг) на 5-7-е сутки в 1,2 раза (р<0,05).

Из других показателей синдрома холестаза в плазме крови также наблюдалось увеличение содержания общего и непрямого (свободного) билирубина (табл.3). Так, например, на 5-е сутки концентрация общего и непрямого билирубина в плазме значимо (р<0,001) увеличивалась в 2,5 и 3,5 раза соответственно по сравнению с группой интактных крыс и на 10-е сутки превышала исходный уровень в 1,5 и 1,9 раза соответственно (р<0,001).

Пептидная композиция в дозе 100 мкг/кг достоверно не изменяла содержание общего и непрямого билирубина в плазме крови, а в дозе 600 мкг/кг с 5-х суток исследования значимо (р<0,001) уменьшала этот показатель в 1,5-1,9 и 1,8-2,6 раза соответственно.

Препарат сравнения гептрал в дозе 100 мг/кг также с 5-х суток исследования значимо (р<0,001) уменьшал содержание общего и непрямого билирубина в 1,4-1,6 и 1,7-1,8 раза соответственно.

По выраженности действия в отношении содержания общего и непрямого билирубина плазмы крови пептидная композиция (600 мкг/кг) значимо превосходила гептрал (100 мг/кг) на 10-е сутки в 1,3 и 1,6 раза соответственно (р<0,05).

Таблица 3 Динамика других биохимических показателей крови у крыс с токсическим ССl₄-гепатитом под влиянием пептидной композиции и препарата сравнения гепатопротектора гептрала Показатель Интактные крысы Сутки исследования Серия 5-е (n=8) 7-е (n=8) 10-е (n=8) Общий белок, г/л 76,6±1,3 (n=24) 58,0±1,4^ooo 67,1±1,4^ooo 73,9±1,7 Контроль 60,9±1,0^ooo 69,2±1,0^o 73,0±1,6 ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (100 мкг/кг) 68,7±1,9^***# 72,8±1,5^*# 75,6±1,3 ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (600 мкг/кг) 64,2±0,8^* 68,4±1,4 72,2±1,6 Гептрал (100 мг/кг) Альбумины, г/л 42,8±0,8 (n=24) 34,7±1,1^ooo 36,9±1,2^ooo 39,7±1,0^o Контроль 37,6±0,9^ooo 38,3±1,3^o 39,0±1,1^o ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (100 мкг/кг) 39,4±1,2^* 41,4±1,0* 41,8±0,6 ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (600 мкг/кг) 38,6±0,7* 39,0±1,2 40,0±1,1 Гептрал (100 мг/кг) Общий холестерин (ХС), мМ/л 2,21±0,08 (n=26) 1,18±0,11^ooo 1,32±0,12^ooo 2,14±0,11 Контроль 1,20±0,10^ooo 1,32±0,11^ooo 2,11±0,12 ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (100 мкг/кг) 1,72±0,06^***# 2,21±0,13***# 2,62±0,24 ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (600 мкг/кг) 1,48±0,08^* 1,85±0,10^* 2,20±0,19 Гептрал (100 мг/кг) Триглицериды (ТГ), мМ/л 1,70±0,09 (n=26) 0,34±0,03^ooo 0,46±0,04^ooo 1,53±0,10 Контроль 0,41±0,03^ooo 0,50±0,02^ooo 1,62±0,19 ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (100 мкг/кг) 0,60±0,06^* 0,92±0,10^**# 1,97±0,10^* ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (600 мкг/кг) 0,52±0,03^* 0,68±0,04* 1,68±0,09 Гептрал (100 мг/кг) Билирубин общий, мкМ/л 6,2±0,1 (n=25) 15,7±0,3^ooo 12,2±0,4^ooo 9,3±0,2^ooo Контроль 13,9±0,9^ooo 10,5±0,7^ooo 6,7±0,5^* ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (100 мкг/кг) 9,8±0,4^*** 7,9±0,3^*** 4,8±0,2^***## ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (600 мкг/кг) 10,1±0,6^*** 8,6±0,5^*** 6,0±0,3^*** Гептрал (100 мг/кг) Билирубин непрямой, мкМ/л 1,81±0,01 (n=25) 6,28±0,34^ooo 5,12±0,31⁰⁰⁰ 3,41±0,29^ooo Контроль 5,71±0,29^ooo 4,41±0,19^ooo 2,68±0,17^ooo ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (100 мкг/кг)     3,44±0,14^*** 2,72±0,12^*** 1,29±0,03^***## ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (600 мкг/кг) 3,51±0,17^*** 2,98±0,11^*** 2,03±0,08^*** Гептрал (100 мг/кг) Мочевина, мМ/л 8,2±0,1 (n=26) 20,8±2,6^ooo 14,8±0,6^ooo 9,3±0,5^o Контроль 19,3±2,4^ooo 12,4±0,8^* 8,9±0,6 ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (100 мкг/кг) 13,2±9^*# 9,5±6^***# 7,4±0,1^* ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (600 мкг/кг) 16,6±1,0 11,9±0,8^* 8,1±0,4 Гептрал (100 мг/кг) Креатинин, мкМ/л 46,8±0,2 (n=26) 100,2±8,2^ooo 71,4±1,7^ooo 60,9±1,6^ooo Контроль 97,6±8,5^ooo 66,9±1,8^ooo 59,7±1,5^ooo ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (100 мкг/кг) 62,1±1,4^*** 59,5±1,9^*** 46,3±1,1^***# ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (600 мкг/кг) 65,9±1,8^*** 63,2±1,3^** 50,1±1,0^*** Гептрал (100 мг/кг)

Было установлено, что у животных контрольной группы CCl₄ вызывал на 5-10-е сутки исследования развитие синдрома недостаточности синтетических процессов в гепатоцитах. Так, например, на 5-е сутки уровень общего белка и альбуминов в плазме крови значимо (р<0,001) снижался в 1,3 и 1,2 раза соответственно по сравнению с группой интактных крыс. На 10-е сутки концентрация общего белка достоверно не отличалась от исходной, а уровень альбуминов был значимо несколько ниже исходного в 1,1 раза (р<0,001) (табл.3).

Пептидная композиция в дозе 100 мкг/кг достоверно не изменяла содержание общего белка и альбуминов в плазме крови, а в дозе 600 мкг/кг на 5-7-е сутки исследования значимо (р<0,05) увеличивала эти показатели в 1,1-1,2 и 1,1 раза соответственно.

Препарат сравнения гептрал в дозе 100 мг/кг также только на 5-е сутки исследования значимо (р<0,05) повышал уровень общего белка и альбуминов в 1,1 раза, а на 7-10-е сутки достоверно не влиял на этот показатель.

По выраженности действия пептидная композиция (600 мкг/кг) значимо превосходила гептрал (100 мг/кг) только в отношении повышения уровня общего белка плазмы крови на 5-7-е сутки в 1,1 раза (р<0,05).

Также в плазме крови наблюдалось снижение содержания общего холестерина (холестерола; ХС) и триглицеридов (триацилглицеролов; ТГ) (табл.3). Так, например, на 5-е сутки уровень общего ХС и ТГ в плазме значимо (р<0,001) снижался в 1,9 и 5,0 раза соответственно по сравнению с группой интактных крыс. На 10-е сутки концентрация общего ХС и ТГ достоверно не отличалась от исходной (табл.3).

Пептидная композиция в дозе 100 мкг/кг достоверно не изменяла содержание общего ХС (холестерин) и ТГ (триглицериды) в плазме крови, а в дозе 600 мкг/кг на 5-7-е сутки исследования значимо увеличивала эти показатели в 1,5-1,7 (р<0,001) и 1,8-2,0 раза (р<0,05) соответственно, повышая концентрацию общего ХС к 7-м суткам до исходного уровня, а ТГ - к 10-м.

Препарат сравнения гептрал в дозе 100 мг/кг на 5-7-е сутки исследования значимо (р<0,05) повышал уровень общего ХС и ТГ в 1,3-1,4 и 1,5 раза соответственно, повышая их содержание до исходного уровня к 10-м суткам.

По выраженности действия в отношении содержания общего ХС плазмы крови пептидная композиция (600 мкг/кг) значимо (р<0,05) превосходила гептрал (100 мг/кг) на 5-7-е сутки в 1,2 раза, а в отношении содержания ТГ - только на 7-е в 1,4 раза.

Было обнаружено, что в плазме крови отмечается повышение содержания мочевины (главный конечный продукт обмена белков, синтезируемый в печени) и креатинина (табл.3). Так, например, на 5-е сутки уровень мочевины и креатинина в плазме значимо (р<0,001) увеличивался в 2,5 и 2,1 раза соответственно по сравнению с группой интактных крыс.На 10-е сутки концентрация мочевины и креатинина превышала исходный уровень в 1,1 (р<0,05) и 1,3 раза (р<0,001) соответственно (табл.3).

Пептидная композиция в дозе 100 мкг/кг достоверно не изменяла содержание креатинина в плазме крови, а уровень мочевины значимо (р<0,05) уменьшала только на 7-е сутки в 1,2 раза, в дозе 600 мкг/кг с 5-х суток исследования значимо снижала эти показатели в 1,3-1,6 (р<0,05) и 1,2-1,6 раза (р<0,001) соответственно.

Препарат сравнения гептрал в дозе 100 мг/кг только на 7-е сутки исследования значимо (р<0,05) понижал уровень мочевины в 1,2 раза, а содержание креатинина, начиная с 5-х суток, в 1,2-1,5 раза (р<0,01).

По выраженности действия в отношении содержания мочевины плазмы крови пептидная композиция (600 мкг/кг) значимо (р<0,05) превосходила гептрал (100 мг/кг) на 5-7-е сутки в 1,3 раза, а в отношении содержания креатинина - только на 10-е в 1,1 раза.

Данные о динамике показателей перекисного (пероксидного) окисления липидов (ПОЛ) и отражающие состояние системы эндогенной антиоксидантной защиты (по изучению таких антиоксидантов, как витамины α-токоферол /витамин Е/ и ретинол /витамин А/) представлены в табл.4. Из нее видно, что в плазме крови крыс контрольной группы отмечалось (за счет воздействия CCl₄) значительное повышение содержания диеновых конъюгатов /ДК/, появляющихся на начальных этапах ПОЛ (табл.4). Так, на 5-е сутки концентрация ДК в плазме значимо (р<0,001) увеличивалась в 4,2 раза по сравнению с группой интактных крыс, а на 10-е сутки возвращалось к исходному уровню (табл.4).

Пептидная композиция в дозе 100 мкг/кг достоверно не влияла на уровень ДК. Композиция в дозе 600 мкг/кг с 5-х суток исследования значимо (р<0,001) уменьшала содержание ДК в 1,5-3,2 раза.

Препарат сравнения гептрал в дозе 100 мг/кг также значимо (р<0,001) уменьшал уровень ДК в 1,5-3,2 раза.

По выраженности действия в отношении содержания ДК плазмы крови пептидная композиция (600 мкг/кг) значимо превосходила гептрал (100 мг/кг) на 5-7-е сутки в 1,2-1,7 раза (р<0,05).

Также в плазме крови наблюдалось значительное повышение содержания оснований Шиффа - вторичных продуктов взаимодействия N-концевых остатков белков, аминокислот и аминогрупп фосфолипидов с альдегидами, возникающими в ходе реакций ПОЛ (табл.4). Так, например, на 5-е сутки концентрация оснований Шиффа в плазме крови значимо (р<0,001) увеличивалась в 6,5 раза по сравнению с группой интактных крыс и на 10-е сутки превышала исходный уровень в 1,2 раза (р<0,001) (табл.4).

Пептидная композиция в дозе 100 мкг/кг на 5-е сутки достоверно не влияла на уровень оснований Шиффа, а на 7-е сутки значимо (р<0,05) уменьшала этот показатель в 1,2 раза. Композиция в дозе 600 мкг/кг с 5-х суток исследования значимо (р<0,001) уменьшала содержание оснований Шиффа в 1,4-2,8 раза.

Препарат сравнения гептрал в дозе 100 мг/кг значимо (р<0,01) уменьшал уровень оснований Шиффа в 1,3-2,0 раза.

По выраженности действия в отношении содержания оснований Шиффа плазмы крови пептидная композиция (600 мкг/кг) значимо превосходила гептрал (100 мг/кг) на 5-7-е сутки в 1,1-1,4 раза (р<0,001).

Таблица 4 Динамика некоторых показателей перекисного (пероксидного) окисления липидов (ПОЛ) в крови крыс с токсическим CCl₄-гепатитом под влиянием пептидной композиции и препарата сравнения гепатопротектора гептрала Показатель Интактные крысы Сутки исследования Серия 5-е (n=8) 7-е (n=8) 10-е (n=8) Диеновые конъюгаты (ДК), отн. ед. 0,51±0,01 (n=22) 2,15±0,08^ooo 1,08±0,06^ooo 0,55±0,02 Контроль 1,95±0,10^ooo 0,97±0,09^ooo 0,44±0,05 ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (100 мкг/кг) 1,45±0,07^***# 0,42±0,05^***### 0,17±0,01^*** ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (600 мкг/кг) 1,75±0,08^** 0,73±0,04^*** 0,17±0,02^*** Гептрал (100 мг/кг) Основания Шиффа, отн. ед. 20,2±0,3 (n=22) 131,8±4,2^ooo 122,8±2,6^ooo 24,6±1,0^ooo Контроль 118,5±5,8^ooo 106,2±4,9^* 22,8±1,7 ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (100 мкг/кг) 96,3±3,9^***### 43,6±1,4^***### 15,2±0,7^*** ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ (600 мкг/кг) 104,1±5,7^** 60,1±2,2^*** 15,9±0,8^*** Гептрал (100 мг/кг)

Итак, наблюдаемая у животных контрольной группы динамика содержания ДК и оснований Шиффа свидетельствует о выраженных деструктивных свободнорадикальных процессах окисления фосфолипидов мембран гепатоцитов. Следует подчеркнуть, что пептидная композиция (600 мкг/кг) способна существенно ослаблять выраженность этих процессов.

Таким образом, гепатотоксин CCl₄ вызывает у крыс острый токсический гепатит с воспалительной деструкцией печени (что подтверждается данными морфологических исследований), о чем свидетельствует цитолиз гепатоцитов и нарушение основных функций печени (синтетической и др.), также отмечается холестаз (увеличение активности ЩФ, содержания свободной фракции билирубина, общего билирубина).

Пептидная композиция (600 мкг/кг) и гептрал (100 мг/кг), оказывая гепатопротекторное действие, нормализуют большинство биохимических показателей, отражающих различные функции печени (ACT, АЛТ, ЩФ, общий белок, альбумины, общий ХС, ТГ), степень энзимной токсемии (α-амилаза), уровень ПОЛ (содержание ДК и оснований Шиффа) на 7-10 сутки. При этом по эффективности пептидная композиция (600 мкг/кг) превосходит или не уступает препарату сравнения гепатопротектору гептралу.

Морфологическое подтверждение

Результаты приведенных выше биохимических исследований подтверждаются данными морфологических исследований печени у крыс.

На 5-10-е сутки у всех животных контрольной группы наблюдается характерная картина: сначала отмечается крупноклеточная жировая дистрофия гепатоцитов, локализующаяся центролобулярно и охватывающая значительную часть клеток, а затем патологические изменения в гепатоцитах усиливаются, что выражается в жировой дегенерации клеток и их гидропической дистрофии. Происходит разрастание соединительнотканного каркаса. Реактивное воспаление переходит в фазу пролиферации, что находит отражение в отсутствии инфильтрата и утолщении соединительной ткани вокруг сосудов. В гепатоцитах - гидропическая дистрофия и глыбчатый распад. Ядра многих гепатоцитов пикнотичны, что свидетельствует о необратимости патологических изменений и начинающейся гибели клеток.

В группе животных, получавших препарат сравнения гепатопротектор гептрал, во всех случаях отмечается патология гепатоцитов (жировая инфильтрация), но ее масштаб меньше, чем в контрольной группе. Гидропическая дистрофия гепатоцитов отмечена чаще, чем в контроле, лизиса гепатоцитов не наблюдалось. Структура печени во всех случаях не отличается от интактного органа за исключением утолщения междольковой соединительной ткани. Происходит умеренное разрастание соединительнотканного каркаса, но оно менее выражено, чем в контрольной группе. Можно сделать вывод о хорошем (точнее, умеренном) гепатопротекторном действии гептрала, вызывающего нормализацию структуры печени после ее повреждения CCl₄.

В печени группы животных, получавших пептидную композицию в дозе 100 мкг/кг, наблюдаются сходные патологические изменения: выраженная крупнокапельная жировая дистрофия, распространяющаяся от центра дольки к периферии, по масштабу сравнимая с контрольной группой и больше, чем в группе, получавшей гептрал. Патологические изменения сопровождаются инфильтрацией клетками соединительной ткани, выраженной меньше, чем в контрольной группе, но больше, чем в группе, получавшей гептрал. Нередко к этому присоединяется гиперплазия эпителия протоков. Нормализация выражена хуже, чем в группе с гептралом. Усиленное развитие соединительнотканного каркаса выражается в появлении большего, чем в контроле, количества соединительнотканных клеток и скоплений мелкоклеточного базофильного инфильтрата, но количество соединительнотканных волокон в данной группе не возрастает по сравнению с контролем, хотя и превышает таковое в группе с гептралом. Следовательно, пептидная композиция в дозе 100 мкг/кг вызывает определенное уменьшение выраженности патологических процессов в гепатоцитах, хотя и в меньшем степени, чем гептрал, т.е. оказывает слабое (незначительное) гепатопротекторное действие.

В группе животных, получавших пептидную композицию в дозе 600 мкг/кг, происходит значительное уменьшение выраженности патологических изменений гепатоцитов по сравнению с контрольной группой, по масштабу сравнимое с группой гептрала. Сосудистые реакции более выражены, чем в названных группах, гиперплазия соединительнотканного каркаса выражена несколько больше, чем в группе с гептралом, но значительно меньше, чем в контроле. Пролиферация эпителия протоков выражена лучше, чем в группах сравнения.

Таким образом, на основании анализа морфологических изменений, происходящих в ткани печени и непосредственно в гепатоцитах, а также динамики основных биохимических показателей крови, отражающих явления синдромов цитолиза и холестаза, активации процессов ПОЛ и снижения активности антиоксидантной системы организма, можно сделать заключение, что композиция (600 мкг/кг) оказывает благоприятное влияние на модели острого токсического гепатита у животных. Действие пептидной композиции (600 мкг/кг) проявляется, в частности, снижением гиперферментемии, ингибированием ПОЛ, улучшением состояния антиоксидантной системы, в уменьшении выраженности поражения на уровне гепатоцитов, ускорении процессов регенерации клеток и активации их метаболизма. Эти данные свидетельствуют об эффективности композиции в качестве гепатопротекторного средства на модели острого токсического поражения печени. При этом по эффективности композиция (600 мкг/кг) превосходит или не уступает препарату сравнения гепатопротектору гептралу (100 мг/кг).

Надо особо подчеркнуть, что действие пептидной композиции наступает раньше на 5-7 сутки, тогда как препарат сравнения - гептрал наиболее эффективен только на 10 сутки. Это может иметь большое значение при терапии в случаях острых поражений печени.

ЛИТЕРАТУРА

1. Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков А.С. Методические указания по изучению гепатозащитной активности фармакологических веществ. // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ /Под редакцией Р.У.Хабриева - М., 2005. - С.683-691.

2. Ивашкин В.Т. Болезни печени и желчевыводящих путей. - М., 2002. - 416 с.

3. Ивашкин В.Т., Лапина Т.Л., Баранская Е.К. Рациональная фармакотерапия заболеваний органов пищеварения. - 2003. - М.: «Литтерра». - 1045 с.

4. Ивашкин В.Т., Уланова И.М. Преждевременная смертность в Российской Федерации и пути ее снижения. // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. - 2006. - Т.16, №1. - С.8-14.

5. Колесова О.Е., Маркин А.А. Перекисное окисление липидов и методы определения продуктов липопероксидации в биологических средах. // Лабораторное дело. 1985. - №1. С.540-546.

6. Меньшиков В.В. (ред.). Лабораторные методы исследования в клинике: справочник. - М., 1987. - 368 с.

7. Мировая статистика здравоохранения, 2010 год. Всемирная организация здравоохранения, 2010 г. - 177 с.

8. Саратиков А.С., Венгеровский А.И. Новые гепатопротекторы природного происхождения. // Экспер. и клин. фармакол. - 1995. - Т.58, №1. - С.8-11.

9. Смольякова В.И., Плотников М.Б., Чернышева Г.А. и др. Гемореологические эффекты тиофана при поражении печени тетрахлорметаном. // Экспер. и клин. фармакол. - 2010. - Т.73, №8. - С.32-34.

10. Федеральное руководство по использованию лекарственных средств (формулярная система). Выпуск XI // Под редакцией А.Г.Чучалина, Ю.Б.Белоусова, В.В.Яснецова - М.: «Эхо», 2010. - 944 с.

Изобретение относится к медицине и касается средств, обладающих гепатопротективной активностью. Предложена композиция, облададающая гепатопротективной активностью, которая состоит из смеси пептидов H-Lys-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-Pro-OH и H-Asp-Glu-Leu-OH, взятых в весовом соотношении (1-8):(1-8):(1-8). Предложено также применение вышеуказанной композиции для получения лекарственного средства, обладающего гепатопротективной активностью. Изобретение обеспечивает расширение арсенала лекарственных средств, обладающих гепатопротективной активностью с низким уровнем токсичности и не имеющих побочных действий. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 пр., 4 табл.

1. Композиция, обладающая гепатопротективной активностью, состоит из смеси пептидов H-Lys-Asp-Glu-OH, H-Asp-Glu-Pro-OH и H-Asp-Glu-Leu-ОН, взятых в весовом отношении (1-8):(1-8):(1-8).

2. Применение композиции по п.1, для получения лекарственного средства, обладающего гепатопротективной активностью.

3. Применение по п.2, где средство выполнено в виде таблетки, при этом таблетки могут быть подъязычные, пролонгированного действия и покрыты оболочкой, или в виде капсул, или в виде спрея назального, или капель назальных, или в виде аэрозоля подъязычного или орального, или в виде порошка, или в виде раствора для внутривенного и внутримышечного введения, или в виде лиофилизата для приготовления раствора, или в виде капель для приема внутрь.