ПЕПТИД, СТИМУЛИРУЮЩИЙ РЕГЕНЕРАЦИЮ ТКАНИ ПЕЧЕНИ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2007 года по МПК A61K38/06 A61P1/16 

Изобретение относится к лекарственным средствам для лечения заболеваний печени и может быть использовано как средство, стимулирующее регенерацию ткани печени.

В настоящее время известны препараты, улучшающие метаболические процессы в печени, к которым относятся природные антиоксиданты, в частности витамины группы В (B₁, В₆, B₁₂), аскорбиновая кислота, витамин Е, витамин А; препараты из лекарственных растений - Лив-52 (Большая Российская Энциклопедия лекарственных средств, М.: Издательство Ремедиум, т.2, 2002, с.435). Известны средства, улучшающие обмен веществ в клетках печени, среди которых следует отметить силибинин (Большая Российская Энциклопедия лекарственных средств, М.: Издательство Ремедиум, т.2, 2002, с.719); сирепар (Большая Российская энциклопедия лекарственных средств, М.: Издательство Ремедиум, т.2 2002, с.722); эссенциале (патент Франции №2556050); а также синтетические пептидные препараты (патент РФ №2166957, 2000 г.).

Известные средства обладают только однонаправленным действием, а именно - улучшают метаболические процессы в печени и повышают ее устойчивость к патогенным воздействиям.

Необходимо отметить, что препараты, направленные на регенерацию гепатоцитов, в уровне техники не обнаружены.

В связи с этим актуальна разработка новых групп препаратов, в том числе биологически активных пептидных соединений, обладающих свойством регенерировать ткань печени.

Структурных аналогов, представленных в уровне техники, предлагаемый пептид не имеет.

Настоящим изобретением поставлена и решена задача получения пептида, стимулирующего регенерацию ткани печени и фармацевтической композиции, содержащей этот пептид в качестве активного начала, а также способа ее применения.

Технический результат изобретения заключается в создании пептида, обладающего биологической активностью, проявляющейся в стимулировании регенерации ткани печени, а также фармацевтической композиции, содержащей этот пептид в качестве активного начала, использование которой стимулирует регенерацию ткани печени за счет восстановления синтеза тканеспецифических белков и нормализации функций клеток печени.

Для решения поставленной задачи и достижения указанного технического результата предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Одним из объектов предложенной группы изобретений является фармацевтическая композиция, стимулирующая регенерацию ткани печени, содержащая в качестве активного начала эффективное количество пептида глутамил-аспартил-лейцин общей формулы: H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] и фармацевтически приемлемый носитель. При этом фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для парентерального введения.

Другой аспект настоящего изобретения касается пептида глутамил-аспартил-лейцин общей формулы: H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1].

Обнаружено, что пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы: H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1], обладает способностью стимулировать регенерацию ткани печени. Предлагается применение пептида глутамил-аспартил-лейцин общей формулы: H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] для приготовления лекарственного средства, стимулирующего регенерацию ткани печени.

Следующий аспект настоящего изобретения касается способа стимуляции регенерации ткани печени, заключающегося во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы: H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела, по крайней мере, один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. При этом введение осуществляют парентерально.

Пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы: H-Glu-Asp-Leu-OH получают классическим методом пептидного синтеза в растворе.

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, которые содержат сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.

Стимулирующее действие пептида H-Glu-Asp-Leu-OH на регенерацию ткани печени выявлено при его экспериментальном изучении.

Изучение биологической активности проводили на эксплантатах печени, в экспериментальных моделях частичной гепатэктомии и цирроза печени.

Понятие "фармацевтическая композиция", подразумевает различные лекарственные формы, содержащие пептид H-Glu-Asp-Leu-OH, которые могут найти лечебное применение в медицине в качестве средства, стимулирующего регенерацию ткани печени.

Для получения фармацевтических композиций, отвечающих изобретению, эффективное количество пептида H-Glu-Asp-Leu-OH, как активное начало, смешивают с фармацевтически приемлемым носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования.

Понятие "эффективное количество" подразумевает использование такого количества активного начала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.

Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, желаемой для введения в организм.

Для парентерального введения носитель обычно включает физиологический раствор или стерильную воду, хотя могут быть включены другие ингредиенты, способствующие стабильности, или для сохранения стерильности.

Сущность изобретения поясняется чертежом и таблицами.

На чертеже показано влияние пептида H-Glu-Asp-Leu-OH на развитие эксплантатов печени.

В Таблице 1 представлено влияние пептида H-Glu-Asp-Leu-OH на число делящихся клеток в регенерирующей печени крыс через 32 и 96 часов после частичной гепатэктомии (% от общего числа клеток печени).

В Таблице 2 представлено влияние пептида H-Glu-Asp-Leu-OH на биохимические показатели крови у крыс с экспериментальным циррозом печени.

В Таблице 3 представлено влияние пептида H-Glu-Asp-Leu-OH на содержание суммарного гликогена (усл.ед.) в печени крыс с экспериментальным циррозом печени.

В Таблице 4 представлено влияние пептида H-Glu-Asp-Leu-OH на морфологические и биохимические показатели периферической крови морских свинок при изучении токсичности.

В Таблице 5 представлено влияние пептида H-Glu-Asp-Leu-OH на биохимические показатели периферической крови больных хроническим гепатитом.

Изобретение иллюстрируется примером синтеза пептида глутамил-аспартил-лейцин общей формулы: (H-Glu-Asp-Leu-OH) (пример 1), примерами испытания биологической активности пептида (примеры 2, 3, 4), примером изучения токсичности (пример 5), а также примером результатов клинического применения пептида, демонстрирующим его фармакологические свойства и подтверждающим возможность достижения лечебного эффекта (пример 6).

Пример 1. Синтез пептида H-Glu-Asp-Leu-OH

1. Название соединения: глутамил-аспартил-лейцин.

2. Структурная формула:

H-Glu-Asp-Leu-OH

3. Брутто-формула без противоиона: C₁₅H₂₅N₃O₇.

4. Молекулярный вес без противоиона: 375,37.

5. Противоион: ацетат.

6. Внешний вид: белый аморфный порошок без запаха.

7. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме:

ВОС - трет.бутилоксикарбонильная группа,

OSu - N-оксисукцинимидный эфир,

DCC - N,N'-дициклогексилкарбодиимид,

OBzl - бензиловый эфир,

TFA - трифторуксусная кислота.

6. Характеристики готового препарата:

- содержание основного вещества: 98,15% (по ВЭЖХ, 220 нм),

- ТСХ - индивидуален, R_f=0,65 (ацетонитрил-вода 1:3),

- содержание влаги: 6%,

- рН 0,001% раствора: 4,57,

- удельное оптическое вращение: [α]_D ²²:-30° (с=1, Н₂О), "Polamat A", Carl Zeiss Jena.

Пример синтеза:

1) BOC-Glu(OBzl)-OSu, N-оксисукцинимидный эфир N-трет.бутилоксикарбонил-(γ-бензил)глутаминовой кислоты (I).

N-трет.бутилоксикарбонил-(γ-бензил)глутаминовую кислоту BOC-Glu(OBzl)-OH (33,7 г, 0,1 моль) растворяли в 50 мл N,N'-диметилформамида, охлаждали до температуры -10°С, добавляли при перемешивании охлажденные (4-6°С) растворы N,N'-дициклогексилкарбодиимида (23,0 г, 0,11 моль) в 30 мл N,N'-диметилформамида и N-гидроксисукцинимида (13,0 г, 0,11 моль) в 20 мл N,N'-диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали в течение 12 ч при охлаждении льдом и далее в течение 1 суток при комнатной температуре. Выпавшую N,N'-дициклогексилмочевину отфильтровывали и полученный раствор активированного эфира использовали без выделения на следующей стадии.

2) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH, N-трет.бутилоксикарбонил-(γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартат (II).

(β-Бензил)аспарагиновую кислоту H-Asp(OBzl)-OH (28,0 г, 0,12 моль) и 36 мл (0,12 моль) триэтиламина суспендировали в 50 мл N,N'-диметилформамида и перемешивали в течение 1 ч. Затем добавляли порциями раствор активированного эфира ВОС-Glu(OBzl)-OSu (I), полученный на предыдущей стадии. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 суток. Затем подкисляли 0,5 н серной кислотой до рН 2-3 и экстрагировали этилацетатом 4×50 мл. Вытяжки объединяли и последовательно промывали 0,5 н H₂SO₄ 3×50 мл, водой 2×50 мл, 5% раствором NaHCO₃ 2×50 мл, водой 2×50 мл, насыщенным раствором NaCl 2×50 мл. Органический слой сушили над Na₂SO₄, упаривали растворитель в вакууме, остаток кристаллизовали под гексаном. Получено 50 г продукта (92%).

R_f=0,34 (бензол-ацетон 2:1).

3) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu-OBzl, бензиловый эфир N-трет.бутилоксикар-бонил-(γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартиллейцина (III).

Дипептид BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (II) (1,20 г, 2,2 ммоль) и N-оксибензотриазол (0,4 г, 3 ммоль) растворяли в 5 мл тетрагидрофурана и охлаждали до температуры -10°С. К суспензии Tos·H-Leu-OBzl (1,38 г, 3,5 ммоль) в 5 мл тетрагидрофурана добавляли 0,5 мл (3,5 ммоль) триэтиламина и тоже охлаждали. N,N'-дициклогексилкарбодиимид (0,62 г, 3,0 ммоль) растворяли в 5 мл тетрагидрофурана и охлаждали. Охлажденные растворы объединяли и в течение 1 суток перемешивали при охлаждении льдом. Выпавшую N,N-дициклогексилмочевину отфильтровывали, растворитель упаривали в вакууме. Остаток растворяли в 50 мл этилацетата и последовательно промывали 0,5 н Н₂SO₄ 2×520 мл, водой 2×20 мл, 5% раствором NaHCO₃ 2×20 мл, водой 2×20 мл, насыщенным раствором NaCl 2×20 мл. Органический слой сушили над Na₂SO₄, упаривали растворитель в вакууме, остаток кристаллизовали под гексаном. Перекристаллизация из изопропилового спирта. Получено 0,97 г продукта (68%). R_f=0,88 (бензол-ацетон 1:1).

4) H-GIu-Asp-Leu-OH, глутамил-аспартил-лейцин.

Защищенный трипептид BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu-OBzl (III) (0,90 г) растворяли в смеси метиловый спирт-вода (4:1) и гидрировали над катализатором Pd/C (5%) в течение 4 ч. Катализатор отфильтровывали, растворитель упаривали в вакууме, остаток сушили в вакууме над КОН и Р₂O₅. Далее продукт растворяли в 2 мл смеси хлористый метилен-трифтор-уксусная кислота (5:1) и выдерживали при комнатной температуре в течение 2 ч. Полноту прохождения реакции деблокирования контролировали по ТСХ в системе ацетонитрил-вода (1:3). Растворитель упаривали в вакууме, остаток сушили в вакууме над КОН.

Для очистки 300 мг препарата растворяли в 4 мл 0,01% трифторуксусной кислоты и подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой 50×250 мм Diasorb-130-C16T, 7mkm. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module. Условия хроматографирования: А: 0,1% TFA; В: MeCN/0,l% TFA, градиент В 0→50% за 100 мин. Объем пробы 5 мл, детекция при 215 нм, сканирование 190-600 нм, скорость потока 10 мл/мин. Отбирали фракцию 47,0-54,0 мин. Растворитель упаривали в вакууме при температуре не выше 40°С, упаривание многократно (5 раз) повторяли с 10 мл 10% раствора уксусной кислоты. Окончательно остаток растворяли в 20 мл деионизованной воды и лиофилизовывали.

Получено 196 мг очищенного препарата в виде аморфного белого порошка без запаха.

5) Анализ готового препарата.

- Содержание основного вещества определяли методом ВЭЖХ на колонке Phenomenex С 18 LUNA 4,6×150 mm. A: 0,1% TFA, В: MeCN; grad.B 0-100% in 10 min. Скорость потока 1 мл/ мин. Детекция при 220 нм, сканирование 190-600 нм, проба 20μ1. Содержание основного вещества 98,15%.

- ТСХ: индивидуален, R_f=0,65 (ацетонитрил-вода 1:3, пластинки ПТСХ-П-В-УФ Sorbfil, силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин).

- Содержание влаги: 6% (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при 100°С).

- рН 0,001% раствора: 4,57 (потенциометрически).

- Удельное оптическое вращение: [α]_D ²²:-30° (с=1, H₂O), "Polamat A", Carl Zeiss Jena.

Пример 2. Влияние пептида H-Glu-Asp-Leu-ОН на развитие эксплантатов печени

Эксперименты проведены на 27 фрагментах печени крыс линии "Wistar" с массой тела 150-200 г. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты печени помещали в эту среду и культивировали в чашках Петри в термостате при температуре 36,7°С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли пептид H-Glu-Asp-Leu-OH в концентрациях 1,10 и 100 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента печени. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.

На чертеже показано влияние пептида H-Glu-Asp-Leu-OH на развитие эксплантатов печени.

Установлено, что через 1 сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке и начиналось выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток по периферии эксплантата. На 3-и сутки культивирования при концентрации пептида H-Glu-Asp-Leu-OH 10 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 28%, по сравнению с контрольными значениями ИП. При исследовании эксплантатов печени на более длительных сроках культивирования (7 дней) было выявлено аналогичное стимулирующее действие пептида H-Glu-Asp-Leu-OH в той же концентрации.

Таким образом, в отношении ткани печени пептид H-Glu-Asp-Leu-OH оказывает тканеспецифическое действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов.

Пример 3. Влияние пептида H-Glu-Asp-Leu-OH на компенсаторную регенерацию печени после частичной гепатэктомии у крыс

Исследование проведено на 18 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150-200 г.

Животные были разделены на 3 группы: 1 группа - здоровые животные, 2 группа - контроль (крысы, которым была произведена частичная гепатэктомия с удалением 2/3 печени), 3 группа - прооперированные животные, которым затем вводили подкожно через 2 и 24 часа после операции по 0,1 мкг пептида H-Glu-Asp-Leu-OH на крысу в 0,5 мл стерильного 0,9% физиологического раствора NaCl. В эти же сроки животным 1-й и 2-й групп вводили стерильный физиологический раствор в том же объеме.

Прооперированные крысы были умерщвлены эфиром через 32 и 96 часов после операции. В это же время забивали и крыс контрольной группы. Печень крыс фиксировали в формалине. После окраски препаратов гематоксилин-эозином, определяли митотический индекс в клетках печени, а также количество полиплоидных клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла (количество делящихся клеток).

Изучение митотической активности клеток регенерирующей печени через 32 часа после частичной гепатэктомии показало, что число митозов и клеток в S-фазе клеточного цикла становится в два раза больше, чем в печени здоровых животных. Эти отличия недостоверны в случае введения физиологического раствора, тогда как после инъекций пептида H-Glu-Asp-Leu-OH увеличение количества митозов, клеток, синтезирующих ДНК, и общей суммы делящихся клеток становится достоверным (Таблица 1).

При изучении препаратов печени через 96 часов после гепатэктомии оказалось, что и у крыс, получавших физиологический раствор, и у крыс, получавших пептид H-Glu-Asp-Leu-OH, наблюдается значительное усиление митотической активности гепатоцитов. При сравнении данных подопытной (третьей) и контрольной (второй) групп выяснилось, что у крыс, которым вводили пептид H-Glu-Asp-Leu-OH, наблюдается количество митозов, в два раза большее, чем у крыс, получавших физиологический раствор. Количество клеток, находящихся в S-фазе митотического цикла, у крыс подопытной группы не отличалось достоверно от количества гепатоцитов в S-фазе в контрольной группе, хотя в целом количество делящихся клеток через 96 часов после гепатэктомии в регенерирующей печени крыс с введением пептида H-Glu-Asp-Leu-OH было на 75% больше, чем у крыс после введения физиологического раствора (Таблица 1).

Таким образом, установлено, что при введении крысам пептида H-Glu-Asp-Leu-OH через 96 часов после частичной гепатэктомии наблюдается усиление митотической активности гепатоцитов, свидетельствующее об ускорении репаративных процессов в печени.

Пример 4. Эффективность применения пептида H-Glu-Asp-Leu-OH у крыс с экспериментальным циррозом печени

В работе использовали 45 белых беспородных крыс-самцов, масса которых в начале опыта составляла 120-180 г. Животных подвергали ингаляционному воздействию четыреххлористого углерода (CCl₄) в течение 6 месяцев. Половине животных вводили внутримышечно пептид H-Glu-Asp-Leu-OH по 0,5 мкг на крысу в 0,5 мл стерильного физиологического 0,9% раствора NaCl ежемесячно курсами по 5 последовательных дней. Животные контрольной группы получали инъекции стерильного физиологического раствора по аналогичной схеме.

Состояние печени у животных оценивали по данным биохимического анализа, определяя концентрацию белка, билирубина, холестерина, аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (ACT).

Содержание суммарного гликогена в гепатоцитах определяли цитофлуориметрически в препаратах-мазках после проведения флуоресцентной PAS-реакции.

Содержание гликогена является одним из важнейших индикаторов функциональной активности гепатоцитов. Известно, что цирроз печени характеризуется существенными нарушениями гликогенообразовательной функции гепатоцитов.

В результате проведенных исследований было установлено, что у животных после воздействия CCl₄ развивались выраженные нарушения в печени. Наблюдалось уменьшение содержания общего белка, уровня билирубина и холестерина. Резко возрастала активность аминотрансфераз (Таблица 2).

При одновременном введении CCl₄ и пептида H-Glu-Asp-Leu-OH биохимические показатели восстанавливались до нормальных значений и свидетельствовали о менее выраженной деструкции печени, чем у животных контрольной группы (Таблица 2).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что пептид H-Glu-Asp-Leu-OH ограничивает развитие патологического процесса в печени. Он уменьшает ферментемию, ограничивает признаки гепатоцеллюлярной недостаточности и тромбогеморрагического синдрома, увеличивая очаги регенерации в печени.

На фоне воздействия гепатотропным ядом содержание суммарного гликогена в гепатоцитах увеличивается в среднем в 2,5 раза (Таблица 3).

Установлено, что после применения пептида H-Glu-Asp-Leu-OH повышенное содержание гликогена снижается практически до нормы.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о положительном действии пептида H-Glu-Asp-Leu-OH на гликогенообразовательную функцию гепатоцитов цирротически измененной печени, а также о восстановлении метаболической состоятельности ткани печени.

Пример 5. Изучение токсичности пептида H-Glu-Asp-Leu-OH

Общетоксическое действие пептида H-Glu-Asp-Leu-OH исследовали в соответствии с требованиями "Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" (2000): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении пептида.

Исследование по изучению острой токсичности проведено на 66 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-22 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор NaCl.

Исследования по изучению под острой токсичности проведено на 55 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 140-180 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мкг/кг, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9% раствор NaCl. До введения препарата на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.

Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата на 88 морских свинках-самцах с массой тела 260-300 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно пептид в течение 6 мес. в дозах 1 мкг/кг, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9% раствор NaCl в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли: количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинно-мозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.

При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого пептида животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.

Изучение подострой и хронической токсичности пептида свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 100-1000 раз. При исследовании влияния пептида на морфологический состав крови морских свинок не установлено достоверного изменения морфологических и биохимических показателей периферической крови морских свинок (Таблица 4).

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.

Отсутствие общетоксического действия позволяет рекомендовать фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного начала пептид Н-Glu-Asp-Leu-OH, для проведения клинических испытаний.

Пример 6. Эффективность применения пептида H-Glu-Asp-Leu-OH у больных хроническим гепатитом

Исследование проведено на 34 больных хроническим гепатитом в возрасте от 30 до 56 лет, которых разделили на 2 группы методом рандомизации

Больных основной группы разделили на 3 подгруппы в зависимости от стадии заболевания. Пациентам, страдающим хроническим гепатитом в стадии обострения, при тяжелом состоянии вводили фармацевтическую композицию, содержащую пептид Н-Glu-Asp-Leu-OH, в дозе 5,0 мг в 1,0 мл стерильного 0,9% физиологического раствора внутримышечно однократно ежедневно в течение 10 дней, а пациентам в стадии обострения при состоянии средней степени тяжести - в дозе 10,0 мкг в 1,0 мл стерильного 0,9% физиологического раствора внутримышечно однократно ежедневно в течение 10 дней. Больным хроническим гепатитом в стадии ремиссии вводили фармацевтическую композицию, содержащую пептид H-Glu-Asp-Leu-OH, в дозе 1,0 мкг в 1,0 мл стерильного 0,9% физиологического раствора внутримышечно однократно ежедневно в течение 10 дней.

Контрольная группа состояла из 15 аналогичных больных, которым назначалось общепринятое лечение.

В динамике оценивали жалобы больных и биохимические показатели крови.

На фоне проводимого лечения 89% больных основной группы отмечали исчезновение слабости, повышение аппетита и работоспособности, у 53% больных значительно снизилась интенсивность болевого синдрома.

При проведении обследования больных наиболее значительное внимание уделялось оценке результатов биохимических исследований, характеризующих аминотрансферазную активность, пигментную и белковообразовательную функции печени.

У 81% обследованных больных отмечались гипербилирубинемия и повышение уровня аланинаминотрансферазы (АЛТ), что свидетельствует об определенной активности хронического воспалительного процесса.

Применение фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Leu-ОН в разных дозировках, способствовало нормализации уровня билирубина и активности АЛТ (Таблица 5), что свидетельствует о нормализации метаболических процессов в печени, снижении активности воспалительного процесса и восстановлении синтеза тканеспецифических белков клетками печени.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о свойстве фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Leu-OH, стимулировать регенерацию ткани печени. Кроме того, результаты исследований подтверждают целесообразность применения фармацевтической композиции, содержащей пептид Н-Glu-Asp-Leu-OH, в комплексном лечении хронического гепатита в фазе обострения и ремиссии.

Таблица 1Группа животныхСрок исследованияМитотический индекс% клеток, находящихся в фазе синтеза ДНКОбщее количество делящихся клетокЗдоровые животные + физ. раствор-0,682±0,0131,752±0,4633,403±0,498Контроль (частичная гепатэктомия + физ. раствор)32 чДо0,431±0,0191,043±0,1271,474±0,143 После1,364±0,5952,063±0,4743,427±1,066 96 чДо0,417±0,0530,924±0,0911,342±0,060 После2,012±0,146*3,417±0,295*5,429±0,388*Частичная гепатэктомия + пептид H-Glu-Asp-Leu-ОН32 чДо0,449±0,0650,872±0,1011,321±0,156После2,316±0,451**3,885±0,838**6,197±1,274**96 чДо0,296±0,0850,984±0,1391,278±0,125После4,850±0,336*&4,667±1,312**9,513±1,608*#* - Р<0,001 по сравнению с показателями до операции;** - Р<0,05 по сравнению с показателями до операции;& - Р<0,001 по сравнению с показателями у животных контрольной группы;# - Р<0,05 по сравнению с показателями у животных контрольной группы.

Таблица 2ПоказательЗдоровые животныеКонтрольПептид H-Glu-Asp-Leu-OHБелок, г/л85,5±4,274,2±2,1*84,4±3,4**Общий билирубин, мкмоль/л13,4±1,39,2±1,1*14,7±3,2**Холестерин, мм/л4,5±0,33,1±0,3*4,3±0,32**АЛТ, мЕ/мл6,1±1,19,2±1,2*5,7±0,78**ACT, мЕ/мл12,7±2,118,2±1,3*12,3±1,9*** - Р<0,05 по сравнению с показателем у здоровых животных;** - Р<0,05 по сравнению с показателем в соответствующей контрольной группе.Таблица 3Здоровые животныеКонтроль (воздействие CCl₄)Воздействие CCl₄+ пептид H-Glu-Asp-Leu-OH3,85±0,18,21±0,3*3,65±0,1*** - Р<0,05 по сравнению с показателем у здоровых животных;** - Р<0,05 по сравнению с показателем у животных контрольной группы.

Таблица 4ПоказательВведение пептида H-Glu-Asp-Leu-OH (1 мкг/кг) 3 месяца6 месяцев Контроль (n=24)Пептид (n=24)Контроль (n=24)Пептид (n=24)Эритроциты, ×10¹²/л5,3±0,65,4±0,15,4±0,35,3±0,3Гемоглобин, г/л14,2±1,414,5±0,914,5±1,314,1±1,5Ретикулоциты, %1,3±0,071,1±0,051,1±0,051,2±0,04Тромбоциты, ×10⁹/л143,7±7,9144,9±4,8144,5±8,6143,5±6,4Лейкоциты, ×10⁹/л9,4±0,59,9±0,69,6±0,510,8±0,3Нейтрофилы палочкоядерные, %0,31±0,040,29±0,060,33±0,040,31±0,02Нейтрофилы сегментоядерные, %45,8±2,145,7±3,146,2±3,545,4±2,6Эозинофилы, %0,69±0,050,72±0,080,72±0,040,67±0,06Базофилы, %0,61±0,040,64±0,030,72±0,030,67±0,04Моноциты, %2,5±0,022,6±0,042,6±0,062,4±0,07Лимфоциты, %48,9±2,550,2±1,951,3±2,749,9±1,8СОЭ, мм/ч1,69±0,051,64±0,032,01±0,051,87±0,07Резистентность эритроцитов, % NaCl    - максимальная0,41±0,020,40±0,010,40±0,070,43±0,05- минимальная0,32±0,050,29±0,050,33±0,030,31±0,07Общий белок в сыворотке крови, г/л72,9±3,172,6±3,373,1±3,471,6±2,8Натрий в сыворотке крови, ммоль/л153,9±5,7154,8±6,8155,5±6,2152,8±4,9Калий в сыворотке крови, моль/л5,1±2,35,3±1,85,2±2,15,2±1,9

Таблица 5Показатель (ммоль/л)До леченияПосле лечения общепринятыми средствамиПосле лечения с применением пептида H-Glu-Asp-Leu-OHХолестерин5,1±0,55,2±0,25,2±0,2Билирубин27,4±1,722,3±1,1*18,6±1,4*#ACT40,3±3,239,8±2,739,5±2,3АЛТ54,5±4,946,2±3,841,7±2,9*Триглицериды2,3±0,42,4±0,22,4±0,3* - Р<0,05 по сравнению с показателем до лечения.# - Р<0,05 по сравнению с показателями после лечения общепринятыми средствами

Группа изобретений относится к лекарственным средствам для лечения заболеваний печени. Предлагается фармацевтическая композиция, стимулирующая регенерацию ткани печени, содержащая в качестве активного начала эффективное количество пептида глутамил-аспартил-лейцин общей формулы: H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] и фармацевтически приемлемый носитель. Предлагается пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы: H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1], стимулирующий регенерацию ткани печени. Предлагается способ стимуляции регенерации ткани печени, заключающийся во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы: H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела, по крайней мере, один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. Изобретение обеспечивает создание пептида, обладающего биологической активностью, проявляющейся в стимулировании регенерации ткани печени, а также фармацевтической композиции, содержащей этот пептид в качестве активного начала, использование которой стимулирует регенерацию ткани печени за счет восстановления синтеза тканеспецифических белков и нормализации функций клеток печени. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 табл., 1 ил.

1. Фармацевтическая композиция, стимулирующая регенерацию ткани печени, характеризующаяся тем, что содержит в качестве активного начала эффективное количество пептида глутамил-аспартил-лейцин общей формулы Н-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] и фармацевтически приемлемый носитель.2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что она находится в форме, подходящей для парентерального введения.3. Пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1].4. Пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1], обладающий способностью стимулировать регенерацию ткани печени.5. Пептид по п.4 для приготовления лекарственного средства, стимулирующего регенерацию ткани печени.6. Способ стимуляции регенерации ткани печени, заключающийся во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела, по крайней мере, один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.7. Способ по п.6, отличающийся тем, что введение осуществляют внутримышечно.