Пептидное соединение, восстанавливающее функцию органов дыхания и обладающее иммуномодулирующим действием Российский патент 2018 года по МПК A61K38/07 A61P11/00 

Изобретение относится к медицине, в частности, к лекарственным средствам, и может быть использовано как средство, восстанавливающее функцию органов дыхания и одновременно обладающее иммуномодулирующим действием.

В настоящее время наблюдается тенденция к росту заболеваний органов дыхания, в частности неспецифических заболеваний легких, которые занимают по распространенности третье место в мире, среди которых хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) – крайне распространенное заболевание, являющееся одной из основных причин нетрудоспособности, инвалидности, значительно снижающее качество жизни пациентов и занимающее четвертое место среди причин смерти в промышленно развитых странах. Причем актуальность этой проблемы возрастает с каждым днем: если за последние десятилетие общая смертность и смертность от сердечно–сосудистых заболеваний снижается, то смертность от ХОБЛ выросла на 28% (Айсанов З.Р., Кокосов А.Н., Овчаренко С.И.,Хмелькова Н.Г., Цой А.Н., Чучалин А.Г., Шмелев Е.И. Хронические обструктивные болезни легких. Федеральная программа// РМЖ; 2001; 1: 9–33; Болезни органов дыхания: Руководство для врачей: в 4т. Под общей ред. Н.Р. Палеева. Т.1. Общая пульмонология. М.: Медицина, 1989). Точно определить распространенность ХОБЛ затруднительно в связи с существовавшей многие годы терминологической неопределенностью. По данным некоторых исследований, этот показатель колеблется от 10% до 30%. В США ХОБЛ страдает около 14 млн. человек, в Великобритании – 900 тыс. человек, в России – 11 млн. (Дворецкий Л.И. Инфекция и хроническая обструктивная болезнь легких //Consilium Medicum. 2001; 3 (12): 587-595). По данным Всемирной организации здравоохранения отмечается тенденция к неуклонному росту смертности от данного вида патологии (NHLBI/WHO Workshop Summary: Global strategy for the diagnosis, management and prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001; Vol. 163: 1256-1270; хроническая обструктивная болезнь легких /Под ред. А. Г. Чучалина. - М.: Министерство здравоохранения, РФ Научно-исследовательский институт пульмонологии МЗ РФ, 1998).

Термин ХОБЛ появился около 30 лет назад и объединил заболевания, характеризующиеся медленно, но неуклонно прогрессирующей необратимой бронхиальной обструкцией с нарастающими явлениями хронической дыхательной недостаточности. В группу ХОБЛ входят хронический обструктивный бронхит, эмфизема легких, бронхиальная астма тяжелого течения, а в США и Великобритании также муковисцидоз, облитерирующий бронхиолит и бронхоэктатическая болезнь (Болезни органов дыхания: Руководство для врачей: в 4т. Под общей ред. Н.Р. Палеева. Т.1. Общая пульмонология. М.: Медицина, 1989).

Лечение этой патологии представляет сложную задачу. При обострении ХОБЛ ведущий этиологический фактор – инфекционный. Основными бактериальными патогенами являются H. influenzae, M. catarrhalis (значительно чаще в зимнее время года), S. Pneumoniae, Str. Aureus, а также Enterobactericae и P. аeruginosa. Важно помнить и о роли вирусов при инфекционных обострениях ХОБЛ (до 30% случаев), среди которых превалируют риновирусы, и значительно реже выявляются вирусы гриппа А и В (Seemungal T, Donaldson GC, Breuer J, Jhonston I S, Jeffries DJ, Wedzicha JA. Rinoviruses are associated with exacerbations of COPD. Eur Resp J. 1998; 12 (Suppl. 28): 298).

При лечении ХОБЛ необходим комплексный подход. Из лекарственных препаратов бронходилататоры составляют базисную терапию, поскольку именно бронхиальная обструкция играет первостепенную роль в патогенезе ХОБЛ Barnes PJ. Bronchodilators: basic pharmacology. In Calverley P, Pride N, eds. Chronic obstructive pulmonary disease. London: Chapman and Hall, 1995; 391–417). Хотя при ХОБЛ имеет место необратимая бронхообструкция, применение бронхолитиков позволяет уменьшить выраженность одышки и других симптомов ХОБЛ приблизительно у 40% больных и увеличить толерантность к физической нагрузке. В соответствии с рекомендациями GOLD выбор той или иной группы бронхолитиков (М–холинолитики, b2–агонисты и метилксантины) и их комбинаций производится для каждого конкретного пациента индивидуально, в зависимости от тяжести заболевания и особенностей его прогрессирования, характера ответа на лечение и риска побочных эффектов, а также доступности лекарственных средств. При неэффективности максимальных доз бронходилататоров применяется глюкокортикостероидная терапия, улучшающая бронхиальную проходимость у 10–30% пациентов и требующая проведения пробного лечения перед назначением на длительный прием.

Антибактериальная терапия проводится исключительно в период обострения ХОБЛ. В последнее время на первый план выступает ежегодная профилактическая вакцинация всех больных ХОБЛ противогриппозной вакциной, снижающая показатели смертности больных примерно на 50%, позволяющая уменьшить число обострений заболевания, их продолжительность и тяжесть течения, а значит, улучшить показатели бронхиальной проходимости, уменьшить число дней нетрудоспособности и улучшить качество жизни пациентов (Цой А.Н., Архипов В.В. Доказательная фармакотерапия хронической обструктивной болезни легких// Consilium Medicum. 2002; 04 (09): 486-492.;Дворецкий Л.И. Инфекция и хроническая обструктивная болезнь легких //Consilium Medicum. 2001; 3 (12): 587-595).

Для лечения ХОБЛ также широко используются муколитические средства, основной терапевтический эффект которых заключается в непосредственном разжижении патологически вязкого секрета посредством изменения состава и количества гликопротеина слизи, который секретируют клетки эпителиальной выстилки дыхательных путей. Цель муколитической терапии – уменьшение кашля и облегчение отхождения мокроты.

Известен препарат полипептидной природы (патент РФ №1681426 на изобретение "Способ получения средства, восстанавливающего дыхательную функцию легких", 1989, МПК А 61К35/24), полученный из органического сырья (трахеи животных).

Известно пептидное соединение, восстанавливающее функцию органов дыхания (патент RU2255757, МПК A61K 38/00, опубл. 10.07.2005 г.), представляющее собой тетрапептид аланил-глутамил-аспартил-лейцин общей формулы Ala-Glu-Asp-Leu [SEQ ID NO:1], обладающий биологической активностью, проявляющейся в восстановлении функции органов дыхания. Известно также фармакологическое средство пептидной природы, восстанавливающее функцию органов дыхания, содержащее активный пептидный агент и фармацевтически приемлемый носитель, в качестве активного пептидного агента использовано эффективное количество тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu [SEQ ID NO:1]. Известное соединение обладает близкой биологической активностью и является наиболее близким аналогом по химической структуре к заявляемому пептиду (следует отметить, что заявляемое новое пептидное соединение - тетрапептид Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ структурных аналогов не имеет).

Возможность использования известного соединения в качестве основы лекарственных средств для лечения и профилактики ряда пульмонологических заболеваний и восстановления функции органов дыхания ограничивается целым рядом его недостатков: быстрой биодеградацией прототипа в крови и тканях организма; слабой биодоступностью прототипа при его пероральном приеме; низкой биологической активностью прототипа. Кроме этого, известное соединение не обладает выраженными иммуномодулирующими свойствами.

Задача изобретения - получение нового биологически активного соединения пептидной природы, эффективно восстанавливающего функцию органов дыхания и обладающего иммуномодулирующими свойствами.

Технический результат от заявляемого изобретения - комплексное восстановительное действие на функцию органов дыхания, включая иммуномокоррекцию.

Технический результат достигается тетрапептидом аланил-глутамил-аспартил-лейцин амид общей формулы Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂.

Технический результат достигается также применением тетрапептида аланил-глутамил-аспартил-лейцин амид общей формулы Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂, для восстановления функции органов дыхания и иммунокоррекции.

Технический результат достигается также фармакологическим средством пептидной природы, восстанавливающим функцию органов дыхания и обладающим иммуномодулирующим действием, содержащим активный пептидный агент и фармацевтически приемлемый носитель. В отличие от прототипа в качестве активного пептидного агента содержит эффективное количество тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ в дозе 0,01-1000 мкг/кг массы тела.

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные по методикам, принятым в данной области.

Сущность изобретения поясняют иллюстрации.

Фиг. 1. Структурная формула заявляемого тетрапептида H-Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂;

Фиг. 2. Схема синтеза тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ в растворе с помощью метода смешанных ангидридов;

Фиг.3. Кинетика биодеградации тетрапептидов [³ H] Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ и [³ H] Ala-Glu-Asp-Leu в плазме крыс, обработанной гепарином;

Фиг.4. Фармакокинетические кривые тетрапептидов Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ и Ala-Glu-Asp-Leu в плазме крыс после внутривенного введения тетрапептидов в дозе 15 мг/кг;

Фиг.5. Фармакокинетические кривые тетрапептидов Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ и Ala-Glu-Asp-Leu в плазме крыс после перорального введения тетрапептидов в дозе 50 мг/кг;

Фиг.6. Принципиальная схема экспериментальной установки для моделирования ХОБЛ с помощью окуривания экспериментальных животных сигаретным дымом. На фиг.6 показано: 1 - Выхлопная труба; 2 - Кабина для животных; 3 - Распределительное устройство; 4 - Чистый воздух; 5- Всасывающий насос; 6 - Клапан №1; 7 - Клапан №2; 8 - Сигарета; 9 - Электронный блок.

Тетрапептид Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ может быть получен любыми известными способами, как с помощью различных методов синтеза в растворе, так и с использованием различных методов твердофазного синтеза. В качестве примера приведено получение этого тетрапептида в растворе с помощью метода смешанных ангидридов (фиг.2).

1. Название соединения: L-аланил-L-глутамил-L-аспартил-L-лейцин-амид

2. Структурная формула тетрапептида H-Ala-Glu-Asp-Leu- NH₂ приведена на фиг.1.

3. Брутто-формула без противоиона: C₁₈H₃₁N₅O₈

4. Молекулярный вес без противоиона: 445,48

В описании синтеза использованы следующие сокращения:

Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ - L-аланил-L-глутамил-L-аспартил-L-лейцин амид

Boc-Glu(OBzl)-OH x ДЦГА- дициклогексиламиновая соль N-карботретбутилокси-γ-(О-бензил)-глутаминовой кислоты;

Boc-Glu(OBzl)-OH- N-карботретбутилокси-γ-(О-бензил)-глутаминовая кислота;

Boc-Asp(OBzl)-OH - N- карбокситретбутилокси-β-(О-бензил)-аспарагиновая кислота;

Leu-NH₂xHCl - гидрохлорид лейцин амида;

Boc-Asp(OBzl)-Leu-NH₂ - N- карбокситретбутилокси-β-(О-бензил)-аспартил-лейцин амид;

Asp(OBzl)-Leu-NH₂ * CF₃COOH - β-(О-бензил)-аспартил-лейцин амид трифторацетат;

Boc-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu-NH₂- N-карботретбутилокси-γ-(О-бензил)-глутамил-β-(О-бензил)-аспартил-лейцин амид;

Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu-NH₂*CF₃COOH - γ-(О-бензил)-глутамил-β-(О-бензил)-аспартил-лейцин амид трифторацетат;

Z-Ala-OH- карбобензокси-аланин;

Z-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu-NH₂ - карбобензокси-аланил-γ-(О-бензил)-глутамил-β-(О-бензил)-аспартил-лейцин амид;
NMM - N-метилморфолин;

ТФУ- трифторуксусная кислота;

Pd/C - палладий на угле;

DCC - дициклогексилкарбодиимид;

HOBt-гидроксибензотриазол;

IBCF- изобутилхлорформиат;

ДЦГА-дициклогексиламин;

ДМФА-диметилформамид;

ИПС-изопропиловый спирт.

Синтез Boc -Asp (OBzl)-Leu-NH₂.

Растворяем 2,16 г (0,00667 Моля) Boc-Asp(OBzl)-OH в 10,0 мл ДМФА, охлаждаем до -25 ^оС и добавляем 0,89 мл (0,935 г, 0,00669 Моль) 98 % IBCF. После достижение температуры -25 ^оС начинаем прикапывать при перемешивании в течение 15-20 мин 0,74 мл (0,0,68 г, 0,00682Моль) NMM, поддерживая температуру не выше -20 ^оС. Выдерживаем реакционную массу 20 мин при температуре -20 ^оС, затем охлаждаем до температуры до -40 ^оС. После чего добавляем 1,14 г (0,0068 Моль) Leu-NH₂xHCl, суспендированного в 7,5 мл ДМФА, охлажденного до -10 ^оС. После чего добавляем 0,82 мл (0,75 г, 0,734 Моль) NMM. Охлаждаем реакционную массу до -20 ^оС. Выдерживаем при этой температуре 90 мин. Медленно поднимаем температуру реакционной массы до комнатной. Затем оставляем реакционную массу на ночь. Упариваем на роторном испарителе при остаточном давлении не выше 3 мм.рт.ст. и температуре в бане не выше +42 ^оС до окончания отгонки растворителя. Остаток растворяем в 30 мл этилацетата комнатной температуре (около +20 ^оС). Полученный раствор при комнатной температуре промываем по 7,5 мл водой, 3 % раствором лимонной кислоты, а затем еще два раза водой. Отгоняем этилацетат на роторном испарителе при остаточном давлении не выше 40 мм.рт.ст. и температуре в бане не выше +42 ^оС до окончания отгонки растворителя. Остаток затираем в смеси гексана (15 мл) с диэтиловым эфиром (1,5 мл) при комнатной температуре. Осадок фильтруем, промываем его дважды по 7,5 мл гексаном при комнатной температуре. Полученный осадок сушим в конвекционном сушильном шкафу при температуре не выше +40 ^оС до постоянной массы. Выход соединения Boc -Asp (OBzl)-Leu-NH₂ - 2,32 г (96 %).

Синтез Boc-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu-NH₂

К 1,87 г (0,0043Моль) Boc-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu-NH₂ при охлаждении на ледяной бане добавляем 6,75 мл охлажденной до +5 ^оС трифторуксусной кислоты. Перемешиваем до растворения, убираем ледяную баню, выдерживаем дополнительно еще 30 минут. Упариваем на роторном испарителе при остаточном давлении не более 20 мм.рт.ст. и температуре в бане не выше +40 ^оС до окончания отгонки трифторуксусной кислоты, соупариваем 2 раза по 7.5 мл бензола в тех же условиях. Остаток растворяем в 9 мл ДМФА , охлаждаем полученный раствор до -12 ^оС. После чего добавляем NMM (0.4-0,7 мл) до рН=7,3-7,5. Добавление NMM осуществляют непосредственно перед добавлением этого раствора к раствору смешанного ангидрида из Z-Glu(OBzl)-OH и IBCF.

К охлажденной до + 5- +10 ^оС суспензии Boc-Glu(OBzl)-OH х ДЦГА 2,47 г (0,00476 Моль) в 30 мл этилацетата добавляем 12 мл охлажденного до + 5- +10 ^оС раствора 20 % лимонной кислота (24 г моногидрата лимонной кислоты) до рН=4-5 , перемешиваем полученную смесь 5 минут, отделяем органический слой, водный слой подкисляем 30 % раствором серной кислотой комнатной температуры до рН=3 и экстрагируем дважды по 7.5 мл этилацетатом комнатной температуры. Промываем объединенный экстракт дважды по 4.5 мл 3 % раствором лимонной кислотой и дважды по 4.5 мл водой (температура воды и раствора лимонной кислоты комнатная). Упариваем этилацетат на роторном испарителе при остаточном давлении не выше 40 мм.рт.ст. и температуре в бане не выше +40 ^оС до окончания отгонки растворителя. Остаток соупариваем с 7.5 мл ДМФА для удаления воды на роторном испарителя при остаточном давлении не выше 3 мм.рт.ст. и температуре в бане не выше +40 ^оС до окончания отгонки растворителя. Вес полученного масла 1,92 г. Выход продукта 95 % (0,00377 Моль, 1.52 г Boc-Glu(OBzl)-OH).

Растворяем полученное масло 1,92 г (0,00452 Моль, 1.52 г Boc-Glu(OBzl)-OH) в 9 мл ДМФА , охлаждаем до - 30 ^оС и одной порцией добавляем 0,59 мл (6,17 г, 0,00452 Моль) 98 % IBCF. Температуру в реакционной массе поддерживаем в пределах от - 18 ^оС до - 20 ^оС. Выдерживаем 20 мин при температуре - 20 ^оС. Охлаждаем до температуры от - 35 ^оС до - 40 ^оС. Затем добавляем раствор Asp(OBzl)-Leu-NH₂, полученного из 1,87 г (0,0043 Моль) Boc-Asp(OBzl)-Leu-NH₂ и растворенного в 9 мл ДМФА, охлажденного до -20 ^оС, к которому затем добавляют 0,4-0,7 мл NMM, до достижения рН 7,3-7,5. При этом температура повышается до -15 ^оС. Реакционную смесь вновь охлаждают до температуры -20 ^оС. При этой температуре перемешиваем в течение 90 мин. Медленно поднимаем температуру до комнатной и оставляем на ночь. Упариваем на роторном испарителе при остаточном давлении не выше 3 мм.рт.ст. и температуре в бане не выше + 40 ^оС. Остаток растворяем в 2,4 мл этилацетата комнатной температуры. Затем промываем этилацетатный раствор по 4.5 мл: водой, 3 % раствором лимонной кислоты еще два раза водой. Температура воды и раствора лимонной кислоты - комнатная. Отгоняем этилацетат на роторном испарителе при остаточном давлении не выше 40 мм.рт.ст. и температуре в бане не выше + 40 ^оС до окончания отгонки растворителя. Остаток растворяем в 30 мл ИПС при температуре + 65-75 ^оС и оставляем полученный раствор для кристаллизации при комнатной температуре. Осадок фильтруем, промываем его на фильтре два раза 7.5 мл ИПС комнатной температуры, два раза 7.5 мл гексана комнатной температуры. Промытый осадок сушим в конвенционном сушильном шкафу при температуре не выше + 40 ^оС до постоянной массы. Выход соединения Boc-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu-NH₂ - 2,54 г (90 %).

Синтез Z-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu-NH₂.

К 2.828 г (0,0043Моль) Boc-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu -NH₂ при охлаждении ледяной бане добавляем 5,4 мл охлажденной до +5 ^оС ТФУ. Перемешиваем до растворения, убираем ледяную баню. Выдерживаем еще 30 минут. Упариваем полученный раствор на роторном испарителе при остаточном давлении не более 20 мм.рт.ст. и температуре в бане не выше + 40 ^оС до окончания отгонки ТФУ. Соупариваем два раза по 7.5 мл бензола в тех же условиях. Остаток растворяем в 9 мл ДМФА , охлаждаем полученный раствор до температуры - 12-15 ^оС, добавляем NMM (0,4-0,6 мл) до рН =7,3-7,5. NMM добавление к этому раствору осуществляем непосредственно перед добавлением к этому раствору раствора смешанного ангидрида из Z-Ala-OH и IBCF.

Растворяем 1,009 г (0,00452 Моль) Z-Ala-OH в 7.2 мл ДМФА. Охлаждаем до температуры - 30 ^оС. И одной порцией в этот раствор при перемешивании добавляем 0,59 мл (0,62 г, 0,00452 Моль) 98 % IBCF. Затем при перемешивании добавляем 0,49 мл (0,46 г, 0, 00452 Моль) NMM. Температуру при добавлении поддерживаем от - 18 ^оС до - 20 ^оС. Выдерживаем полученную реакционную семь при температуре - 20 ^оС в течение 20 мин. Охлаждаем раствор до температуры от - 35 ^оС до - 40 ^оС. Затем к реакционной смеси добавляем раствор Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu-NH₂, полученный из 2,828 г (0,0043 Моль) Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu-NH₂ и растворенного в ДМФА , охлажденного до - 20 ^оС, к которому затем добавленного 0,4-0,6 мл NMM для достижения рН=7,3-7,5. Температура поднимается до - 15 ^оС. Реакционную смесь охлаждаем до температуры - 20 ^оС. Выдерживаем при этой температуры при перемешивании 90 мин. После чего медленно поднимаем температуру до комнатной и оставляем на ночь.

Упариваем на роторном испарителе при остаточном давлении не выше 3 мм.рт.ст. и температуре в бане не выше + 40 ^оС до полного удаления растворителя. Остаток растворяем в 24 мл этилацетата комнатной температуры. Полученный раствор промываем по 4.5 мл: водой, 3 % раствором лимонной кислоты, водой два раза, 3 % раствором лимонной кислоты. Отгоняем этилацетат на роторном испарителе при остаточном давлении не выше 40 мм.рт.ст. и температуре в бане не выше + 40 ^оС до окончания отгонки растворителя. Остаток растворяем в 30 мл ИПС при температуре + 65-75 ^оС и оставляем кристаллизоваться при комнатной температуре. Полученный осадок фильтруем, дважды промывают по 7.5 мл ИПС комнатной температуры, дважды 7.5 мл гексаном комнатной температуры. Промытый осадок сушим в конвекционном сушильном шкафу при температуре не а + 40 ^оС до постоянной массы. Выход соединения Z-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu-NH₂ - 2,72 г (83 %).

Синтез Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂.

Растворяем 7.5 г (0.00987 Моль) Z-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Leu-NH₂ в минимальном количестве ДМФА (ориентировочно в 18 мл) при + 40 ^оС. К полученному раствору добавляем 18 мл уксусной кислоты. К полученному раствору добавляем 1,2 г 5 % палладия на угле (Sigma-Aldrich 205680 SPEC), суспендированного в 4,5 мл воды , и сразу начинаем пропускать интенсивный ток газообразного водорода. Проводим гидрирование реакционной массы при температуре + 40-42 ^оС. Во время гидрирования возможно выделение из реакционной массы осадка. Поэтому сначала (через 1-2 часа после начала процесса гидрирования) добавляем 7.5-15 мл смеси 1:1 уксусной кислоты и ДМФА, а затем через 10-15 часов при повторном выпадении осадка добавляем 7.5-9 мл воды. Процесс гидрирования провидится в течение 18-20 часов. После окончания гидрирования отфильтровываем палладий на угле. Уголь промываем два -три раза уксусной кислотой , а затем два-три раза теплой водой (с температурой + 40-50 ^оС).

Фильтрат и промывки упариваем раздельно. Фильтрат и объединенные промывки упариваем на роторном испарителе при температуре не выше +42 ^оС при остаточном давлении вначале 20 мм.рт.ст. , а затем при остаточном давлении 5 мм.рт.ст. Упаривание осуществляют примерно на 2/3 от исходного раствора. После чего кубовые остатки образовавшиеся от упаривания фильтрата и промывки объединяют вместе. К полученному общему кубовому остатку добавляют 30 мл ИПС комнатной температуры и тщательно перемешивают в течение 2-5 минут до образования кристаллов. Образовавшиеся кристаллы быстро фильтруют под пленкой. Кристаллы на фильтре промывают три раза по 15 мл ИПС комнатной температуры, затем два раза промывают по 15 мл гексаном комнатной температуры и сушат под вакуумом на роторном испарителе при остаточном давлении 20 мм.рт.ст. и температуре в бане не выше +40 ^оС до постоянного веса. Выход соединения Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ 4.17 г (95%).

Для пояснения сущности изобретения приведены примеры.

Пример 1. Изучение общетоксического действия тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH_2.

Общетоксическое действие тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ исследовали в соответствии с требованиями Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ”/ Под редакцией член-корреспондента, профессора Р.У. Хабриева - 2 изд., перераб. и доп.- М.: ОАО "Издательство "Медицина", 2005: 823.

Исследование общетоксического действия тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ осуществлялось в два этапа: а) изучение "острой токсичности"; б) изучение "хронической" токсичности.

Эти исследования проводили на мышах линии SHR обоего пола в возрасте 2-2,5 месяцев и массой тела 18-22 г, и на крысах линии Wistar обоего пола в возрасте 2-4 месяцев и массой тела 150-240 г.

При однократном внутримышечном и внутрижелудочном введении тетрапептида мышам линии SHR обоего пола (по 35-140 мкг/мышь) и крысам линии Wistar обоего пола (по 350-1400 мкг/крысу) токсический эффект препарата не был обнаружен. Расчет токсической дозы показал, что для данного тетрапептида значение ЛД ₅₀ составляет 1587 мг/кг при однократном внутрижелудочном введении и 1111 мг/кг при многократном внутрижелудочном введении в течение 24 дней ежедневно. Расчет кумуляции составил 0,70. Это указывает на отсутствие привыкания организма к данному тетрапептиду. Необходимо отметить, что ЛД ₅₀ превышает предполагаемую терапевтическую дозу для перорального применения в 225000 раз.

Пример 2. Изучение биотрансформации и времени жизни тетрапептидов Ala-Glu-Asp-Leu и Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ в плазме крови крысы.

Для исследования биотрансформации тетрапептидов Ala-Glu-Asp-Leu и Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ применялась ВЭЖХ продуктов взаимодействия [³ H] Ala-Glu-Asp-Leu и [³ H] Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ с плазмой крови крыс, предварительно обработанной гепарином. Использовались меченные тритием эти тетрапептиды с молярной радиоактивностью 55 и 65 Ки/мМоль. При выполнении ВЭЖХ применялись последовательно соединенные УФ-детектор и проточный детектор радиоактивности. Хроматографию проводили на колонке , заполненной сорбентом с обращённой фазой С₁₈, размером частиц 5 мкм (Luna 5u C18(2) 100A. В качестве подвижной фазы использовалась смесь ацетонитрила и 0,05 М раствора однозамещённого фосфата калия с рН 3 в соотношении 1:9.

Для идентификации пептидных фрагментов, которые могут образовываться при биотрансформации в плазме крови крыс этих двух тетрапептидов [³ H] Ala-Glu-Asp-Leu и [³ H] Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ были синтезированы 2-3 членные пептидные фрагменты, образующиеся при различных путях биодеградации с C и N конца пептидной цепи. Для определения кинетики биодеградации использовалась исходная концентрация этих тетрапептидов 7.0 мкМоль в гепариновой плазме крови крысы.

Результаты выполненных исследований показали, что гидролиз тетрапептидов [³ H] Ala-Glu-Asp-Leu и [³ H] Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ в гепариновой плазме крови крыс под действием пептидаз происходил по двум разным схемам. Гидролиз тетрапептида [³ H] Ala-Glu-Asp-Leu происходил под действием диаминопептидаз, имеющихся в плазме крови крыс, с N- конца пептидной цепи. В то время как, гидролиз [³ H] Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ происходил под действием дикарбоксипептидаз с С- конца пептидной цепи. Кроме этого было достоверно показано, что тетрапептид [³ H] Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂, по сравнению с тетрапептидом [³ H] Ala-Glu-Asp-Leu , обладает более высокой устойчивостью к гидролизу в гепариновой плазме крови крыс.

Изменение концентрации тетрапептидов в гепариновой крови крыс во времени показано на фиг.3. Период полудеградации для тетрапептида [³ H] Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ равнялся 18 минут. В то время аналогичный показатель для тетрапептида [³ H] Ala-Glu-Asp-Leu был равен 3 минуты.

Пример 3. Изучение фармакокинетики тетрапептидов Ala-Glu-Asp-Leu и Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ в плазме крови крыс при пероральном и внутривенном способах введения.

Для изучения фармакокинетики тетрапептидов Ala-Glu-Asp-Leu и Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ в плазме крови крыс была разработана высокоспецифичная и высокочувствительная методика их количественного определения с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемным масс-спектрометрическим детектором (API 3200 Q Trap, Applied Biosystems/MDS SCIEX, США). Детектирование целевых соединений проводили методом ионизации электроспрей (ESI) в режиме регистрации положительных ионов, образующихся из этих тетрапептидов. Хроматографическое разделение осуществляли на колонке Zorbax Extend C18, 3.5 мкм, 50×4.6 мм (Agilent, США) в градиентном режиме элюирования (скорость потока 1 мл/мин, общее время анализа 3.5 мин). Подвижная фаза состояла из ацетонитрила и воды, содержащих 0.1% муравьиной кислоты. В этих условиях время удерживания тетрапептидов Ala-Glu-Asp-Leu и Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ составило соответственно 0.95±0.01 мин и 0.65±0.01 мин.

Извлечение тетрапептидов из плазмы крови крыс проводили методом твердо-фазной экстракции (ТФЭ) в экстракционных платах Oasis HLB, 30 μm (30 mg) (Waters, Ирландия). Предел количественного определения (Lower Limit of Quantification – LLOQ) в плазме крови крысы тетрапептидов Ala-Glu-Asp-Leu и Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ составило соответственно составлял 70 нг/мл и 80 нг/мл , при соотношении сигнал/ шум >6. Градуировочные графики для этих тетрапептидов имели линейную зависимость (r = 0.9976 и 0.9899 1/x weighting фактор) в диапазоне концентраций 75÷10000 нг тетрапептида/ мл плазмы. Эти исследования проводили на крысах самцах линии Wistar обоего пола в возрасте 2-4 месяцев и массой тела 150-240 г.

Исследование фармакокинетики двух этих тетрапепдидов при пероральном и внутривенном способах введения проводили на 20 крысах самцах Wistar, разделенных на следующие равные по количеству животных группы:

Группа №1. Пяти крысам перорально (с помощью внутрижелудочного зонда) вводили тетрапептид Ala-Glu-Asp-Leu в дозе 50 мг/кг;

Группа №2. Пяти крысам внутривенно в хвостовую латеральную вену тетрапептид Ala-Glu-Asp-Leu в дозе 5 мг/кг;

Группа №3. Пяти крысам перорально (с помощью внутрижелудочного зонда) вводили тетрапептид Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ в дозе 50 мг/кг;

Группа №4. Пяти крысам внутривенно в хвостовую латеральную вену тетрапептид Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ в дозе 5 мг/кг;

Во всех четырех группах использовались для введения стерильные растворы тетрапептидов. Для приготовления этих растворов применялись стерильный физиологический раствор.

Используемые дозы каждого препарата были значительно выше предполагаемых фармакологически эффективных доз тетрапептидов, применяемых для лечения экспериментальных патологических процессов у крыс. Пробы крови отбирали декапитацией животных. Кровь собирали в пробирки, содержащие ЭДТА, через 5, 10, 15, 20 и 30 мин после перорального и внутривенного введения. Плазму крови отделяли центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 мин и сразу подвергали обработке для проведения ВЭЖХ-МС анализа.

На фиг. 4 в графическом виде приведены данные по изменению концентрации этих исследованных тетрапептидов в крови крыс при внутривенном введении этих субстанций.

На фиг.5 в графическом виде приведены данные по изменению концентрации тетрапептидов в крови крыс при пероральном введении этих субстанций введении этих субстанций.

Полученные экспериментальные данные по изменению концентраций этих двух тетрапептидов при пероральном и внутривенных способах введения были обработаны методами математической статистик для получения следующих фармакокинетических параметров:

AUC _0→∞ (мкг/мл х мин) - площадь под графиком " концентрация лекарственного вещества — время», рассчитывается от момента введения до бесконечности";

MRT (мин) — среднее время пребывания лекарственного вещества в организме;

К _эл (мин ^-1) — константа скорости элиминации, параметр, характеризующий скорость выведения препарата из организма после перорального или внутривенного введения;

К _аб (мин ^-1) — константа скорости абсорбции, параметр, характеризующий скорость абсорбции препарата в организм после перорального введения;

V_ss (мл) – стационарный объем распределения вещества;

Cl (мл/мин) – общий клиренс – объем плазмы, который очищается от препарата в единицу времени;

T_1/2 (мин) — период, за который выводится половина введённой (или всосавшейся) дозы лекарственного вещества;

Численные значения этих фармакокинетических параметров приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Фармакокинетические параметры для тетрапептидов Ala-Glu-Asp-Leu и Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ при пероральном и внутривенном способах введения

Обозначение параметра Ala-Glu-Asp-Leu Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ Внутривенный способ введения,
Доза 15 мг/кг Пероральный способ введения
Доза 50 мг/кг Внутривенный способ введения
Доза 15 мг/кг Пероральный способ введения
Доза 50 мг/кг AUC _0→∞ , мкг/мл х мин 23,7 21,6 33,5 31,0 К _эл, мин -1 0,119 0,137 0,075 0,095 К _аб, мин -1 - 0,089 - 0,099 V_ss, мл 35260 100603 35161 478688 T_{1/2 ,}мин 5,79 5,03 8,17 10,47 Cl , мл/мин 4214 4622 2981 3154

Как видно из представленных в таблице 1 данных:

а) При пероральном способе введения такой параметр как К_аб для нового тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ выше , чем для аналогичный параметр для тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu. Это указывает на то, что новый тетрапептид Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ по сравнению с взятым прототипом, лучше усваивается через желудочно -кишечный тракт, т.е. количество этого нового тетрапептида , попадающего в системный кровоток, выше.

б) При пероральном и внутривенном способах введения параметр К_эл для нового тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ существенного ниже, чем указанный параметр для тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu, т.е. этот новый тетрапептид подвергается заметно более слабой биотрансформации в организме.

в) При пероральном и внутривенном способах введения Cl для нового тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ существенного ниже, чем указанный параметр для тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu. Это также указывает на то, что этот новый тетрапептид подвергается заметно более слабой биотрансформации в организме.

Пример 4. Исследование противоспалительной активности тетрапептидов на модели экспериментальной бронхопневмонии, вызванной введением скипидара в бронхи крыс.

Исследование противоспалительной активности тетрапептидов на модели экспериментальной бронхопневмонии, вызванной введением скипидара в бронхи крыс, проводили на крысах самцах линии Wistar в возрасте 2-4 месяцев и массой тела 150-240 г.

Исследования были выполнены на 60 крысах самцах. Все животные были разделены на следующие три равные по количеству животных группы (по 15 крыс самцов в каждой группе):

Группа № 1. (Интактная группа). Животные, не подвергшиеся введению скипидара, с дополнительным введением физиологического раствора.

Группа №2 ( Контрольная группа). Животные с моделированным острым бронхолегочным воспалением с дополнительным внутрибрюшинным введением физиологического раствора.

Группа №3. Животные с моделированным острым бронхолегочным воспалением с последующим внутрибрюшинны м введением тетрапептид Ala-Glu-Asp-Leu в дозе 30 мг/кг;

Группа №4. Животные с моделированным острым бронхолегочным воспалением с последующим внутрибрюшинном введением тетрапептид Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ в дозе 30 мг/кг.

Острое бронхолегочное воспаление (бронхопневмонию) у крыс моделировали способом, подробно описанном в работе (Зарубина И.В., Мокренко Е.В., Болехан А.В., Шабанов П.Д. Противоспалительная и иммуномодулирующая активность метапрота, трекрезана и полиоксидония и их комбинации при экспериментальном бронхолегочном воспалении у крыс// Вестник Смоленской государственной медицинской академии. 2016; 15 (1): 5-13).

Крысы из группы № 1 не подвергались в ходе исследования какому либо хирургическому воздействию.

Каждой крысе из групп № 2, 3 и 4 под эфирным наркозом хирургическим путем обнажали трахею и уколом в просвет между двумя хрящевыми полукольцами иглой диаметром 0,8 мм вводили 0,1 мл живичного скипидара (по ГОСТ 1571-82). Разрез на шее ушивали. Затем сразу после операции и далее каждый день на протяжении 5 дней животным из групп № 1 и № 2 внутрибрюшинно вводили стерильный физиологический раствор; а животным из группы № 3 и № 4 внутрибрюшинно вводили стерильный раствор, содержащий соответственно тетрапетиды Ala-Glu-Asp-Leu и Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ . На пятые сутки исследования определяли число выживших животных. В таблице 2 представлены данные по количеству выживших животных в каждой из четырех групп на 5 сутки проведения исследования. После чего животных декапитировали и отделяли легкие животных. Легкие хранили в жидком азоте. После чего ткань измельчали, гомогенизировали и проводили определение биохимических показателей, характеризующих энергетический обмен клеток легочных тканей животных:

а) Содержание молочной кислоты (Лактат);

б) Содержание пирувата;

в) Содержание аденозинтрифосфорной, аденозиндифосфорной и аденозинмонофосфорной кислот;

г) содержание малонового диальдегида;

д) Содержание диеновых конъюгатов.

Таблица 2.

Влияние введения тетрапептидов на выживаемость крыс при моделировании острого бронхолегочного воспаления.

Номер группы Количество животных взятых для исследования, штук Количество выживших животных на 5 сутки исследования, штук Доля выживших животных на 5 сутки исследований, % Группа № 1. (Интактная группа) 15 14 93,0 Группа №2
(Контрольная группа. Бронхолегочное воспаление) 15 5 30,0 Группа №3 (Бронхолегочное воспаление и введение Ala-Glu-Asp-Leu) 15 9 60,0 Группа №3 (Бронхолегочное воспаление и введение Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ ) 15 12 80,0

Как видно из представленных в таблице 2 экспериментальных данных, введение в течение 5 дней крысам с острым бронхолегочным воспалением тетрапептидов заметно увеличивает выживаемость животных. Однако, новый тетрапептид Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ более эффективно увеличивает выживаемость животных, чем взятый для сравнения прототип.

Таблица 3.

Влияние тетрапептидов на метаболические процессы в легких крыс при моделировании острого бронхолегочного воспаления.

Показатели Группы животных Группа № 1. (Интактная группа) Группа №2 (Контрольная группа)
Бронхолегочное воспаление Группа №3
Бронхолегочное воспаление и введение Ala-Glu-Asp-Leu Группа №4 Бронхолегочное воспаление и введение Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ ) Лактат, мкМоль/г ткани 3,06 ± 0,14 7,66 ±0,12 5,17 ±0,16 3,88 ±0,11 * Пируват, мкМоль/г ткани 0,29 ±0,03 0,06 ±0,03 0,16 ± 0,04 0,22 ±0,05 * Соотношение Лактат/пируват 10,6 127,7 32,3 17,6 АТФ, мкМоль/г ткани 2,84 ± 0,08 1,35 ± 0,07 1,88 ±0,06 * 2,55 ± 0,06 * АДФ, мкМоль/г ткани 0,75 ±0,07 1,29 ±0,06 0,95 ±0,07 * 0,81 ±0,05 * АМФ, мкМоль/г ткани 0,44 ±0,05 0,87 ±0,04 0,65 ±0,08 * 0,51 ±0,09 * Энергетический заряд, усл. ед. 0,798 0,568 0,677 0,809 Малоновый диальдегид, нМоль/г ткани 4,52 ± 0,35 9,14 ± 0,41 7,52 ± 0,52 5,92 ± 0,48 * Диеновые конъюгаты, нМоль/г ткани 27,1±2,8 57,6 ±4,9 38,8 ±5,2 31,1±3,8 *

* Примечание. * р < 0,05 в сравнении с Группой № 2.

Расчетной величиной, объединяющей три компонента адениловой системы в единую формулу и позволяющей судить о направленности обменных процессов в ткани/крови, может служить такой параметр как энергетический заряд адениловой системы.

Величину энергетического заряда адениловой системы (в условных единицах) рассчитывали по формуле: (АТФ + 0,5АДФ)/(АТФ + АДФ + АМФ) (Atkinson DE, Walton GM . Adenosine triphosphate conservation in metabolic regulation. Rat liver citrate cleavage enzyme// J. Biol. Chem. 1967, 242: 3239–3241).

Для большинства здоровых, нормально функционирующих клеток этот параметр находится в диапазоне 0,80-0,95. Уменьшение параметра меньше 0,8 свидетельствует об ухудшении энергообеспечения клеток организма. Когда эта величина становится ниже 0,5, клетки погибают.

Из представленных в таблице 3 численных значений этого параметра в группах крыс можно сделать следующие выводы:

а) В группе № 2 (Контрольная группа животных с бронхолегочном воспалением) значение этого параметра почти на 40 % меньше, чем значение аналогичного параметра в группе № 1 (Интактные животные);

б) После введения тетрапептидов значения этих параметров (Группы № 3 и № 4) заметно увеличивается по сравнению с значением параметра в Группе № 2;

в) В группе № 4 (Бронхолегочное воспаление и введение Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂) значение этого параметра почти на 19 % больше, чем значение аналогичного параметра в группе № 3 (Бронхолегочное воспаление и введение Ala-Glu-Asp-Leu). Т.е. введение нового тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ значительно более эффективно нормализует энергетическое состояние клеток по сравнению с введением пептида, взятого за прототип.

Пример 5. Модель хронической обструкционной болезни легких (ХОБЛ), индуцированной сигаретным дымом у крыс.

Хроническую обструкционную болезнь легких (ХОБЛ) у крыс моделировали способом (с некоторыми изменениями), описанном в работе (Rodrigo de las and others . A new experimental model of cigarette smoke-induced emphysema in Wistar rats// J Bras Pneumol. 2014; 40(1): 46-54).

Всего для исследований было взято 48 самцов крыс Wistar массой 400-450 грамм. Все животные были разделены на восемь равных по количеству животных (в каждой группе по 6 крыс ) групп:

1) Группа № 1 - интактные животные;

2) Группа № 2 - животные с индуцированной ХОБЛ и не получавшие какого-либо лечения (негативный контроль);

3) Группа № 3 - животные с индуцированной ХОБЛ и дополнительно получавшие внутрижелудочно дозу 50 мкг/кг нового тетрапептида;

4) Группа № 4 - животные с индуцированной ХОБЛ и дополнительно получавшие внутрижелудочно дозу 500 мкг/кг нового тетрапептида;

5) Группа № 5 - животные с индуцированной ХОБЛ и дополнительно получавшие внутрижелудочно дозу 5000 мкг/кг нового тетрапептида;

6) Группа № 6 - животные с индуцированной ХОБЛ и дополнительно получавшие внутривенно дозу 1 мкг/кг нового тетрапептида;

7) Группа № 7- животные с индуцированной ХОБЛ и дополнительно получавшие внутривенно дозу 10 мкг/кг нового тетрапептида;

8) Группа № 8 - животные с индуцированной ХОБЛ и дополнительно получавшие внутривенно дозу 100 мкг/кг нового тетрапептида.

В качестве нового исследуемого пептида в группах №№ 3-8 использовался тетрапептид Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ .

Индукция ХОБЛ выполнялась путем окуривания экспериментальных животных (кроме группы интактных крыс) сигаретным дымом с помощью специального оборудования. Принципиальная схема этого оборудования показана на фиг. 6.

Система размещения животных состоит из четырех металлических кабинок (24 см х 17 см х 15 см), закрытых сверху сеткой. В каждой кабинке размещаются по 3 крысы. Металлические кабинки симметрично размещаются в герметичном, прозрачном, полимерный боксе (70 см х 70 см х 20 см). В исследовании используется 2 экспериментальной установки. В одной из этих экспериментальных установок размещаются животные для окуривания сигаретным дымом. В другой установке размещаются животные из группы интактных крыс, которые не подвергались воздействию сигаретного дыма. Экспериментальные установки размещаются в различных лабораторных помещениях. В лабораторных помещениях поддерживалась температура воздуха в пределах 20-25 ^О С и относительная влажность 60-70 %. Экспериментальная установка состоит из внешнего держателя сигареты, который подключен гибким шлангом к динамическому всасывающему насосу. Всасывающий насос создает отрицательное давление, что заставляет чистый воздух из лабораторных помещений проходит через зажженную сигарету с образованием сигаретного дыма, который затем поступает по шлангу в полимерный бокс. Всасывающий насос запрограммирован на чередование периодов подачи сигаретного дыма и периодов подачи чистого воздуха (для предотвращения асфиксии у экспериментальных животных) в полимерный бокс.

В сутки выполнялись пять периодов воздействия сигаретного дыма на экспериментальных животных (кроме животных из группы интактных крыс) примерно через равные промежутки времени. Длительность такого каждого периода воздействия сигаретного дыма составляла 1 час. В течение этого часа животные подвергались воздействию дыма, образующегося от 4 сигарет. В течение этого часа окуривания сигаретным дымом осуществлялось в течение 15 минут, затем в течение 5 минут подавал чистый комнатный воздух (во избежание гипоксии у животных). После чего цикл подача сигаретного дыма - подача свежего воздуха повторялся. 15 минутный период окуривания животных сигаретным дымом в свою очередь состоял из следующих циклов: 15 секунд подача сигаретного дыма и 15 минут - прекращение подачи сигаретного дыма. Таким образом, в течение 1 суток животные (кроме крыс из интактной группы) подвергались воздействию сигаретного дыма , образующегося от сжигания 20 сигарет.

Концентрация угарного газа (монооксида углерода), также содержащегося в сигаретном дыме, в полимерный боксе определялась с помощью портативного газового детектора "GasAlert Micro 5" (производство компании "Honeywell Analytics Distribution Inc "). В течение 1 часового периода воздействия сигаретного дыма на животных концентрация этого газа в полимерном боксе изменялась в пределах 300-500 ррм. В ходе эксперимента для окуривания использовались сигареты "Прима" со следующим содержанием в 1 сигарете смолы и никотина - 16 мг и 1,2 мг, соответственно. С учетом объема полимерного бокса, содержания смолы в каждой сигарете, используемого в течение одних суток количества сигарет, длительность и количество периодов воздействие сигаретного дыма на экспериментальные животные, среднего объема вентиляции легкого у крыс , каждое животное (кроме крыс из интактной группы) в течение одних суток получало дозу смолы, равную 80 мг/кг.

В таблице 4 приведена схема эксперимента на крысах самцах линии Wistar.

Таблица 4.

Схема эксперимента на крысах самцах линии Wistar на модели хронической обструкционной болезни легких (ХОБЛ), индуцированной сигаретным дымом.

Номер группы № 1 № 2 № 3 № 4 № 5 № 6 № 7 № 8 Количество животных в группе, штук 6 6 6 6 6 6 6 6 Путь введения препарата Нет Нет Вн/ж * Вн/ж * Вн/ж * Вн/в ** Вн/в ** Вн/в ** Продолжительность индукции ХОБЛ, день Нет 24 24 24 24 24 24 24 Срок начала введения препарата от начала индукции ХОБЛ, день Нет Нет 10 10 10 10 10 10 Длительность введения препарата, день Нет Нет 14 14 14 14 14 14 Доза вводимого препарата, мкг/кг Нет Нет 50 500 5000 1 10 100

Примечание: * внутрижелудочный способ введения препарат; ** -внутривенный способ введения препарат.

На первом этапе исследования животные из групп №№ 2-8 подвергались окуриванию сигаретным дымом по методике, описанной выше, в течение 10 дней.

На втором этапе исследования животные их групп №№ 2-8 дополнительно подвергались окуриванию сигаретным дымом еще в течение 14 дней. При этом животные из группы № 2 не получали дополнительно внутривенно или внутрижелудочно новый тетрапептид. Животные из групп №№ 3-5 дополнительно внутрежелудочно вводили новый тетрапептид в указанных в таблице 4 дозах. Животные из групп №№ 6-8 дополнительно внутривенно вводили новый тетрапептид в указанных в таблице 4 дозах.

Во всех группах №№ 3-8 использовались для введения стерильные растворы тетрапептида. Для приготовления этих растворов применялись стерильный физиологический раствор.

Объем введения составлял 500 мкл на крысу при внутрижелудочном введении (группы №№ 3-5) и 10 мкл на крысу при внутривенном введении (группы № 6-8).

На первом и втором этапе исследования интактные животные из группы № 1 не подвергались окуриванию сигаретным дымом, а также не подвергались введению нового тетрапептида.

На 28 день проведения эксперимента у животных из всех групп выполнялись морфометрические исследования препаратов легочной такни (Пример № 7), а также исследования клеточного состава бронхоальвеолярного лаважа (Пример № 8).

Пример 6. Морфометрические исследования препаратов легочной ткани крыс на модели ХОБЛ, индуцированной сигаретным дымом.

Морфометрические исследования препаратов легочной ткани крыс на модели ХОБЛ, индуцированной сигаретным дымом, проводили для всех восьми экспериментальных групп животных.

Для этих исследований использовались по 3 - 4 животных в каждой группе.

Перед исследованием животные подвергались общей анестезии с помощью комбинированного препарата "Золетил^® 50 " (производства компании "Virbac Sante Animale") (Доза 7 мг/кг).

Легкие расправлялись введением через трахею 10%-ного раствора нейтрального формалина. Проводили стандартную фиксацию тканей в растворе формалина и обезвоживания в этиловом спирте с возрастающей концентрацией (70–96 %). После чего образцы легочной ткани заливались в парафин. Из парафиновых блоков изготавливались гистологические срезы толщиной 5–7 мкм и окрашивались гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону.

Гистологические срезы фотографировались с помощью микроскопа Nicon и цифровой фотокамеры Progres CF USB.Морфометрический анализ осуществлялся с помощью аппаратно-программного комплекса Видео-Тест-Морфология 5.2. Каждый препарат фотографировался с увеличением в 4, 20 и 40 раз. При увеличении в 4 раза проводилась оценка стенки бронхов: измерялись площади бронха, клеточного инфильтрата, просвета бронха и суммарная площадь других компонентов стенки бронха (слизистая и мышечная оболочки, соединительная ткань). Измерения осуществлялись с помощью программ ручной обработки путем выделения указанных структур и автоматического определения их площади (мм²) и периметра (мм). Полученные данные использовались для расчета площадей инфильтрата.

Толщина мышечного слоя стенки бронха оценивалась при 20-кратном увеличении (шаг измерений 10 мкм). С помощью программ ручной обработки производилось 10-20 последовательных измерений каждого препарата. Толщина межальвеолярных перегородок (мкм) и площадь альвеол (мкм²) определялись при 40-кратном увеличении. В каждом препарате с помощью программ ручной обработки осуществлялось 10-20 последовательных измерений толщины межальвеолярных перегородок. В программе автоматических измерений путем бинаризации выделялся просвет альвеол и определялась их площадь.

Статистический анализ полученных экспериментальных данных выполнялся с помощью программного обеспечения "Статистика 6.0". Проверка нормальности распределения экспериментальных данных была выполнена с помощью критерия Шапиро-Уилка. Статистически значимые различия между средними значениями в каждой экспериментальной выборке определялись при 0,05 уровне значимости. Средние значения и стандартные ошибки в определении среднего значения для всех экспериментальных данных по результатам морфологических исследований для этих групп животных приведены ниже в таблице 5.

Таблица 5.

Результаты морфометрических исследований препаратов легочной ткани крыс

Показатели Интактная группа Негативный контроль Вн/ж
50 мкг/кг Вн/ж
500 мкг/кг Вн/ж
5000 мкг/кг Вн/в
1 мкг/кг Вн/в
10 мкг/кг Вн/в
100 мкг/кг Площадь инфильтрата, % 11,5±0,55 22,04±0,62 (*) 19,8±0,38 (*) 16,06±0,45
(*), (**) 15,2±0,60 (*), (**) 20,4±0,65 (*) 18,64±0,55 (*), (**) 14,6±0,14 , (**) Толщина мышечной оболочки стенки бронха, мм 8,9±0,40 15,6±0,33
(*) 14,2±0,25
(*) 13,2±0,30
(*), (**) 11,4±0,45 (*), (**) 15,3±0,55 (*) 12,4±0,38 (*), (**) 9,8±0,43
(**) Толщина межальвеолярных перегородок, мм 3,95±0,25 4,98±0,22
(*) 4,80±0,24
(*) 4,65±0,11
(*) 4,35±0,18
(*),(**) 4,75±0,18
(*) 4,58±0,22
(*) 4,11±0,08
(**) Площадь просвета альвеол, мкм2 398,4±32,0 489,5±28,2 (*) 480,7±38,0 (*) 470,5±48,0 (**) 430,4±45,0 (*),(**) 481,8±45,0 (*) 467,7± 42,0
(*) 419,4±38,0 , (*), (**)

Примечание : (*) - различия статистически значимы по критерию Стьюдента (при р<0,05) по сравнению с интактными животными;

(**) - различия статистически значимы по критерию Стьюдента (при р<0,05) по сравнению с животными негативного контроля.

Как видно из представленных в таблице 5 данных, в легких животных из группы № 2 (негативный контроль) по сравнению с тканями легкими от интактных животных из группы № 1 отмечалось достоверное увеличение толщины мышечной оболочки бронхиальной стенки, утолщение межальвеолярных перегородок, а также значительное увеличение процента площади, занимаемой клеточным инфильтратом. Отмечалась также увеличение площади просвета альвеол.

При внутрижелудочном и внутривенном введении нового тетрапептида в различных дозах животным в группах № 3-8 прослеживается тенденция на улучшение всех морфометрических показателей по сравнению с аналогичными показателями у животных из группы № 2 (негативный контроль). В некоторых случаях улучшение этих показателей у животных в группах № 3-8 носят статистически достоверный характер по сравнению показателями у животных из группы № 2 (негативный контроль).

Однако эти показатели в большинстве случаях у животных в группах № 3-8 не достигали интактных значений.

Следовательно, новый тетрапептид оказывает специфическое фармакологическое действие, которое проявляется в тенденции по нормализации и уменьшению патологических процессов, возникающих в бронхолегочных структурах животных при длительном воздействии сигаретного дыма.

Пример 7. Исследование клеточного состава бронхоальвеолярного лаважа крыс на модели ХОБЛ, индуцированной сигаретным дымом.

Определение клеточного состава бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) крыс на модели ХОБЛ, индуцированной сигаретным дымом, проводили для всех восьми экспериментальных групп животных.

Для забора БАЛ использовались по 3 - 4 животных в каждой группе.

Перед забором бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) животные подвергались общей анестезии с помощью комбинированного препарата "Золетил^® 50 " (производства компании "Virbac Sante Animale") (Доза 7 мг/кг).

У животного обнажали внутригрудную трахею средним разрезом и делали разрез между кольцами трахеи. Затем вводили шприц с 5 мл физиологического раствора. Физиологический раствор вначале медленно, постепенно выдавливали из шприца, а затем его постепенно отбирали в шприц. После забора БАЛ шприц отсоединяли и полученную таким образом жидкость переносили в силиконизированные пробирки на 5 мл. Клеточный состав БАЛ исследовали с помощью автоматического ветеринарного гематологического анализатора BE-2800 Vet (производство компании "Mindray"). В составе БАЛ каждого животного были определены содержания следующих клеток: лимфоциты, макрофаги, эозинофилы, сегментоядерные нейтрофилы и сегментоядерные нейтрофилы.

Статистический анализ полученных экспериментальных данных выполнялся с помощью программного обеспечения "Статистика 6.0". Проверка нормальности распределения экспериментальных данных была выполнена с помощью критерия Шапиро-Уилка. Статистически значимые различия между средними значениями в каждой экспериментальной выборке определялись при 0,05 уровне значимости.

Средние значения и стандартные ошибки в определении среднего значения для всех экспериментальных данных по клеточному состава БАЛ для этих групп животных приведены ниже в таблице 6.

Таблица 6.

Клеточный состав БАЛ экспериментальных животных в абсолютных значениях.

Показатели клеточного состава БАЛ, * 10 ⁹/л Интактная группа Негативный контроль Вн/ж
50 мкг/кг Вн/ж
500 мкг/кг Вн/ж
5000 мкг/кг Вн/в
1 мкг/кг Вн/в
10 мкг/кг Вн/в
100 мкг/кг Лимфоциты 0,39±0,11 1,34±0,15 (*) 1,15±0,18 (*) 1,06±0,16 (*) 0,87±0,15 (*) 0,95±0,12 (*), (**) 0,64±0,15 (*), (**) 0,58±0,14 , (**) Макрофаги 0,034±0,009 0,32±0,01 (*) 0,21±0,006 (*) , (**) 0,16±0,008 (*), (**) 0,12±0,01 (*), (**) 0,25±0,009 (*), (**) 0,21±0,01 (*), (**) 0,09±0,007 (*), (**) Эозинофилы 0,014±0,005 0,033±0,007 0,025±0,006 0,022±0,007 (*) 0,019±0,01 0,024±0,005 0,022±0,006 0,018±0,007 Сегментоядерные нейтрофилы 0,28±0,07 1,31±0,18 (*) 0,65±0,08 (*), (**) 0,48±0,09 , (**) 0,39±0,05 , (**) 0,84±0,11 (*), (**) 0,55± 0,06
(**) 0,38±0,08 , (**) Палочкоядерные нейтрофилы 0,008±0,004 0,042±0,008 (*) 0,030±0,009 (*) 0,028±0,012 (*) 0,016±0,007 , (**) 0,025±0,01 (*), (**) 0,015±0,006 , (**) 0,012±0,005 (**) Общий цитоз 0,73±0,19 3,16±0,36 (*) 2,07±0,28 (*), (**) 1,75±0,27 (*), (**) 1.42±0.23 (*), (**) 2.10±0.25 (*), (**) 1.44±0.23 (*), (**) 1.08±0.25 (*), (**)

Примечание : (*) - различия статистически значимы по критерию Стьюдента (при р<0,05) по сравнению с интактными животными;

(**) - различия статистически значимы по критерию Стьюдента (при р<0,05) по сравнению с животными негативного контроля.

Как видно из представленных в таблице 6 данных, у животных в группе негативного контроля по сравнению с животными из интактной группы заметно изменяется клеточный состав БАЛ - происходит статистически значимое увеличение содержания: лимфоцитов, макрофагов и обеих разновидностей нейтрофилов. Кроме этого, отмечается статически значимое увеличение и общего цитоза БАЛ. Такой клеточный состав БАЛ свидетельствует о наличие воспаления бронхов у животных из группы негативного контроля.

Похожая картина, свидетельствующая о наличие воспалительных процессов, наблюдается и в других экспериментальных группах животных с ХОБЛ, но получавших дополнительно тетрапептид. Однако степень выраженности воспалительных процессов в этих группах животных заметно слабее. Это особенно видно при сравнении относительных значений клеточного состава БАЛ для в различных группах животных по отношению к аналогичным значениям клеточного состава БАЛ в интактной группе животных, приведенных в таблице 7 .

Таблица 7.

Клеточный состав БАЛ экспериментальных животных в относительных значениях по отношению к соответствующим значениям в интактной группе

Показатели клеточного состава БАЛ, в % Интактная группа Негативный контроль Вн/ж
50 мкг/кг Вн/ж
500 мкг/кг Вн/ж
5000 мкг/кг Вн/в
1 мкг/кг Вн/в
10 мкг/кг Вн/в
100 мкг/кг Лимфоциты 100 %
(0,39±0,11) 243 195 172 123 143 64 49 Макрофаги 100 %
(0,034±0,009) 841 517 370 252 635 517 76 Эозинофилы 100 %
(0,014±0,005) 136 78 57 36 71 57 28 Сегментоядерные нейтрофилы 100 %
(0,28±0,07) 368 132 71 39 200 96 36 Палочкоядерные нейтрофилы 100 %
(0,008±0,004) 425 275 250 160 213 88 50 Общий цитоз 100 %
(0,73±0,19) 333 184 140 94 188 97 45

В таблице 7 приведены относительные значения клеточного состава БАЛ в различных группах животных по отношению к аналогичным значениям клеточного состава БАЛ в интактной группе животных. Показатели клеточного состава БАЛ в интактной группе животных взяты за 100 % .

Следовательно, новый тетрапептид оказывает специфическое фармакологическое действие, которое проявляется как в снижении воспалительного процесса в слизистых оболочках бронхов животных , а также в тенденции по нормализации клеточного состава бронхоальвеолярного лаважа этих животных.

Кроме этого, как видно из представленных в таблицах 6 и 7 экспериментальных данных с увеличением дозы вводимого тетрапептида (как при внутрижелудочном так и при внутривенном способах введения) наблюдается достаточно выраженная тенденция к снижению воспалительных процессов в слизистых оболочках бронхов в группах животных с ХОБЛ, получавших дополнительно новый тетрапептид.

Пример 8. Влияние тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ на рост эксплантатов органотипической культуры легких крыс.

Для определения влияния тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ на рост эксплантатов органотипической культуры легких крыс использовались методика , изложенная в работе (Аль-Шакри С.Х., Чалисова Н.И., Закуцкий А.Н., Боровец С.Ю. Влияние аминокислот и их метаболитов на развитие органотипической культуры семенников у крыс// Нефрология. 2007; 11 (2): 86-92).

Свежие ткани крыс самцов линии Вистар в возрасте 3-4 месяцев разделяли на мелкие фрагменты величиной около 1 мм³. Полученные таким образом кусочки легкого крыс (эксплантанты) использовались для приготовления образцов опытной группы и образцов контрольной группы. Для приготовления образцов опытной и контрольной групп кусочки легкого крыс размещали в чашке Петри с коллагеновым покрытием (примерно 10-15 эксплантов) в 1 чашке Петри, а затем добавляли для проведения культивирования по 15 мл питательной среды.

Состав используемой питательной среды (из расчет на 100 мл ): раствор Хенкса - 41 мл; среда Игла -30 мл, фетальная сыворотка теленка - 25 мл, водный раствор 20 % глюкозы -1 мл, инсулин -2,5 мл (100 ЕД) и гентамицин 0,5 мл (20 мг). Для исследований использовалась питательная среда, значение рН которой изменялась в диапазоне 7.2-7.4.

В опытной группе исследуемый раствор нового тетрапептида добавляли в чашки Петри к смеси экспланта и питательной среды среду в различных количествах, так чтобы концентрации этого соединения в культурной среде изменялись в диапазоне 0,01-10 нг/мл культуральной среды. Объем добавляемого раствора тетрапептида в чашки Петри равнялся 15 мкл.

В контрольной группе питательной среде с эксплантами вместо раствора тетрапептида в чашки Петри добавляли 15 мкл физиологического раствора. После чего содержимое чашек Петри из опытной группы (с эксплантами, питательной средой и раствором тетрапептида) и контрольной группы (с эксплантами, питательной средой и с физиологическим раствором) культивировались в лабораторном CO ₂- инкубаторе при строгом соблюдении температурного (36,5±0,25 ^OC) режима в газовой среде с содержанием 5 % углекислого газа при относительной влажности 95±5 %.

Наблюдение за изменением клеточных структур в чашках Петри проводилось с использованием микроскопа  OLYMPUS CKX41 с установленным цифровым модулем визуализации VIDI-CAM. Обработка полученных изображений выполнялась с помощью программы IMAG PRO INSIGHT. В эксплантах контрольной и опытной групп после 3 суток культивирования наблюдались две зоны: центральная и периферическая. Центральная зона (с большей оптической плотностью) представляет собой клетки легкого крыс, исходно размещенные на коллагеновом покрытии. Периферическая зона (зона роста) образуется клетками, которые мигрируют из исходных тканей эксплантов, а затем пролифелируют на коллагеновом покрытии.

Для количественной оценки роста клеток экспланта определялся параметр "Индекс площади (ИП)", выраженный в условных единицах и рассчитываемый по следующей формуле:

ИП= (Площадь всего экспланта)/(Площадь центральной зоны экспланта).

Для обработки полученных результатов измерения ИП использовались методы математической свастики. Рассчитывали значения индексов площадей для эксплантов из контрольной (ИПкон) и опытной (ИП опыт) групп. В качестве показателя, отражающего раствора нового тетрапептида на рост эксплантов органотипической культуры легких крыс , использовали выраженное в процентах отношение ИПопыт/ИПкон.

В таблице 8 приведены значения ИПопыт/ИПкон при изменении концентрации нового тетрапептида 0,7-10 мкг/мл культуральной среды.

Таблица 8.

Влияние различных концентраций тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ в культуральной среде на рост эксплантатов органотипической культуры легких крыс.

Наименование показателя, Концентрация тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ в культуральной среде, нг/мл 0,01 0,5 2,5 5,0 10,0 ИПопыт/ИПкон, % 3 19,0 * 37,0 * 45,0 * 55,0 *

Примечание : * -статистически значимые отличия по сравнению с контролем при р<0,05.

Результаты эксперимента приведены в таблице 8, из которой следует, что тетрапептид Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ достоверно стимулирует рост эксплантатов органотипической культуры легких крыс в широком диапазоне концентраций от 0,5 до 10,0 нг/мл.

Таким образом, применение тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ при непосредственном воздействии на органотипическую культуру тканей легкий крыс способствует ускоренному обновлению клеточной популяции этих тканей.

Пример 9. Влияние тетрапептидов Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ и Ala-Glu-Asp-Leu на формирование иммунного ответа на тимусзависимый антиген.

Исследование тетрапептидов Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ и Ala-Glu-Asp-Leu на формирование иммунного ответа на тимусзависимый антиген, проводили на самцах мышей линии СBA и массой тела 20-30 г.

Исследования были выполнены на 28 животных. Все животные были разделены на следующие 7 равные по количеству животных группы (по 4 животных в каждой группе):

Группа № 1. (Контрольная группа). Животные, подвергшиеся иммунизации, с дополнительным введением физиологического раствора.

Группа № 2. Животные, подвергшиеся иммунизации с дополнительным внутримышечным введением тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu в дозе 0,1 мкг/кг;

Группа № 3. Животные, подвергшиеся иммунизации с дополнительным внутримышечным введением тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu в дозе 10 мкг/кг;

Группа № 4. Животные, подвергшиеся иммунизации с дополнительным внутримышечным введением тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu в дозе 1000 мкг/кг;

Группа № 5. Животные, подвергшиеся иммунизации с дополнительным внутримышечным введением тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ в дозе 0,1 мкг/кг;

Группа № 6. Животные, подвергшиеся иммунизации с дополнительным внутримышечным введением тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ в дозе 10 мкг/кг;

Группа № 7. Животные, подвергшиеся иммунизации с дополнительным внутримышечным введением тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ в дозе 1000 мкг/кг.

Животным из опытных групп №№ 2-7 за 6 суток до проведения иммунизации ежедневно внутримышечно вводили растворы исследуемых пептидов в количестве 0,1 мл на одно животное. Для введения использовались стерильные растворы тетрапептидов. Для приготовления этих растворов применялись стерильный физиологический раствор.

Животным из контрольной группы в течение этих 6 суток (группа № 1) вводили стерильный изотонический раствор хлорида натрия.

Иммунизацию животного проводили путем однократного внутривенного введения 0, 05 мл взвеси эритроцитов барана в стерильном физиологическом растворе (доза 5·10⁷ эритроцитов барана/мышь).

На 5-е сутки после иммунизации кровь для получения сыворотки и определения значений титров гемагглютининов (ГМА) получали от животных путем декапитации.  Затем животных подвергались эвтаназии с помощью цервикальной дислокации. После чего извлекали селезенки и готовили клеточную суспензию органа для количественного определения антителобразующих клеток (АОК) с помощью метода Ерне и Нордина.

Полученные экспериментальные данные (численные значения АОК и ГМА) подвергались статистической обработке с помощью программного обеспечения "Статистика 6.0". Проверка нормальности распределения экспериментальных данных была выполнена с помощью критерия Шапиро-Уилка. Статистически значимые различия между средними значениями в каждой экспериментальной выборке определялись при 0,05 уровне значимости. Средние значения и стандартные ошибки в определении среднего значения для всех экспериментальных данных титров ГМА и АОК для всех групп животных приведены ниже в таблице 9.

Таблица 9.

Влияние тетрапептидов Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ и Ala-Glu-Asp-Leu на иммунный ответ у мышей линии СВА

Номер группы Используемый тетрапептид Доза, мкг/кг Показатели иммунного ответа Титры ГМА, log ₂ Количество АОК на 10 ⁶ клеток селезенки 1 Контрольная группа -/- 7,9 ±0,5 135,1±8,2 2 Ala-Glu-Asp-Leu 0,1 8,1±0,3 138,1±20,2 3 Ala-Glu-Asp-Leu 10,0 8,6±0,4 142,6±18,2 4 Ala-Glu-Asp-Leu 1000,0 8,7±0,6 143,2±14,5 5 Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ 0,1 8,9±0,3 * 206,4±18,5 * 6 Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ 10,0 12,4±0,5 * 458,4±41,3 * 7 Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ 1000,0 14,8±0,6 * 472,5±31,2 *

Примечание: * отмечены достоверные различия с контролем (p<0,05).

Использованные сокращения: ГМА - гемагглютинины, АОК - антителобразующие клетки.

Как следует из представленных в таблице 9 данных, применение нового тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ приводит к существенному увеличению количество антителобразующих спленоцитов (АОК) и антиэритроцитарных анти-тел (ГМА). Достоверные отличия с контролем в группе, где применяли новый тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂, отмечены уже при введении субстанции в дозе 0,1 мкг/кг. У животных, которым вводили тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu, эффекты по увеличению количеств АОК и ГМА выражены очень слабо. Эти результаты указывают на то, что в отличие от прототипа (тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu ) новый тетрапептид (Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂) обладает ярко выраженной иммуномодулирующей активностью.

Таким образом, заявляемое пептидное соединение оказывает комплексное восстановительное действие на функцию органов дыхания, включая иммуномокоррекцию.

Группа изобретений относится к медицине и касается тетрапептида аланил-глутамил-аспартил-лейцин амид общей формулы Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂. Группа изобретений также касается применения указанного тетрапептида для восстановления функции органов дыхания и иммунокоррекции; фармакологического средства пептидной природы, восстанавливающего функцию органов дыхания и обладающего иммуномодулирующим действием, содержащего активный пептидный агент и фармацевтически приемлемый носитель. Группа изобретений обеспечивает комплексное восстановительное действие на функцию органов дыхания, включая иммунокоррекцию. 3 н.п. ф-лы, 6 ил., 9 табл., 9 пр.

1. Тетрапептид аланил-глутамил-аспартил-лейцин амид общей формулы Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂.

2. Применение тетрапептида аланил-глутамил-аспартил-лейцин амид общей формулы Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂, для восстановления функции органов дыхания и иммунокоррекции.

3. Фармакологическое средство пептидной природы, восстанавливающее функцию органов дыхания и обладающее иммуномодулирующим действием, содержащее активный пептидный агент и фармацевтически приемлемый носитель, отличающееся тем, что в качестве активного пептидного агента содержит эффективное количество тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu-NH₂ в дозе 0,01-1000 мкг/кг массы тела.