СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКТИНОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТИВОКАНДИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2013 года по МПК C12N9/20 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для получения препаратов-пребиотиков.

В настоящее время к лектинам относят широкий спектр веществ белковой природы. Существует несколько определений лектинов (1). Первое определение (лектины как специфические агглютинины и преципитины) учитывает максимальный спектр белковых агглютининов и преципитинов, в том числе с неустановленным механизмом действия для ряда адгезинов. К таким белковым соединениям относятся, например, полилизинсодержащие, которые агглютинируют и преципитируют лиганды за счет высокой заряженности их молекул. Фосфорсодержащие аминокислоты или липиды в составе белков также могут обуславливать агглютинацию клеток или преципитацию катионных и сильно гидрофобных гликоконьюгатов. К достоинствам определения следует отнести простоту тестирования кандидатов в лектины, включение в поле зрения новых перспективных биоэффекторов и адгезинов (для ряда адгезинов уже доказана важность углеводов в биоузнавании), рассмотрение сложных поливалентных систем с позиций лиганд-рецепторного анализа с учетом вклада взаимодействий с белками, липидами, катионами металлов или углеводами. Второе определение лектинов расширяет спектр белков за счет включения моновалентных (неагглютинирующих и непреципитирующих) молекул, например некоторых токсинов растений и бактерий. К углеводсвязывающим белкам относятся также некоторые гормоны, транспортеры углеводов, но не ферменты углеводного обмена, изменяющие структуру химических связей в углеводном субстрате. Третье определение аффинитинов как любых углеводсвязывающих белков включает лектины как составную часть, наряду с ферментами углеводного обмена и иммуноглобулинами. Это определение не выделяет лектины, особенно в случае пектинов семейства I (иммуноглобулинового)-типа с иммуноглобулинподобными доменами.

На наш взгляд более приемлемо второе определение, когда к лектинам относятся белки неиммуноглобулиновой природы, способные к специфическому узнаванию гликоконъюгатов и обратимому связыванию с ними без нарушения ковалентной структуры связываемых углеводов. Согласно современным данным, некоторые из ферментов углеводного обмена, относящихся ко всем 6 классам ферментов по международной классификации, удовлетворяют условиям этого определения. Так, гликозилтрансферазы ведут себя как лектины при связывании с донорными углеводами и отсутствии акцепторных молекул. Кроме того, многие гликозидазы (например, α-амилазы, глюкоамилазы, эндоглюканазы и целлобиогидролазы) имеют не перекрывающиеся с каталитическими центрами углеводсвязывающие пространственные модули, удовлетворяющие характеристике углеводсвязывающих участков лектинового типа.

Если первоначально исследователи не называли углеводсвязывающие рецепторы пектинами, то теперь это отмечается повсеместно. То же самое наблюдается и в отношении углеводсвязывающих бактериальных токсинов и вирусных гемагглютининов, которые на равных правах с прочими белками стали называть пектинами. Имеется много публикаций по лектиноидным (лектинподобным) ферментам с литическим действием в отношении клеток.

Известен способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающих структур, заключающийся в культивировании колоний штамма L. fermentum 90 TS-4, отобранных по признаку агглютинации 0,1%-ным раствором конканавалина А в концентрации не ниже 1,75·10^-3 мг/мл в жидкой среде МРС-1; отделении клеток центрифугированием и концентрировании полученного супернатанта культуральной жидкости над мембраной UM-20 «Диафло», удалении полученного осадка и очистке и выделении целевого продукта методом аффинной хроматографии на конканавалин-А-сефарозе, что обеспечивает получение субстанции с выраженной модулирующей активностью в отношении высокоадгезивных штаммов дрожжеподобных грибов вида Candida albicans и условно-патогенных штаммов микроорганизмов вида Escherichia coli (2).

Недостатком известного способа является то, что он позволяет выделять только антиадгезивный компонент на основе лектинсвязывающих структур, но никак не лектины, обладающие противокандидной активностью.

Известен способ получения бактериального лектина, специфичного к сиаловым кислотам, предполагающий использование в качестве сырья непатогенной культуры Bacillus mesentericus ВКПМ В-2466, способной синтезировать внеклеточные сиалоспецифичные лектины; выращивание продуцента в течение 14-16 ч глубинным способом на полусинтетической среде с биостимулятором-автолизатом из пивных дрожжей, получение целевого продукта с выходом 46,8-60% осаждением культуральной жидкости сульфатом аммония при насыщении 60-70% и диализом, хранение целевого продукта в замороженном состоянии при (-10°С) (3).

Недостатком известного способа является то, что выделяемые с его помощью белки не обладают противокандидной активностью.

Известно, что противокандидной активностью обладают метаболиты культур ацидофильных лактобацилл, однако такая активность менее выражена, чем антибактериальная (4).

В основу заявляемого изобретения положена задача выделения лектинов, обладающих противокандидной активностью, из культуральной жидкости смеси штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus (NK1, 100_аш, К₃Ш₂₄) после выращивания микроорганизмов.

Задача решена тем, что культуральную жидкость замораживают, удаляют слой жира, обезжиренную часть размораживают и отделяют клетки центрифугированием, супернатант стерилизуют мембранной вакуумной фильтрацией, концентрируют мембранной ультрафильтрацией в процессе центрифугирования, обрабатывают концентрат супернатанта с компонентами более 27 кDа пятикратным избытком ледяного ацетона, выделяют центрифугированием образовавшийся осадок, удаляют надосадок и проводят очистку и выделение целевого продукта методом горизонтального изоэлектрофореза. Отделение клеток микроорганизмов, мембранную ультрафильтрацию супернатанта, отделение осадка после инкубации отфильтрованного супернатанта с избытком ледяного ацетона осуществляют центрифугированием при скорости вращения ротора 5500 об/мин в течение 90 мин. Перед электрофорезом осадок разводят 20 мМ NaCl в соотношении 2:1 по объему и смешивают с 10% твин-80 до конечной концентрации твина 1%. Очистку и выделение целевого продукта проводят методом горизонтального изоэлектрофореза в пластине 5% полиакриламидного геля с 7-8 М мочевиной и 5% сахарозой в градиенте рН 4-8 при температуре (10±2)°С в течение 8 ч. При выделении целевого продукта после электрофореза гелевые ленты нарезают по изоточкам, замораживают при температуре (-20°С) в течение 2 ч, размораживают и диспергируют, отделяют центрифугированием твердые частицы, концентрируют центрифугированием при 5500 об/мин в течение 60 мин при комнатной температуре, удаляют низкомолекулярные примеси и смешивают концентрат с фосфатным буфером в 100-кратном объеме. Гелевые ленты нарезают по изоточкам pI (4.0-4.3) при выделении кислых лектинов и pI (7.6-8.0) при выделении щелочных лектинов.

В результате проведенных исследований нами показано, что стерилизация супернатанта мембранной вакуумной микрофильтрацией позволяет не только исключить контаминацию продукта посторонней микрофлорой, но и удалить примесные микрочастицы из супернатанта. Мембранная ультрафильтрация в центрифугах с качалочным ротором обеспечивает удаление из материалов низкомолекулярных компонентов с молекулярной массой менее 30 кDа, как на стадии переработки супернатанта, так и при выделении целевого продукта из полиакриламидного геля. Инкубация отфильтрованного супернатанта с пятикратным избытком ледяного ацетона в течение 8 ч гарантирует переход основной массы целевого продукта в осадок, что значительно повышает качество последующего выделения и очистки лектинов. Применение горизонтального изоэлектрофореза в 5% полиакриламидном геле с 7-8 М мочевиной и 5% сахарозой в градиенте рН 4-8 обеспечивает высокую степень очистки от примесных белков и выделения целевого продукта. Изофокусирование в процессе электрофореза в двух точках рI (4.0-4.3) и рI (7.5-8.0) позволяет выделять не только кислые, но и щелочные лектины. Вся же совокупность последовательных операций и процессов, предложенная в заявляемом изобретении, обеспечивает получение лектинов с противокандидной активностью.

Согласно изобретению, способ получения лектинов, обладающих противокандидной активностью, из культуральной жидкости смеси штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus (NK1, 100_аш, К₃Ш₂₄) после выращивания микроорганизмов обеспечивается тем, что культуральную жидкость замораживают, удаляют слой жира, обезжиренную часть размораживают и отделяют клетки центрифугированием, супернатант стерилизуют мембранной вакуумной фильтрацией, концентрируют мембранной ультрафильтрацией в процессе центрифугирования, обрабатывают концентрат супернатанта с компонентами более 30 кDа пятикратным избытком ледяного ацетона, выделяют центрифугированием образовавшийся осадок, удаляют надосадок и проводят очистку и выделение целевого продукта методом горизонтального изоэлектрофореза. Отделение клеток микроорганизмов, мембранную ультрафильтрацию супернатанта, отделение осадка после инкубации отфильтрованного супернатанта с избытком ледяного ацетона осуществляют центрифугированием при скорости вращения ротора 5500 об/мин в течение 90 мин. Перед электрофорезом осадок разводят 20 мМ NaCl в соотношении 2:1 по объему и смешивают с 10% твин-80 до конечной концентрации твина 1%. Очистку и выделение целевого продукта проводят методом горизонтального изоэлектрофореза в пластине 5% полиакриламидного геля с 7-8 М мочевиной и 5% сахарозой в градиенте рН 4-8 при температуре (10±2)°С в течение 8 ч. При выделении целевого продукта после электрофореза гелевые ленты нарезают по изоточкам, замораживают при температуре (-20°С) в течение 2 ч, размораживают и диспергируют в физрастворе, отделяют центрифугированием твердые частицы, концентрируют центрифугированием при 5500 об/мин в течение 60 мин при комнатной температуре, удаляют низкомолекулярные примеси и смешивают концентрат с фосфатным буфером в 100-кратном объеме. Гелевые ленты нарезают по изоточкам pI (4.0-4.3) при выделении кислых лектинов и pI (7.6-8.0) при выделении щелочных лектинов.

Заявляемый способ получения лектинов, обладающих противокандидной активностью, является новым и в литературе не описан.

Техническим результатом заявляемого изобретения является выделение лектинов, обладающих противокандидной активностью, из культуральной жидкости смеси штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus (NK1, 100_аш, К₃Ш₂₄) после выращивания микроорганизмов.

Сущность изобретения поясняется на следующем примере, показывающем выделение лектинов, обладающих противокандидной активностью, из культуральной жидкости смеси штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus (NK1, 100_аш, К₃Ш₂₄) после выращивания микроорганизмов.

Пример. Для выделения лектинов использовали культуральную жидкость (КЖ) смеси трех штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus (NK1, 100_аш, К₃Ш₂₄), применяемых в производстве пробиотика «Ацилакт», полученную в соответствии с патентом (5).

КЖ замораживали в течение 8 ч при температуре минус 20°С, удаляли механическим способом жировой слой и размораживали обезжиренную КЖ. Температура замораживания и размораживания КЖ, а также продолжительность этих процессов не оказывают влияния на технический результат.

Обезжиренную КЖ центрифугировали в течение 90 мин при 5500 об/мин в центрифуге Р-6 (Россия) по 60 мл КЖ в каждом стакане. Клетки микроорганизмов удаляли деконтацией. Далее осуществляли стерилизацию супернатанта мембранной вакуумной микрофильтрацией в патронах Steriflip (Millipore, США) по 40 мл супернатанта в патроне, создавая вакуум водоструйным насосом. Одновременно со стерилизацией происходит процесс удаления микрочастиц из супернатанта.

Затем, при той же температуре (10°С), проводили процесс мембранной ультрафильтрации в течение 90 мин при 5500 об/мин для удаления из супернатанта низкомолекулярных компонентов с молекулярной массой менее 30 кДа, используя центрифугу с качалочным ротором Rotina-45R (Германия) с вставкой в каждый стакан объемом 1 л по 4 патрона Centricon Plus-20 (Millipore, США), завинченных снизу на пластмассовые 50 мл сборники фильтрата, по 10 мл стерилизованного супернатанта в патроне. Выход отфильтрованного супернатанта составлял 100 мкл из каждого патрона.

Для образования осадка целевого продукта отфильтрованный супернатант обрабатывали 5-кратным избытком ледяного ацетона в течение 8 ч при температуре (5±2)°С. Образовавшийся осадок отделяли на центрифуге РС-6 при 5500 об/мин в течение 90 мин.

Далее осадок разбавляли 20 мМоль NaCl в соотношении 2:1 по объему и разливали по эппендорфам по 50 мкл, инкубировали в термостате при 80°С в течение 3 мин, охлаждали до комнатной температуры и добавляли по 5 мкл 10% твин-80 (Sigma). Перемешанную суспензию наносили на помещенную на пластину геля параллельно нитевому платиновому электроду ацетатцеллюлозную ленту шириной 0,5 см по 20 мкл на 1 см ленты и осуществляли изофокусирование (Multiphore II, Amersham, Швеция; 600-700 В; на аноде - 10 мМ H₃PO₄, на катоде - 0,1 М NaOH) в градиенте рН 4-8, обеспеченном Servalit (Serva, Германия) 4-6 (40% w/v) и Biolyte (Bio-Rad, США) 6-8 (40% w/v) из расчета по 1 мл каждого на 10 мл геля) в пластине (15×25×0,1 см) 5% полиакриламидного геля с 7-8 М мочевиной и 5% сахарозой при температуре (10±2)°С в течение 8 ч. Через 30 мин изофокусирования повторяли нанесение концентрата на ленту.

Гелевые ленты с продуктом нарезали из пластины геля параллельно электродам по изоточкам в интервале pI (4.0-4.3) при выделении кислых пектинов и pI (7.6-8.0) при выделении щелочных и помещали в термостойкие пробирки с 5 мл физраствора, замораживали при минус 20°С в течение 2 ч, размораживали, измельчали в объеме пробирки, центрифугировали при 5500 об/мин в течение 60 мин и декантировали надосадок.

Далее повторяли операции мембранной микрофильтрации и ультрафильтрации, как описано выше.

Полученные концентраты целевого продукта (лектинов) переносили в эппендорфы и замораживали.

Выход полученного препарата лектинов из супернатанта после концентрирования составляет 1-5 мг из 1 г белка концентрата.

В таблице приведены сравнительные данные по противокандидной активности (против клинических щтаммов Candida albicans, свежевыделенных и из музея ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского»), определеяемой методом диффузии в агар, лектинов в концентрации менее 1 мкг/мл, полученных согласно заявляемому способу, и различных субстанций «Ацилакта» (прототип), приготовленного согласно патента (5).

Как следует из представленных в таблице сравнительных данных, лектины, полученные заявляемым способом из культуральной жидкости смеси штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus (NK1, 100_аш, К₃Ш₃₄) после выращивания микроорганизмов, обладают явным противокандидным действием, значительно превышающим таковую способность прототипа.

Противокандидная активность препаратов культуральных жидкостей смеси пробиотических штаммов лактобацилл Испытуемый препарат Противокандидная активность Зона лизиса гриба вокруг диска, мм Пролонгированность действия, мес Ингибирование роста (уменьшение числа колоний, образование колоний меньшего размера) Лектины, полученные заявленным способом 10-16 5 (для кислых пектинов при 0-15°С) да «Ацилакт» нативный (1000-2000 мкг/мл) 2-4 (отсутствие в разведениях 1:2, 1:5 и более) нет нет Супернатант «Ацилакта»(1000-2000 мкг/мл) 2-4 (отсутствие в разведениях 1:2, 1:5 и более) нет нет Ультрафильтрат «Ацилакта» 3-4 (отсутствие в разведениях 1:2, 1:5 и более) нет нет

ЛИТЕРАТУРА

1. Лахтин В.М. Лектины и аспекты их изучения. / Микробиологический журнал. - Киев, 1989. - т.51, №3. - с.69-74.

2. RU, патент 2367686 C1, C12N 1/20, A61K 31/715, 20.09.2009.

3. SU, авторское свидетельство 1622397 A1, C12P 19/04, 22.09.1990.

4. Пробиотики, пребиотики, синбиотики и их роль в поддержании иммуномикроэкологического статуса человека. / Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Поспелова В.В., Николаева Т.Н., Бляхер М.С., Черепанова Ю.В., Агапова Ю.В. // MATERIA MEDICA. Тематический сборник для практикующих врачей. - М: «Фармарус Принт», 2006. - с.43-57.

5. RU, патент 2053781 C1, A61K 35/74, 10.02.1996.

Культуральную жидкость, полученную после выращивания смеси штаммов Lactobacillus acidophilus NKI, 100_аш, К₃Ш₂₄, замораживают, удаляют слой жира, обезжиренную часть размораживают и отделяют клетки центрифугированием. Полученный супернатант стерилизуют мембранной вакуумной фильтрацией, концентрируют мембранной ультрафильтрацией в процессе центрифугирования, обрабатывают концентрат супернатанта с компонентами более 30 кDа пятикратным избытком ледяного ацетона. Полученный осадок разводят 20 мМ NaCl в соотношении 2:1 по объему и смешивают с 10% твин-80 до конечной концентрации твина 1%. Очистку и выделение целевого продукта проводят методом горизонтального изоэлектрофореза в пластине 5% полиакриламидного геля с 7-8 М мочевиной и 5% сахарозой в градиенте рН 4-8 при температуре 8-12°С в течение 8 ч. При выделении целевого продукта после электрофореза гелевые ленты нарезают по изоточкам, замораживают при температуре (-20°С) в течение 2 ч, размораживают и диспергируют, отделяют центрифугированием твердые частицы, концентрируют центрифугированием при 5500 об/мин в течение 60 мин при комнатной температуре, удаляют низкомолекулярные примеси и смешивают концентрат с фосфатным буфером в 100-кратном объеме. Гелевые ленты нарезают по изоточкам р1 (4.0-4.3) при выделении кислых лектинов и рI (7.6-8.0) при выделении щелочных пектинов. Это обеспечивает получение лектинов, обладающих противокандидной активностью. 4 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения лектинов, обладающих противокандидной активностью, из культуральной жидкости смеси штаммов Lactobacillus acidophilus NK1, 100_аш, К₃Ш₂₄ после выращивания микроорганизмов, характеризующийся тем, что культуральную жидкость замораживают, удаляют слой жира, обезжиренную часть размораживают и отделяют клетки центрифугированием, супернатант стерилизуют мембранной вакуумной фильтрацией, концентрируют мембранной ультрафильтрацией в процессе центрифугирования, обрабатывают концентрат супернатанта с компонентами более 30 кДа пятикратным избытком ледяного ацетона, выделяют центрифугированием образовавшийся осадок, удаляют надосадок и проводят очистку и выделение целевого продукта методом горизонтального изоэлектрофореза с применением пластины 5% полиакриламидного геля с 7-8 М мочевиной и 5% сахарозой в градиенте рН 4-8 при температуре 8-12°С в течение 8 ч.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что отделение клеток микроорганизмов, мембранную ультрафильтрацию супернатанта, отделение осадка после инкубации отфильтрованного супернатанта с избытком ледяного ацетона осуществляют центрифугированием при скорости вращения ротора 5500 об/мин в течение 90 мин.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед электрофорезом осадок разводят 20 мМ NaCl в соотношении 2:1 по объему и смешивают с 10% твин-80 до конечной концентрации твина 1%.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при выделении целевого продукта после электрофореза гелевые ленты нарезают по изоточкам, замораживают при температуре -20°С в течение 2 ч, размораживают и диспергируют, отделяют центрифугированием твердые частицы, концентрируют центрифугированием при 5500 об/мин в течение 60 мин при комнатной температуре, удаляют низкомолекулярные примеси и смешивают концентрат с фосфатным буфером в 100-кратном объеме.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что гелевые ленты нарезают по изоточкам pI (4,0-4,3) при выделении кислых пектинов и pI (7,6-8,0) при выделении щелочных пектинов.