КОМПОЗИЦИЯ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ПОСТАНОВКИ КСАНТИНОКСИДАЗНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/573 

Изобретение относится к медицинской биохимии, аналитической химии, а именно к созданию реагентов, для проведения и определения активности ферментативной реакции в клинической лабораторной диагностике.

Ксантиноксидаза (КФ: 1.17.3.2) - фермент, катализирующий превращение гипоксантина в ксантин и далее в мочевую кислоту, а также окисление ряда птеридинов, альдегидов и имидазолов (Мецлер Д., 1976). Активное изучение ксантиноксидазы началось в связи с открытием ее супероксидобразующей, канцерогенной и апопто генной активностей. Кроме того, показано, что ксантиноксидаза является главной системой генерирования активных форм кислорода в живых организмах (Маеда X., 1998). В последнее десятилетие определение активности ксантиноксидазы все чаще используется с диагностической целью при различных патологических состояниях.

Известен способ определения активности ксантиноксидазы в сыворотке крови у детей (Полиорганная мембранная патология. Ред. Ю.Е.Вельтищев и др. М 1991; С.165-167) в котором используется композиция реагентов включающая: раствор карбоната натрия, раствор ЭДТА и раствор нитротетразолиевый синий (красящий раствор)и воду.

В пробирку последовательно добавляют 2,6 мл раствора карбоната натрия, 0,1 мл раствора ЭДТА и 0,2 мл раствора нитротетразолиевого синего. В опытную пробирку добавляют 0,1 мл ксантина. Сыворотку (предварительно прогретую в термостате) добавляют в реакционную смесь непосредственно перед измерением, которое осуществляют в течение 1 мин на спектрофотометре при длине волны 560 нм. Разница между исследуемой и контрольной пробой является показателем активности ксантиноксидазы.

Недостатком известной смеси реагентов является невозможность использования в виде готовой смеси; поскольку используемые реагенты нестабильны, смесь требуюет приготовления непосредственно перед применением.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является известный и широко применяемый набор реагентов, используемый для определения активности ксантиноксидазы в методе S.Hashimoto (Shigebumi Hashimoto «A new spectrophotometric Assay Method of Xantineoxidase in Grude Homodenate» Analytical biochemistry, 1974, 62, с.426-435), содержащий фосфатный буфер (pH 7.4, 150 µмоль), 0,6 мМ оксонат калия, ксантин (0.2 µмоль), трихлоруксусную кислоту (20%).

Недостатками известного набора реагентов являются:

- сложность постановки реакции с использованием известного набора реагентов, поскольку их необходимо использовать в несколько этапов;

- высокая токсичность, поскольку трихлоруксусная кислота является токсичным веществом, поэтому она не может быть включена в реагентную смесь изначально, поскольку изучаемый фермент будет ингибирован;

- ограниченные возможности использования, поскольку для последующего анализа необходимо использовать дорогостоящее оборудование (УФ-спектрофотометр), вследствие чего известный реагент невозможно использовать в условиях стандартно оснащенной клинико-диагностической лаборатории;

- невозможность серийного производства.

Техническим результатом изобретения являются:

- упрощение применения при постановке реакции;

- снижение токсичности;

- расширение возможности использования в условиях стандартно оснащенной клинико-диагностической лаборатории;

- возможность серийного производства.

Технический результат достигается тем, что композиция реагентов для постановки ксантиноксидазной реакции, содержит калий фосфорнокислый двузамещенный, соляную кислоту, воду, субстрат (сочетание субстратов) выбранных из группы - птеридины, альдегиды, цистеин, а также дополнительно содержит полиэфирный гетерополимер выбран из группы - акриловый, олефиновый, силоксановый, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-4 Кислота соляная 0,1-0,2 Субстрат 0,003-0,01 Полиэфирный гетерополимер 40-60 Вода остальное

В композиции реагентов для постановки ксантиноксидазной реакции, субстрат, выбранный из группы: пурины (пурин, 2,6-дигидропурин (ксантин), 1-метилксантин, 6-меркаптопурин, гипоксантин(6-оксипурин), аденин); птеридины (птеридин, 2,6-диоксиптеридин, гистидин), цистеин, 6-деоксиацикловир, аллопуринол; альдегиды (алифатические альдегиды (алкенали, алканали, 2-бутеналь, 2-ноненаль, 4-гидрокси-2-ноненаль), ароматические альдегиды (бензальдегид, ванилин), и воду, согласно изобретения, дополнительно содержит полиэфирный гетерополимер выбранный из группы: акриловый, олефиновый, силоксановый.

Использование полиэфирного гетерополимера в качестве разделительного геля, позволяет существенно упростить постановку реакции, поскольку реакция может быть проведена в один этап, так как во время центрифугирования кровь разделяется на твердую и жидкую фракции, при этом твердая фракция осаждается под гелем, а жидкая, которую разделительный гель пропускает сквозь себя, остается сверху. В связи с тем, что исследуемый фермент (ксантиноксидаза) функционирует преимущественно в клетках, этот механизм обеспечивает стабильность состава плазмы и останавливает ферментативную реакцию. При этом исключается необходимость использования для остановки реакции токсичной трихлоруксусной кислоты, или подобных реагентов, необходимых для осаждения белка. Поэтому использование для разделения компонентов крови и остановки реакции полиэфирного гетерополимера позволяет сделать композицию нетоксичной.

Реакция может быть проведена при помощи химически стабильной, композиции реагентов, что позволяет производить ее серийно и поставлять в лаборатории непосредственно в готовом для постановки реакции виде, например, в пробирках, где полиэфирный гетерополимер до начала центрифугирования находится в нижней части пробирки в виде слоя, не смешанного с другими компонентами композиции.

Заявляемая композиция реагентов позволяет определять активность ксантиноксидазы в цельной гепаринизированной крови, а при необходимости - в другом биоматериале, и может применяться для определения активности ксантиноксидазы с использованием как сложного оборудования исследовательского уровня, современных биохимических анализаторов, так и недорогого легкодоступного фотометрического оборудования поскольку для регистрации накопления продукта реакции, в отличие от аналога (где используется спектрофотометрическое определение по поглощению монохроматического ультрафиолетового света депротеинатами исследуемых образцов, требующий оборудования исследовательского уровня), могут быть использованы стандартные методы определения мочевой кислоты, которые выполняются с применением любого доступного фотометрического оборудования, поскольку регистрация накопления продукта реакции осуществляется в видимой области спектра.

При концентрации компонентов буферной смеси (калий фосфорнокислый двузамещенный и соляную кислоту,) вне указанных диапазонов (3-4% и 0,1-0,2% соответственно) нарушается стабильность исследуемого фермента и/или применяемого субстрата, скорость реакции замедляется. Буферная смесь предназначена для поддержания в реагентной композиции оптимального значения водородного показателя (pH), что необходимо для нормального протекания ферментативной реакции и для обеспечения стабильности субстрата, входящего в состав композиции.

Субстрат для ксантиноксидазы выбран из группы: пурины (пурин, 2,6-дигидропурин (ксантин), 1-метилксантин, 6-меркаптопурин, гипоксантин(6-оксипурин), аденин); птеридины (птеридин, 2,6-диоксиптеридин, гистидин), цистеин, 6-деоксиацикловир, аллопуринол; альдегиды (алифатические альдегиды (алкенали, алканали, 2-бутеналь, 2-ноненаль, 4-гидрокси-2-ноненаль), ароматические альдегиды (бензальдегид, ванилин), поскольку перечисленные субстраты специфично взаимодействуют с ферментом (ксантиноксидазой), что делает возможным оценку его активности (по скорости образования продуктов, копродуктов, а также по скорости убыли субстрата). Субстраты могут быть использованы как в виде монореагента, так и в сочетании. Выбор конкретного субстрата или нескольких субстратов для включения их в композицию, а также их концентраций (в границах установленного диапазона) осуществляется в зависимости от предполагаемого способа регистрации скорости ферментативной реакции (по скорости образования продуктов, копродуктов, по скорости убыли субстрата, спектрофотометрическая регистрация, флюорометрическая регистрация, хроматографическая регистрация, уриказный метод и т.п.). При низкой или избыточной концентрации субстрата снижается аналитическая чувствительность определения активности фермента.

Полиэфирный гетерополимер выбран из группы: акриловый, олефиновый, силоксановый поскольку именно данные вещества обладают физико-химическими свойствами, которые не препятствуют протеканию ферментативной реакции (поэтому могут находиться в составе композиции изначально), эффективно отделяют красные кровяные клетки от плазмы крови при центрифугировании (что позволяет остановить ферментативную реакцию после ее проведения), не являются токсичными. Включение в состав реагента полиэфирного гетерополимера в массовой доле 40-60% необходимо для остановки ферментативной реакции с применением центрифуги и получения образцов для определения активности фермента. Увеличение или снижение массовой доли полиэфирного гетерополимера снижает качество получаемых при центрифугировании образцов и разделения компонентов крови.

Пример использования композиции реагентов

В стеклянную или пластиковую пробирку, содержащую в качестве стабилизатора гепарин, забирают 1,0 мл крови, перемешивают. Материал стабилен в течение 48 часов при 4°C.

Для исследования активности ксантиноксидазы необходимо 0,6 мл цельной крови, предлагаемый реагент и стандартный набор реактивов и оборудования для определения содержания мочевой кислоты в сыворотке крови уриказным методом.

Ход исследования

Пример конкретного состава композиции для постановки ксантиноксидазной реакции:

Соотношение компонентов, мас.%:

Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-4 Кислота соляная 0,1-0,2 2,6-дигидропурин 0,003-0,004 Полиэфирный гетерополимер 40-60 Вода остальное

1) Инициация ферментативной реакции.

В полиэтилентерфталатовую пробирку, содержащую реагентную композицию вносят 0,3 мл цельной крови. Параллельно готовится «холостая проба». Состав, объем и соотношение реагентов полностью идентично опытной пробе за исключением 2,6-дигидропурина. Содержимое пробирок перемешивают.

2) Инкубация. Осуществляется в течение 90 минут при 37°C в термостате.

3) Получение образцов для определения содержания мочевой кислоты. Центрифугирование 15 минут при 4000 об/мин. Надосадочную жидкость используют для дальнейшего анализа.

5) Определение содержания мочевой кислоты в опытной и «холостой» пробах с использованием стандартных тест-систем.

Активность ксантиноксидазы рассчитывается как разность содержания мочевой кислоты между опытной и «холостой» пробами, и выражается в мкМ/мин/л или в международных единицах активности (mU/ml).

В отличие от аналога из реагентной композиции исключен оксонат калия, предназначенный для ингибирования уриказы - фермента, содержащегося в тканях некоторых животных и препятствующий накоплению продукта ксантиноксидазной реакции - мочевой кислоты. В тканях человека (в том числе и в крови) данный фермент не содержится, поэтому нет необходимости включать в состав реагентной смеси ее ингибитор (оксонат калия). Кроме того, наличие оксоната калия в реагентной смеси сделает невозможным регистрацию продукта при помощи стандартного уриказного метода.

Изобретение относится к химическим композициям реагентов. В состав композиции входят: калий фосфорнокислый двузамещенный и соляная кислота - в качестве компонентов буферной смеси, вода, субстрат или сочетание субстратов, выбранных из группы - птеридины, альдегиды, цистеин, а также дополнительно содержится акриловый, олефиновый или силоксановый полиэфирный гетерополимер. Композиция применяется в клинической лабораторной диагностике и биохимии для проведения ксантиноксидазной реакции. Техническими результатами изобретения являются упрощение постановки реакции, снижение токсичности композиции и возможность ее серийного производства. 1 пр.

Композиция реагентов для постановки ксантиноксидазной реакции, содержащая калий фосфорнокислый двузамещенный, соляную кислоту, субстрат, воду, отличающаяся тем, что субстрат (сочетание субстратов) выбраны из группы - птеридины, альдегиды, цистеин, а также дополнительно содержит полиэфирный гетерополимер, выбранный из группы - акриловый, олефиновый, силоксановый, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-4 Кислота соляная 0,1-0,2 Субстрат 0,003-0,01 Полиэфирный гетерополимер 40-60 Вода Остальное