УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ КЛЕТОК Российский патент 2013 года по МПК C12M1/34 

Настоящее изобретение относится к области стимулирования роста клеток живых организмов, а точнее к устройствам электрического управления процессом роста клеток и тканей путем непосредственного приложения к тканям и клеткам электрического поля или тока. Настоящее изобретение относится к устройствам осуществления управления ростом клеток и тканей in vitro.

Известны устройства электрической стимуляции (ЭС) роста клеток и тканей in vitro [1, 2, 3].

Известно устройство ЭС [1], содержащее набор электродов, размещенных на электродной плате, осуществляющей электрическое соединение с электродами, и слой защитного покрытия, отделяющего электродную плату от среды культивирования клеток. Особенностью устройства является локальное подведение ЭС к клеткам и тканям, находящимся в питательной среде, что понижает энергопотребление устройства, и позволяет более эффективно подводить напряжение или ток к культивируемым клеткам. Тем не менее, данная конструкция требует применения особых планшетов, и не может быть использована в традиционных культуральных планшетах (планшетках для роста культур клеток), что ограничивает область его применения при исследовании различных оснований для культивирования клеток.

Известно устройство ЭС [2], которое содержит набор из двух электродов различной геометрии, находящихся на противоположных сторонах лунки культурального планшета. При этом устройство отличается тем, что электрическое поле для ЭС клеток формируется на электродах, что снижает эффективность воздействия на одну клетку, а также приводит к неравномерному распределению линий электрического поля на дне лунки культурального планшета.

Тем не менее, даже использование электродов произвольной формы не позволяет проводить ЭС на поверхностях для культивирования клеток в стандартных культуральных планшетах с подведением потенциала непосредственно к каждой клетке.

Наиболее близким по технической сущности к заявленному изобретению является устройство ЭС [3], содержащее культуральный планшет, набор химически и биологически инертных электродов для размещения над культуральным планшетом, расположенных на противоположных сторонах каждой лунки, каждый из электродов в которой плоский и вытянут вдоль лунки. По сравнению с описанными выше конструкциями устройств ЭС [1, 2] данное устройство может быть использовано в стандартных многолуночных культуральных планшетах, при этом в каждую лунку планшета может быть введен одновременно потенциал ЭС. Однако, как и описанные выше устройства ЭС [1,2], оно не обладает достаточной локализацией электрического поля вблизи клеток и требует приложения высоких напряжений для доставки потенциала ЭС через среду для культивирования к клеткам, что повышает его энергопотребление. Это обусловлено, в первую очередь, большим расстоянием между электродами.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение локальности передаваемого потенциала к клетке и снижение потребляемой мощности, за счет организации системы электродов, непосредственно передающих потенциал ЭС клеткам через электропроводящее основание. Технический результат заявленного изобретения заключается в повышении эффективности стимулирующего воздействия электрического поля на одну клетку и равномерном распределении линий электрического поля в зоне дна лунки.

Для достижения поставленной задачи в устройство ЭС, содержащее многолуночный культуральный планшет и макетную плату с внешними выводами, прикрепленную к крышке планшета, введен набор электродов, размещенных на крышке планшета, которые погружаются в питательную среду до контакта с основанием на дне лунки, причем на каждую лунку приходится два электрода располагающегося на одной линии, проходящей через центр планшета и находящиеся на не менее, чем на половине радиуса от центра и отличающийся тем, что каждый электрод является цилиндрическим, диаметр которого является минимально необходимым для обеспечения подвода потенциала к проводящему основанию, располагающемуся на дне лунки. Электроды соединены с макетной платой для подведения внешних электрических импульсов при этом из каждой пары электродов, один соединен с одной электрической шиной, второй - со второй электрической шиной на макетной плате, располагающейся на крышке стандартного культурального планшета, обеспечивая подведение соответствующей разности потенциалов, при этом контакт электродов с шиной на макетной плате осуществляется через отверстие в крышке планшета диаметром, не превышающем полутора диаметров электрода, что обеспечивает свободу хода электрода и защиту от проникновения внешних факторов в процессе роста клеток.

Благодаря свободному ходу электродов на дно лунки может быть помещено электропроводящее основание с латеральными размерами, не менее чем расстояние между электродами, к которому может быть подведен электрический сигнал непосредственно в процессе культивирования клеток на проводящем основании.

Максимальный положительный эффект достигается, если основание и электроды формируют при соприкосновении омический контакт, то есть контакт, сопротивление которого не превышает 100 Ом. Тогда основное падение напряжения происходит на электропроводящем основании, а не в среде для культивирования, что позволяет минимизировать прикладываемые напряжения для ЭС клеток, расположенных на электропроводящем основании.

Изобретение иллюстрируется графическими материалами, где изображено:

Фиг.1 - схема устройства подведения ЭС через проводящие цилиндрические электроды, находящиеся в контакте с проводящим основанием в лунке культурального планшета, где:

1 - цилиндрические электроды, 2 - лунка, 3 - проводящее основание, 4 - макетная плата, 5 - электрические шины, 6 - отверстие для цилиндрического электрода.

Фиг.2 - вид зависимости жесткости электрода и контактного сопротивления со средой от радиуса электрода.

Фиг.3 - конструктивная схема 6 луночного планшета с цилиндрическими электродами, где:

1-6 - луночный планшет, 2 - крышка 6 - луночного планшета, 3 - макетная плата на верхней стороне крышки, 4 - цилиндрические электроды диаметром 0,3 мм, 5 - электрическое соединение для передачи сигнала от внешнего источника.

Фиг.4. - микрофотография фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ) на проводящем основании после культивирования в течение 48 часов при приложенных импульсах напряжения 10 мВ (а) и 200 мв (б), где:

1 - покровное стекло, покрытое проводящей пленкой углеродных нанотрубок, 2 - золотые контактные площадки, 3 - клетки ФЭЧ.

Фиг 5. Зависимость коэффициента пролиферации клеток ФЭЧ, измеренного по методу МТТ на длине волны 492 нм, от приложенных к электродам импульсов напряжений.

Устройство ЭС согласно изобретению содержит (Фиг.1) культуральный планшет, содержащий, по крайней мере, одну лунку, над каждой лункой помещаются два цилиндрических электрода 1, соединенные через отверстие 6 в крышке стандартного культурального планшета с электрическими шинами 5, нанесенными на макетную плату. При этом электроды образуют контакт с проводящим основанием на дне лунки, на котором происходит ЭС культивирование клеток и тканей.

Диаметр электрода рассчитывается из двух условий: диаметр электродов должен быть достаточным для обеспечения упругого контакта одного конца электрода с проводящим основанием в лунке при прогибе электрода не более 10% от длины участка электрода в лунке, с другой стороны - площадь контакта поверхности электрода с окружающей средой должна быть минимальной для обеспечения минимальных утечек тока через среду для культивирования.

Известно, что жесткость электрода в виде стержня К определяется его механическими свойствами и геометрическими размерами согласно выражению:

$$K=\frac{E}{l}\pi r^2,$$

где Е - модуль Юнга, l - длина стержня, r - радиус стержня.

В приближении, что все напряжение падает на контактной области поверхности электрода и среды для культивирования, выражение для сопротивления R принимает следующий вид:

$$P=\frac{pl}{\pi r^2},$$

где ρ - удельное сопротивление электрода, l - длина стержня, r - радиус стержня.

Согласно изобретению, сопротивление контактной области со средой должно быть максимальным, для обеспечения прохождения тока непосредственно через проводящее основание к клеткам, при этом жесткость должна быть достаточна высокая, для обеспечения омического контакта конца электрода с проводящим основанием. Согласно Фиг.2 сопротивление будет максимальным при уменьшении радиуса, тогда как жесткость увеличивается с увеличением радиуса электрода. Таким образом, следует искать оптимальное значение радиуса для конкретного материала электрода. С учетом того, что зависимость изменения сопротивления от радиуса уменьшается быстрее, чем увеличивается жесткость, то радиус должен быть выбран в области низких значений. В заявленном изобретении радиус цилиндрического электрода может быть не менее 0,1 мм и не более 5 мм.

Электрические потенциалы в виде постоянного напряжения, переменного, импульсного или сигнала любой другой формы подаются на два электрода, находящихся в лунке. При этом электроды выполнены или покрыты из химически и биологически инертного материала, обладающего высокой электропроводностью. При этом диаметр электродов выбирается из условия обеспечения их жесткости для формирования контакта с основанием: то есть, при контакте с основанием электроды должны испытывать только упругую деформацию. Материал электродов может быть платина, золото, нержавеющая сталь, или другие биосовместимые сплавы, покрытые золотом или платиной.

Материал проводящего основания может быть выполнен из любого биологически инертного и химически стойкого проводящего материала, например золото, платина, оксид титана, легированный оловом, пленка нанотрубок, графенов.

Цилиндрический электрод может быть закреплен на макетной плате под плечом 90°, обеспечивая свободный ход электрода по вертикали на расстояние не менее 10% от высоты электрода, обеспечивая пружинный контакт к проводящему основанию на дне лунки планшета.

Максимальная эффективность устройство достигается когда все напряжение прикладываемое к электродам линейно падает на проводящем основании, при этом максимальная локализация электрического поля достигается в случае, если основание выполнено в виде перколированной сетки с шагом ячеек не более, чем размер одной культивируемой клетки.

Пример конкретного исполнения

В качестве примера конкретного исполнения изобретения был выбран стандартный 6-луночный планшет с диаметром каждой лунки 3,5 см и глубиной 1 см (Фиг.3). В крышке планшета формировались по два отверстия над каждой лункой. Диаметр отверстия составлял 0,5 мм. На крышке располагалась макетная плата со сформированной системой разводных шин. К каждой шине над каждой лункой припаивалось по одному электроду диаметром 0,3 мм из биосовместимого сплава 40КХНМ-ВИ со сформированным золотым покрытием толщиной не менее 1 мкм. Электрод общей длиной не более 5 см, изгибался под углом не более 100° и не менее 80° к основанию, так что рабочая часть электрода помещалась через отверстие в крышке перпендикулярно к основанию лунки, касаясь ее своим концом. Оставшаяся часть располагалась горизонтально к макетной плате и припаивалась другим концом к подводящей шине. При этом длина участка электрода между отверстием, в которое входит электрод и местом припоя составляет не менее 1 см для обеспечения свободного хода электрода по вертикали в диапазоне не белее 1 мм.

На дне лунки размещалась электропроводящая подложка, выполненная из основания в виде покровного стекла размером 24×24 мм², системы золотых контактных площадок по краям покровного стекла длиной 24 мм и шириной не менее 10 мм. Между золотыми электродами формировалась тонкая пленка из углеродных нанотрубок. Сопротивление между электродом и золотой контактной площадкой составляло не более 100 Ом.

Клетки фибробласта эмбриона человека (ФЭЧ) культивировали на модифицированных с помощью углеродных нанотрубок покровных стеклах с подведенными электродами, находящихся в 6-луночных планшетах в среде Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Культивирование и ЭС клеток проводились в СО₂ термостате при 37°С, 5% СО₂ в течение 72 часов без антибиотиков.

Через электроды к проводящему основанию подводилась разность потенциалов от 10 мВ до 5 В. После 24 часов инкубации без приложенного напряжения подавался сигнал из 5 импульсов с длиной одного импульса 5 мсек, расстоянием между импульсами 5 мсек и периодом между сериями импульсов 1 сек в течение 48 часов.

Результат использования изобретения в виде конкретного исполнения приведен на Фиг.4 и Фиг.5. Результаты демонстрируют, что благодаря предложенной конструкции изобретения клеточная пролиферация начинает изменяться уже - при напряжениях 50 мВ, при напряжении 200 MB и выше наблюдается пространственная ориентация клеточного монослоя на проводящем основании. При этом максимальное увеличение пролиферации наблюдается при разности потенциалов 100 мВ, что соответствует потребляемой мощности ~1 мкВт. Таким образом, предложенная контракция приводит к локальности передаваемого потенциала непосредственно к каждой клетке и снижению потребляемой мощности в процессе ЭС роста клеток

Источники информации

1. Патент США 6032062.

2. Патент США 20090170178.

3. Патент США 7148059.

Изобретение относится к области стимулирования роста клеток живых организмов, в частности к устройствам электрического управления процессом роста клеток и тканей путем непосредственного приложения к тканям и клеткам электрического поля или тока. Устройство содержит культуральный планшет с лунками и крышкой. На крышке планшета расположены макетная плата, имеющая электрические шины, электроды. Электроды выполнены с возможностью погружения в культуральную среду до контакта с основанием на дне лунки. На каждой лунке размещено по два электрода. Каждый электрод выполнен цилиндрическим, радиус которого равен не менее 0,1 мм и не более 5 мм для обеспечения требуемой жесткости и контактного омического сопротивления с основанием лунки при подводе потенциала к проводящему основанию, размещенному на дне лунки. В крышке планшета выполнены отверстия диаметром, не превышающим полутора диаметров электрода, для размещения в них электродов с возможностью обеспечения свободного хода электродов и защиты от проникновения внешних факторов в процессе роста клеток. Каждый цилиндрический электрод закреплен на макетной плате посредством плеча под углом 90°. Основание каждой лунки может быть выполнено в виде проводящей перколированной сетки с шагом ячейки, не превышающим размера одной культивируемой клетки. Изобретение обеспечивает повышение стимулирующего воздействия электрического поля на одну клетку и равномерное распределение линий электрического поля в зоне дна лунки. 5 ил

Устройство для электрической стимуляции клеток, содержащее культуральный планшет, имеющий крышку и, по крайней мере, одну лунку для размещения в ней культуральной среды клеток, расположенные на крышке планшета макетную плату, имеющую электрические шины, электроды, выполненные с возможностью погружения в культуральную среду до контакта с основанием на дне лунки, причем на каждую лунку размещено по два электрода, расположенных на одной линии, проходящей через центр планшета, и находящиеся на расстоянии не менее чем на половине радиуса от центра, электроды соединены электрически через макетную плату с внешними выводами для подведения электрических импульсов, при этом из каждой пары электродов один соединен с одной электрической шиной, второй - со второй электрической шиной для подвода соответствующей разности потенциалов, каждый электрод выполнен цилиндрическим, радиус которого равен не менее 0,1 мм и не более 5 мм для обеспечения требуемой жесткости и контактного омического сопротивления с основанием лунки при подводе потенциала к проводящему основанию, размещенному на дне лунки, при этом в крышке планшета выполнены отверстия диаметром, не превышающим полутора диаметров электрода, для размещения в них электродов с возможностью обеспечения свободного хода электродов и защиты от проникновения внешних факторов в процессе роста клеток, причем каждый цилиндрический электрод закреплен на макетной плате посредством плеча под углом 90°, основание каждой лунки может быть выполнено в виде проводящей перколированной сетки с шагом ячейки, не превышающим размера одной культивируемой клетки.