Средство, способное стимулировать пролиферацию клеток культур МСК - мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга донора и ФЭЧ - эмбриональных фибробластов человека Российский патент 2023 года по МПК C12N5/00 C12N5/02 C12N5/775 

Изобретение относится к области клеточной биологии и может найти применение при культивировании клеточных культур.

Известно, что мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) оказывают иммуносупрессивное воздействие на иммунокомпетентные клетки, в частности наблюдается подавление активации и пролиферации.

Питательная среда является одним из важнейших компонентов выращивания клеток in vitro. Многие из удач, связанных с высокой скоростью роста и продуктивностью культур клеток, обязаны питательной среде, которая является источником питательных веществ, минералов, микроэлементов и ростовых факторов. Сыворотка крови животных в большинстве случаев является одним из важнейших компонентов питательных сред. В ней содержатся пептидные ростовые факторы, стимулирующие клеточную пролиферацию, и другие важные для жизнедеятельности клетки in vitro компоненты. Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Под ред. Пальцева М.А., М, ОАО «Издательство «Медицина», Издательство «Шико», 2009, т. 1, с. 272 tates. Pest Manag Sci. 2006, v. 62, n. 7, p. 673-677.

Корпорация Sigma предлагает применять среду DMEM/F12 для выращивания широкого спектра культур. В связи с богатым содержанием питательных веществ в среду DMEM/F12 можно добавлять небольшое количество эмбриональной бычьей сыворотки, либо использовать без сыворотки, но тогда необходимо добавлять такие факторы, как инсулин, трансферин, эпидермиальный фактор роста и др.

Известно использование среды DMEM/F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, Biosera), биодобавки ИТС (инсулин-трансферин-селенит, ПанЭко) и гентамицина (50 мкг\мл) для культивирования клеток млекопитающих, содержащая ростовые факторы, стимулирующие клеточную пролиферацию. Трухан И.С. Питательная среда как ключевой фактор культивирования клеток млекопитающихся. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2018,. №12-1, с. 165-172.

Известно о стимулирующем влиянии эритропоэтина на функциональную активность ММСК костного мозга крысы, в частности увеличивается пролиферация, миграция клеток. ММСК получали из клеток костного мозга бедренных костей у крыс. Клетки культивировали в питательной среде DMEM с 10%-иым содержанием эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Россия), 160 мкг/мл гентамицина сульфата («Дальхимфарм», Россия), 2 ммоль L-глутамина (ICN, США) при температуре 37°С во влажной атмосфере с 5%-ным содержанием CO2. В работе использовали клетки 3-5 пассажей. Оценка влияния эритропоэтина в трех дозах 34, 68, 100 МЕ/мл на пролиферативную и миграционную активность ММСК костного мозга показала, что уже в первые часы (1-4 ч.) эксперимента эритропоэтин в дозах 34 и 68 МЕ/мл оказывает стимулирующее действие на пролиферацию ММСК. Данные свойства эритропоэтина можно использовать для увеличения функциональной активности ММСК, что имеет практическое значение при использовании ММСК, предобработанных эритропоэтином, в целях клеточной терапии ишемических заболеваний. Бондаренко Н.А., Лыков А.П., Казаков О.В., Кабаков А.В. и др., Изменения функциональных свойств мезенхимаальных стволовых клеток под влиянием эритропоэтина. Современные проблемы науки и образования. 2017, №6. URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=27257 (дата обращения: 27.06.2022).

Технической задачей заявленного изобретения является выявление способности стимулировать пролиферацию клеток культур МСК-мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга донора и ФЭЧ-эмбриональных фибробластов человека новым средством - водным экстрактом биомассы жука-чернотелки Alphitobius diaperinus, содержащего не менее 15 масс. % сухих веществ, в том числе, свободные аминокислоты, пептиды, сахара, кислоты.

Технический результат, достигаемый от реализации изобретения, заключается в расширении арсенала средств, обеспечивающих способность стимулировать пролиферацию клеток культур МСК-мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга донора и ФЭЧ-эмбриональных фибробластов человека.

Технический результат достигается средством, способным стимулировать пролиферацию клеток культур МСК-мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга донора и ФЭЧ-эмбриональных фибробластов человека, согласно изобретению, представляющим собой антибактериально обработанный водный экстракт биомассы жука-чернотелки Alphitobius diaperinus, содержащий не менее 15 масс. % сухих веществ, в том числе, свободные аминокислоты, пептиды, сахара, органические кислоты, полученный гомогенизацией биомассы жука, водной экстракцией гомогената жука при перемешивании в течение суток и отделением экстракта, полученный осадок вторично экстрагируют в течение суток при перемешивании, аналогично отделяют вторичный экстракт от осадка, экстракты объединяют, центрифугируют в течение 20 мин при 5000 об/мин, супернатант сливают и подвергают антибактериальной обработке.

Техническая сущность заявленного изобретения заключается в следующем.

В качестве основного субстрата для питания жуков использовали зерновую смесь на основе пшеничных отрубей (кормовой субстрат №1). Помимо отрубей в состав данной кормовой смеси входят: кукурузная мука, дробленый горох, сухое молоко.

Кормовой субстрат - смесь №1 имеет следующий состав компонентов, масс. %:

отруби пшеничные - 85, кукурузная мука - 5, дробленый горох - 5, сухое молоко - 5.

Для подкормки жуков использовали влажный корм в виде геля, который наносили на пластиковые подложки (Кормовой субстрат - смесь №2). В состав влажного корма входят: кукурузная мука, соевая мука, дробленый горох, манная крупа, сухое молоко, подсолнечный жом.

Кормовой субстрат - смесь №2 имеет следующий состав компонентов, масс. %:

соевая мука - 49, кукурузная мука - 10. дробленый горох - 10, манная крупа - 10, сухое молоко - 10, подсолнечный жом - 10, вода - остальное.

Данный субстрат после смешения компонентов и добавления 200 масс. % воды от массы смеси наносят на пластиковые подложки, которые помещают на поверхности субстрата, на котором живут жуки. На 240 см² площади расходуется 30 г влажного субстрата. Влажный корм меняется по мере съедания на свежий.

Использовали взрослых жуков по приобретении их наружным покровом темно-коричневого цвета. Жуков отделяли от субстрата просеиванием.

После обездвиживания охлаждением при температуре -18°С в течение 15 мин, биомассу жука гомогенизируют любым способом - растиранием (измельчением) в ступке, измельчением в мясорубке, кофемолке, блендере и т.п. Затем проводят водную экстракцию путем заливки в 10 г гомогената жука Alphitobius diaperinus 30 мл дистиллированной воды и экстракции при перемешивании в течение суток. Экстракт отделяют от твердой массы через стеклянный фильтр, фильтровальную бумагу или капроновую марлю. Полученный осадок заливают 20 мл дистиллированной воды. Экстрагируют вторично сутки при перемешивании. Аналогично отделяют вторичный экстракт от твердой массы, экстракты объединяют, центрифугируют в течение 20 мин при 5000 об/мин и супернатант сливают. Далее супернатант пропускают через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,1 мкм и подвергают фильтрации под давлением с использованием фильтров Миллипак или Миллипор Экспресс или аналогичных фильтров с диаметром пор 0,1 мкм (фильтры, обеспечивающие стерильность и удаление микоплазмы и других микроорганизмов из биологических растворов). Получают очищенный от микроорганизмов водный экстракт биомассы жука-чернотелки Alphitobius diaperinus, содержащий не менее 15 масс. % сухих веществ, в том числе, ростовые факторы - свободные аминокислоты, пептиды, сахара, органические кислоты.

Оценку стимулирующей эффективности полученного средства проверяли следующим образом:

Для изучения влияния заявленного средства на жизнеспособность клеток МСК и ФЭЧ использовали МТТ-тест. Этот тест основан на способности митохондриальных дегидрогеназ живых клеток превращать «желтый» МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)2,5-дифенил тетразолиум бромид) в нерастворимый в водных растворах «синий» формазан. Для анализа клетки рассевали в 96 луночные плато в (10 тыс на лунку) в 100 мкл стандартной культуральной среды. Через 24 ч инкубации к клеткам добавляли по 10 мкл (1/10 объема среды) тестируемого средства в различных концентрациях. Клетки инкубировали еще 48 ч. После чего в каждую лунку добавляли по 20 мкл препарата МТТ (разведенного в физрастворе 5 мкг\мл) и инкубировали в течение 3 ч. За 3 ч инкубации в живых клетках происходит ферментативная реакция и нарабатывается формазан, который в виде кристаллов накапливается в клетках. Чем больше живых клеток, тем больше синтезируется кристаллов. Далее раствор тщательно убирали из лунок и добавляли в каждую лунку 60 мкл ДМСО (диметилсульфоксид) для растворения кристаллов формазана. Тщательно встряхивали до полного растворения. Количественное определение формазана проводили на многоканальном фотометре с фильтром 530 нм. Жизнеспособность клеток оценивали по сравнению оптической плотности в лунках без тестируемого средства и в лунках с препаратами.

Клетки ФЭЧ и МСК растили на стандартной культуральной среде DMEM/F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, Biosera), биодобавки ИТС (инсулин-трансферин-селенит, ПанЭко) и гентамицина (50 мкг\мл). Трухан И.С. Питательная среда как ключевой фактор культивирования клеток млекопитающих. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2018, №12-1, с. 165-172. Клетки рассевали по 3 тыс.на лунку, культивировали с заявленным средством - антибактериально обработанным водным экстрактом биомассы жука чернотелки Alphitobius diaperinus в разведениях от 1:20 до 1:200 в течение 4 суток.

Схема опыта тестирования:

1-й день - рассевали клетки в 96 луночные плато.

2-й день - в лунки добавляли по 10 мкл разных разведений средства. Контролем служили лунки, в которые добавляли 10 мкл культуральной среды. Клетки растили в стандартных условиях в течение 48 ч.

3-й день - рост клеток в стандартных условиях.

4-й день - с помощью МТТ теста оценивали количество клеток, которое выросло в лунках. Все разведения ставили в 3 повторах, и рассчитывали среднее значение.

Влияние средства, представляющего собой антибактериально обработанный водный экстракт биомассы жука-чернотелки Alphitobius diaperinus, содержащий не менее 15 масс. % сухих веществ, в том числе, свободные аминокислоты, пептиды, сахара, органические кислоты, на пролиферацию клеток культур МСК-мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга донора и ФЭЧ-эмбриональных фибробластов человека, рассчитывали в % количество клеток, выращенных в присутствии экстракта, от количества клеток в контроле, которое принимали за 100%. Результаты представлены в таблице (Таблица).

На примере пролиферации клеток культуры ФЭЧ показано, что заявленное средство усиливает пролиферацию клеток по дозозависимому типу. Максимальный эффект этого средства наблюдается в дозе 5% (разведение 1:20), которое снижается по мере увеличения разведения. При разведении 1:200 и выше эффекта уже нет.

Пролиферация культивируемых клеток культуры МСК-мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга донора и клеток культуры ФЭЧ-эмбриональных фибробластов человека стимулируется на 20-65% при введении в питательную среду для культивирования клеток заявленного средства в разведении от 1:20 до 1:100.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлено средство, способное стимулировать пролиферацию клеток культур МСК-мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга донора и ФЭЧ-эмбриональных фибробластов человека, которое представляет собой антибактериально обработанный водный экстракт биомассы жука-чернотелки Alphitobius diaperinus, содержащий не менее 15 масс. % сухих веществ, в том числе, свободные аминокислоты, пептиды, сахара, кислоты. Получено оно гомогенизацией биомассы жука, водной экстракцией гомогената жука при перемешивании в течение суток, отделением экстракта. Полученный осадок вторично экстрагируют в течение суток при перемешивании, аналогично отделяют вторичный экстракт от осадка. Экстракты объединяют, центрифугируют в течение 20 мин при 5000 об/мин, супернатант сливают и подвергают антибактериальной обработке. Изобретение позволяет расширить арсенал средств, обеспечивающих способность стимулировать пролиферацию клеток культур МСК-мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга донора и ФЭЧ-эмбриональных фибробластов человека. 1 табл.

Средство, способное стимулировать пролиферацию клеток культур МСК-мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга донора и ФЭЧ-эмбриональных фибробластов человека, характеризующееся тем, что оно представляет собой антибактериально обработанный водный экстракт биомассы жука-чернотелки Alphitobius diaperinus, содержащий не менее 15 масс. % сухих веществ, в том числе, свободные аминокислоты, пептиды, сахара, кислоты, полученный гомогенизацией биомассы жука, водной экстракцией гомогената жука при перемешивании в течение суток и отделением экстракта, полученный осадок вторично экстрагируют в течение суток при перемешивании, аналогично отделяют вторичный экстракт от осадка, экстракты объединяют, центрифугируют в течение 20 мин при 5000 об/мин, супернатант сливают и подвергают антибактериальной обработке.