ШТАММ Micrococcus luteus, ОБЛАДАЮЩИЙ КАТАЛАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ОСТАТКОВ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Российский патент 2013 года по МПК C12N1/26 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/265 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается использования культуры рода Micrococcus вида Micrococcus luteus для получения нового штамма Micrococcus luteus, который обладает высокой каталазной активностью и способствует повышению продуктивности агроэкосистемы, участвуя в процессах трансформации органических остатков природного происхождения.

Известно, что культура рода Micrococcus - облигатные аэробы, сапрофиты или факультативные паразиты, патогенных видов нет, хорошо растут на питательном агаре, клетки в неправильных скоплениях, у некоторых видов наблюдаются подвижные клетки, распространены повсеместно - в почве, воздухе, воде, пищевых продуктах, разлагают органические остатки, ru.m.wikipedia.org/wiki/Micrococcus.

Известно, что культура рода Micrococcus насчитывает восемь видов: Micrococcus antarcticus Liu et al., 2000 (Micrococcus psychrophilum); Micrococcus flavus Liu et al., 2007; Micrococcus luteus Colm,1872^typus; Micrococcus lylae Kloos et al., 1974, Weiser M et al. 2002; Micrococcus endophyticus Chen et al. 2009; Micrococcus terreus Zhang et al. 2010; Micrococcus yunnanensis Zhao et al. 2009; Micrococcus niistensis sp. nov. 2010, ru.m.wikipedia.org/wiki/Micrococcus.

Известен способ получения компоста, предусматривающий смешение отходов птицеводческих и животноводческих хозяйств с влагопоглощающими материалами и последующее проведение твердофазной ферментации полученной смеси с использованием стимулятора компостирования на основе микроорганизмов, включающих Micrococcus urea П-3, RU №2197453 C1, C05F 11/08, 27.01.2003.

Известен почвогрунт торфяной, включающий биокомпост, полученный путем аэробной ферментации твердых коммунальных отходов и микробного удобрения, содержащего ассоциацию активных микроорганизмов Clavibacter michiganese. Bacillus amylognefaciens, Micrococcus varians, №2366640 C2, C05F 9/00, C05F 11/02, C05F 11/08, 10.09.2009.

Известен биопрепарат для рекультивации техногенно нарушенных объектов окружающей среды и восстановления плодородия почв, включающий пористый носитель и физиологически активные микроорганизмы, как денитрификаторы, в том числе на основе культуры Micrococcus, RU №2248255 C1, B09C 1/10, А01В 79/00, C12S 13/00, 20.03.2005.

Известен способ очистки водоемов от нефтяных загрязнений путем обработки поверхности водоема клетками аэробных микроорганизмов, выбранными из группы культур, включающих микроорганизмы рода Micrococcus, №2191643 C1, B09C 1/10, C12N 1/20, 27.10.2002; RU №2025466 C1, C02F 1/40, 30.12.1994.

Известен биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, включающий наполнитель, минеральные добавки и аэробные нефтеокисляющие бактерии, содержащие консорциум бактериальных штаммов Pseudomonas putida ПИ К_о - 1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus species ПИ К_у - 1, RU №2122980 C1, C02F 3/34, B09C 1/10, C12P 39/00, 10.12.1998.

Известен биопрепарат-нефтедеструктор, включающий культуру бактерий и микробное удобрение-носитель в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила, сформированного при переработке отходов свиноводческих комплексов, содержащее нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis, №2319740 C2, C12N 1/20, B09C 1/10, C02F 3/34, 20.03.2008.

Известен биопрепарат-нефтедеструктор, включающий культуру бактерий и микробное удобрение - носитель в виде ферментированного подстилочного птичьего помета, содержащее нативные микроорганизмы: Clavibacter michiganese, Bacillus amyloliquefaciens, Micrococcus varians, №2292326 C1, C05F 11/08, B09C 1/10, C12N 1/20, 27.01.2007.

Известен способ использования биомассы Micrococcus luteus в виде продукта ее щелочного гидролиза в качестве пигмента для полимерной окрашенной композиции, RU №2420541 C2, C08J 3/20, С09В 61/00, C08L 23/06, 10.06.2011.

Известны способы использования биомассы Micrococcus luteus для определения антигистоновой активности микроорганизмов или определения антилактоферриновой активности микроорганизмов, или определения антикарнозиновой активности микроорганизмов, или определения антилизоцимной активности микроорганизмов, RU №2203956 C2, C12Q 1/02, 10.05.2003; RU №2156807 C2, C12Q 1/02, C12Q 1/04, 27.09.2000; RU №2132879 C1, C12Q 1/04, 10.07.1999; RU №2126051 C1, C12Q 1/02, 10.02.1999.

Известно культивирование штамма - продуцента Micrococcus luteus для получения дисахарида, RU №2230119 C1, C12P 19/12, 10.06.2004.

Известен способ разложения перекиси водорода, используемой для дезинфекции контактных линз, включающий контактирование контактной линзы с жидкой средой, содержащей перекись водорода, в присутствии каталазы микробиологического происхождения, являющейся продуктом деятельности Micrococcus luteus, RU №2126273 C1, A61L 2/18, 20.02.1999.

В известных микроорганизмах рода Micrococcus штамма Micrococcus luteus, с заявляемыми свойствами, не обнаружено.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи, позволяющей выявить из рода Micrococcus штамм, обладающий высокой каталазной активностью и способствующий повышению продуктивности агроэкосистемы.

Технический результат настоящего изобретения заключается в выделении штамма Micrococcus luteus, участвующего в процессах трансформации органических остатков природного происхождения.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что выявлен новый штамм Micrococcus luteus ПБТ-1, который обладает каталазной активностью, осуществляет трансформации органических остатков природного происхождения и повышает продуктивность агроэкосистемы.

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Получен новый штамм Micrococcus luteus ПБТ-1, который обладает высокой каталазной активностью и способствует повышению продуктивности агроэкосистемы, участвуя в процессах трансформации органических остатков природного происхождения.

Родовое название Micrococcus - мелкие грамположительные сферические клетки, которые располагаются поодиночке или в неправильных скоплениях, в большинстве своем неподвижные. На плотных питательных средах образуют круглые, гладкие колонии белого, желтого или красного цвета. Яркий цвет обусловлен выделением окрашенного продукта в окружающую среду или пигментацией самой клетки (окраска может использоваться как характерный признак).

Род Micrococcus на сегодняшний день насчитывает 8 видов, в число которых входит Micrococcus luteus.

Видовое название Micrococcus luteus (Schroeter, 1872).

Штамм Micrococcus luteus ПБТ-1 выделен в июле 2009 г. из образцов дерново-подзолистой почвы, смешанной с соломой зерновых, в Ленинградской области.

Культурально - морфологические, физиологе - биохимические особенности культуры

Быстрорастущая культура. Грамположительные кокки, активно продуцирующие каталазу. Облигатный аэроб. В мазках 18-часовой культуры обнаруживаются мелкие сферические клетки, попарно и в цепочках, размером: 0,5×0,5 мкм. На МПА и МПА с глицерином растет обильно, через сутки образует блестящую колонию желтого цвета. На 3-и сутки образует колонии вязкой консистенции, насыщенного желтого цвета, края колонии округлой формы. При хранении колония становится сухой, долго хранится, хорошо сохраняя свою активность.

Отношение к источникам углерода.

Слабо использует в качестве источника углерода рафинозу, подкисляя среду, практически не использует: арабинозу, галактозу, глюкозу (слабый рост), дульцит, мальтозу, рамнозу, сахарозу, сорбит. Хорошо использует глицерин.

Гидролизует желатину, на МПЖ рост сверху и по штриху, с разрывом среды и газообразованием. Крахмал не гидролизует. На МПБ аммиак не образует, нитраты утилизирует, но не восстанавливает. Солеустойчив, хорошо растет на МПБ с 2,5% и 6,5% NaCl. Штамм не патогенен.

Идентификация штамма Micrococcus luteus

Культура исследована по многочисленным свойствам, используемым в современной систематике.

Для депонирования выделенных штаммов микроорганизмов в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) дополнительно проведена их генетическая идентификация.

Таксономическую принадлежность штаммов определяли с использованием программы BLAST (Altschul et al., 1990), доступной на сервере NCBI.

Для предварительной идентификации использованы литературные данные (Хоулт, 1980; Логинов, 2005) и ресурсы Интернета.

Для идентификации до рода бактериального штамма был просеквенирован участок, соответствующий позициям 700-1400 нуклеотидов гена 16S рРНК. Наибольшее сходство выявлено с родом Micrococcus (с Micrococcus luteus, 100% сходства).

Данные идентификации, характеризующей штамм Micrococcus luteus, представлены на рисунке.

Согласно 9-му изданию определителя Bergey (1986), «Краткому определителю бактерий Берги» (1980), «Практикуму по микробиологии» под ред. Н.С.Егорова (1976), «Методы общей бактериологии» под. ред. Ф.Герхарда (М., 1984), Интернет-ресурсам и др., выделенный штамм отнесен к роду Micrococcus, вид Micrococcus luteus.

Штамм Micrococcus luteus ПБТ-1 депонирован 29.11.2011 под регистрационным номером RCAM 01016 в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения «Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии)».

Пример 1.

Выращивание штамма Micrococcus luteus

Выделение из образцов дерново-подзолистой почвы, смешанной с соломой зерновых, высевом на плотные питательные среды: МПА с 1% глицерином, методом предельных разведении (5-6-е разведение). Количество КОЕ (колониеобразующих единиц) штамма в образце достигает 5-10 млн/г почвы.

Пример 2.

Исследование каталазной активности

При выращивании штамма Micrococcus luteus на поверхности плотной питательной среды (мясо-пептонный агар с 1% глицерином) наносят каплю 10% раствора перекиси водорода, что приводит к выделению кислорода в виде пузырьков газа, свидетельствующих о наличии в клетках бактерии каталазы. При определении каталазы в жидкой культуре штамма Micrococcus luteus, выросшей на мясо-пептонном бульоне с 1% глицерином (1 мл жидкой культуры + 1 каплю 10% перекиси водорода), наблюдают обильное выделение пузырьков газа (кислорода), выходящих за пределы аналитических лунок (Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. 1976).

Пример 3. Процессы трансформации органических остатков природного происхождения

Штамм Micrococcus luteus - культура аэроб, которая активно участвует в окислении органических соединений природного происхождения. При использовании штамма Micrococcus luteus, выросшего на специальной питательной среде с органическими добавками, для разложения растительных остатков, через 1 месяц наблюдается изменение цвета субстрата (потемнение), повышается ломкость (стебли становятся мягкими, легко разрываются).

Проведение биотеста на культуральной жидкости Micrococcus luteus показало, что замачивание семян редиса в питательной среде со штаммом по соответствующей методике (Методические рекомендации ВНИИСХМ. Некоторые новые методы количественного учета почвенных микроорганизмов и изучение их свойств. Л., 1987. 52 с.) может стимулировать рост и развитие проростков, повышая всхожесть редиса от 80-85% (контроль) до 90-95%, а общий вес корней и надземной массы в среднем на 10% относительно контроля.

Штамм Micrococcus luteus ПБТ-1 хранится в коллекции ООО «Петербургские Биотехнологии», 196603, г.Санкт-Петербург - г.Пушкин, Красносельское шоссе, д. 14/28, литера АВ, пом. 1-Н.

Рекомендуемые методы хранения:

- периодически пересеваемую культуру хранят на среде МПА с 1% глицерином, рН 6,8-7,0, при комнатной температуре 3 месяца;

- хранение под минеральным маслом на МПА (рН 6,8-7,0) осуществляют при комнатной температуре не менее 1 года;

- культуру выращивают на МПА при 25°-30°С, хранят при температуре +4°С в холодильнике, поддерживают на МПА с 1% глицерином при +4°, пересев осуществляют 1 раз в 3 месяца;

- длительное хранение (3 года и более) осуществляют в криоконсервированном состоянии при -80°С.

После хранения культура образует однотипные колонии.

Предложенный штамм Micrococcus luteus ПБТ-1 относится к микробиологической промышленности и включает известные способы выделения, подтвержденные исследованиями ООО «Петербургские Биотехнологии», что обусловливает, по мнению заявителя, соответствие его критерию «промышленная применимость».

Новый штамм Micrococcus luteus ПБТ-1 обладает высокой каталазной активностью и способствует повышению продуктивности агроэкосистемы, участвуя в процессах трансформации органических остатков природного происхождения.

Данные идентификации штамма Micrococcus luteus

Штамм Micrococcus luteus ПБТ-1, обладающий высокой каталазной активностью и способствующий повышению продуктивности агроэкосистемы, участвуя в процессах трансформации органических остатков природного происхождения, депонирован в Ведомственной Коллекции Полезных Микроорганизмов Сельскохозяйственного Назначения Россельхозакадемии (RCAM) (ГНУ ВНИИСХМ) под регистрационным номером RCAM 01016 и может быть использован при трансформации органических остатков природного происхождения. Изобретение позволяет повысить продуктивность агроэкосистемы. 3 пр.

Штамм Micrococcus luteus, обладающий каталазной активностью, осуществляющий трансформации органических остатков природного происхождения и повышающий продуктивность агроэкосистемы, депонированный в Ведомственной Коллекции Полезных Микроорганизмов Сельскохозяйственного Назначения «Россельхозакадемии (RCAM) (ГНУ ВНИИСХМ) под регистрационным номером RCAM 01016.