ШТАММ Micrococcus sp., ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ОБЩЕГО АЗОТА, АММОНИЙ-ИОНА, ЖЕЛЕЗА И АЛЮМИНИЯ В СТОЧНЫХ ВОДАХ ОЧИСТНЫХ СООРУЖЕНИЙ ПРОМЫШЛЕННЫХ ПРЕДПРИЯТИЙ Российский патент 2015 года по МПК C02F3/34 C12N1/20 C12R1/265 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, эффективного для очистки сточных вод промышленных предприятий от общего азота, аммоний-иона, железа и алюминия.

Известен штамм Micrococcus luteus (Schroder 1872) ПБТ-1 [RU, патент №2488630, приоритет от 11.05.2012 г., опубликовано 27.07.2013 г.], обладающий высокой каталазной активностью и способствующий повышению продуктивности агросистемы, участвуя в процессах трансформации органических остатков природного происхождения. Указанный штамм Micrococcus luteus способен к разложению растительных остатков, стимуляции роста и развитию проростков, к повышению всхожести редиса, в отличие от заявленного штамма Micrococcus sp. №3, предназначенного для очистки сточных вод очистных сооружений промышленных предприятий от общего азота, аммоний-иона, железа и алюминия.

Известен способ очистки водоемов от нефтяных загрязнений [RU, патент №2025466, приоритет от 15.04.1991 г., опубликовано 30.12.1994 г.] путем обработки поверхности водоема клетками аэробных микроорганизмов, выбранными из группы культур, включающих микроорганизмы рода Micrococcus.

Известен консорциум микроорганизмов - деструкторов [RU, заявка на изобретение №2011136481, приоритет от 01.09.2011 г., опубликована 27.10.2013 г.]: Alcaligenes sp. Г0401 ВТ №17, Micrococcus nishomyaensis Г0402 ВТ №16, Brevibacterium iodinum Г0403 ВТ №15, Pseudomonas aeruginosa Г0404 ВТ №14, Pseudomonas facilis Г0405 ВТ №13, Brevibacterium linens Г0406 ВТ №12, Bacillus subtilis Г0407 ВТ №11, Flavobacterium aquatile Г0408 ВТ №10, Clostridium butyricum Г0409 ВТ №9, используемый для очистки природных и сточных вод, почв и почвогрунтов от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности.

Известен биопрепарат-нефтедеструктор [RU, патент №2319740, приоритет от 21.01.2005 г., опубликовано 20.03.2008 г.], включающий культуру бактерий и микробное удобрение-носитель в виде высушенной биомассы микроорганизмов активного ила, сформированного при переработке отходов свиноводческих комплексов, содержащее нативные микроорганизмы: Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Micrococcus hylae, Arthrobacter viscosus, Bacillus licheniformis, может быть использован для очистки загрязненной нефтью и нефтепродуктами почв при одновременном восстановлении физико-химических свойств и естественного биоценоза.

Данные способы используют штамм Micrococcus для очистки от нефтепродуктов в отличие от заявленного штамма Micrococcus sn. №3, предназначенного для очистки сточных вод очистных сооружений промышленных предприятий от содержания общего азота, аммоний-иона, железа и алюминия.

Известен способ получения (R)-1-арил-2-тетразолилэтилового эфира карбаминовой кислоты [RU, заявка №2508290, приоритет от 22.06.2009 г., опубликовано 27.02.2014 г.]. Для получения R)-1-арил-2-тетразолилэтилового эфира карбаминовой кислоты необходимо биологическое асимметрическое восстановление, которое может быть выполнено в буфере, содержащем штамм микроорганизма, способный к продуцированию оксидоредуктазы. Штамм микроорганизма выбирают из группы, включающей дрожжи рода Candida, включая Candida parapsilosis и Candida rigosa; дрожжи рода Pichia, включая Pichia anomala и Pichia jadinii; дрожжи рода Saccharomyces, включая Baker′s yeast, Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces pastorianus; дрожжи, включающие Rhodotorula mucilaginosa или Trigonopsis variabilis; бактерии, включая Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Erwinia herbicola, Micrococcus luteus, Bacillus stearothermophilus, Rhodococcus erythropolis и Rhodococcus rhodochrous; грибы, включая Mucor racemosus и Geotrichum candidum, и соответствующие комбинации. Т.е. в данном способе штамм Micrococcus luteus предназначен для продуцирования оксидоредуктазы, а не для очистки сточных вод очистных сооружений промышленных предприятий от содержания общего азота, аммоний-иона, железа и алюминия.

Известен способ получения дисахарида [RU, патент №2230119, приоритет от 11.10.2002 г., опубликовано 10.06.2004 г.], где в качестве исходного сырья для получения биологически активных веществ используют клеточные стенки культуры Micrococcus lysodeikticus (Micrococcus luteus). Способ включает культивирование штамма-продуцента Micrococcus lysodeikticus (luteus) и выход из исходного сырья дисахаридов. Культивирование штамма Micrococcus lysodeikticus (Micrococcus luteus) в данном способе не предполагается использование этого штамма для очистки сточных вод очистных сооружений промышленных предприятий от содержания общего азота, аммоний-иона, железа и алюминия.

Известен биопрепарат БИАВА для рекультивации почв, способ его получения [RU, патент №2248255, приоритет от 05.09.2003 г., опубликовано 20.03.2005 г.], для рекультивации техногенно нарушенных объектов окружающей среды и восстановления плодородия почв, включающий пористый носитель и физиологически активные микроорганизмы, как денитрификаторы, в том числе на основе культуры Micrococcus. Данный способ предназначен для очистки техногенно нарушенных почв, в водных средах не заявлен. Заявленные свойства (очистка сточных вод очистных сооружений промышленных предприятий от содержания общего азота, аммоний-иона, железа и алюминия) в данном способе на культуру Micrococcus не указаны.

Известен способ использования биомассы Micrococcus luteus [RU, патент №2420541 приоритет от 11.01.2009 г., опубликовано 10.06.2011 г.], в виде продукта ее щелочного гидролиза в качестве пигмента для полимерной окрашенной композиции. Из биомассы культуры Micrococcus luteus выделяют желтый пигментный препарат сарцинаксантин. Заявляемых свойств в данном способе использования штамма Micrococcus luteus не обнаружено.

Известны способы использования биомассы Micrococcus luteus для определения антигистоновой активности микроорганизмов [RU, патент №2203956, приоритет от 06.12.2001 г., опубликован 10.05.2003 г.], антилактоферриновой активности микроорганизмов [RU, патент №2156807, приоритет 16.08.1999 г., опубликовано 10.02.2000 г.], антикарнозиновой активности микроорганизмов [RU, патент №2132879, приоритет 27.04.1998 г., опубликовано 10.07.1999 г.], антилизоцимной активности микроорганизмов [RU, патент №2126051, приоритет 27.01.1997 г., опубликовано 10.02.1999 г.]. Штамм культуры Micrococcus luteus используется как тест-культура к бактерионосительству, микробиологического мониторинга антропогенного загрязнения окружающей среды, диагностики дисбиозов, изучения влияния лекарственных препаратов на персистентные характеристики микроорганизмов. Таким образом, в данных способах не предполагает использование этого штамма для очистки сточных вод очистных сооружений промышленных предприятий от содержания общего азота, аммоний-иона, железа и алюминия.

Задача изобретения - выявление из рода Micrococcus штамма, обладающего новыми свойствами.

Технический результат настоящего изобретения заключается в выделении штамма Micrococcus sp. №3, участвующего в процессах очистки сточных вод очистных сооружений промышленных предприятий от общего азота, аммоний-иона, железа и алюминия.

Согласно изобретению указанный технический результат достигается тем, что выявлен новый штамм Micrococcus sp. №3, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов, присвоен номер ВКМ Ac-2632D, предназначенный для снижения содержания общего азота, аммоний-иона, железа и алюминия в сточных водах очистных сооружений промышленных предприятий.

Штамм Micrococcus sp. №3 ВКМ Ac-2632D выделен в 2012 году из пробы сточной воды аэротенков целлюлозно-бумажного предприятия путем высева водного разведения испытуемой пробы методом предельных разведений аликвоты по 100 мкл на поверхность агаризованной среды ΜΠΑ. Далее выделенную культуру изучали с целью установления ее каталитической способности к процессам очистки сточных вод от основных загрязняющих веществ. Штамм проявил значительную активность в снижении содержания общего азота (53%), аммоний-иона (35%), биосорбции железа (84%) и алюминия (31%).

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма: Среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды - Пептон 20 г, KCl - 1,0 г; MgSO₄×5Н₂O - 0,5 г; NaCl - 3,0; 15-25°C, 3-5 суток в условиях жидкофазной ферментации.

Родовое название Micrococcus. Штамм характеризуется следующими признаками: Колонии мелкие, круглые с ровным краем, объемные, непрозрачные, матовые, ярко-желтого цвета. Консистенция мягкая. Пигмента в среду не выделяет. Каталазный тест - положительный. Строгий аэроб. Клетки ~1 мкм, равномерно окрашены, неправильной округлой формы, образуют дипло- и тетракокки.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 3 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - Пептон 20 г, NaCl -3,0 г; KCl - 1,0 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г; агар микробиологический - 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°C.

Род Micrococcus на сегодняшний день насчитывает 8 видов, в число которых входит Micrococcus luteus.

Видовое название Micrococcus luteus (Schroeter 1872) Cohn 1872.

Наименование микроорганизма, опознавательная ссылка, присвоенная депозитором - Micrococcus sp. №3.

Определение филогенетического положения штамма Micrococcus luteus проводили при помощи анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК.

Для экстракции ДНК из культур использовали метод [Ausubel F.M, Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. Current protocols in Molecular Biology. N.Y.: John Wiley and Sons. 19941].

Ген 16S рРНК амплифицировали с универсальными эубактериальными праймерами 27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) и 1492 г (5′-TACGGΥΤACCTTGTTACGACTT-3′) [Lane, D.J. 16/23S sequencing // Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics /Eds. Stackebrandt E., Goodfellow M. Chichester: Wiley. 1991. P. 115-175; Medlin L., Etwood H.J., Stickel S., Sogin M.L. The characterisation of enzymatically amplified eukaryotic 16S-like rRNA coding regions // Gene. 1998. V. 71. P. 491-499]. ПЦР проводили на приборе GeneAmp PCR System 2700 (“Applied Biosystems”, США).

Определение нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer.

Филогенетический анализ. Предварительный анализ полученных нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК проводили в программе BLAST банка генов национального центра биологической информации (NCBI ). Последовательности генов 16S рРНК выравнивали с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий с помощью программы MEGA версии 5 [Tamura K, Peterson D, Peterson Ν, Stecher G, Nei M, Kumar S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods // Molecular Biology and Evolution. 2011. (submitted)]. Определение филогенетического положения штаммов и процента сходства проводили с использованием инструментов сайта EzTaxon-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/) [Kim, O.S., Cho, Y.J., Lee, K, Yoon, S.H., Kim, Μ., Νa, H., Park, S.C., Jeon, Y.S., Lee, J.H., Yi, H., Won, S., Chun, J. Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA Gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species // Int J Syst Evol Microbiol. 2012. 62, 716-721].

Способность штамма к снижению содержания основных загрязняющих веществ, присутствующих в сточной воде очистных сооружений лесопромышленных комплексов изучали в лабораторных опытах со сточной водой, взятой из аэротенков ОАО «Монди СЛПК». Результаты приведены в примерах ниже.

Пример 1

а) Приготовление культуральной жидкости микроорганизмов

На 1 л воды добавляли NaNO₃ - 2.0 г; KH₂PO₄ - 1.0 г; KCl - 0.5 г; MgSO₄×5H₂O - 0.5 г, раствор разливали в 250 мл колбы по 100 мл, стерилизовали их в течение часа в автоклаве, охлаждали до комнатной температуры, затем до температуры экспозиции в холодильнике, после чего проводили заражение содержимого колбы предварительно приготовленной суспензией живой культуры Micrococcus sp. №3 ВКМ Ac-2632D по 10 мкл при комнатной температуре в стерильных условиях, с титром живых клеток 10 млрд.клеток/1 мл в количестве 1 мл на колбу.

Наработка биомассы культуры микроорганизмов проводилась в колбах на 250 мл на термостатированной установке выращивания микроорганизмов УВМТ-12-250 при температуре 30°C и 180 оборотах в минуту в течение 3 суток.

б) Определение каталитической способности штамма Micrococcus sp. №3 ВКМ Ac-2632D Ac-2632D

В колбы на 250 мл была налита сточная вода аэротенков ОАО «Монди СЛПК» в количестве 150 мл и одновременно введен штамм Micrococcus sp. №3 ВКМ Ac-2632D в количестве 0.15 мл с тиром клеток 10¹⁰КОЕ. Опыт проводился на термостатированной установке выращивания микроорганизмов УВМТ-12-250 при температуре 30°C и 180 оборотах в минуту в течение 1 суток. Результаты анализов представлены в таблице.

Как видно из представленных в таблице результатов - в сравнении с контролем, в пробах сточной воды с введенным штаммом произошло снижение содержания общего азота, аммоний-иона, железа и алюминия.

Штамм Micrococcus sp. №3 ВКМ Ac-2632D хранится в ФГБУН Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (ИБФМ РАН). Просп. Науки, д. 5, г. Пущино, Московской области, 142290.

Данные идентификации Micrococcus sp. №3 ВКМ Ac-2632D

ШТАММ Micrococcus sp. №3 ВКМ AC-2632D

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм Micrococcus sp. ВКМ Ac-2632D, предназначенный для снижения содержания общего азота, аммоний-иона, железа и алюминия в сточных водах очистных сооружений промышленных предприятий. Штамм проявляет активность в снижении содержания общего азота на 53%, аммоний-иона - на 35%, железа - на 84% и алюминия - на 31%.

Штамм Micrococcus sp. №3 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов, номер ВКМ Ac-2632D, предназначен для снижения содержания общего азота, аммоний-иона, железа и алюминия в сточных водах очистных сооружений промышленных предприятий.