ШТАММ БАКТЕРИЙ MICROCOCCUS LUTEUS VKM Aс-2627D - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/01 

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм Micrococcus luteus VKM As-2627D - деструктор нефти и нефтепродуктов, который может быть использован для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).

Известен штамм Micrococcus sp. ВКМ Ac-2632D (1. Патент RU №2567010, Штамм Micrococcus sp., предназначенный для снижения содержания общего азота, аммоний-иона, железа и алюминия в сточных водах очистных сооружений промышленных предприятий. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, C12R 1/265. Заявка: 2014126253, 27.06.2014. Опубликовано: 27.10.2015 Бюл. №30. Патентообладатель: ФГБУН Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН. Авторы: Анчугова Е.М., Очеретенко Д.П., Володин В.В., Щемелина Т.Н., Маркарова Н.Ю.), обладающий эффективно снижать в сточных водах очистных сооружений промышленных предприятий содержание общего азота, аммоний-иона, железа и алюминия.

Однако известный штамм Micrococcus sp. ВКМ Ac-2632D не обладает способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), что исключает возможность его применения для очистки объектов окружающей среды (почвы и воды) от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Известен штамм Micrococcus luteus ПБТ-1 (2. Патент RU №2488630, Штамм Micrococcus luteus, обладающий каталазной активностью и осуществляющий трансформации органических остатков природного происхождения. C1, C12N 1/26, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/265. Заявка: 20121194227/10, 11.05.2012. Опубликовано: 27.07.2014 Бюл. №21. Патентообладатель: Общество с ограниченной ответственностью «Петербургские Биотехнологии», Жемякин С.В. Авторы: Жемякин С.В., Попов А.А., Свиридова О.В., Воробьев Н.И.), способный повышать продуктивность агроэкосистемы, участвуя в процессах трансформации органических остатков природного происхождения.

Недостатком штамма является то, что известный штамм не обладает способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), что также исключает возможность его применения для очистки объектов окружающей среды (почвы и воды) от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Известен способ использования биомассы Micrococcus luteus (3. Патент RU №2420541. Полимерная окрашенная композиция. МПК C08J 3/20, C08L 23/06, С098В 61/00. Дата подачи заявки: 11.01.2009. Опубликовано: 10.06.2011. Патентообладатель: Казанское открытое акционерное общество «Органический синтез». Авторы: Андреева И.Н., Бобрешова Е.Е., Валиева Н.Н., Кудряшов В.Н., Огородникова Т.И., Рязанцева И.Н.) в виде продукта ее щелочного гидролиза для полимерной окрашенной композиции.

Однако способности к деструкции нефти и нефтепродуктов у известного штамма Micrococcus luteus не обнаружено.

Известны способы использования биомассы Micrococcus luteus для определения антигистоновой активности микроорганизмов (4. Патент RU №2203956. Способ определения антигистоновой активности микроорганизмов. С2, C12Q 1/02. Заявка: 2001133150/13, 06.12.2001. Опубликовано: 10.05.2003. Патентообладатель: Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН. Авторы: Бухарин О.В., Плотников А.О., Немцева Н.В., Сгибнев А.В.); антилактоферриновой активности микроорганизмов (5. Патент RU №2156807. Способ определения антилактоферриновой активности микроорганизмов. С2, C12Q 1/02, C12Q 1/04. Заявка: 99117578/13, 16.08.1999. Опубликовано: 27.09.2000. Патентообладатель: Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН. Авторы: Бухарин О.В., Валышев А.В., Харитонова Т.В., Чернова О.Л., Киргизова С.Б.); антилизоцимной активности микроорганизмов (6. Патент RU №2126051. Способ определения антилизоцимной активности микроорганизмов. МПК C12Q 1/00. Дата подачи заявки: 27.01.1997. Опубликовано: 10.02.1999. Патентообладатель: Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН. Авторы: Бухарин О.В., Валышев А.В., Елагина Н.Н., Иванов Ю.Б., Черкасов С.В.).

В известных способах штамм культуры Micrococcus luteus используется как тест-культура к бактерионосительству, микробиологического мониторинга антропогенного загрязнения окружающей среды, диагностики дисбиозов, изучения влияния лекарственных препаратов на персистентные характеристики микроорганизмов и другие цели.

Однако, использование штамма культуры Micrococcus luteus в известных способах в качестве деструктора нефти и нефтепродуктов не предусмотрено.

Известны штаммы: Pseudomonas putida 36 (7. Авторское свидетельство СССР N 1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. A1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20 C02F 3/34, C02F 101:32, C12N 1/20, C12R 1:40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт.Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.), Acinetronacter sp. НВ-1 (8. Патент RU N2077579. Штамм бактерий Acinetobacter species, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1:01, C12N 1/20, В09С 101:00. Заявка: 94043331/13, 06.12.1994. Опубликовано: 20.04.1997. Заявитель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии. Авторы: Жиркова Н.А., Кобелев B.C., Холоденко В.П. Патентообладатель: Государственный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии), Pseudomonas alcaligenes Е7 (9. Патент RU N2134723. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes Е7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12R 1:38. Заявка: 98105707/13, 25.03.1998. Опубликовано: 20.08.1999. Заявитель: Государственный научный центр прикладной микробилогии. Авторы: Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. Патентообладатель: Государственный научный центр прикладной микробилогии).

Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Известен консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов в составе Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp.ПИ Ку-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 мас. % каждого микроорганизма, при этом совместно с суспензией биопрепарата в загрязненнуюсреду вводят ризоторфин в количестве 30-120 г/м3 (10. Патент RU 2191643. Способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. CI, В09С 1/10, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1:01. Заявка: 2001119562/13, 09.07.2001. Опубликовано: 27.10.2002. Заявитель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ". Авторы: Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Новикова И.И. Патентообладатель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ").

Недостатком является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне +18+22°С, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, не способны к деградации нефтепродуктов при пониженных положительных температурах (+10°С).

В качестве прототипа служит штамм бактерий «Bacillus subtilis Колыма 7/2» (11. Патент RU2446900. Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями Bacillus subtilis. С2. В09С 1/10 (2006.01). Заявка: 2010129158/13, 13.07.2010. Опубликовано: 10.04.2012. Авторы: Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова A.M. Патентообладатель: Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии), обладающий способностью снижать концентрацию нефти до 0,48%, то есть уровень нефти от 135143 мг/кг снижается до 645 мг/кг в течение 3 месяцев летнего периода.

Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и не способен утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +10 до +37°С

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих способностью утилизировать как нефть, так и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +10 до +37°С

Поставленная задача решена тем, что получен штамм Micrococcus luteus VKM As-2627D - деструктор нефти и нефтепродуктов, обладающий утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовыйконденсат), перспективный для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) в широком диапазоне температур (от +10 до +37°С).

Происхождение штамма.

Штамм бактерий Micrococcus luteus VKM As-2627D (авторский номер LER-4) выделен из горной породы Угольного разреза «Кангаласский», п. Кангалассы, Республика Саха (Якутия).

Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) под регистрационным номером VKM As-2627D.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфология: грамположительные, аспорогенные, кокковидные клетки, в мазках располагаются попарно, одиночно и беспорядочными скоплениями.

Культуральные характеристики.

На мясопептонном агаре (МПА), масс. %: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, рН 7,0-7,2 и ГРМ агаре (на основе гидролизата рыбной муки), масс. %: гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; рН 7,1-7,5, формирует выпуклые матовые колонии яркого лимонно-желтого цвета, диаметром 1-2 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности среды, легко размазываются.

На агаризованной среде Мюнца (12. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5 - С. 1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат) следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, рН - 7,2, растет в виде матовых желтых колоний диаметром 1 мм; консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности среды, легко размазываются.

На среде Сабуро (масс. %): гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный - 0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; рН 6,0±3, формирует выпуклые матовые колонии яркого лимонно-желтого цвета, диаметром 1-2 мм; консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности среды, легко размазываются.

В мясопептонном бульоне промышленного производства образует муть.

По отношению к кислороду - факультативный анаэроб.

Растет в диапазоне рН 5,5-8,0, при температуре от +10 до +37°С.

Используемые источники углерода - сорбит.

Проверенные не используемые источники углерода: лактоза, глюкоза, цитрат натрия, малонат натрия.

Другие проверенные тесты: оксидаза-отрицательный, не декарбоксилирует лизин, декарбоксилирует орнитин, не способен расщеплять фенилаланин, индол-отрицательный, сероводород не продуцирует, не активный в отношении инозита, уреазы и β-галактозидазы.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Штамм не патогенен для растений (проверка на фитотоксичность проведена на семенах овса посевного (Avena sativa) сорт «Скакун», пшеницы (Triticum) сорт «Приленская-19» и клевера лугового (Trifolium pretense).

Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном МПА или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°С.

Штамм может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН), по адресу: 677980, Республика Саха (Якутия), г. Якутск, ул. Октябрьская, 1.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Micrococcus luteus VKMAs-2627D.

Штамм бактерий Micrococcus luteus VKM As-2627D выделен из горной породы Угольного разреза «Кангаласский», п. Кангалассы, Республика Саха (Якутия), методом накопительных культур на среде Мюнца с нефтью с последующим пересевом на МПА.

Для этого 1,0 г горной породы с вышеуказанного объекта растирали в ступке в асептических условиях, вносили в колбу, объемом 250 мл, содержащей, предварительно подготовленной 100 мл минеральной среды Мюнца следующего состава: (масс. %) KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное, рН 7,2.

В качестве источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду Мюнца в количестве 1000 мг на 1,0 дм³ среды.

Инкубация проводилась в термостатируемых качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +20±1°С.

Рост бактерий наблюдали уже через 3 дня инкубации по образованию мутной эмульсии и дезинтеграции слоя нефти.

Чистая культура бактерий была получена путем культивирования при вышеперечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с МПА.

Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах (+10, +20, +30 и +37°С).

Через 72 ч при культивировании штамма при температурах от плюс 10 до +37 градусов С на поверхности МПА наблюдали появление выпуклых, матовых колоний яркого лимонно-желтого цвета, диаметром 1-2 мм, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16SpPHK и ключевых фенотипических признаков, согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (13. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1985, p. 408.). идентифицированы, как штамм Micrococcus luteus.

Пример 2. Приготовление бактериального препарата на основе клеток штамма Micrococcus luteus VKM As-2627D.

Изолированные колонии, полученные по примеру 1, пересевают на скошенный МПА и инкубируют 48 часов при температуре +20±1°С.

Клетки смывают 0,9% раствором NaCl и готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята с титром 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Для получения препарата готовят жидкую минеральную среду с нефтью (нефтепродуктами) следующего состава (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; нефть (нефтепродукты) - 1,0; вода дистиллированная - остальное; рН среды - 7,2 и культивируют в колбах в качалочных условиях в течение 48 часов, при температуре плюс 20±1°С, при 200 об/мин.

Получают жидкую мутноватую смесь клеток штамма Micrococcus luteus VKM As-2627D с титром 1-5×10⁹ клеток/см, которую можно использовать в качестве препарата для обработки почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Micrococcus luteus VKM As-2627D.

Клетки штамма Micrococcus luteus VKM As-2627D смывают 0,9% раствором NaCl со скошенного МПА (по примеру 2), готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см³, с концентрацией 1×10⁹ микробных клеток/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.

Полученный бактериальный изолят штамма Micrococcus luteus VKM As-2627D культивируют в водной среде с минеральным составом (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄⋅7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; вода дистиллированная - остальное; рН среды- 7,2.

В колбочки объемом 200,0 см³ вносят по 100,0 см³ готовой минеральной среды и 1000 мг нефти. Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1×10⁹ клеток/см³.

В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь.

Колбы культивируют при температурах +10°С; +20°С; +30°С; +37°С в течение 3-5 суток.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-025» (14. ФР. 1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117. Методка выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-0,25»).

Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами предлагаемый штамм Micrococcus luteus VKM As-2627D уже на 3-е сутки культивирования утилизирует от 3,3 до 5,6% - нефти и нефтепродуктов при температуре +10°С; от 54,9 до 59,7% - при температуре +20°С; от 67,9 до 69,7% - при температуре +30°С; от 70,7 до 74,9% - при температуре +37°С (таблица 1).

Пример 4. Очистка воды от нефти с помощью клеток штамма Micrococcus luteus VKM As-2627D.

В эксикатор объемом 5,0 дм³ вносят 3,0 дм³ водопроводной воды, отстоявшейся в течение суток при комнатной температуре.

В воду добавляют 30000 мг сырой неочищенной нефти и 30,0 см³ бактериального изолята штамма Micrococcus luteus VKM As-2627D, приготовленного по примеру 2, содержащего 1,0-10⁹ клеток/см³ суспензии.

В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30000 мг нефти и без внесения микробной суспензии бактериального изолята.

Эксперимент проводят в течение 60 суток, поддерживая температуру воды в интервале +15+20°С.

Полученные результаты (таблица 2) показали, что в воде, деструкция нефти под влиянием штамма Micrococcus luteus VKM As-2627D за 60 суток составила 69,9% для нефти и 71,0% для дизельного топлива; деструкция в контрольной емкости существенно не изменилась.

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки (от 3 до 60 суток), в широком диапазоне температур от +10 до +37°С, который может быть использован для очистки объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат).

Изобретение относится к микробиологии. Штамм бактерий Micrococcus luteus LER - 4 обладает способностью утилизировать нефть и нефтепродукты, депонирован под регистрационным номером VKM Aс-2627D и может быть использован для очистки почвы и воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами в широком диапазоне температур от +10 до +37°С. Изобретение позволяет повысить качество очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов. 2 табл., 4 пр.

Штамм бактерий Micrococcus luteus VKM Aс-2627D - деструктор нефти и нефтепродуктов.