ШТАММ Penicillium sp., ОБЛАДАЮЩИЙ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ И ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ОСТАТКОВ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Российский патент 2013 года по МПК C12N1/26 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/38 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается использования культуры рода Penicillium вида Penicillium sp.для получения нового штамма Penicillium sp., который обладает полифункциональными свойствами и способствует повышению продуктивности агро-экосистемы, участвуя в процессах трансформации органических остатков природного происхождения.

Известны методы препаративного хроматографического разделения комплексных ферментных препаратов штаммов-продуцентов Trichoderma sp., Penicillium sp., Chrysosporium sp., Aspergillus sp.и выделения индивидуальных ферментов, inbi.ras.ru/labs/sinitsyn/index…

Известен способ обработки ила в очистном сооружении, включающий стадию обработки ила микрогрибами из рода Penicillium, Trichoderma, Fusarium, Phoma, Mucor, Galactomyces, Aspergillus, Botrytis, Geomyces и их смесей, и культивирования в параллельном резервуаре, RU №2303572 C2, C02F 3/34, C02F 11/02, C02F 1/72, 27.07.2007.

Известен способ очистки почвы от загрязнений нефтью, предусматривающий периодические внесение в почву суспензии микроорганизмов в виде штаммов микромицетов, выбранных из родов Penicillium, Mucor, Aspergillus, Trichoderma, RU №2049739 C1, C02F 3/34, 10.12.1995.

Известен способ осахаривания лигноцеллюлозного сырья, включающий подготовку сырья и обработку подготовленного сырья ферментным препаратом, в качестве которого используют культуральную жидкость, полученную культивированием штамма Penicillium verruculosum BKMF-3972D, RU №2405838 C1, C13K 1/02, 10.12.2010.

Известен способ получения штамма гриба. Penicillium verruculosum - продуцента фермента, кодируемого нуклеотидной последовательностью, предусматривающий трансформацию клетки гриба Penicillium verruculosum генетической конструкцией, RU №2378372 C2, C12N 15/00, C12N 9/24, C12N 1/15, 10.01.2010.

Известен штамм гриба Penicillium verrucosum ВКПМ F-984, используемый для получения средства, обладающего иммуномодулирующими свойствами, RU №2373276 C1, C12N 1/14, A61K 36/06, 20.11.2009.

Известен штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum ВКМ F-3972D - продуцент комплекса целлюлаз, содержащего целлобиогидролазу, эндоглюканазу, β-глюкозидазу, целлобиазу, ксиланазу и ксилоглюканазу, RU №2361918 C1, C12N 9/24, C12P 19/00, 20.07.2009.

Известен штамм гриба Penicillium vermiculatum Dang.BH3P-24 для получения препарата против фитопатогенных грибов, RU №2322490 C1, C12N 1/14, 20.04.2008.

Известен фрагмент ДНК мицелиального гриба Penicillium verruculosum, RU №2238974 С2, C12N 1/21, C12N 15/00, 27.10.2004.

Известны ферментные препараты, полученные на основе новых рекомбинантны штаммов Penicillium verruculosum, которые эффективно гидролизуют различные виды предобработанных хвойной и лиственной древесины, inbi.ras.ru/dissertation/disser…

Известна новая эндо-(1-4)-β-D-ксиланаза XylB (SEQ ID NO:1) ми-целиального гриба Penicillium canescens, RU №2412246 C2, C12N 9/42, C12N 15/55, C12N 15/11, C12N 1/14, 20.02.2011.

Известен штамм гриба Penicillium canescens - продуцент секретируемой бета-галактозидазы, RU №2197526 C1, C12N 15/56, C12N 1/15, 27.01.2003; RU №2126049 C1, C12N 15/56, C12N 15/80, C12N 1/15, 10.02.1999; RU №2080387 C1, C12N 9/38, C12N 15/56, C12N 15/80, C12N 1/14, 27.05.1997.

Известна технология производства технических ферментов β-глюканаз (целлюлаз) и ксиланаз на основе высокоактивных мутантных штаммов-продуцентов Penicillium funiculosum и Trichoderma longibrachiautum для применения в качестве кормовых добавок в рационах сельскохозяйственных животных и птицы, inbi.ras.ru/labs/simtsyn/index…

Известен способ биотехнологического получения сбраживаемых сахаров из лигноцеллюлозных материалов, включающий обработку сырья ферментным препаратом, полученным культивированием штамма Penicillium funiculosum S-2006 на среде, RU №2316584 C1, C12N 1/14, C12P 19/02, C12P 19/04, C12N 9/42, 10.02.2008.

Известен штамм мицелиального гриба Penicillium funiculosum BKM F-3668D (Всероссийская коллекция микроорганизмов при ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН) - продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, β-глюканазы, ксиланазы, пектиназы и маннаназы, RU №2287570 C2, C12N 1/14, C12N 9/42, 20.11.2006.

Известен штамм Penicillium funiculosum IMI378536, продуцирующий комплекс ферментов - целлюлазу, эндо-1,4-β-ксиланазу, целлобиогидролазу, β-глюкозидазу, эндо-1,3(4)-β-глюканазу, ферулоил-эстеразу, RU №2261910 С2, C12N 9/16, C12N 9/24, C12N 9/42, C12N 1/16, 10.10.2005.

Известен штамм Penicillium funiculosum KM МГУ 433 - продукт глюкозооксидазы, RU №2170762 С2, C12N 1/14, C12N 904, 20.07.2001.

Известен штамм микромицета Penicillium sizovae P11 (хранящийся в коллекции бактерий Вятского государственного университета под регистрационным номером VGUCM-P11) - деструктор лигнина древесины, RU №2355753 C2, C12N 1/14, 20.05.2009.

Известен штамм гриба Penicillium chrysogenum - продуцент бензил-пенициллина и феноксиметилпенициллина, RU №2035514 C1, C12P 37/00, 20.05.1995; RU №1594991 C, C12P 37/00, C12N 1/14, 9.07.1995; RU №1549075 A1, C12P 37/00, 15.12.1994.

Известен штамм гриба Penicillium chrysogenum BKMF-3330Д, используемый для получения биомассы, извлекающей радионуклиды и тяжелые металлы из жидкостей, RU №2024078 C1, G21F 9/18, C02F 3/34, 30.11.1994.

Известен штамм гриба Penicillium species ЦКМ Fн 37Б, используемый для очистки поверхности воды от плаваящей нефти, RU №2063435 C1, C12N 1/14, C02F 3/34, 10.07.1996.

Известен способ биологической очистки серосодержащих сточных вод, включающий биодеградацию сераорганических соединений с использованием микроорганизмов-деструкторов, в качестве которых используют ассоциацию из микромицета Penicillium sp. №15 и бактерий Thiobacillus sp. №3 в соотношении 4:1, RU №2314267 C2, C02F 3/34, C02F 103/36, C12N 1/20, C12N 1/14, 10.01.2008.

Известен микробиологический способ удаления нитроароматического соединения, присутствующего в растворе или в почве, включающий контактирование раствора или почвы с биомассой штамма Penicillium sp. (номер депонирования 1-2081, CNCM, Институт Пастера, Франция) в условиях, подходящих для минерализации нитроароматического соединения указанным штаммом Penicillium sp. в присутствии источника углерода для указанного штамма, RU №2249564 C2, C02F 3/34, B09C 1/10, C12N 1/14, 10.04.2005.

В известных микроорганизмах рода Penicillium штамма Penicillium sp., с заявляемыми свойствами, не обнаружено.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи, позволяющей выявить из рода Penicillium штамм, обладающий полифункциональными свойствами и способствующий повышению продуктивности агроэкосистемы.

Технический результат настоящего изобретения заключается в выделении штамма Penicillium sp., участвующего в процессах трансформации органических остатков природного происхождения.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что выявлен новый штамм Penicillium sp.ПБТ-2, который обладает полифункциональными свойствами, осуществляет трансформации органических остатков природного происхождения и повышает продуктивность агроэкосистемы.

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Получен новый штамм Penicillium sp. ПБТ-2, который обладает полифункциональными свойствами и способствует повышению продуктивности агроэкосистемы, участвуя в процессах трансформации органических остатков природного происхождения.

Видовое название Penicillium sp. Thom.

Штамм Penicillium sp. ПБТ-2 выделен в июле 2009 г. из образцов дерново-подзолистой почвы, смешанной с соломой зерновых, в Ленинградской области.

Культурально-морфологические, физиолого-биохимические особенности культуры

Медленнорастущий штамм. Микроскопия (фазово-контрастная и световая) 5-суточной культуры на среде Чапека показала наличие многоядерного мицелия, прямостоячих конидиеносцев, имеющих разветвления наверху, верхний ряд мутовок состоит из фиалид, в которых находятся круглые споры. Аэроб. Каталазоположителен. На среде Чапека появляется через двое суток, колонии белого цвета, на 3-5-е сутки в средине зеленого цвета, на 7-и сутки колонии темнеют до серо-зеленого, с белым ободком, появляется пигмент светло коричневого цвета.

Отношение к источникам углерода.

Штамм использует углеводы на 5-7-е сутки с подкислением среды: хорошо - арабинозу, галактозу, глюкозу, слабее - мальтозу, рамнозу, сорбит, сахарозу, рафинозу. Не использует - дульцит.

Растет на МПЖ, активно разжижает желатину послойно сверху, рост сверху. На МПБ аммиак образует, нитраты восстанавливает. Крахмал слабо гидролизует. На среде Эшби умеренный рост, способен к азотфиксации. Растет на МПА, хороший рост на МПА с глицерином. Медленно растет на жидкой и агаризованной среде Гетчинсона с целлюлозой (фильтровальной бумагой). Солеустойчив, хорошо растет на МПБ с 2,5% и 6,5% NaCl.

Идентификация штамма Penicillium sp.

Культура исследована по многочисленным свойствам, используемым в современной систематике.

Для депонирования выделенных штаммов микроорганизмов в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) дополнительно проведена их генетическая идентификация.

Для идентификации до рода штамма микромицета был просеквенирован участок ITS (ITS+5S+ITS2). Наибольшее сходство выявлено с родом Penicillium, 100% сходства (ближайший родственник Penicillium crustosum).

Данные идентификации, характеризующей штамм Penicillium sp., представлены на рисунке, приведенном в конце описания.

Культура исследована по многочисленным свойствам, используемым в современной систематике. Штамм идентифицирован с использованием публикаций: «Микромицеты почв» под ред. Билай В.И. (Киев, 1982), Raper K.B., Thom Ch. A manual of the Penicillia. Baltimore (1949), «Почвенная микология» Мирчинк Т.Г (МГУ, 1988), «Практикум по микробиологии» под ред Егорова Н.С. (1976), Интернет-ресурсам и др., и отнесен к роду Penicillium, вид sp.

Штамм Penicillium sp.ПБТ-2 депонирован 29.11.2011 под регистрационным номером RCAM 01017 в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения «Государственное научное учреждение. Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии)».

Пример 1

Выделение штамма Penicillium sp. ПБТ-2

Штамм Penicillium sp.ПБТ-2 выделен из образцов дерново-подзолистой почвы, смешанной с соломой зерновых высевом на агаризованную питательную среду Чапека (методом предельных разведений, 3-е разведение).

Количество КОЕ (колониеобразующих единиц) штамма Penicillium sp.ПБТ-2 в образце достигает 20-30 тыс./г почвы.

Пример 2

Целлюлозолитическая активность

При росте на стандартной агаризованной или жидкой среде Гетчинсона штамм Penicillium sp. ПБТ-2 обладает способностью разлагать целлюлозу (фильтровальную бумагу).

В среду Гетчинсона с фильтровальной бумагой вносят 1 мл культуральной жидкости.

Через 3 недели культивирования культуры микромицета, выросшей на скошенной агаризованной среде Чапека, наблюдается изменение субстрата.

Образуются зоны разложения фильтровальной бумаги, которые при этом темнеют.

Определение целлюлазной активности проводят на основе учета остаточного количества нерасщепленной целлюлозы.

Остаточное количество нерасщепленной целлюлозы составляет 20%.

Пример 3

Процессы трансформации органических остатков природного происхождения

Штамм Penicillium sp. ПБТ-2 активно участвует в окислении органических соединений природного происхождения.

Штамм Penicillium sp. ПБТ-2 продуцирует ферменты класса оксидоредуктаз - каталазу, пероксидазу (участвующую в разложении органических остатков, в том числе гумусовых веществ) и полифенолоксидазу (способствующую процессам синтеза гумусовых соединений) (А.Ш.Галстян. Ферментативная активность почв Армении. 1974. - 275 с.).

Штамм Penicillium sp. ПБТ-2, выросший на специальной питательной среде с органическими добавками разлагает растительные остатки (солома зерновых, древесные отходы).

Через 1 месяц наблюдается изменение цвета субстрата (побурение), субстрат становится рыхлым, легко ломается. Через 2-3 месяца наблюдают появление гумусовых веществ (фульвокислот и гуминовых кислот - в следовых количествах).

Штамм Penicillium sp. ПБТ-2 хранится в коллекции ООО «Петербургские Биотехнологии», 196603, г.Санкт-Петербург - г.Пушкин, Красносельское шоссе, д. 14/28, литера АВ, пом. 1-Н.

Способ поддержания и хранения:

Культуру выращивают на среде Чапека при 25°-30°С.

Хранится при температуре +4°С в холодильнике.

Пересев I раз в 3 месяца.

Длительное хранение (3 года и более) осуществляется в криоконсервированном состоянии при -80°С.

Предложенный штамм Penicillium sp. ПБТ-2 относится к микробиологической промышленности и включает известные способы выделения, подтвержденные исследованиями ООО «Петербургские Биотехнологии», что обусловливает, по мнению заявителя, соответствие его критерию «промышленная применимость».

Новый штамм Penicillium sp. ПБТ-2 обладает полуфункциональными свойствами и способствует повышению продуктивности агроэкосистемы, участвуя в процессах трансформации органических остатков природного происхождения.

Данные идентификации штамма Penicillllium sp.

Штамм Penicillium sp. ПБТ-2, выделенный из образцов дерново-подзолистой почвы, смешанной с соломой зерновых, обладающий полифункциональными свойствами и способствующий повышению продуктивности агроэкосистемы, участвуя в процессах трансформации органических остатков природного происхождения, депонирован в Ведомственной Коллекции Полезных Микроорганизмов Сельскохозяйственного Назначения Россельхозакадемии (RCAM) (ГНУ ВНИИСХМ) под регистрационным номером RCAM 01017 и может быть использован при трансформации органических остатков природного происхождения. Изобретение позволяет повысить продуктивность агроэкосистемы. 3 пр.

Штамм Penicillium sp., обладающий полифункциональными свойствами, осуществляющий трансформации органических остатков природного происхождения и повышающий продуктивность агроэкосистемы, депонированный в Ведомственной Коллекции Полезных Микроорганизмов Сельскохозяйственного Назначения Россельхозакадемии (RCAM) (ГНУ ВНИИСХМ) под регистрационным номером RCAM 01017.