ШТАММ Rhodococcus Erythropolis, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ РАЗЛОЖЕНИЯ НЕФТИ Российский патент 2013 года по МПК C12N1/26 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/38 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть, и которая может быть использована для очистки загрязненных почв.

Известен штамм Rhodococcus erythropolis для разложения нефти и нефтепродуктов (Патент РФ 2257409, МКИ C12N 1/20, В09С 1/10, опубл. 2004). Штамм депонирован как Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1668. Штамм выделен из образца загрязненной нефтью почвы Республики Башкортостан, растет на многих натуральных и синтетических средах и обладает сравнительно высокой скоростью утилизации нефти и нефтепродуктов.

Следует отметить, что существенным недостатком рассматриваемого штамма является то, что данный микроорганизм не обладает способностью к биологическому окислению «тяжелых» и ароматических углеводородов и других видов вредных химических соединений, таких как спирты, альдегиды, технические масла, жиры и др.

Известен консорциум штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus erythropolis IT BKM Ac-1769 и Pseudomonas fluorescens BKM В-6847 (Патент РФ 2428471, C12N 1/26, C02F 3/34, В09С 1/10, опубл. 2010), входящих в состав экобиопрепарата «Центрум-MMS», предназначенного для очистки от загрязнителей углеводородной природы, в первую очередь от нефти и горючесмазочных веществ и позволяющего повысить эффективность очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов.

Однако недостатком данного изобретения является то, что культивирование микроорганизмов различной таксономической и видовой принадлежности, а также различающихся по скорости роста, субстратной специфичности, температурному оптимуму роста приводит к их конкурентной борьбе и снижает их выживаемость, и как следствие усложняет и делает процесс выращивания более материально и энергозатратным.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств и получение нового штамма, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти.

Для достижения поставленной задачи предложен штамм Rhodococcus erythropolis 1-КП. Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) под номером RCAM01142.

Штамм Rhodococcus erythropolis 1-КП выделен из нефтезагрязненной подзолистой почвы Кольского полуострова.

Выделение штамма осуществлялось путем культивирования исходного образца загрязненной нефтью почвы в жидкой минеральной среде с добавлением углеводородов с последующим рассевом на мясопептонный агар (МПА) для получения изолированных колоний.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определителе бактерий Bergey (Bergey's. Manual of Systematic Bacteriology. 1986. 8^th ed V.2. Baltimore-Londone, William & Wilkins), а также на основании изучения последовательности генов 16S рРНК.

Культивирование в лабораторных условиях производилось на питательных средах следующего состава:

1) Среда МПА (сахароза - 5,0 г/л; глюкоза - 5,0 г/л; МПА - 50 г/л; агар-агар - 8,0 г/л), рН среды 7,3-7,5 до стерилизации.

2) Минеральная среда с C₁₄-C₁₇ для сохранения практической ценности культуры:

(K₂HPO₄ - 0,5 г/л; KH₂PO₄ - 0,5 г/л; MgSO₄ - 0,3 г/л; NH₄H₂PO₄ - 1,0 г/л; пептон - 2,0 г/л; агар-агар - 15,0; после внесения среды в пробирки до стерилизации наслаиваем ~0,8 мл фракции жидких углеводородов С₁₄-С₁₇), рН среды 7,1-7,2 до стерилизации.

Условия выращивания: на среде МПА 96 часов при 28°С, на минеральной среде с углеводородами 96-120 часов при 28°С.

Хранение штамма производят при периодическом пересеве на свежеприготовленные среды 1 раз в 3 месяца.

По морфологическим признакам штамм характеризуется как грамположительная палочка размером (0,6-0,8)×(2,3-2,5) мкм, спор не образует, неподвижная.

Данный штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими особенностями. Колонии на мясопептонном агаре при культивировании при Т=28°С блестящие, выпуклые, гладкие, бежевого цвета слизистые с ровным краем. Размер колоний не превышает 5,0 мм через трое суток после высева. Является аэробом. Растет в диапазоне температуры от 4 до 35°С. Оптимальное значение температуры 28°С. Растет при рН от 3,5 до 9,0, оптимальное значение рН=6,9.

Штамм Rhodococcus erythropolis 1-КП характеризуется следующими биохимическими характеристиками. Ассимилирует мальтозу, маннозу, фруктозу, сахарозу, глюкозу, углеводороды, этиловый спирт, глицерин. Потребляет уксусную, пропионовую, масляную, лимонную, салициловую кислоту. Ассимилирует аммонийный азот, нитратный азот. Не требует добавок факторов роста и витаминов в питательную среду для выращивания. Желатину не разжижает, крахмал не гидролизует. Кислотообразование при росте на сахарах и углеводородах слабое. Индол и сероводород не образует. Каталазоположителен. Устойчив к цефазидину, полимиксину, цефалексину.

Применение на практике данного штамма обусловливается его физиолого-биохимическими особенностями. Штамм предназначен для ликвидации последствий загрязнения почвы нефтью.

Ниже приведены примеры биологического окисления нефти штаммом Rhodococcus erythropolis 1-КП.

Подготовленная для опытов садово-огородная почва была расфасована по 1,5 кг в лабораторные батарейные стаканы емкостью 5 литров каждый. Загрязнение почвы нефтью осуществлялось непосредственно в стаканах. В качестве нефтяного загрязнителя были выбраны два образца нефти, качественный состав которых приведен в Табл.1. Навеска нефтяного загрязнителя в почву вносилась весовым методом и составляла ~30 г, или ~2,0 вес.% на почву. Стаканы с нефтезагрязненной почвой выдерживались в условиях лаборатории с периодическим рыхлением. Это способствовало более равномерному распределению нефтяного загрязнителя в почве и, по возможности, испарению его легких фракций.

В Табл. 1 представлены результаты химико-битуминологического анализа средней пробы почв, загрязненных образцами нефтей, вес.%. Нефть 1 - нафтеново-ароматическая тяжелая нефть месторождения «Русское». Нефть 2 - метаново-нафтеновая легкая нефть месторождения «Западный Тэбук».

Экспериментальная оценка способности штамма микроорганизмов биодеградировать нефть проводилась в лабораторных условиях. В подготовленные почвенные образцы, предварительно расфасованные по 1,5 кг в лабораторные батарейные стаканы емкостью 5 литров каждый, и загрязненные нефтью и дизельным топливом вносили культуру микроорганизмов с титром 10⁵-10⁸ кл/мл. Маточную культуру бактерий Rhodococcus erythropolis 1-КП выращивали на качалке (200 об/мин) при 28°С в течение 48-72 часов в колбах со 100 мл одной из сред следующего состава, вес.%:

1. Пептон - 1%

K₂HPO₄ - 0,15%

MgSO₄ - 0,15%

Глицерин - 1%

Вода водопроводная - остальное до 100%,

рН до стерилизации 7,6;

2. Мясопептонный бульон с глюкозой (0,5 вес.%) и сахарозой (0,5 вес %).

рН до стерилизации 7,6.

Экспериментальная оценка способности штамма микроорганизмов биодеградировать нефть проводилась в лабораторных условиях. В подготовленные почвенные образцы, предварительно расфасованные по 1,5 кг в лабораторные батарейные стаканы емкостью 5 литров каждый, и загрязненные нефтью вносили культуру микроорганизмов с титром 10⁵-10⁸ кл/мл. Маточную культуру бактерий Rhodococcus erythropolis 1-КП выращивали на качалке (200 об/мин) при 28°С в течение 48-72 часов в колбах со 100 мл одной из сред следующего состава, вес.%:

1. Пептон - 1%

K₂HPO₄ - 0,15%

MgSO₄ - 0,15%

Глицерин - 1%

Вода водопроводная - остальное до 100%,

рН до стерилизации 7,6;

2. Мясопептонный бульон с глюкозой (0,5 вес.%) и сахарозой (0,5 вес %).

рН до стерилизации 7,6.

Опыты проводились при комнатной температуре (в среднем 18-20°С) в течение 91 суток с периодическим перемешиванием и увлажнением по мере высыхания почвы. Увлажнение производилось стерильной водой; примерно раз в 3 недели увлажнение осуществлялось минеральной средой, содержащей K, Р, N и имеющей рН до стерилизации 7,1-7,2. Почва в контрольных опытах увлажнялась только стерильной водой.

Учет численности живых клеток микроорганизмов в эксперименте проводился общепринятым методом предельных разведении на элективных средах.

Мониторинг происходящих процессов очистки нефтезагрязненной почвы выполнялся по следующим параметрам:

- содержание нефтепродуктов, мг/кг.

- содержание и качественный состав хлороформенного экстракта.

Периодичность отбора почвы на эти виды анализов составляла, как правило, 2 недели; анализ проводился согласно ГОСТу 17.1.4.01-80 и РД 52.18.575-96.

В Табл.2 приведены результаты проведенного мониторинга - содержание нефтепродуктов (НП), вес.% от первоначального содержания в почве при очистке штаммом загрязнений, состав которых приведен в Табл. 1. Дано в вес.% относительно их исходного содержания в нефтезагрязненной почве.

Таблица 2 Содержание нефтепродуктов (НП) в загрязненной почве в процессе очистки штаммом Rhodococcus erythropolis 1-КП Загрязнитель Содержание НП, вес.% от первоначального содержания в почве Продолжительность очистки, недели 0 2 4 6 8 13   Нефтепродукты Нефть 1 0,0 -13,7 -32,1 -47,2 -62,4 -62,5 Нефть 2 0,0 -16,9 -20,1 -42,5 -65,0 -71,0

Согласно данным таблицы, за 13 недель продолжительности опыта содержание нефтепродуктов в загрязненных образцах почвы снижается на 62,5-71,0% от первоначального их содержания. Снижение содержания нефтепродуктов в образцах, загрязненных нефтью, наблюдается со 2 недели от начала постановки опытов.

В Табл.3 приведено содержание и качественный состав ХБА нефтезагрязненной почвы по образцам Табл.1 через 91 сутки от начала опытов очистки штаммом Rhodococcus erythropolis 1-КП.

Данные качественного состава ХБА - (хлороформенного битумоида α) образцов загрязненной почвы до очистки, представленные в Табл.1, в сравнении с данными по опытным образцам, представленными в Табл.3, позволяют сделать анализ характера изменения группового и углеводородного состава хлороформенного битумоида α в процессе биологического окисления штаммом Rhodococcus erythropolis 1-КП.

Согласно результатам анализа, содержание ХБА в опытных образцах нефтезагрязненной почвы колеблется в пределах 1,33-2,43% при продолжительности опытов 91 сутки. Резко изменился и качественный состав ХБА опытных образцов почвы, по сравнению с доопытным составом ХБА. Через 91 сутки после начала опытов по утилизации нефтяного загрязнения почвы отмечается снижение наиболее доступных для микроорганизмов его фракций. Наиболее доступной для биоокисления в составе нефтяного загрязнения является фракция масел. Содержание масел снизилось до 38,55-42,25% отн.

Исходя из представленных выше данных, следует, что штамм Rhodococcus erythropolis 1-КП RCAM01142 характеризуется высокой эффективностью в процессах утилизации нефти, и как следствие может быть использован для биологической очистки почв от данных загрязнителей.

Также следует отметить, что рассматриваемый штамм Rhodococcus erythropolis 1-КП углеводородокисляющего микроорганизма может быть использован в процессах биологического окисления нефтепродуктов, например дизельного топлива. Основанием для этого заключения является то, что в состав дизельного топлива и других нефтепродуктов, также как и в состав нефтей, входят различные классы углеводородов, которые подвергаются биологической деградации микроорганизмами.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть. Штамм Rhodococcus erythropolis 1-КП, выделенный из нефтезагрязненной подзолистой почвы Кольского полуострова, обладающий высокой скоростью утилизации нефти, депонирован в Ведомственной Коллекции Полезных Микроорганизмов Сельскохозяйственного Назначения Россельхозакадемии (RCAM) (ГНУ ВНИИСХМ) под номером RCAM01142 и может быть использован для очистки загрязненных почв от нефти. Изобретение позволяет повысить качество очистки почв от нефти. 3 табл.

Штамм Rhodococcus erythropolis, депонированный в Ведомственной Коллекции Полезных Микроорганизмов Сельскохозяйственного Назначения Россельхозакадемии (RCAM) (ГНУ ВНИИСХМ) под регистрационным номером RCAM 01142 и используемый для разложения нефти.