СПОСОБ ВЫБОРА ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12N1/26 C12Q1/02 C12Q1/04 

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов, которые могут быть использованы для очистки водных и почвенных экотопов от нефтезагрязнений.

Загрязнение окружающей среды нефтепродуктами является экологической проблемой мирового масштаба. В связи с этим активно изучаются микроорганизмы, участвующие в деструкции нефтяного загрязнения в природных экосистемах (Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Ильинский В.В. и др. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон.// Микробиология, Т.63, № 5, 1994, с.579-585; Ткаченко В.Н., Бурковский И.В. Влияние нефтяных углеводородов на микробентос литорали Белого моря // Экология, № 5, 1986, с.9-15).

В настоящее время все большее внимание уделяется выделению аборигенных штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов и созданию биопрепаратов на их основе, что позволяет в достаточно сжатые сроки удалить из почвы или воды загрязнитель, превратив его в продукты жизнедеятельности бактерий - углекислый газ и воду (Современная микробиология / под. ред. И.Ленгелера, Г.Шлегеля, пер. с англ., М.: изд. Мир, 2005. 281 с.).

Известны способы индикации деструктивной активности микроорганизмов: по увеличению численности бактерий-деструкторов на средах, содержащих нефтепродукты как единственный источник углерода; по определению активности углеводородокисляющих бактерий с использованием н-алканов, меченых тритием (Коронелли Т.В., Дермичева С.Г, Семененко М.Н. Определение активности углеводородокисляющих бактерий с использованием н-алканов, меченых тритием // Прикладная биохимия и микробиология, Т. 24, № 2, 1988 г., с.203-206; по потреблению нефтепродукта или отдельных фракций (Государственный комитет Российской Федерации по охране окружающей среды. Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах природной, питьевой и сточной воды флуориметрическим методом на анализаторе жидкости «Флюорат-02» ПНД Ф 14.1:2:4.35-95, М.: 1998 г., с.17).

Однако индикация деструктивной активности микроорганизмов по увеличению численности бактерий на среде с углеводородами не позволяет достоверно судить об их деструктивной активности, поскольку увеличение численности бактерий на среде с углеводородами может являться следствием резистентности микроорганизма к нефтепродуктам (Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология, Т.32, №6, с.579-585).

Учет численности углеводородокисляющих бактерий чашечным методом дает большую ошибку, а использование метода предельных разведений трудоемко (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под. ред. М.О.Биргера. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1982. - 464 с.).

Наиболее близким аналогом к заявляемому способу является способ отбора нефтеокисляющих бактерий - продуцентов биосурфактантов (патент РФ № 2320715, МПК 8 C12N 1/20, 1/26; C12Q 1/02, 1/04, 2008). Способ включает культивирование нефтеокисляющих бактерий на плотной среде в чашках Петри при комнатной температуре. По окончании культивирования определяют морфотип колоний бактерий. Бактерии колоний М-типа отбирают как продуценты биосурфактантов. Бактерии колоний R-типа или S-типа смывают фосфатным буфером с рН 6,8, полученную суспензию разводят до оптической плотности 0,1-0,3 при длине волны 670 и определяют эмульгирующую активность и показатель гидрофобности клеток. При значении показателя гидрофобности более 20% и положительной эмульгирующей активности бактерии отбирают как продуценты биосурфактантов.

Недостатками прототипа, на взгляд авторов, является то, что в данном способе не учитывается реакция ферментных систем нефтеокисляющих бактерий на нефть или нефтепродукты, что не позволяет достоверно оценить углеводородокисляющую активность микроорганизмов.

Технический результат, на достижение которого направлено заявляемое техническое решение, заключается в создании доступного и достоверного способа выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов для эффективной очистки водных и почвенных экотопов от нефтезагрязнений.

Для достижения названного технического результата в заявляемом способе выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов проводят отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, выделяют чистые культуры углеводородокисляющих бактерий, культивируют их на плотной питательной среде, у выросших штаммов микроорганизмов определяют каталазную активность, затем из них готовят взвесь на физиологическом растворе в концентрации 1 млрд. клеток/мл (одномиллиардная микробная взвесь), смешивают ее с жидкой средой Раймонда в соотношении 1:150, в качестве единственного источника углерода добавляют нефть или нефтепродукты с места загрязнения из расчета 1 см³ на 1 дм³ среды Раймонда, инкубируют в течение 12 суток, затем высевают на плотную питательную среду, культивируют, по окончании культивирования у исследуемых штаммов микроорганизмов определяют каталазную активность и при ее снижении по сравнению с исходной на 30% и более исследуемый штамм микроорганизма выбирают как активный деструктор нефти и нефтепродуктов.

Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, что заявляемый способ за счет учета реакции ферментных систем микроорганизмов на утилизацию нефти или нефтепродуктов позволяет выбрать среди аборигенной микрофлоры штаммы микроорганизмов-деструкторов, наиболее активно разлагающие нефть и нефтепродукты, что способствует проведению эффективных мероприятий по очистке загрязненных нефтью и нефтепродуктами водных и почвенных экотопов.

Самоочищение от нефтяного загрязнения - сложный, многоступенчатый процесс, состоящий из одновременно протекающих физических, химических и биологических процессов. Окисление углеводородов нефти является кислородзависимым процессом. Окисление углеводородов происходит по свободно-радикальному механизму и является цепной реакцией, инициатором которой является кислород. В результате происходит образование высокореакционных форм кислорода - супероксид-аниона (О₂), пероксида водорода (Н₂О₂), и гидроксил-радикала (НО). (И.Ленгелер, Г.Шлегель, Современная микробиология. пер. с англ., М.: изд. Мир 2005. С.281, 341; Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный С.В. Механизмы деградации углеводородов нефти микроорганизмами // Успехи современной биологии, Т.126, №3, с.285-296). Активные формы кислорода инактивируются у аэробных бактерий с помощью химических и ферментативных реакций. В ферментативной детоксикации принимают участие каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы.

Известно, что важным показателем ферментативной активности является каталаза, которая служит дифференциально-диагностическим признаком у микроорганизмов (Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта, и др. - М.: Мир, 1997-761 с.)

В результате проведенных исследований авторами экспериментально установлена взаимосвязь между каталазной активностью штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов и их углеводородокисляющей активностью, а именно, что при деструкции нефти или нефтепродукта происходит снижение каталазной активности штаммов микроорганизмов-деструкторов на 30% и более по сравнению с их исходной активностью.

Авторами были проведены следующие исследования.

Из природных водоемов, подвергающихся загрязнению нефтью и нефтепродуктами (озеро Беленовское и родники Беляевского района Оренбургской области), были взяты пробы воды и выделены чистые культуры углеводородокисляющих бактерий.

Среди выделенных культур были представители видов Gordona terrae ИКВС 19, Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 17, Pseudomonas sp. ИКВС 2161, Pseudomonas putida ИКВС 2162, Pseudomonas putida ИКВС 2163, которые по данным литературы (А.В.Кураков, В.В.Ильинский, С.В.Котелевцев и др. Биоиндикация и реабилитация экосистем при нефтяных загрязнениях, М.: изд. «Графикой», 2006, - 336 с.) участвуют в разложении нефти и нефтепродуктов.

Далее культуру штамма Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 выращивали на агаризированной среде Чапека следующего состава: нитрат натрия 2 г, двузамещенный фосфат калия 1 г, сульфат марганца 7-водный 0,5 г, хлорид калия 0,5 г, сульфат железа (II) 7-водный 0,01 г, сахароза 30 г, дрожжевой экстракт 2 г, агар 15 г, дистиллированная вода 1000 см³, при температуре 25-27°С, в течение 48 часов.

Культуру штамма Pseudomonas putida ИКВС 2163 выращивали на 1,5% мясопептонном агаре, при температуре 25-27°С, в течение 48 часов.

У выращенных культур определяли исходную каталазную активность известным способом (Бухарин О.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В. и др., Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 р.//бюлл. эксперим. биологии, 2000 г. - Т. 130, №7 - С.80-82).

Согласно вышеупомянутому способу каталазная активность рассчитывается по формуле:

А_кат - каталазная активность, микромоль/мин*ОД;

ОД^оп - оптическая плотность комплекса J₂-KI в опыте;

ОД^к - оптическая плотность комплекса J₂-KI в контроле, полученном путем смешивания исходных растворов Н₂О₂ и KI с добавлением HCl;

Т - время инкубации исследуемой культуры с Н₂О₂;

ОД^м - оптическая плотность взвеси исследуемой культуры;

12,500 - расчетный коэффициент.

Из полученных культур указанных штаммов готовили взвесь на физиологическом растворе в концентрации 1 млрд. клеток/мл (одномиллиардная микробная взвесь), и вносили 1 см³ взвеси (1*10 6) в среду Раймонда в соотношении 1:150, в качестве единственного источника углерода добавляли стерильное дизельное топливо из расчета 1 см³ на 1дм³ среды.

Затем посевы инкубировали в течение 35 суток при температуре 25-27°С. С целью определения динамики каталазной активности в процессе деструкции нефтепродукта у исследуемых штаммов микроорганизмов определяли каталазную активность на 6, 12, 23 и 35 сутки инкубирования, согласно известному способу, указанному выше.

Изменение каталазной активности у исследуемых штаммов микроорганизмов рассчитывали по формуле:

А=((а1-а2)/а1)*100%, где

А - снижение каталазной активности, %;

a1 - исходная каталазная активность штамма, микромоль/мин*ОД;

а2 - опытная каталазная активность штамма, микромоль/мин*ОД.

Химический анализ на содержание нефтепродуктов проводился флуориметрическим методом на анализаторе жидкости «Флюорат - 02».

Деструкцию нефтепродуктов бактериями рассчитывали по формуле:

Д=((с1-с2)/с1)*100%,где

Д - деструкция нефтепродуктов;

c1 - начальное содержание нефтепродуктов, мг/дм³;

с2 - содержание нефтепродуктов в опыте, мг/дм³.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, каталазная активность штамма Gordona terrae ВКПМ Ac-1741 снижалась к шестым суткам - на 35,1%, а к 23 суткам на 74,9%. Снижение каталазной активности носило постоянный, стабильный характер, сохранялось и соответствовало периоду активной деструкции дизельного топлива. К концу эксперимента (35 сутки) каталазная активность штамма увеличивалась, и степень снижения активности фермента составляла 39,5%.

По результатам химического анализа к 35 суткам деструкция нефтепродукта произошла на 99,9%.

Каталазная активность штамма Pseudomonas putida ИКВС 2163 в опыте была высокой, снижение каталазной активности наблюдалось только к 35 суткам. По результатам химического анализа штамм не потреблял дизельное топливо, так как убыль дизельного топлива в опыте была сопоставима с контролем.

Аналогично проводили эксперимент со штаммами Pseudomonas sp. ИКВС 2161, Pseudomonas putida ИКВС 2162, Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 17, где в качестве единственного источника углерода была взята нефть Сорочинского месторождения (Оренбургская область).

В процессе эксперимента каталазная активность Pseudomonas sp. ИКВС 2161 к 12 суткам снижалась на 41,2%.

По результатам химического анализа штамм Pseudomonas sp. ИКВС 2161 к 12 суткам эксперимента потребил до 24,8% нефти, а к 35 суткам убыль нефти в опыте составила 40,1%.

В процессе эксперимента у штамма Pseudomonas putida ИКВС 2162 каталазная активность к 12 суткам снизилась на 30,4%. Максимальное снижение каталазной активности отмечалось на 23 сутки - 38,6%.

По результатам химического анализа штамм Pseudomonas putida ИКВС 2162 к 12 суткам эксперимента потребил до 53,0% нефти, а к 35 суткам убыль нефти в опыте составила 80,7%.

В процессе эксперимента каталазная активность Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 17 к 6 суткам снижалась на 26,7%. Максимальное снижение каталазной активности было отмечено на12 сутки 35,0%.

По результатам химического анализа штамм Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 17 к 12 суткам эксперимента потребил до 16,5% нефти, а к 35 суткам убыль нефти в опыте составила 49,7%.

Снижение каталазной активности у штаммов Gordona terrae ВКПМ Ac-1741, Pseudomonas sp. ИКВС 2161, Pseudomonas putida ИКВС 2162, Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 17 носило постоянный, стабильный характер и совпадало с периодом наиболее активной деструкции.

Как видно из проведенных экспериментов, динамика изменения каталазной активности и численности характеризовалась вариабельностью в повторностях. Несмотря на это, снижение каталазной активности в опыте всегда соответствовало периоду активной деструкции.

Из таблицы 1 видно, что наиболее оптимальным сроком для выбора штаммов-деструкторов являются 12 сутки, определение каталазной активности в более поздние сроки только подтверждает полученные ранее результаты, более ранние сроки могут привести к ложноотрицательным результатам:

Для учета естественного испарения нефти и нефтепродуктов использовали контроль 1 и контроль 2. В качестве контроля 1 использовали жидкую среду Раймонда с добавлением дизельного топлива из расчета 1 см³ на 1 дм³ среды, а контролем 2 служила жидкая среда Раймонда с добавлением нефти Сорочинского месторождения. (Таблица 2).

Как видно из таблицы 2, естественное испарение нефти и нефтепродуктов незначительно, а следовательно, снижения содержания нефти и нефтепродуктов в эксперименте свидетельствует о бактериальной деструкции нефти и нефтепродукта.

По результатам экспериментов было отмечено, что снижение каталазной активности на 30% и более наблюдается у штаммов, которые активно потребляют нефть или нефтепродукт.

Таким образом, заявляемый способ позволяет выбирать среди аборигенной микрофлоры штаммы микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов.

Способ осуществляется следующим образом.

1) Проводят отбор проб с нефтезагрязненной поверхности.

2) Выделяют чистые культуры углеводородокисляющих бактерий классическим бактериологическим методом.

3) Культивируют выделенные культуры углеводородокисляющих бактерий на плотной питательной среде: модифицированном агаре Чапека (грамположительные бактерии) или мясопептонном агаре (грамотрицательные бактерии). Продолжительность культивирования составляет от 2 до 3 суток в зависимости от индивидуальной скорости роста каждого штамма при температуре 25-27°С.

4) У всех выросших штаммов микроорганизмов определяют каталазную активность известным способом (Бухарин О.В., Черкасов С. В., Сгибнев А.В. и др., Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 р. // бюлл. эксперим. биологии, 2000 г. - Т.130, №7 - С.80-82) и принимают ее за исходную (а1). Согласно известному способу каталазную активность рассчитывают по формуле:

А_кат - каталазная активность, микромоль/мин*ОД;

ОД^оп - оптическая плотность комплекса J₂-KI в опыте;

ОД^к - оптическая плотность комплекса J₂-KI в контроле, полученном путем смешивания исходных растворов Н₂О₂ и KI с добавлением HCl;

Т - время инкубации исследуемой культуры с Н₂О₂;

ОД^м - оптическая плотность взвеси исследуемой культуры;

12,500 - расчетный коэффициент.

5) Из выращенных штаммов микроорганизмов готовят одномиллиардную микробную взвесь.

6) Смешивают полученную взвесь с жидкой средой Раймонда в соотношении 1:150 и в качестве единственного источника углерода добавляют сырую стерильную нефть или нефтепродукт с конкретного места загрязнения из расчета 1 см³ на 1 дм³ среды Раймонда.

7) Инкубируют в течение 12 суток при оптимальной для выделенных штаммов микроорганизмов температуре.

8) После инкубирования исследуемые штаммы микроорганизмов высевают на плотную питательную среду - модифицированный агар Чапека для грамположительных бактерий или 1,5% мясопептонный агар для грамотрицательных бактерий, с помощью шпателя Дригальского.

9) Посевы культивируют при оптимальной для выделенных штаммов микроорганизмов температуре в течение 3 суток.

10) По окончании культивирования у исследуемых штаммов микроорганизмов определяют каталазную активность (а2) известным способом (Бухарин О.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В. и др., Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 р. // бюлл. эксперим. биологии, 2000 г. - Т.130, №7 - С.80-82).

11) Затем рассчитывают степень изменения каталазной активности у исследуемых штаммов микроорганизмов по формуле:

А=((а1-а2)/а1)*100%,

где А - снижение каталазной активности, %;

a1 - исходная каталазная активность штамма, микромоль/мин*ОД;

а2 - опытная каталазная активность штамма, микромоль/мин*ОД.

Судят об углеводородокисляющей активности исследуемых штаммов микроорганизмов по изменению их каталазной активности до и после инкубирования с нефтью или нефтепродуктами с места загрязнения. Если каталазная активность у исследуемого штамма снижается на 30% и более по сравнению с исходной, то данный штамм выбирают как активный деструктор нефти или нефтепродукта.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Из реки Боровка (Оренбургская область), подвергающейся периодическому загрязнению нефтью Сорочинского месторождения, были взяты пробы воды. Было выделено два доминирующих по численности углеводородокисляющих штамма. При идентификации штаммы были отнесены к видам Rhodococcus erythropolis ИКВС 11 и Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15.

Далее культуры штаммы Rhodococcus erythropolis ИКВС 11 и Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15 выращивали на модифицированном агаре Чапека. Приготовленную среду разливали по флаконам, автоклавировали при 1 атм. в течение 20 мин. Питательную среду остужали до 45-50°С, разливали по стерильным чашкам Петри в объеме 10 см³. Давали питательной среде застыть. На застывшую поверхность агаризованной среды Чапека засевали бактериологической петлей (d 0,4 мм) культуры исследуемых штаммов. Посевы выращивали в термостате при температуре 25-27°С в течение 48 часов.

У выросших штаммов определяли исходную каталазную активность известным способом (Бухарин О.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В. и др., Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 р. // бюлл. эксперим. биологии, 2000 г. - Т.130, №7 - с.80-82).

К 0.2 см³ стандартизированной до оптической плотности 0.2 взвеси каждой из исследуемых культур добавляли 1 см³ свежеприготовленного 00125 М раствора Н₂О₂ и инкубировали 10 мин при комнатной температуре, реакцию разложения Н₂О₂ каталазой останавливали добавлением 5 капель раствора соляной кислоты. Затем добавляли 1 см³ свежеприготовленного 0.025 М раствора иодида калия, тщательно перемешивали и осаждали клетки Rhodococcus erythropolis ИКВС 11 и Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15 центрифугированием в течение 15 мин при 3000 g, после чего замеряли светопоглощение образовавшегося в надосадочной жидкости комплекса J₂-KI (λ=492 нм, объем кюветы 0.2 мл) не позднее чем через 10 мин. после центрифугирования.

Рассчитывали исходную каталазную активность Rhodococcus erythropolis ИКВС 11 и Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15 по формуле:

А_кат - каталазная активность, микромоль/мин*ОД;

ОД^оп - оптическая плотность комплекса J₂-KI в опыте;

ОД^к - оптическая плотность комплекса J₂-KI в контроле, полученном путем смешивания исходных растворов Н₂О₂ и KI с добавлением HCl;

Т - время инкубации исследуемой культуры с Н₂О₂;

ОД^м - оптическая плотность взвеси исследуемой культуры;

12,500 - расчетный коэффициент.

Исходная каталазная активность Rhodococcus erythropolis ИКВС 11:

a1=(12,5*(1-0,192/0,40))/10*0,187=(12,5*0,52)/1,87=3,5 микромоль/мин*ОД, где

ОД^м - 0,187;.

ОД^к - 0,40;

ОД^оп - 0,192;

Т - 10 мин.

Исходная каталазная активность Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15:

a1=(12,5*(1-0,184/0,42))/10*0,22=(12,5*0,562)/2,2=3,2 микро-моль/мин*ОД, где

ОД^м - 0,22;

ОД^к - 0,42;

ОД^оп - 0,184;

Т - 10 мин.

Из выросших штаммов готовят одномиллиардную микробную взвесь. В стерильные флаконы наливали 150 см³ стерильной среды Раймонда. Полученные взвеси культур вносили по 1 см³ во флаконы с опытной средой Раймонда, в качестве единственного источника углерода добавляли стерильную нефть Сорочинского месторождения из расчета 1 см³ на 1 дм³ среды. Время инкубации 12 суток, при температуре 25-27°С.

На 6 сутки культивирования из предварительно сделанных разведений исследуемые штаммы Rhodococcus erythropolis ИКВС 11 и Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15 высевали на питательную агаризированную среду Чапека объемом 0,1 см³. У выросших культур определяли каталазную активность.

На 6 сутки каталазная активность Rhodococcus erythropolis ИКВС 11 составила:

а2=(12,5*(1-0,193/0,41))/10*0,2=(12,5*0,425)/2=3,3 микромоль/мин*ОД, где

ОД^м - 0,2;

ОД^к - 0,41;

ОД^оп - 0,193;

Т - 10 мин.

На 6 сутки каталазная активность Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15 составила:

а2=(12,5*(1-0,276/0,48))/10*0,19=(12,5*0,425)/1,9=2,8 микромоль/мин*ОД, где

ОД^м - 0,19;

ОД^к - 0,48;

ОД^оп - 0,276;

Т - 10 мин.

Определяли изменение каталазной активности у исследуемых культур по формуле:

А=((а1-а2)/а1)*100%, где

А - снижение каталазной активности, %;

а1 - исходная каталазная активность штамма, усл. ед.;

а2 - опытная каталазная активность штамма, усл.ед.

1. Определяли изменение каталазной активности у штамма Rhodococcus erythropolisИКВС 11.

Исходная каталазная активность штамма Rhodococcus erythropolis ИКВС 11 составляла 3,5 микромоль/мин*ОД (а1), на 6 сутки каталазная активность штамма составила 3,3 микромоль/мин*ОД (а2). Снижение каталазной активности:

А=((3,5-3,3)/3,5)*100%=(0,2/3,5)*100%=0,057*100%=5,7%, где

А - снижение каталазной активности, %;

а1 - 3,5 микромоль/мин*ОД;

а2 - 3,3 микромоль/мин*ОД.

У штамма Rhodococcus erythropolis ИКВС 11 снижение каталазной активности на 6 сутки культивирования составило 5,7%. Так как снижение каталазной активности произошло менее чем на 30%, штамм Rhodococcus erythropolis ИКВС 11 оставлен для дальнейшего культивирования до 12 суток.

На 12 сутки инкубации из предварительно сделанных разведений штамм Rhodococcus erythropolis ИКВС 11 высевали на питательную агаризированную среду Чапека объемом 0,1 см³.

На 12 сутки каталазная активность Rhodococcus erythropolis ИКВС 11 составила:

а2=(12,5*(1-0,237/0,45))/10*0,19=(12,5*0,526)/1,9=3,1 микромоль/мин*ОД, где

ОД^м - 0,19;

ОД^к - 0,45;

ОД^оп - 0,237;

Т - 10 мин.

Снижение каталазной активности:

А=((3,5-3,1)/3,5)*100%=(0,4/3,5)*100%=0,114*100%=11,4%.

Снижение каталазной активности у штамма Rhodococcus erythropolis ИКВС 11 к 12 суткам составило 11,4%, следовательно, данный штамм не может быть выбран в качестве активного деструктора нефти Сорочинского месторождения.

2. Определяли изменение каталазной активности у штамма Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15.

Исходная каталазная активность штамма Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15 составляла 3,2 микромоль/мин*ОД (а1), на 6 сутки каталазная активность штамма составила 2,8 микромоль/мин*ОД (а2). Снижение каталазной активности;

А=((3,2-2,8)/3,2)*100%=(0,4/3,2)*100%=0,125*100%=12,5%, где

а1 - 3,2 микромоль/мин*ОД;

а2 - 2,8 микромоль/мин*ОД.

Таким образом, у штамма Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15 снижение каталазной активности на 6 сутки культивирования составило 12,5%. Так как снижение каталазной активности произошло менее чем на 30%, штамм Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15 оставлен для дальнейшего культивирования до 12 суток.

На 12 сутки инкубации из предварительно сделанных разведений штамм Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15 высевали на питательную агаризированную среду Чапека объемом 0,1 см³.

На 12 сутки каталазная активность Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15 составила:

a1=(12,5*(1-0,252/0,40))/10*0,21=(12,5*0,37)/2,1=2,2 микромоль/мин*ОД, где

ОД^м - 0,21;

ОД^к - 0,40;

ОД^оп - 0,252;

Т - 10 мин.

На 12 сутки у штамма Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15 каталазная активность составила 2,2 микромоль/мин*ОД (а2). Снижение каталазной активности рассчитывали по вышеприведенной формуле:

А=((3,2-2,2)/3,2)*100%=(1,0/3,2)*100%=0,312*100%=31,3%, где

a1 - 3,2 микромоль/мин*ОД;

а2 - 2,2 микромоль/мин*ОД.

Таким образом, у штамма Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15 к 12 суткам произошло снижение каталазной активности более чем на 30% по сравнению с исходной и составило 31,3%, следовательно, данный штамм выбирается в качестве активного деструктора нефти Сорочинского месторождения. Из двух исследованных штаммов в качестве деструктора нефти Сорочинского месторождения выбирается штамм Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 15.

Пример 2

С участка почвы, подвергшегося загрязнению нефтью Бугурусланского месторождения, были взяты почвенные пробы, из которых были выделены два доминирующих по численности углеводородокисляющих штамма. При идентификации штаммы были отнесены к видам Rhodococcus erythropolis ИКВС 23 и Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 21.

Для определения их углеводородокисляющей активности заявляемым способом, аналогично примеру 1, определяли изменение каталазной активности у Rhodococcus erythropolis ИКВС 23 и Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 21 под влиянием Бугурусланской нефти.

Результаты приведены в табл.3.

Как видно из таблицы 3, у штамма Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 21 при росте на нефти Бугурусланского месторождения снижение каталазной активности к 12 суткам достигло 33,2%, то есть снижение каталазной активности произошло более чем на 30% по сравнению с исходной, а у штамма Rhodococcus erythropolis ИКВС 23 каталазная активность к 12 суткам снизилась только до 9,7%.

Снижение каталазной активности у штамма Rhodococcus erythropolis ИКВС 23 произошло менее чем на 30% по сравнению с исходной и, следовательно, он не может быть выбран в качестве деструктора данного загрязнения.

У штамма Rhodococcus rubropertinctus ИКВС 21 наблюдалось снижение каталазной активности более чем 30% по сравнению с исходной, следовательно, он может использоваться в качестве деструктора нефти Бугурусланского месторождения.

Как видно из таблицы 3, наиболее оптимальным сроком для выбора штаммов-деструкторов являются 12 сутки, определение каталазной активности в более поздние сроки, в данном примере, только подтверждают полученные к 12 суткам результаты.

Пример 3

Из проб воды, взятых из реки Илек, подвергающейся периодическому загрязнению нефтепродуктами, в частности дизельным топливом, были выделены три доминирующих по численности грамотрицательных штамма, способных к росту на нефтепродуктах: Pseudomonas putida ИКВС № 2061, Pseudomonas alcaligenes ИКВС № 20121 и Acinetobacter sp. ИКВС № 2122.

Для определения их углеводородокисляющей активности заявляемым способом, аналогично примеру 1, определяли изменение каталазной активности у Pseudomonas putida ИКВС № 2061, Pseudomonas alcaligenes ИКВС № 20121 и Acinetobacter sp. ИКВС № 2122 под влиянием дизельного топлива.

Результаты приведены в таблице 4.

У штамма Pseudomonas putida ИКВС №2061 к 12 суткам каталазная активность снизилась до 44,3%.

У штамма Pseudomonas alcaligenes ИКВС № 20121 каталазная активность снижалась незначительно и к 12 суткам культивирования достигла 8,3%, что говорит о низкой деструктивной активности данного штамма.

В опыте со штаммом Acinetobacter sp. ИКВС № 2122 каталазная активность снижалась к 12 суткам до 36,75%.

В результате среди исследованных штаммов можно выделить Pseudomonas putida ИКВС № 2061 и Acinetobacter sp. ИКВС № 2122 как наиболее активных деструкторов дизельного топлива.

Как видно из таблицы 4, наиболее оптимальным сроком для выбора штамма-деструктора являются 12 сутки, определение каталазной активности в более поздние сроки может привести к ложноотрицательным результатам, связанным с накоплением в среде культивирования продуктов обмена.

Таким образом, заявляемый способ позволяет выбрать среди аборигенной микрофлоры штаммы микроорганизмов-деструкторов, наиболее активно разлагающие нефть и нефтепродукты, что способствует проведению эффективных мероприятий по очистке загрязненных нефтью и нефтепродуктами водных и почвенных экотопов.

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов. Для выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов проводят отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, выделяют чистые культуры углеводородокисляющих бактерий, культивируют их на плотной питательной среде, у выросших штаммов микроорганизмов определяют каталазную активность, затем из них готовят одномиллиардную микробную взвесь, смешивают ее с жидкой средой Раймонда в соотношении 1:150, в качестве единственного источника углерода добавляют нефть или нефтепродукты с места загрязнения из расчета 1 см³ на 1 дм³ среды Раймонда, инкубируют в течение 12 суток, затем высевают на плотную питательную среду, культивируют, по окончании культивирования у исследуемых штаммов микроорганизмов определяют каталазную активность и при ее снижении по сравнению с исходной на 30% и более исследуемый штамм микроорганизма выбирают как активный деструктор нефти и нефтепродуктов. Изобретение позволяет выбрать среди аборигенной микрофлоры штаммы микроорганизмов-деструкторов, наиболее активно разлагающие нефть и нефтепродукты, что способствует проведению эффективных мероприятий по очистке загрязненных нефтью и нефтепродуктами водных и почвенных экотопов.

Способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов, отличающийся тем, что проводят отбор проб с нефтезагрязненной поверхности, выделяют чистые культуры углеводородокисляющих бактерий, культивируют их на плотной питательной среде, у выросших штаммов микроорганизмов определяют каталазную активность, затем из них готовят одномиллиардную микробную взвесь, смешивают ее с жидкой средой Раймонда в соотношении 1:150, в качестве единственного источника углерода добавляют нефть или нефтепродукты с места загрязнения из расчета 1 см³ на 1 дм³ среды Раймонда, инкубируют в течение 12 суток, затем высевают на плотную питательную среду, культивируют, по окончании культивирования у исследуемых штаммов микроорганизмов определяют каталазную активность и при ее снижении по сравнению с исходной на 30% и более исследуемый штамм микроорганизма выбирают как активный деструктор нефти и нефтепродуктов.