ОЛЕОФИЛЬНЫЙ БИОПРЕПАРАТ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННОЙ ПОЧВЫ Российский патент 2002 года по МПК B09C1/10 C12N1/20 C12N1/26 C12N1/26 C12R1/01 

Изобретение относится к микробной экологии и биотехнологии защиты окружающей среды.

Способы биологической очистки нефтезагрязненной почвы, основанные на использовании ферментативной активности углеводородокисляющих микроорганизмов, характеризуются как наиболее эффективные и экологически безопасные. Известно [1] два принципиальных подхода к биодеградации нефтяных углеводородов: (1) интродукция в загрязненную экосистему специально подобранных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов различных классов углеводородных поллютантов; (2) активизация аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры путем создания оптимальных условий для ее развития. Наиболее перспективны биотехнологии, предусматривающие сочетание этих двух подходов, в частности внесение в почву биопрепаратов, включающих бактериальные ассоциации и минеральные удобрения.

В составе известных биопрепаратов используются штаммы родококков Rhodococcus erythropolis, Dietzia (former Rhodococcus) maris, Rhodococcus sp. [2-4] . Биохимический потенциал представителей вида Rhodococcus ruber, биохимическая уникальность которых - способность ассимилировать в качестве единственных источников углеродного питания наряду с жидкими газообразные углеводороды (пропан, н-бутан), ранее не использовался. Пропан- и бутанокисляющие родококки являются доминирующими компонентами бактериоценозов углеводородных залежей и характеризуются высоким уровнем адаптации к экстремальным условиям существования, в частности психро-, баро-, осмотолерантностью, олигонитро- и олигокарбофилией [5] . Синтезируемая ими ферментная система катализирует реакции биотрансформации практически всех классов органических соединений.

Следует отметить, что применение традиционных бактериальных препаратов позволяет снизить уровень нефтезагрязнения почвы в основном за счет окисления легкодеградируемых компонентов нефти. При этом биологическое разрушение высокомолекулярных парафинов, ароматических и полициклических углеводородов затруднено тем, что данные соединения прочно связываются с почвенными частицами, образуя гидрофобные пленки, и становятся практически недоступными для микроорганизмов. Для повышения биодоступности углеводородных поллютантов используют поверхностно-активные вещества (ПАВ, сурфактанты), которые способствуют десорбции нефтяных углеводородов, облегчая тем самым их ассимиляцию микробными клетками. Однако применяемые для борьбы с углеводородными загрязнениями синтетические сурфактанты - это высокотоксические вещества с низкой деградабельностью. Применение синтетических детергентов приводит к накоплению экологически опасных соединений в почве. Кроме того, получение синтетических сурфактантов осложнено высокой стоимостью исходного сырья и технологических процессов химического синтеза.

Известные формы биопрепаратов, применяемых в виде водной суспензии микроорганизмов, или обезвоженной микробной биомассы, или иммобилизованных на твердом носителе микробных клеток, имеют определенные недостатки, как то: для жидкой формы - низкое сродство к гидрофобному нефтезагрязнению, трудности хранения и перевозки препарата; для сухой (лиофилизированной) формы - низкая выживаемость микроорганизмов, высокие затраты на производство, необходимость предварительной подготовки (активации) биопрепарата; для твердой формы (с применением адсорбентов) - увеличение объема/веса препарата, внесение в окружающую среду недеградабельного материала.

Цель настоящего изобретения - создание на основе бактериальных сурфактантных комплексов эффективного экологически безопасного олеофильного биопрепарата, пригодного для ускорения естественного процесса биодеструкции нефтяных углеводородов в почве.

Поставленная цель достигается тем, что предлагается новый состав и новая форма биопрепарата в виде олеофильной концентрированной эмульсии. В основе биопрепарата в качестве стабилизирующего агента используется биогенный сурфактант, синтезируемый алканотрофными родококками и выделяемый из культуральной жидкости с помощью ультразвуковой обработки [6]. Используемый биосурфактант имеет существенные преимущества перед синтетическими ПАВ, как то: легкая биодеградабельность, устойчивая активность в экстремальных внешних условиях, широкие функциональные характеристики, возможность получения на нетрадиционных и относительно дешевых источниках сырья.

Входящие в состав биопрепарата бактериальные штаммы - грамположительные аэробы, неподвижны, некислотоустойчивы, неспорообразующие. Имеют ярко выраженную каталазную активность и окислительный метаболизм. Отличительная черта - трехстадийный морфогенетический цикл развития (кокки - палочковидные, нитевидные или ветвящиеся клетки - кокки). Имеют IV хемотип клеточной стенки (тип дифференцирующих сахаров А (арабиноза, галактоза) и мезо-диаминопимелиновая кислота) и синтезируют миколовые кислоты (липид LCN-A обнаружен). Характеризуется пептидогликаном вариации А1γ (аланин - глутаминовая кислота - мезо-ДАПК с молярным соотношением 1,99: 1,32:1,0 (2:1:1) и Р II типом фосфолипидов. Приведенная характеристика штаммов, входящих в состав биопрепарата, соответствует современному представлению о роде Rhodococcus.

Штамм Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 выделен из содержимого шламотстойника на территории нефтяного месторождения Пермской области.

Морфолого-культуральные признаки. В течение первых 10-12 ч после высева на мясопептонный агар преобладают нитевидные 8,0-12,0 мкм длиной, редко слабоветвящиеся, фрагментирующиеся через 12-14 ч роста клеточные формы. Последующее деление укороченных фрагментов происходит бинарным способом. Образующиеся палочковидные клетки располагаются v-образно и палисадовидно. Иногда палочковидные клетки в культуре имеют терминальные и субтерминальные вздутия. На плотных углеводородных, а также богатых питательных средах образует колонии мягкой консистенции без воздушного мицелия с палево-телесным недиффундирующим пигментом.

Физиолого-биохимические свойства. Образует кислоту из большей части используемых в традиционных тестах моно- и олигосахаров и сахароспиртов. Усваивает натриевые соли пировиноградной, фумаровой, уксусной, пропионовой и масляной кислот. Образет кислоту из салицина. Способен расти в присутствии 5% NaCl; при исходном рН 5,7 и 8,0; температуре от 10 до 40^oС; выдерживает осмотическое давление 31,4 атм, нагревание при 60^oС в течение 30 мин и при 72^oС в течение 15 мин; растет на безазотистых минеральных средах и толерантен к антимикробным агентам: 0,003% основного фуксина, 0,0001% кристаллического фиолетового и 5% пропиленгликоля. Ассимилирует н-алканы (С10-С17), алифатические спирты, ароматические углеводороды (бензол, толуол, ксилол, нафталин). Деградирует ароматические кислоты и амины. Хорошо растет в присутствии высоких (до 20 об.%) концентраций сырой нефти.

Штамм Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 выделен из дерново-подзолистой почвы на территории нефтегазового месторождения Пермской области.

Морфолого-культуральные признаки. Характеризуется четкой фрагментацией первичного мицелия. В начальной стадии роста прорастание и ветвление исходных кокковидных клеток начинается с формирования одной или трех ростовых трубок, диаметр которых меньше такового родоначальных клеток. В экспоненциальной стадии роста (8-12 ч на богатых питательных средах) выявляются клетки 6,0-12,0•0,6-0,9 мкм с обильно ветвящимся мицелием, который фрагментируется на укороченные палочки и кокковидные элементы. В 28-40 ч культурах присутствуют ветвящиеся клетки длиной 4,0-5,0 мкм с характерной "полосатостью" цитоплазмы и небольшое количество более коротких фрагментов. На плотных углеводородсодержащих и богатых питательных средах образует колонии без воздушного мицелия с ярко-оранжевым и розово-красным недиффундирующим пигментом соответственно.

Физиолого-биохимические свойства. Усваивает гамма-аминомасляную, но не альфа-кетоглутаровую кислоту. Образует ацетамидазу и никотинамидазу (на 21-е сут роста), кислоту из сахарозы. Не усваивает соли винной кислоты. Растет в присутствии 7% NaCl; при исходном рН 5,7 и 8,0; температуре от 10 до 42^oС; выдерживает осмотическое давление 31,4 атм, нагревание при 60^oС в течение 30 мин и при 72^oС в течение 15 мин. Усваивает атмосферный азот. Толерантен к антимикробным агентам: 0,003% основного фуксина, 0,0001% кристаллического фиолетового и 5% пропиленгликоля. Ассимилирует газообразные (этан, пропан, н-бутан) и жидкие (С10-С17) н-алканы, алифатические спирты, ароматические углеводороды (бензол, толуол, ксилол, нафталин). Деградирует ароматические кислоты и амины, поверхностно-активные соединения. Хорошо растет в присутствии высоких (до 20 об.%) концентраций сырой нефти.

Штаммы депонированы в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер 768 во Всемирной федерации коллекций культур) и хранятся в лиофилизированном виде.

Приготовление биопрепарата. В качестве инокулята используют штаммы Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327, взятые в равном соотношении (посевная доза 3,5•10⁵ клеток/мл). Бактериальную культуру выращивают в минеральной среде, содержащей, г/л: нитрат калия - 1,0, однозамещенный фосфат калия -1,0, двузамещенный фосфат калия - 1,0, хлористый натрий - 1,0, сернокислый магний - 0,2, хлористый кальций - 0,02, хлорное железо - 0,01. В качестве источника углерода в минеральную среду добавляют 3,0 об.% смеси нефтяных углеводородов (С12-С17) или дизельного топлива. Культивирование проводят в ферментере при 28^oС. После 72 ч выращивания культуру отстаивают. Водную фракцию сливают. К оставшемуся гидрофобному слою, содержащему бактериальные клетки и углеводородный субстрат, добавляют минеральные соли азота, фосфора и калия в соотношении 70:5:1 и биосурфактант Rhodococcus в количестве 10-50 г/л.

Полученный биопрепарат хранят при температуре не выше +10^oС. Непосредственно перед использованием препарат разбавляют водой в различных соотношениях.

Основные преимущества предложенного олеофильного биопрепарата: (1) повышенная солюбилизация с нефтяными углеводородами, в результате которой бактерии-нефтедеструкторы вступают в непосредственный контакт с загрязнителем; (2) обеспечение биодоступности нефтепродуктов в результате их десорбции с почвенных частиц под действием биосурфактанта; (3) наличие в олеофильном матриксе комплекса необходимых питательных соединений; (4) высокая биодеградабельность; (5) отсутствие токсического воздействия на микрофлору почвы.

Применение олеофильной формы биопрепарата отменяет необходимость дополнительного периодического внесения минеральных удобрений, поскольку замедленное высвобождение органически связанных азота, фосфора и калия обеспечивает пролонгированное снабжение ими почвенных микроорганизмов и корней растений. При этом не происходит вторичного загрязнения поверхностных и грунтовых вод минеральными солями (нитратами, нитритами).

Биопрепарат в олеофильной форме характеризуется высокой жизнеспособностью входящих в его состав родококков (фиг. 1), удобен в хранении и транспортировке, прост в подготовке к использованию.

Испытания эффективности биопрепарата для очистки нефтезагрязненной почвы проводят в условиях твердожидкофазного реактора и аэрируемых почвенных площадок.

Пример 1. Действие биопрепарата на процесс разложения нефтепродуктов в твердожидкофазном биореакторе.

В качестве биореактора используют автоматизированную систему "Фермус-3" (НПО "Биофармавтоматика", Нижний Новгород). Емкость реактора - 3 л, рабочий объем -1,5 л, скорость вращения мешалки - 200 об/мин, подача воздуха под давлением 1,5 кг/ см², комнатная температура. 500 г нефтезагрязненной почвы с высоким (30 вес.%) уровнем загрязнения, 1 л водопроводной воды и 1 г биопрепарата помещают в биореактор. На 8-е и 29-е сутки осуществляют повторное внесение биопрепарата.

Результаты исследования влияния биопрепарата на численность нефтеокисляющих и гетеротрофных бактерий приведены в табл. 1. Как видно из табл. 1, в биореакторе обнаруживаются гетеротрофные и нефтеокисляющие бактерии в количестве 3,4•10⁵ и 9,2•10⁴ клеток/мл соответственно. После внесения биопрепарата численность гетеротрофов увеличивается в 100, а количество углеводородокислителей - 500 раз. В течение второй недели эксперимента численность обеих групп бактерий незначительно уменьшается, а после повторного внесения биопрепарата (8-е сутки эксперимента) вновь возрастает и достигает 10⁸ клеток/мл. В дальнейшем присутствие гетеротрофных и углеводородокисляющих бактерий в биореакторе стабилизируется на высоком уровне, и их количество составляет 1,3•10⁹ и 1,3•10⁸ клеток/мл соответственно.

Сравнительная скорость биодеградации нефтяных углеводородов приведена на фиг. 2. Как видно из фиг. 2, наиболее быстро осуществляется окисление легкодеградируемых нефтяных фракций, в частности парафинов. Так, если изначальная доля данных компонентов в остаточной нефти составляла почти 90%, то к концу срока биоремедиации относительное содержание парафинов снизилось до 61%. Микробиологическая деструкция асфальтенов и смол протекает значительно медленнее. На завершающей стадии эксперимента их доля в остаточном нефтяном загрязнении повысилась на 19,9 и 18,9% соответственно.

Общая эффективность разложения нефти под действием биопрепарата составляет 90% после 6 недель биоремедиации. Таким образом, предлагаемый биопрепарат может быть использован для очистки сильнозагрязненной (до 30 вес. %) нефтепродуктами почвы в твердожидкофазном биореакторе.

Пример 2. Действие биопрепарата на процесс восстановления нефтезагрязненной почвы в аэрируемых почвенных площадках.

На экспериментальном участке изготавливают 4 почвенные площадки размером 2,0 м • 2,0 м • 0,15 м. В основание каждой площадки предварительно закладывают слой глины толщиной 10 см для предотвращения просачивания нефтепродуктов в подпочвенные горизонты и грунтовые воды. Нефтезагрязненную (30 вес.%) почву вносят в контрольные и опытные площадки до достижения концентрации нефтепродуктов 5 и 10 вес.%. В качестве разрыхлителя вносят древесную щепу в соотношении 1:10. Добавление биопрепарата (1-2 л/м²) в опытные площадки осуществляют 1 раз в неделю в течение первого месяца и в дальнейшем 1 раз в месяц. Почву еженедельно рыхлят и увлажняют до достижения уровня относительной влажности 20%.

В табл. 2 приведены данные по изучению действия биопрепарата на численность почвенных нефтеокисляющих и гетеротрофных бактерий. Как видно из табл. 2, внесение биопрепарата стимулирует развитие гетеротрофов (их число возрастает в 10-100 раз по сравнению с первоначальной численностью и достигает 10⁸-10⁹ клеток/г почвы) и в большей степени углеводородокисляющих микроорганизмов, численность которых увеличивается в 100-1000 раз и достигает 10⁷-10⁸ клеток/г почвы. В то время как в контрольных вариантах эксперимента количество гетеротрофных и нефтеразрушающих бактерий не превышает 8,3•10⁶ и 1,1•10⁶ клеток/г почвы соответственно.

Результаты исследования влияния биопрепарата на степень деградации нефти в почве представлены в табл. 3. Как видно из табл. 3, в контрольных почвенных площадках с исходным содержанием нефтепродуктов 5,0 и 10,0 вес.% в течение срока наблюдений концентрация нефтепродуктов уменьшается до 2,4 и 5,5 вес. % соответственно. При этом эффективность биологического разложения нефти за 7 недель составляет 45-51%.

В опытных площадках с исходным уровнем нефтезагрязнения почвы 5,0 и 10,0 вес.% количество нефтепродуктов снижается до 0,4 и 1,5 вес.% соответственно. При этом скорость микробиологической деструкции практически в 2 раза превышает таковую в контрольной (не обработанной биопрепаратом) почве. Общая эффективность микробиологической деградации нефти в опытных площадках составляет 85-90% за 7 недель биоремедиации.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о высокой эффективности биопрепарата, предлагаемого для ускорения процесса микробиологического разложения нефтепродуктов в почве.

Олеофильный биопрепарат на основе бактериальных сурфактантов может быть использован для очистки почв, загрязненных высокими (10-30 вес.%) концентрациями нефти и нефтепродуктов, и рекомендуется к применению в биотехнологиях очистки нефтезагрязненных почв, предусматривающих использование твердожидкофазного биореактора и аэрируемых почвенных площадок.

Источники информации
1. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде. Обзор//Прикладная биохимия и микробиология. - 1996. - Т. 32, N 6. - С. 579-585.

2. Патент РФ N 2019527, кл. С 02 F 3/34.

3. Патент РФ N 2023686, кл. С 02 F 3/34.

4. Патент РФ N 9712054, кл. С 02 F 3/34.

5. Ившина И.Б., Пшеничнов Р.А., Оборин А.А. Пропанокисляющие родококки. - Свердловск: УНЦ АН СССР, 1987. - 125 с.

6. Ivshina, I.B., Kuyukina, M.S., Philp, J.C., Christofi, N. Oil desorption from mineral and organic materials using biosurfactant complexes produced by Rhodococcus species//World Journal of Microbiology and Biotechnology. - 1998. - V. 14. - P. 711-717.

Изобретение относится к биотехнологии защиты окружающей среды. Предлагаются новый состав и новая форма биопрепарата в виде олеофильной концентрированной эмульсии. В основе биопрепарата в качестве стабилизирующего агента используется биогенный сурфактант, синтезируемый алканотрофными родококками. Биопрепарат содержит ассоциацию бактериальных культур-нефтеразрушителей Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 в концентрации 10¹⁰-10¹¹ жизнеспособных клеток/мл и сбалансированную минеральную добавку азота, фосфора и калия. Основные преимущества олеофильного биопрепарата: высокая степень солюбилизации с нефтяными углеводородами, в результате которой бактерии-нефтедеструкторы вступают в непосредственный контакт с загрязнителем; повышение биодоступности нефтяных углеводородов в результате их десорбции с почвенных частиц под действием биосурфактанта; заключенный в олеофильном матриксе комплекс питательных соединений; высокая биодеградабельность; отсутствие токсического воздействия на микрофлору почвы. Биопрепарат характеризуется высокой жизнеспособностью входящих в его состав микроорганизмов, удобен в хранении и при транспортировке. Биопрепарат обеспечивает эффективное ускорение микробиологической деструкции нефтепродуктов в почве с высоким (до 30 вес.%) уровнем загрязнения, рекомендуется к применению в биотехнологиях очистки нефтезагрязненных почв. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл.

1. Биопрепарат для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов, содержащий ассоциацию микроорганизмов, отличающийся олеофильной формой препарата и тем, что в качестве ассоциации микроорганизмов содержит бактериальные культуры-нефтеразрушители Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 в концентрации 10¹⁰-10¹¹ жизнеспособных клеток/мл, в качестве стабилизирующего материала - биосурфактант Rhodococcus и дополнительно содержит минеральные соли азота, фосфора и калия в соотношении 70: 5: 1 при следующем соотношении компонентов, мас. %:
Ассоциация бактериальных культур-нефтеразрушителей - 50,0-80,0
Биосурфактантный комплекс Rhodococcus - 5,0-30,0
Минеральные соли азота, фосфора и калия - Остальное
2. Биопрепарат по п. 1, отличающийся тем, что входящие в состав биопрепарата бактериальные культуры-нефтеразрушители Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 использованы в соотношении 1: 1-3.