ШТАММ Pseudomonas aeruginosa RCAM01139 ДЛЯ РАЗЛОЖЕНИЯ НЕФТИ И ДИЗЕЛЬНОГО ТОПЛИВА Российский патент 2013 года по МПК C12N1/20 C12N1/26 C12R1/385 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новой культуры микроорганизмов, разрушающих нефть и дизельное топливо, и которая может быть использована для очистки загрязненных почв.

Известен консорциум штаммов углеводородокисляющих бактерий Pseudomonas aeruginosa НД К3-1 и Pseudomonas fluorescens НД К3-2 (Патент РФ №2312719, C12N 1/26, В09С 1/10, опубл. 2007), который выделен из образцов почв и подземных вод карстовых полостей, отобранных на территории Пермской обл. и используемый для деструкции нефти и нефтепродуктов.

Следует отметить, что выращивание смеси культур, в данном случае консорциума двух штаммов, возможно при больших материальных и энергозатратах, в сравнении с наращиванием биомассы, состоящей из одной культуры клеток микроорганизмов.

Известен штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa ХР-25 (Патент РФ №2270806, C12N 1/20, C02F 3/34, C12R 1/385, опубл. 2006), который был выделен из фенолзагрязненных почв Стерлитамакского нефтехимического завода путем культивирования почвенного образца в минерализованной среде с последующим отбором наиболее активных форм, и используемый для очистки сточных вод химических предприятий от ароматических соединений.

Из представленных в патенте данных следует, что спектр действия штамма Pseudomonas aeruginosa ХР-25 направлен на утилизацию ароматических соединений, в частности фенола, и не распространяется на другие «тяжелые» фракции углеводородов, а также экотоксикантов, таких как спирты, альдегиды, технические масла, жиры и др.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств и получение нового штамма, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти и дизельного топлива, которые являются единственными источниками углерода и энергии.

Для достижения поставленной задачи предложен штамм Pseudomonas aeruginosa 12-Р, выделенный из образца загрязненной нефтью почвы нефтебазы «Ручьи», Санкт-Петербург. Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) под номером RCAM01139.

Выделение штамма осуществлялось путем культивирования исходного образца загрязненной нефтью почвы в жидкой минеральной среде с добавлением углеводородов с последующим рассевом на мясопептонный агар (МПА) для получения изолированных колоний.

Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определителе бактерий Bergey (Bergey's. Manual of Systematic Bacteriology. 1986. 8^th ed V.2. Baltimore-Londone, William & Wilkins), а также на основании изучения последовательности генов 16S рРНК.

Культивирование в лабораторных условиях производилось на питательных средах следующего состава:

1) Среда Кинг Б (глицерин - 10,0 г/л; пептон - 20,0 г/л; K₂HPO₄ - 1,5 г/л; MgSO₄ - 1,5 г/л; агар-агар - 15,0 г/л), рН среды ~7,6 до стерилизации.

2) Минеральная среда с C₁₄-C₁₇ для сохранения практической ценности культуры:

(K₂HPO₄ - 0,5 г/л; KH₂PO₄ - 0,5 г/л; MgSO₄ - 0,3 г/л; NH₄H₂PO₄ - 1,0 г/л; пептон - 2,0 г/л; агар-агар - 15,0; после внесения среды в пробирки до стерилизации наслаиваем ~0,8 мл фракции жидких углеводородов С₁₄-С₁₇), рН среды 7,1-7,2 до стерилизации.

Условия выращивания: на среде Кинг Б - 72 часа при 28°C, на минеральной среде с углеводородами - 96-120 часов при 28°C.

Хранение штамма производят при периодическом пересеве на свежеприготовленные среды 1 раз в 3 месяца.

По морфологическим признакам штамм характеризуется как грамотрицательная прямая палочка с закругленными концами, размером (0,5-0,7)×(1-3) мкм, хорошо окрашивается всеми анилиновыми красителями. В мазках располагается одиночно, парами или короткими цепочками. Подвижна, имеет один жгутик. Спор не образует, капсулы не имеет, но продуцирует слизь, которая тонким слоем окружает микробную клетку.

Данный штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими особенностями. Колонии молочного цвета, округлые, выпуклые с ровными краями, на среде Кинг Б (пептон - 20 г/л, K₂HPO₄ - 1,5 г/л, MgSO₄×7H₂O - 1,5 г/л, глицерин - 10 г/л) дает желто-зеленую пигментацию. Pseudomonas aeruginosa 12-Р является аэробом. Хемоорганотроф, растет в широких интервалах температуры от 6 до 45°C, диапазон pH от 4,5 до 9,0. Оптимальная температура роста 37°C, pH 7,2-7,5, но также хорошо растет и при температуре 42°C. К питательным средам нетребовательна, хорошо растет на МПА и мясопептонном бульоне (далее - МПБ). На МПА через сутки образуются довольно крупные (3-5 мм) полупрозрачные колонии молочного цвета с перламутровым оттенком. Центр колонии более темный, чем периферия, края ровные, четкие. На скошенном агаре культура Pseudomonas aeruginosa 12-Р дает тонкий блестящий налет. Характерным свойством ее является появление уже к концу первых суток сине-зеленого окрашивания культуры с последующим проникновением пигмента (пиоцианина) в питательную среду.

Данный штамм характеризуется следующими биохимическими характеристиками. Pseudomonas aeruginosa 12-Р обладает слабой сахаролитической активностью: расщепляет только глюкозу с образованием кислоты без газа. Более выражена протеолитическая активность: разжижает желатин и свернутую кровяную сыворотку, гидролизует казеин. Свертывает лакмусовое молоко и затем расщепляет сгусток. Восстанавливает нитраты в нитриты и далее до азота. Не образует индола и H₂S, дает отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра. Проба на оксидазу положительная. Утилизирует 2-кетоглюконат.

Применение на практике данного штамма обусловливается его физиолого-биохимическими особенностями. Штамм предназначен для ликвидации последствий загрязнения почвы нефтью и дизельным топливом.

Ниже приведены примеры биологического окисления нефти и дизельного топлива загрязненной почвы штаммом Pseudomonas aeruginosa 12-Р.

Подготовленная для опытов садово-огородная почва была расфасована по 1,5 кг в лабораторные батарейные стаканы емкостью 5 литров каждый. Загрязнение почвы нефтью и нефтепродуктами осуществлялось непосредственно в стаканах. В качестве нефтяного загрязнителя были выбраны дизельное топливо и два образца нефти, качественный состав которых приведен в Табл.1. Навеска нефтяного загрязнителя в почву вносилась весовым методом и составляла ~30 г, или ~2,0 вес.% на почву. Стаканы с нефтезагрязненной почвой выдерживались в условиях лаборатории с периодическим рыхлением. Это способствовало более равномерному распределению нефтяного загрязнителя в почве и, по возможности, испарению его легких фракций.

В Табл.1 представлены результаты химико-битуминологического анализа средней пробы почв, загрязненных нефтью и дизельным топливом, вес.%. Нефть 1 - нафтеново-ароматическая тяжелая нефть месторождения «Русское». Нефть 2 - метаново-нафтеновая легкая нефть месторождения «Западный Тэбук».

Экспериментальная оценка способности штамма микроорганизмов биодеградировать нефть и дизельное топливо проводилась в лабораторных условиях. В подготовленные почвенные образцы, предварительно расфасованные по 1,5 кг в лабораторные батарейные стаканы емкостью 5 литров каждый, и загрязненные нефтью и дизельным топливом вносили культуру микроорганизмов с титром 105-108 кл/мл. Маточную культуру бактерий Pseudomonas aeruginosa 12-Р выращивали на качалке (200 об/мин) при 28°С в течение 48-72 часов в колбах со 100 мл одной из сред следующего состава, вес.%:

1. Пептон - 1%

К₂НРО₄ - 0,15%

MgSO₄ - 0,15%

Глицерин - 1%

Вода водопроводная - остальное до 100%

рН до стерилизации 7,6

2. Мясопептонный бульон с глюкозой (0,5 вес.%) и сахарозой (0,5 вес %). рН до стерилизации 7,6.

Опыты проводились при комнатной температуре (в среднем 18-20°C) в течение 91 суток с периодическим перемешиванием и увлажнением по мере высыхания почвы. Увлажнение производилось стерильной водой; примерно раз в 3 недели увлажнение осуществлялось минеральной средой, содержащей K, Р, N и имеющей рН до стерилизации 7,1-7,2. Почва в контрольных опытах увлажнялась только стерильной водой.

Учет численности живых клеток микроорганизмов в эксперименте проводился общепринятым методом предельных разведений на элективных средах.

Мониторинг происходящих процессов очистки нефтезагрязненной почвы выполнялся по следующим параметрам:

- содержание нефтепродуктов, мг/кг;

- содержание и качественный состав хлороформенного экстракта.

Периодичность отбора почвы на эти виды анализов составляла, как правило, 2 недели; анализ проводился согласно ГОСТ 17.1.4.01-80 и РД 52.18.575-96.

В Табл.2 приведены результаты проведенного мониторинга - содержание нефтепродуктов (НП), вес.% от первоначального содержания в почве при очистке штаммом Pseudomonas aeruginosa 12-P загрязнений, состав которых приведен в Табл.1. Дано в вес.% относительно их исходного содержания в нефтезагрязненной почве.

Таблица 2 Содержание нефтепродуктов (НП) в загрязненной почве в процессе очистки штаммом Pseudomonas aeruginosa 12-P Загрязнитель Содержание НП, вес.% от первоначального содержания в почве Продолжительность очистки, недели 0 2 4 6 8 13   Нефтепродукты Дизельное топливо 0,0 +2,1 +2,4 -5,4 -41,5 -67,8 Нефть 1 0,0 -22,4 -36,6 -47,0 -57,4 -62,1 Нефть 2 0,0 -15,7 -26,6 -42,8 -59,0 -63,4

Согласно данным Табл.2. за 13 недель продолжительности опытов содержание нефтепродуктов в нефтезагрязненных образцах почвы снижается на 62,1-67,8% от первоначального их содержания. Снижение содержания нефтепродуктов в образцах, загрязненных дизельным топливом, наблюдается с 6 недели, а в образцах, загрязненных нефтью, со 2 недели от начала постановки опытов. Обращает на себя внимание, что окисление нефтепродуктов в дизельном топливе отмечено только после 6 недель продолжения опытов. Объяснением этому может послужить активное окисление дизельного топлива углеводородокисляющими микроорганизмами с новообразованием промежуточных продуктов. В пользу этого свидетельствует высокий титр углеводородокисляющих микроорганизмов в почве, загрязненной дизельным топливом.

В Табл.3 приведены содержание и качественный состав ХБА нефтезагрязненной почвы по образцам Табл.1 через 91 сутки от начала опытов очистки штаммом Pseudomonas aeruginosa 12-P.

Данные качественного состава ХБА - (хлороформенного битумоида α) образцов загрязненной почвы до очистки, представленные в Табл.1, в сравнении с данными по опытным образцам, представленными в Табл. 3, позволяют сделать анализ характера изменения группового и углеводородного состава хлороформенного битумоида α в процессе биологического окисления штаммом Pseudomonas aeruginosa 12-Р.

Согласно результатам анализа содержание ХБА в опытных образцах нефтезагрязненной почвы колеблется в пределах 1,38-1,84% при продолжительности опытов 91 сутки. Резко изменился и качественный состав ХБА опытных образцов почвы, по сравнению с доопытным составом ХБА. Через 91 сутки после начала опытов по утилизации нефтяного загрязнения почвы отмечается снижение наиболее доступных для микроорганизмов его фракций. Наиболее доступной для биоокисления в составе нефтяного загрязнения является фракция масел. Содержание масел снизилось до 40,43% отн. В составе этого загрязнения снизилось содержание асфальтенов, метаново-нафтеновых, моно- и биароматических углеводородов.

Исходя из представленных выше данных, следует, что штамм Pseudomonas aeruginosa 12-Р RCAM01139 характеризуется высокой эффективностью в процессах утилизации нефти и дизельного топлива, и, как следствие, может быть использован для биологической очистки почв от данных загрязнителей.

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Предложен штамм Pseudomonas aeruginosa RCAM01139 для разложения нефти и дизельного топлива. Штамм характеризуется высокой эффективностью в процессах утилизации нефти и дизельного топлива, которые являются единственными источниками углерода и энергии. 3 табл.

Штамм Pseudomonas aeruginosa RCAM01139 для разложения нефти и дизельного топлива.