РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pSN-ZsGreen, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ SOX2 И NANOG ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК ZsGreen, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2013 года по МПК C12N15/00 A61K48/00 

Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии и может быть использовано для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) - это тип стволовых клеток, которые могут быть получены из соматических клеток животных и человека в результате повышенной экспрессии набора определенных генов . Для получения ИПСК человека и животных успешно используется сверхэкспрессия таких генов, как OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC . Позже группой Томсона ИПСК человека были успешно получены с использованием генов OCT4, SOX2, NANOG и LIN28 .

Известно, что для получения большинства новых линий ИПСК в настоящий момент используют генетические конструкции, полученные на основе ретро- и лентивирусных векторов. Этот метод характеризуется тем, что происходит случайное встраивание ДНК-копий геномов ретро- или лентивирусов в геномы клеток, что в свою очередь, может приводить к нарушению функционирования генов .

Для полномасштабного применения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в фундаментальных и прикладных исследованиях, таких как скрининг новых лекарственных веществ, исследования в области токсикологии и регенеративной медицины, необходимо решение ряда проблем.

Во-первых, необходима разработка методов получения ИПСК без генетической модификации их геномов. Во-вторых, способ получения ИПСК должен быть достаточно эффективным.

Известно, что плазмидные векторы - плазмиды - могут временно существовать в ядрах клеток, обеспечивая стабильную транскрипцию нуклеотидных последовательностей, находящихся под контролем конститутивных промоторов.

Известен метод, основанный на использовании специфических последовательностей - 2А-пептидов, позволяющий получать генетические конструкции, обеспечивающие трансляцию нескольких полипептидов (белков) с одной молекулы матричной РНК .

Задачей данного изобретения является конструирование полицистронной неинтегрирующейся плазмидной конструкции, кодирующей белки SOX2 и Nanog человека и флуоресцентный белок ZsGreen, обеспечивающей одновременную трансляцию данных белков и являющейся вектором при получении индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Белки SOX2 и Nanog необходимы для запуска репрограммирования клеток, а флуоресцентный белок ZsGreen служит маркером трансфекции клеток и последующей элиминации плазмидной ДНК.

Реализация изобретения осуществляется следующим образом.

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК выполняется на основе плазмиды pIRES (Clontech) и включает следующие стадии:

1. выделяют РНК из клеток известной линии эмбриональных стволовых клеток человека HUES9 , и производят синтез кДНК с помощью олиго-(dT) праймеров. Полученную кДНК используют в качестве матрицы для синтеза фрагментов, кодирующих белки;

2. синтез фрагмента кДНК гена SOX2 -позиции в мРНК 428-1379- (Homo sapiens SRY (sex determining region Y)-box 2) человека, (регистрационный номер в GeneBank NM_003106.2), размером 1023 пар нуклеотидов, содержащего на 3'-конце последовательность P2A-пептида (SOX2-P2A). Синтез проводят с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами: hSOX2 5' XbaI 5'-TTTAGTGTCTAGAATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTG-3' (прямой праймер, содержит искусственно введенный сайт эндонуклеазы рестрикции XbaI) и hSOX2 P2A 3'5'-TTCTCTTCGACATCCCCTGCTTGTTTCAACAGGGAGAAGTTAGTGGCTCCGCTTCCGGACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATG-3' (обратный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность кодирующую пептид P2A);

3. синтез фрагмента кДНК гена NANOG -позиции в мРНК 217-1134- (Homo sapiens Nanog homeobox) (регистрационный номер в GeneBank NM_024865.2) размером 990 пар нуклеотидов, содержащего на 5'-конце последовательность P2A-пептида (P2A-NANOG). Синтез проводят с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами: hNANOG P2A5' 5'-GCCACTAACTTCTCCCTGTTGAAACAAGCAGGGGATGTCGAAGAGAATCCCGGGCCAATGAGTGTGGATCCAGCTTGTCCCCAAAGC-3' (прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность кодирующую пептид P2A) и hNANOG 3'SalI 5'-CACTCATCTGTCGACTCACACGTCTTCAGGTTGCATGTTCATGGAG-3' (прямой праймер, содержит искусственно введенный сайт эндонуклеазы рестрикции Sal I);

4. объединение фрагментов SOX2-P2A и P2A-NANOG осуществляют методом полимеразной цепной реакции с использованием в качестве матриц перекрывающихся фрагментов SOX2-P2A и P2A-NANOG, а также праймеров hSOX2 5'XbaI и hNANOG 3'SalI. В результате получают фрагмент SOX2-P2A-NANOG размером 1966 пар нуклеотидов;

5. фрагмент ДНК, кодирующий белок ZsGreen, вырезают из плазмиды pZsGreen (Clontech) эндонуклеазой рестрикции XbaI, клонирован в сайт Xba I, находящийся в полилинкере B плазмиды pIRES (Clontech). В результате получают плазмида pIRES-ZsGreen.

6. фрагмент ДНК SOX2-P2A-NANOG клонируют с помощью набора реагентов pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) и штамма E.coli XL-10 Gold;

7. клоны плазмиды pGEM-T Easy со встройками pGEM-SOX2-P2A-NANOG последовательности выделяют стандартным методом щелочного лизиса (Maniatis, Т., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Sping Harbor Laboratory Press);

8. фрагмент SOX2-P2A-NANOG вырезают из плазмиды pGEM-SOX2-P2A-NANOG с помощью эндонуклеазы рестрикции EcoR I и лигируют с плазмидой pIRES-ZsGreen, гидролизованной эндонуклеазой рестрикции EcoR I, сайты которой расположены в полилинкере А.

В результате получена плазмида pSN-ZsGreen размером 8808 п.н. (SN=SOX2, NANOG).

На Фиг.1 изображена карта плазмидной генетической конструкции pSN-ZsGreen. Фрагмент ДНК, кодирующий белки SOX2 и NANOG, встроен в сайт EcoR I в полилинкер А плазмиды pIRES, а ДНК, кодирующая ZsGreen, встроена в сайт Xba I полилинкера В плазмиды pIRES.

Описание и позиции в нуклеотидной последовательности (п.н., пара нуклеотидов) функциональных элементов генетической плазмидной конструкции pSN-ZsGreen представлены в таблице 1.

Таблица 1 Элемент плазмидной генетической конструкции Позиции в последовательности конструкции, п.н. p CMV IE - энхансер/промотор цитомегаловируса 1-750 IVS - интрон 890-1022 Промотор РНК-полимеразы T7 1067-1085 Фрагмент ДНК SOX2-P2A-NANOG 1096-3060 IRES - внутренний сайт посадки рибосом 3095-3676 ZsGreen - кДНК гена ZsGreen 3699-4443 Промотор РНК-полимеразы T3 4489-4511 SV40 poly A - фрагмент содержащий сигнал полиаденилирования мРНК вируса SV40 4543-4765 Ориджин репликации f1 4861-5317 p SV40 - энхансер/ранний промотор вируса SV40 5382-5800 SV40 ori - ориджин репликации вируса SV40 5698-5764 Neo-r - ген устойчивости к неомицину 5845-6640 Синтетический сигнал полиаденилирования 6705-6754 Amp-r - ген устойчивости к ампициллину 7166-8027

Полученная плазмидная генетическая конструкция pSN-ZsGreen построена на основе плазмидного вектора pIRES (Clontech), в который помещены фрагменты кДНК генов SOX2 и NANOG человека, соединенные нуклеотидной последовательностью, кодирующей P2A-пептид и кДНК гена, кодирующего флуоресцентный белок ZsGreen.

Транскрипция единой мРНК SOX2-P2A-NANOG-IRES-ZsGreen осуществляется с конститутивного промотора p CMV IE, обеспечивающего высокий уровень наработки мРНК. Наличие последовательностей P2A и IRES позволяет одновременно транслировать белки SOX2, NANOG и ZsGreen с одной молекулы мРНК.

Фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок ZsGreen, является маркером трансфекции клеток и последующей элиминации плазмидной ДНК.

Плазмидная генетическая конструкция pSN-ZsGreen предназначена для временной или постоянной экспрессии генов SOX2, NANOG и ZsGreen в культивируемых клетках человека, обеспечивает стабильную экспрессию введенного гена.

Рекомбинантная плазмида pSN-ZsGreen может использоваться в качестве вектора для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.

Список литературы

1. Takahashi K. and S. Yamanaka. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006. 126(4): p.663-76.

2. Takahashi K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 2007. 131(5): p.861-72.

3. Yu J. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007. 318(5858): p.1917-20.

4. Okita K. et al. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science, 2008. 322(5903): p.949-53.

5. Szymczak A.L. and Vignali D.A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther, 2005. 5(5): p.627-38.

6. Cowan C.A. et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med, 2004. 350(13): p.1353-6.

Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии. Плазмидная генетическая конструкция pSN-ZsGreen построена на основе плазмидного вектора pIRES (Clontech), в который помещены фрагменты кДНК генов SOX2 и NANOG человека, соединенные нуклеотидной последовательностью, кодирующей Р2А-пептид и к ДНК гена, кодирующего флуоресцентный белок ZsGreen. Транскрипция единой мРНК SOX2-P2A-NANOG-IRES-ZsGreen осуществляется с конститутивного промотора р CMV IE, обеспечивающего высокий уровень наработки мРНК. Наличие последовательностей Р2А и IRES позволяет одновременно транслировать белки SOX2, NANOG и ZsGreen с одной молекулы мРНК. Изобретение может быть использовано для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

1. Рекомбинантная плазмида pSN-ZsGreen, кодирующая белки SOX2 и NANOG человека и флуоресцентный белок ZsGreen, предназначенная для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, представляющая собой генетическую конструкцию на основе плазмиды pIRES, содержащая следующие конструктивные элементы: фрагмент ДНК, кодирующий белки SOX2 и NANOG человека, включающий последовательность, кодирующую Р2А, расположенную между последовательностями SOX2 и NANOG, встроен в сайт рестрикции EcoR I в полилинкер А плазмиды pIRES, размер встройки 1964 пар нуклеотидов, и фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок ZsGreen, встроенный в сайт Хbа I полилинкера В плазмиды pIRES; транскрипция полицистронной мРНК SOX2-P2A-NANOG-IRES-ZsGreen осуществляется с конститутивного промотора р CMV IE.

2. Рекомбинантная плазмида pSN-ZsGreen по п.1, где разделение последовательностей элементами Р2А и IRES позволяет экспрессировать три белка с одной плазмиды одновременно.

3. Рекомбинантная плазмида pSN-ZsGreen по п.1, где фрагмент ДНК, кодирующий белки SOX2 и NANOG человека, запускает репрограммирование клеток для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, а фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок ZsGreen, является маркером трансфекции клеток и последующей элиминации плазмидной ДНК.