РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pOK-DsRed2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ ОСТ4 И KLF4 ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК DsRed2, ПРЕДНАЗНАЧЕНАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2013 года по МПК C12N15/00 A61K48/00 

Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии и может быть использовано для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) - это тип стволовых клеток, которые могут быть получены из соматических клеток животных и человека в результате повышенной экспрессии набора определенных генов [1-3]. Для получения ИПСК человека и животных успешно используется сверхэкспрессия таких генов как OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC [2].

Известно, что для получения большинства новых линий ИПСК в настоящий момент используют генетические конструкции, полученные на основе ретро- и лентивирусных векторов. Этот метод характеризуется тем, что происходит случайное встраивание ДНК-копий геномов ретро- или лентивирусов в геномы клеток, что в свою очередь может приводить к нарушению функционирования генов [4].

Для полномасштабного применения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в фундаментальных и прикладных исследованиях, таких как скрининг новых лекарственных веществ, исследования в области токсикологии и регенеративной медицины необходимо решение ряда проблем. Во-первых, необходима разработка методов получения ИПСК без генетической модификации их геномов. Во-вторых, способ получения ИПСК должен быть достаточно эффективным.

Известно, что плазмидные векторы (плазмиды) могут временно существовать в ядрах клеток, обеспечивая стабильную транскрипцию нуклеотидных последовательностей, находящихся под контролем конститутивных промоторов. Кроме того, известен метод, основанный на использовании специфических последовательностей - 2А-пептидов, позволяющий получать генетические конструкции, обеспечивающие трансляцию нескольких полипептидов (белков) с одной молекулы матричной РНК [5].

Задачей данного изобретения является конструирование полицистронной неинтегрирующейся плазмидной конструкции, кодирующей белки OCT4 и KLF4 человека и флуоресцентный белок DsRed2, обеспечивающей одновременную трансляцию данных белков и являющейся вектором при получении индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Белки OCT4 и KLF4 необходимы для запуска репрограммирования клеток, а флуоресцентный белок DsRed2 служит маркером трансфекции клеток и последующей элиминации плазмидной ДНК.

Реализация изобретения осуществляется следующим образом.

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК выполняют на основе плазмиды pIRES (Clontech) и включает следующие стадии:

1. Выделяют РНК из клеток известной линии эмбриональных стволовых клеток человека HUES9 [6], и производят синтез кДНК с помощью олиго-(dT) праймеров. Полученную кДНК используют в качестве матрицы для синтеза фрагментов, кодирующих белки.

2. Синтез фрагмента кДНК гена OCT4 -позиции в мРНК 53-1135- (Homo sapiens POU domein, class 5, Transcription factor 1 (POU5F1)) человека (регистрационный номер в GeneBank NM_002701), размером 1152 пар нуклеотидов, содержащего на 3'-конце последовательность F2A-пептида (OCT4-F2A). Синтез проводят с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами: hOCT45'NheI 5'-TTTTGCGCTAGCCATGGCGGGACACCTGGCTTCGG-3' (прямой праймер, содержит искусственно введенный сайт эндонуклеазы рестрикции Nhe I) и hOCT4 F2A 3' 5'-CCTGCAAGTTTCAGCAAATCAAAGTTTAATGTCTGCTTTACTGGCGCACCCGAACCCGAGTTTGAATGCATGGGAGAGCCCAGAGTGGTG-3' (обратный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид F2A).

3. Синтез фрагмента кДНК гена KLF4 -позиции в мРНК 622-2035- (Homo sapiens Krueppel-like factor 4) (регистрационный номер в GeneBank NM_004235.4) размером 1484 пар нуклеотидов, содержащего на 5'-конце последовательность F2A-пептида (F2A-KLF4). Синтез проводят с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами: hKLF4 F2A 5' 5'-GCAGACATTAAACTTTGATTTGCTGAAACTTGCAGGTGATGTAGAGTCAAATCCAGGTCCAATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCTCCCATC-3' (прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность кодирующую пептид F2A) и hKLF4 3'MluI 5'-TGTTACGCGTTTAAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGCG-3' (прямой праймер, содержит искусственно введенный сайт эндонуклеазы рестрикции Mlu I).

4. Объединение фрагментов OCT4-F2A и F2A-KLF4 осуществляют методом полимеразной цепной реакции с использованием в качестве матриц перекрывающихся фрагментов OCT4-F2A и F2A-KLF4, а также праймеров hOCT45'NheI и hKLF4 3'MluI. В результате получают фрагмент OCT4-F2A-KLF4 размером 2600 пар нуклеотидов.

5. Фрагмент ДНК, кодирующий белок DsRed2, вырезают из плазмиды pDsRed2 (Clontech) эндонуклеазой рестрикции Xba I, клонирован в сайт Xba I, находящийся в полилинкере B плазмиды pIRES (Clontech). В результате получают плазмиду pIRES-DsRed2.

6. Фрагмент ДНК OCT4-F2A-KLF4 клонируют с помощью набора реагентов pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) и штамма E.coli XL-10 Gold.

7. Клоны плазмиды pGEM-T Easy со встройками pGEM-OCT4-F2A-KLF4 последовательности выделяют стандартным методом щелочного лизиса (Maniatis, Т., Fritsch, E.F. and Sambrook,, J. (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Sping Harbor Laboratory Press).

8. Фрагмент OCT4-F2A-KLF4 вырезают из плазмиды pGEM-OCT4-F2A-KLF4 с помощью эндонуклеаз рестрикции Spe I и EcoR I и лигируют с плазмидой pIRES-DsRed2, гидролизованной эндонуклеазами рестрикции Nhe I и EcoR I, сайты которых расположены в полилинкере А - эндонуклеазы рестрикции Spe I и Nhe I имеют совместимые липкие концы.

В результате получена плазмида pOK-DsRed2 размером 9425 (OK=OCT4, KLF4).

На Фиг.1 изображена карта плазмидной генетической конструкции pOK-DsRed2. Фрагмент ДНК, кодирующий белки OCT4 и KLF4, встроен между сайтами Nhe I и EcoR I в полилинкер А плазмиды pIRES, а ДНК, кодирующая DsRed2, встроена в сайт Xba I полилинкера В плазмиды pIRES.

Описание и позиции в нуклеотидной последовательности (п.н., пара нуклеотидов) функциональных элементов генетической плазмидной конструкции pOK-DsRed2 представлены в таблице 1.

Таблица 1 Элемент плазмидной генетической конструкции Позиции в последовательности конструкции, п.н. p CMV IE - энхансер/промотор цитомегаловируса 1-750 IVS - интрон 890-1022 Промотор РНК-полимеразы T7 1067-1085 Фрагмент ДНК OCT4-F2A-KLF4 1085-3683 IRES - внутренний сайт посадки рибосом 3712-4293 DsRed2- кДНК гена DsRed2 4316-5042 Промотор РНК-полимеразы T3 5091-5113 SV40 poly A - фрагмент, содержащий сигнал полиаденилирования мРНК вируса SV40 5124-5346 Ориджин репликации f1 5442-5898 p SV40 - энхансер/ранний промотор вируса SV40 5963-6381 SV40 ori - ориджин репликации вируса SV40 6279-6345 Neo-r - ген устойчивости к неомицину 6426-7221 Синтетический сигнал полиаденилирования 7286-7335 Amp-r - ген устойчивости к ампициллину 7747-8608

Полученная плазмидная генетическая конструкция pOK-DsRed2 построена на основе плазмидного вектора pIRES (Clontech), в который помещены фрагменты кДНК генов OCT4 и KLF4 человека, соединенные нуклеотидной последовательностью, кодирующей F2A-пептид и кДНК гена, кодирующего флуоресцентный белок DsRed2.

Транскрипция единой мРНК OCT4-F2A-KLF4-IRES-DsRed2 осуществляется с конститутивного промотора p CMV IE, обеспечивающего высокий уровень наработки мРНК.

Наличие последовательностей F2A и IRES позволяет одновременно транслировать белки OCT4, KLF4 и DsRed2 с одной молекулы мРНК.

Фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок DsRed2, является маркером трансфекции клеток и последующей элиминации плазмидной ДНК.

Плазмидная генетическая конструкция pOK-DsRed2 предназначена для временной или постоянной экспрессии генов OCT4, KLF4 и DsRed2 в культивируемых клетках человека, обеспечивает стабильную экспрессию введенного гена.

Рекомбинантная плазмида pOK-DsRed2 может использоваться в качестве вектора для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.

Список использованной литературы

1. Takahashi, K. and S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006. 126(4): p.663-76.

2. 2. Takahashi, K., et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 2007. 131(5): p.861-72.

3. Yu, J., et al., Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007. 318(5858): p.1917-20.

4. Okita, K., et al., Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science, 2008. 322(5903): p.949-53.

5. Szymczak, A.L. and Vignali, D.A., Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther, 2005. 5(5): p.627-38.

6. Cowan, C.A., et al., Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med, 2004. 350(13): p.1353-6.

Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии. Получена плазмидная генетическая конструкция pOK-DsRed2, построенная на основе плазмидного вектора pIRES (Clontech), в который помещены фрагменты кДНК генов ОСТ4 и KLF4 человека, соединенные нуклеотидной последовательностью, кодирующей F2А-пептид и кДНК гена, кодирующего флуоресцентный белок DsRed2. Транскрипция единой мРНК OCT4-F2A-KLF4-IRES-DsRed2 осуществляется с конститутивного промотора р CMV IE, обеспечивающего высокий уровень наработки мРНК. Наличие последовательностей F2A и IRES позволяет одновременно транслировать белки ОСТ4, KLF4 и DsRed2 с одной молекулы мРНК. Изобретение может быть использовано для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

1. Рекомбинантная плазмида pOK-DsRed2, кодирующая белки ОСТ4 и KLF4 человека и флуоресцентный белок DsRed2, предназначенная для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, представляющая собой генетическую конструкцию на основе плазмиды pIRES, содержащая следующие конструктивные элементы: фрагмент ДНК, кодирующий белки ОСТ4 и KLF4 человека, включающий последовательность, кодирующую F2A, расположенную между последовательностями ОСТ4 и KLF4, встроен между сайтами рестрикции Nhe I и EcoR I в полилинкер А плазмиды pIRES, размер встройки 2598 пар нуклеотидов, и фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок DsRed2, встроенный в сайт Xba I полилинкера В плазмиды pIRES; транскрипция полицистронной мРНК ОСТ4-F2A-KLF4-IRES-DsRed2 осуществляется с конститутивного промотора р CMV IE.

2. Рекомбинантная плазмида pOK-DsRed2 по п.1, где разделение нуклеотидных последовательностей элементами F2A и IRES позволяет экспрессировать три белка с одной плазмиды одновременно.

3. Рекомбинантная плазмида pOK-DsRed2 по п.1, где фрагмент ДНК, кодирующий белки ОСТ4 и KLF4 человека, запускает репрограммирование клеток для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок DsRed2, является маркером трансфекции клеток и последующей элиминации плазмидной ДНК.