ПРИМЕНЕНИЕ НОВЫХ ОЛИГОПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ БЕЛКА S100b В КАЧЕСТВЕ СТИМУЛЯТОРОВ И МОДУЛЯТОРОВ РЕГЕНЕРАТОРНЫХ ПРОЦЕССОВ В РОГОВИЦЕ ГЛАЗА Российский патент 2013 года по МПК A61F9/00 A61K38/01 A61P27/02 

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им.П.К.Анохина РАМН

Изобретение относится к медицине, в частности, к офтальмологии, и может быть использовано для лечения различных травматических и дистрофических повреждений роговицы глаза.

Требования к качественной и быстрой реабилитации больных после различных травматических повреждений и дистрофических заболеваний роговицы стимулировали развитие как современной микрохирургии глаза (см., в частности, Беляев B.C., «Операции на роговой оболочке и склере» (М., Медицина. 1984), «Операции на роговой оболочке и склере» (в кн.:

Руководство по глазной хирургии, М., 1988); Каспаров А.А. и др. «Новый способ хирургического лечения буллезной кератопатии»), так и патогенетически обоснованной фармакотерапии репаративных процессов роговицы глаза (Исаева Р.Т. и др. «Новые возможности воздействия на репаративные процессы при проникающих ранах роговой оболочки» Офтальмологический журнал., 1981, №4, стр.75-81); Майчук Ю.Ф. и др. «Новые подходы к терапии первичной дистрофии роговицы», Тези доповiдей дев'ятого з'зду отальмологiв Украiни, 1996).

В структуре глазного травматизма ранения роговицы и их последствия составляют 31-34%, из них самую тяжелую группу патологии, ведущую к значительному снижению зрения, представляют поражения роговицы химическими, термическими и термохимическими агентами, которые составляют от 30 до 62,8% от общего числа глазного травматизма. Согласно различным данным, процент инвалидности вследствие травмы роговицы в Российской Федерации колеблется от 22,8 до 26%.

Несмотря на постоянно расширяющийся арсенал лекарственных веществ и внедрение микрохирургической техники, частота роговичных осложнений остается достаточно высокой. В связи с этим, наряду с совершенствованием методов хирургического лечения, актуальным остается поиск новых, более эффективных лекарственных веществ.

Разработке и внедрению лекарственных средств, способных оказывать положительное влияние на репаративные процессы роговицы, посвящено большое количество работ. Проводились исследования по изучению влияния на регенераторные процессы различных лекарственных средств - см. Азнабаев М.Т. и др., «Эффективность керакола в лечении ожогов глаз и кожи». Поражение глаз при экспериментальных ситуациях. М. 1995; Безуглый Б.С.и др., «Эффективность применения тиотриазолона в комплексном лечении травматических кератитов», Тези доповiдей дев'ятого з'зду отальмологiв Украiни, 1996; Зубарев С.Ф. и др., «Влияние глазных капель арониол на процессы регенерации поврежденной роговицы» (там же); Козлова Т.В. и др., «Влияние агрегатов протеогликанов на послеоперационную регенерацию роговицы», VI съезд офтальмологов, М., 1994 и некоторые другие. На основании комплексных морфологических исследований было установлено стимулирующее влияние на регенеративные процессы фибронектина и коллагена (см., в частности, Полунин Г.С.и др. «Ингибиторы плазминоподобных ферментов и аутофибринонектина в лечении эпителиальных дефектов роговицы», Вестник офтальмол. 1993., №4, стр.14-16). Особый интерес представляют биологически активные препараты, полученные из природного сырья, к которым, в частности, относятся обладающий иммуностимулирующим действием апилак, раствор хлорфиллипта, а также мази, содержащие вытяжки из цветов календулы и шиповника. (Можеренков В.П. и др., «Фитотерапия в офтальмологии». Мед. помощь, 1998, №2, стр.27-29; Неделька А.Ф. и др., «Экспериментальное изучение глазных мазей на основе фитопрепаратов при проникающих травмах роговицы». Новое в лечении ожогов глаз, Тезисы докладов, М., 1989, стр.48-49). Однако, несмотря на широкий арсенал лекарственных средств, используемых для лечения травматических и дистрофических повреждений роговицы, эффективность таких средств, в большинстве случаев, не соответствует современным требованиям.

В связи с этим, особый интерес для лечения различных травматических и дистрофических повреждений роговицы вызывают так называемые регуляторные пептиды, которым принадлежат пусковая, регуляторная и модуляторная функции в обменных процессах, а также участие в воспалительных процессах (см, например, Ашмарин И.П. и др., «Каскадные однонаправленные регуляторные процессы, осуществляемые короткоживущими пептидами (тиролиберин)». Физиолог, журнал СССР им. И.М.Сеченова, 1989, Т.75, №5, с.627-632). Так, в литературе имеются сообщения о влиянии регуляторных пептидов на регенераторные процессы в различных органах и тканях. В патологически измененных тканях такие пептиды проявляют свойства эндогенных протекторов, способствуя сохранению межклеточных кооперативных взаимодействий, увеличивая жизнеспособность клеток и стимулируя восстановительные и репаративные процессы (Борисенко А.В., Биология стволовых клеток, фундаментальные аспекты. Тезисы докладов, 2005, с.17-18). Вместе с тем, в связи с полифункциональным действием биологически активных олигопептидных соединений, которое реализуется по каскадному принципу, в настоящее время активно развивается направление получения синтетических аналогов коротких пептидов, сохраняющих биологическую активность и избирательность действия их белковых предшественников.

В ходе ранее проведенных исследований авторами были полученны новые данные, свидетельствующие о положительном стимулирующем влиянии Са²⁺ - связывающего белка SlOOb, с выраженной нейротрофичекой активностью на заживление роговичной раны у кролика, что выражалось в восстановлении базальной мембраны, слоя эпителиальных клеток, роговичных пластин и поврежденных нервных окончаний. [Краснов М.М, Шерстнев В.В., Зиангирова Г.Г., Бочаров В.Е., Малаева Л.В., Олиневич В.Б. // Вестник офтальмологии. 1994. - Т.110. - N4. - С.29-32; Sherstnev VV, Krasnov MM, Ziangirova GG, Malaeva LV, Bocharov VE, Olinevich VB, Gruden' MA. The stimulating effect of S100beta protein on regeneration of the rabbit cornea]. Biull Eksp Biol Med. 1994 Jul; 118 (7): 98-101. Зиангирова Г.Г., Олиневич В.Б. // Известия АН. СССР Серия Биологическая. 2000. - №1. - С.27-32).

Задачей, положенной в основу создания заявленного решения, является возможность применения в офтальмологии новых синтетических аналогов эндогенных фрагментов белка Sl00b в качестве стимуляторов регенераторно-репаративных процессов в роговице глаза, в частности, после частичной кератэктомии. Техническим результатом, достигаемым при решении поставленной задачи, является быстрое и качественное восстановление поврежденной зоны роговицы после лечения острой и/или хронической травмы роговицы, в частности, после частичной кератэктомии при одновременном сохранении простоты и удобства введения лекарственного средства.

Поставленный результат в заявленном способе лечения острой и/или хронической травмы роговицы, включающем стимуляцию регенераторно-репараторных процессов в роговице глаза, достигается тем, что стимуляцию ведут путем введения синтезированных пептидных фрагментов белка S100b наименованных - SP2 и SP3 в концентрации 10^-6 М два раза в сутки в течение 10 дней конъюнктивальную полость или эндонозально.

Предпочтительный, но не обязательный вариант реализации заявленного способа предусматривает его применение после частичной кератэктомии.

Возможность достижения поставленного результата в заявленном способе лечения острой и/или хронической травмы роговицы и сетчатки обусловлена тем, что упомянутые синтезированные пептидные фрагменты обладают выраженными селективными свойствами в сравнении с матричной молекулой белка S100b, которая участвует в широком спектре биологической активности, таких, как рост, развитие и дифференцировка клеточных элементов, обмен ионов Са,2+, Zn2+, обладает выраженной нейротрофической и ростовой активностью, принимает активное участие в различных патологических процессах в нервной системе. Введение в носовую полость или в конъюнктивальную полость обеспечивает простоту применения при сохранении биологической активности синтезированных пептидных фрагментов белка S100b.

Для подтверждения достижения поставленного результата при использовании заявленного способа были проведены исследования, объектом которых являлись роговицы глаз, полученные от половозрелых самцов крыс линии «Wistar» (n=90), весом 180-200 грамм. В работе использовали экспериментальную модель частичной кератэктомии, которой были подвергнуты все животные после чего крысы были разделены на 6 групп, две группы крыс были контрольными, четыре группы животных использовались для исследования эффектов при двух способах введения препаратов пептидных фрагментов белка S100b -SP2 и SP3 полученных путем пептидного синтеза. Группу №1 (n=15) составили крысы контрольной группы, которым вводили по 25 мкл 0,9% водного раствора хлорида натрия (физиологический раствор) два раза в день в конъюнктивальный мешок поврежденного правого глаза в течение 10 дней; Группу №2 составили крысы, которым вводили физиологический раствор в носовую полость два раза в день по 25 мкл в течение 10 дней. В группу №3 вошли крысы, которым вводили два раза в день по 25 мкл пептида SP2, растворенного в физиологическом растворе в концентрации 10^-6 М в конъюнктивальный мешок поврежденного правого глаза в течение 10 дней. В группу №4 вошли крысы, которым вводили два раза в день по 25 мкл пептида SP2, растворенного в физиологическом растворе в концентрации 10^-6 М в носовую полость два раза в день по 25 мкл в течение 10 дней.. В группу №5 вошли крысы, которым вводили два раза в день по 25 мкл пептида SP3, растворенного в физиологическом растворе в концентрации 10^-6 М в конъюнктивальный мешок поврежденного правого глаза в течение 10 дней. В группу №6 вошли крысы, которым вводили два раза в день по 25 мкл пептида SP3, растворенного в физиологическом растворе в концентрации 10^-6 M в носовую полость два раза в день по 25 мкл в течение 10 дней.

Синтез фрагментов белка S100b осуществлялся твердофазным методом с использованием Boc/Bzl - стратегии в проточном реакторе с непрерывной регистрацией изменения объема пептидилполимера (свеллографический мониторинг). Были получены пептидные препараты адекватной величиной молекулярных масс и степенью чистоты очистки 92%.

В работе использовали экспериментальную модель частичной кератэктомии глаза крыс. Влияние исследуемых веществ на регенераторно-репаративные процессы в роговице глаза оценивали по характеру эпителизации, восстановлению базальной мембраны и роговичных пластин, пролиферативной активности фибробластов и эпителиальных клеток. С помощью сетки окулярмикрометра при увеличении 125 и 1250 осуществляли подсчет плотности и рядности клеток эпителиального пласта по всей раневой поверхности. Оценивали состав и активность клеток воспаления по периферии, в средней и центральной зоне эктомии. Морфологические признаки апоптоза включали в себя: ослабление межклеточных контактов с потерей десмосом и отделение от соседних клеток; фрагментацию и конденсацию ядерного хроматина по периферии клетки; формирование крупных и мелких, сферических и овальных по формы структур содержащих эозинофильные цитоплазматические фрагменты с пикнотическими, базофильными фрагментами ядер. Клиническое течение воспалительного процесса оценивалось биомикроскопически..

Пример 1. У крыс в контрольной группе после проведения частичной кератэктомии правого глаза независимо от способа введения физиологического раствора на 10 сутки наблюдалось, формирование эпителиальной пробки неравномерной толщины, покрывающей всю раневую поверхность и насчитывающей 5-8 рядов, что можно объяснить выраженным полиморфизмом эпителиальных клеток. Ближе к центру толщина эпителиального пласта уменьшалась. Клетки приобретали вытянутую форму в горизонтальной плоскости. Ядра клеток дифференцировались только в базальном слое эпителия. Выявлялось ослабление эпителиально-стромальных и межклеточных контактов на всем протяжении. Плотность эпителиальных клеток в среднем составляла 10±2 в поле зрения (п/з). На отдельных участках она была выше и насчитывала 12-14 клеток в п/з. Клетки в этих зонах отличались разнообразием по форме и размеру. В базальном эпителии встречались вакуолизированные с разреженной цитоплазмой и фрагментированными ядрами клетки. Во многих клетках было отмечено отсутствие ядер, при сохранении цитоскелета. В эпителиальном пласте митотическая и апоптотическая активность проявлялась неравномерно. Митоз встречался в среднем от 2-6 на периферии и 1-2 в центре. Клетки с признаками апоптоза выявлялись на периферии раневой поверхности 1-4 клетки, в центральной зоне 0-2 в п/з.

Базальная мембрана на большем протяжении дифференцировалась слабо и имела неравномерную толщину с участками порозного строения.

Пролиферация фибробластов отмечалась на периферии раневой поверхности в средних слоях. По всей площади кератэктомии лизис роговичных пластин сопровождался хаотичным расположением коллагеновых волокон.

Новообразованные сосуды выявлялись преимущественно на периферии раневой поверхности. Инфильтрат в средних и глубоких слоях стромы состоял из полиморфно-ядерных лейкоцитов, моноцитов и макрофагов и насчитывал от 8 до 10 клеток в поле зрения.

При биоофтальмоскопии пик неоваску ляризация приходился на 3-5 сутки и захватывал периферию и среднюю часть раневой поверхности. В центральной зоне на фоне выраженного отека стромы сосуды не выявлялись.

В 30% случаях отмечалось изъязвления стромы с формированием десцеметоцеле и перфорацией роговицы.

Пример 2. У крыс в экспериментальной группе после проведения частичной кератэктомии правого глаза при последуюшим эндоназальном введении (введение в носовую полость) пептида SP2 в концентрации 10^-6 М на 10 сутки эпителий покрывает всю раневую поверхность. На отдельных участках отмечалось ослабление межклеточных контактов. Клетки имели различную форму и шиповатый вид. Подобные изменения отмечались на участках, где выявлялись участи порозного строения базальной мембраны. Рядность эпителиального пласта на периферии раневой поверхности составляла 8-9, ближе к центру 5-7 рядов клеток. Ослабления межклеточных контактов в базальном эпителии в отдельных клетках сопровождалось фрагментацией ядер, вакуолизация цитоплазмы с сохранением контуров цитоскелета. Большинство фибробластов в субэпителиальном слое находилось в апоптотическом лизисе. В глубоких слоях восстановление поврежденной зоны роговицы происходило за счет формирования ориентированных роговичных пластин. В поверхностных слоях роговичные пластины были дезориентированы в следствии очагами лизиса. Процесс восстановления зоны эктомии сопровождался запустением и тромбозом новообразованных сосудов на всем протяжении зоны эктомии. Полиморфно-ядерные клетки выявлялись в поверхностных и средних слоях 4-8 клеток в поле зрения. Клинически, при введении пептида SP2 в концентрации 10^-6 М отмечалось формирование в поверхностных слоях помутнения средней интенсивности. При сравнении с действием пептида SP3 в той же концентрации и способах введения препарата пептида плотность эпителия роговицы поврежденного глаза была ниже (8±1 рядов клеток).

Пример 3. У крыс в экспериментальной группе после проведения частичной кератэктомии правого глаза м последующем закапывании в нос раствора пептида SP3 в концентрации 10^-6 М эпителиальный пласт покрывал всю раневую поверхность клетками преимущественно овальной формы. Отмечалось восстановление межклеточных связей, базальной мембраны на всем протяжении. На периферии раневой поверхности эпителиальный пласт насчитывал 8-10 рядов. Ближе к центру рядность уменьшалась и достигала 6-8 рядов. Потеря верхнего слоя эпителия происходила путем обычного слущивания клеток. Плотность клеток была, приблизительно одинаковая на всем протяжении эпителиального пласта и насчитывала 12±1. Из них апоптотических клеток в среднем насчитывалось 1-3 в поле зрения, в состоянии митоза 2-5. На фоне восстановления межклеточных контактов, в центральной зоне отмечался полиморфизм базального эпителия, изменение ядерно-цитоплазматического соотношения в сторону увеличения доли цитоплазмы, уменьшение цитохромозии клеток. Ядерный аппарат клеток прокрашивался неравномерно, менее интенсивно в центре, чем на периферии и в парацентральной зоне. В цитоплазме эпителиальных клеток, расположенных ближе к центральной зоне, отмечалась фрагментация ядер на разнообразные по форме и размеру глыбки.

Восстановление рядности и ориентации роговичных пластин в зоны кератэктомии в глубоких и средних слоях сопровождалось облитерацией новообразованных сосудов. В поверхностных слоях выявлялись очаги лизиса и дезориентации роговичных пластин. Отмечено формирование фибробластической мембраны состоящей из ориентированных веретенообразных по форме кератоцитов, расположенной преимущественно в средних слоях. Субэпителиально в клоне фибробластов отмечалось преобладание пролиферативных процессов над апоптотическими 3 к 1. Формированные роговичных пластин отмечалось на всем протяжении эктомированной зоны. Структура роговичных пластин в глубоких и частично поверхностных слоях в зоне эктомии была близка к норме. В поверхностных слоях на отдельных участках выявлялись очаги дезориентированных коллагеновых волокон.

В инфильтрате преобладали полиморфно-ядерные лейкоциты расположенные неравномерно преимущественно в поверхностных слоях от 2 до 4 в п/з.

Фибробластическая мембрана при введении SP3 в концентрации 10^-6 М выявлялась практически по всей поверхности зоны эктомии и состояла из веретенообразных кератоцитов. Межклеточное пространство было заполнено тонкими, интенсивно прокрашенными роговичными пластинами. Полиморфно-ядерные лейкоциты выявлялись в субэпителии от 2 до 4 в п/з.

Биоофтальмоскопии при введении SP3 в концентрации 10^-6 М в роговице отмечалось формирование выраженного помутнения. Активность формирования новообразованных сосуды пришлось на 3-4 сутки и оставалось стабильным в течение 2 дней. К 10 суткам сосуды выявлялись на отдельных участках по периферии зоны эктомии и находились в состоянии запустения.

Отличительной особенностью SP3 являлось его выраженное влияние на пролиферативную активность фибробластов.

Необходимо подчеркнуть, что существенных различий влияния SP2 и SP3 на течение регенераторно-репаративного процесса от способа введения отмечено не было.

Таким образом, на экспериментальных моделях частичной кератэктомии показано выраженное стимулирующее влияние на протекающие регенераторно-репаративные процессы в частично поврежденной роговице глаза взрослых крыс синтезированных новых олигопептидных фрагментов белка S100b SP2 и SP3. Доказана выраженная пролиферативная активность фибробластов при применении SP3, что обеспечивало восстановление объема стромы роговицы в зоне эктомии. Эффекты SP2 характеризовались стабилизирующим действием на клеточный состав и частичное восстановление стромы роговицы. Внедрение олигопептидных фрагментов в офтальмологическую практику позволит существенное снизить эффект повреждающего агента и обеспечить повышение качества реабилитации пациентов при повреждении роговицы.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для лечения травматических и дистрофических повреждений роговицы глаза. Для этого в конъюнктивальную полость или эндоназальным путем вводят пептидные фрагменты белка S100b - SP2 и/или SP3 в концентрациях 10^-6 М. Введение осуществляют ежедневно два раза в сутки в течение 10 дней. Способ обеспечивает быстрое и качественное восстановление поврежденной зоны роговицы за счет стимуляции регенераторно-репараторных процессов в роговице. 3 пр., 1 з.п., ф-лы.

1. Способ лечения острой и/или хронической травмы роговицы, включающий стимуляцию регенераторно-репараторных процессов в роговице глаза, при этом стимуляцию ведут путем введения синтезированных пептидных фрагментов белка S100b SP2 и/или SP3 в концентрации 10^-6 М два раза в сутки в течение 10 дней в конъюнктивальную полость или эндоназально.

2. Способ по п.1 применяемый после частичной кератэктомии.