МЕТОД МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПЕПТИДОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Российский патент 2013 года по МПК H01J49/00 G01N33/68 

Настоящее предлагаемое изобретение относится к области масс-спектрометрии и найдет широкое применение при решении задач органической и биоорганической химии, иммунологии и медицины, диагностики заболеваний, любого биохимического исследования, основанного на определении аминокислотной последовательности белков и их фрагментов.

Собственно процесс определения последовательности (секвенирование) может быть основан на химических, биохимических реакциях, или на физико-химических принципах (фрагментация молекулы).

Известно и наиболее часто используется химическое последовательно повторяющееся отщепление N-концевой аминокислоты от молекулы исходного пептида с последующей идентификацией каждого очередного отщепленного аминокислотного остатка. Определение последовательности проводят в три стадии: 1. присоединение реагента к N-концевой аминокислоте; 2. отщепление ее в виде производного этой аминокислоты; 3. перевод отщепленной в неустойчивой форме производной аминокислоты в устойчивое производное, которое идентифицируется одним из многих существующих микрометодов хроматографии, электрофореза, масс-спектрометрии.

Совокупность действий: присоединение реагента, отщепление неустойчивого производного аминокислоты, превращение его в устойчивое производное аминокислоты в зависимости от инструментального оформления процесса определения аминокислотной последовательности называется жидкофазным [1], твердофазным [2], газофазным [3] методом Эдмана. Метод Эдмана выбран в качестве аналога в настоящем изобретении.

Недостатками метода Эдмана являются: высокая стоимость определения аминокислотной последовательности (за счет высокой стоимости специально очищенных реактивов и эксплуатационных расходов), невысокая производительность (15-20 аминокислот в сутки), невозможность определения последовательности аминокислот при наличие блокированного N-концевого аминокислотного остатка, потери пептида за счет вымывания его из реактора при проведении анализа; а в твердофазном варианте (исключающем вымывание за счет химического присоединения пептида к твердому полимеру), присутствует непредсказуемость полноты присоединения пептида к полимеру, что значительно уменьшает шансы на определение аминокислотной последовательности пептида.

Технические и методологические усовершенствования последних лет позволили повысить чувствительность и скорость определения аминокислотной последовательности по методу Эдмана, но они не смогли преодолеть принципиальные ограничения метода, связанные с химической природой процесса определения, а именно: низкая производительность, зависящая от невысокой скорости химических реакций, дороговизна реагентов, необходимых для проведения анализа, принципиальная невозможность определения последовательности при наличие химических блокирующих групп на N-концевой аминокислоте.

Кроме метода Эдмана, известен масс-спектрометрический метод [4] определения аминокислотной последовательности пептида, который выбран в качестве прототипа в настоящем изобретении.

Известный метод масс-спектрометрического секвенирования пептидов заключается в том, что раствор исследуемого пептида поступает в источник ионов, из которого заряженные частицы, в том числе молекулярный ион пептида поступают в масс-фильтр, в котором молекулярный ион пептида выделяется и попадает в столкновительную ячейку; образовавшиеся фрагменты молекулярного иона пептида поступают либо в масс-спектрометрический детектор для регистрации масс-спектра, либо выделяется ближайший к молекулярному иону ион-фрагмент, который вновь направляется в столкновительную ячейку и весь процесс повторяется.

Недостатком известного масс-спектрометрического метода является то, что при его применении требуется неоднократный выбор иона-фрагмента для последующей его фрагментации, что делает процесс многостадийным и длительным, а сам метод требует сложного и, следовательно, дорогостоящего оборудования.

Целью предлагаемого в настоящем изобретении метода является определение аминокислотной последовательности пептида, основанное на масс-спектрометрическом фрагментировании в ионном источнике между соплом и скиммером молекулярного иона пептида под воздействием электрического поля управляемой величины и на последующем анализе масс-спектров фрагментов.

Реализация предлагаемого метода происходит следующим образом. Пептид подают в источник ионов, электрогазодинамическая система транспортировки которого позволяет управлять степенью фрагментации молекулярного иона при помощи изменения электрического поля. Далее ионы разделяют в масс-анализаторе и направляют в детектор, где осуществляют регистрацию масс-спектра пептида и его фрагментов с различной глубиной фрагментации одновременно в одном спектре. Фрагментные масс-спектры пептидов, полученные при разных значениях напряженности электрического поля, обрабатывают системой регистрации, анализируют, в результате чего определяют аминокислотную последовательность исходного пептида. Принципиальное отличие данного метода заключается в том, что управляемая степень фрагментации в источнике ионов под воздействием варьируемого электрического поля в диапазоне 10-10⁴ В/м и давлениях остаточного газа в диапазоне 100-2000 Па позволяет определять аминокислотную последовательность пептидов, содержащих до 10-15 аминокислотных остатков, что соответствует средней длине пептидов - продуктов ферментативного гидролиза белков.

Литературные источники

1. Edman, P., Begg G. // Europ. J. Biochem., 1967, v.1, p.80-91.

2. Laursen R.A. // Europ. J. Biochemistry, 1971, v.20, p.89-102.

3. Hewick R.M., Hunkapiller M.W., Hood Leroy E., Dreyer W.J. // J. Biol. Chem., 1981, v.15, p.7990-8005.

4. Wells J.M., McLuckey S.A. // Biol. Mass Spectrom., 2005, v.402, p.148-185.

Метод масс-спектрометрического секвенирования пептидов и определения их аминокислотных последовательностей основан на фрагментировании в ионном источнике масс-спектрометра между соплом и скиммером молекулярных ионов пептидов под воздействием электрического поля управляемой величины и на последующем анализе масс-спектров фрагментов. Пептид поступает в источник ионов, электрогазодинамическая система транспортировки которого позволяет управлять степенью фрагментации молекулярного иона при помощи изменения электрического поля. Далее ионы разделяют в масс-анализаторе и направляют в детектор, где осуществляют регистрацию масс-спектра пептида и его фрагментов с различной глубиной фрагментации одновременно в одном спектре. Масс-спектры фрагментов пептида, полученные при разных значениях напряженности электрического поля, обрабатывают системой регистрации, анализируют, в результате чего определяют аминокислотную последовательность исходного пептида. Управляемая степень фрагментации в источнике ионов под воздействием варьируемого электрического поля в диапазоне 12²-10⁴ В/м и давлениях остаточного газа в диапазоне 100-2000 Па позволяет определять аминокислотную последовательность пептидов, содержащих до 10-15 аминокислотных остатков, что соответствует средней длине пептидов - продуктов ферментативного гидролиза белков. Технический результат - упрощение и ускорение способа.

Метод масс-спектрометрического секвенирования пептида и определение его аминокислотной последовательности, основанный на прямом вводе раствора, содержащего пептид, в источник ионов с последующим фрагментированием (дроблением) молекулярного иона пептида, регистрации полученных фрагментов в масс-спектрометрическом детекторе, анализе системой регистрации полученных масс-спектров и определении аминокислотной последовательности пептида, отличающийся тем, что фрагментирование молекулярного иона пептида производят в области между соплом и скиммером источника ионов воздействием электрического поля при нескольких значениях поля в диапазоне 10²÷10⁴ В/м и давлениях остаточного газа в диапазоне 100÷2000 Па, зарегистрированные масс-спектры фрагментов молекулярного иона пептида для нескольких фиксированных значений напряженности электрического поля анализируют, определяют аминокислотную последовательность пептида.