ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ Российский патент 2013 года по МПК A61K39/295 A61P9/14 

Изобретение относится к области медицины, в частности кардиофармакологии, и может быть использовано для коррекции эндотелиальной дисфункции.

Из уровня техники известен способ коррекции эндотелиальной дисфункции смесью растворов гомеопатических разведении поликлональных антител к эндотелиальной синтазе оксида азота человека (RU 2306953 C1, A61K 39/395, 2007). Однако недостатком данного изобретения является то, что использование смеси растворов гомеопатических разведении поликлональных антител к NO-синтазе эффективно при эндотелиальной дисфункции, связанной с низким уровнем эндотелиальной NO-синтазы, и может не обеспечивать терапевтическую эффективность при эндотелиальной дисфункции с нормальной продукцией NO-синтазы.

Изобретение направлено на создание эффективного и безопасного лекарственного средства для коррекции эндотелиальной дисфункции, препятствующего возникновению воспаления стенки сосуда и развития эндотелиальной дисфункции.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что лекарственное средство для коррекции эндотелиальной дисфункции содержит активированную - потенцированную форму антител к фактору роста сосудистого эндотелия (VEGF).

Заявленное лекарственное средство может быть использовано для коррекции L-Name-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс самцов линии Wistar, вызванной внутрибрюшинным ежедневным введением 2 раза в сутки L-Name в дозе 12,5 мг/кг по 4,5 мл/кг (9 мл/кг/сут.), путем введения внутрижелудочно активированной - потенцированной формы антител к фактору роста сосудистого эндотелия в виде смеси растворов гомеопатических разведении С12, С30, С200.

Активированная - потенцированная форма антител к фактору роста сосудистого эндотелия может быть использована в виде активированного - потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом многократного последовательного разведения в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения.

Кроме того, лекарственное средство может быть выполнено в твердой лекарственной форме, которая содержит эффективное количество гранул нейтрального носителя, насыщенного смесью активированной - потенцированной формы антител к фактору роста сосудистого эндотелия, и фармацевтически приемлемые добавки, которые включают лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

При этом водный или водно-спиртовой раствор активированной - потенцированной формы антител к фактору роста сосудистого эндотелия может быть получен путем многократного последовательного разведения в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения из матричного раствора антител к фактору роста сосудистого эндотелия с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.

Кроме того, активированная - потенцированная форма антител к фактору роста сосудистого эндотелия может быть использована в виде смеси различных разведении, приготовленных по гомеопатической технологии, преимущественно, в виде смеси трех растворов, приготовленных из матричного раствора, разведенного, соответственно, в 100¹², 100³⁰, и 100²⁰⁰ раз, что эквивалентно сотенным разведениям С12, С30, С200, приготовленным по гомеопатической технологии.

Предложенная активированная - потенцированная форма антител к фактору роста сосудистого эндотелия в лекарственном средстве (т.е. форма антител, приготовленная по гомеопатической технологии потенцирования путем многократного последовательного разведения в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения (см., например, В. Швабе "Гомеопатические лекарственные средства", М., 1967 г., с.14-29), которая обладает активностью в фармакологических моделях и/или клинических методах коррекции эндотелиальной дисфункции), обеспечивает активацию eNOS, усиливает неоваскуляризацию ишемизированных тканей, в результате чего нормализуются сосудистый тонус и кровообращение, повышается толерантность к физической нагрузке, улучшается общее самочувствие.

Полученное в соответствии с изобретением лекарственное средство представляет собой новый фармакологический препарат, который характеризуется наличием специфической фармакологической активности, отсутствием побочных эффектов, привыкания и пристрастия, экологической чистотой и низкой себестоимостью.

Кроме того, заявленное лекарственное средство расширяет арсенал препаратов, предназначенных для коррекции эндотелиальной дисфункции.

Лекарственное средство приготовляют следующим образом. Для приготовления активированной - потенцированной формы антител используют моноклональные или поликлональные антитела, которые могут быть получены по известным технологиям - методикам, описанным, например, в книге: Иммунологические методы, под ред. Г. Фримеля, М., «Медицина», 1987, с.9-33; или, например, в статье Laffly Е., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.

Для получения антител к фактору роста сосудистого эндотелия в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов может быть использован адъювант и цельная молекула фактора роста сосудистого эндотелия следующей последовательности:

Возможно для получения антител к фактору роста сосудистого эндотелия использование в качестве иммуногена (антигена) полипептидного фрагмента фактора роста сосудистого эндотелия, выбранного, например, из следующих последовательностей:

Предпочтительным для приготовления заявленного лекарственного средства является использование антител к фактору роста сосудистого эндотелия, которые в качестве матричного (первичного) раствора с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, используют для последующего приготовления активированной - потенцированной формы.

Поликлональные антитела могут быть получены активной иммунизацией животных. Для этого по специально разработанной схеме животным делают серию инъекций требуемыми в соответствии с изобретением веществами - антигенами: фактором роста сосудистого эндотелия. В результате проведения такой процедуры получают моноспецифические антисыворотки с высоким содержанием антител, которые используют для получения активированных - потенцированных форм. При необходимости проводят очистку антител, присутствующих в антисыворотке, например, методом аффинной хроматографии, путем применения фракционирования солевым осаждением или ионообменной хроматографии.

Перед отбором крови за 7-9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. В процессе иммунизации у кроликов отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства растворимых антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. После окончания первого цикла иммунизации кроликов в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Для получения антисыворотки из иммунизированных кроликов собирают кровь в центрифужную пробирку объемом 50 мл. С помощью деревянного шпателя удаляют со стенок пробирки образовавшиеся сгустки и помещают палочку в сгусток, образовавшийся в центре пробирки. Кровь помещают в холодильник (температура 4°С) на ночь. На следующий день удаляют сгусток, прикрепившийся к шпателю, и центрифугируют оставшуюся жидкость при 13000g в течение 10 мин. Супернатант (надосадочная жидкость) является антисывороткой. Полученная антисыворотка должна быть желтого цвета. Добавляют к антисыворотке 20%, (весовая концентрация) NaN₃ до конечной концентрации 0,02% и хранят до использования в замороженном состоянии при температуре -20°С (или без добавления NaN₃ - при температуре -70°С). Для выделения из антисыворотки антител к фактору роста сосудистого эндотелия производят абсорбцию на твердой фазе в следующей последовательности:

1. 10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 М NaCl добавляют 6,26 г Na₂SO₄, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°С;

2. выпавший осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре;

3. после удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером;

4. фракцию антител определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.

Затем производят очистку антител, например, методом аффинной хроматографии путем прикрепления полученных антител к фактору роста сосудистого эндотелия, который находится на нерастворимом матриксе с последующим элюированием концентрированными растворами соли.

Полученный таким образом буферный раствор поликлональных антител к фактору роста сосудистого эндотелия, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл используют в качестве матричного (первичного) раствора для последующего приготовления активированной - потенцированной формы лекарственного средства.

Моноклональные антитела могут быть получены, например, с помощью гибридомной технологии, которая включает несколько этапов: последовательная иммунизация животных, предпочтительно мышей; выделение из иммунизированных животных антитело-продуцирующих В-лимфоцитов из лимфоидных органов животного (селезенка, лимфатические узлы); создание гибридом (антитело-продуцирующие В-лимфоциты и гибридизируют с миеломными клетками); культивирование гибридом и отбор продуктивных гибридных клеток; скрининг секретируемых гибридомами антител; клонирование гибридомных клеток; выделение антител из культуральной жидкости и очистка моноклональных антител.

Мышам делают иммунизацию антигеном - фактором роста сосудистого эндотелия смешанного с адъювантом. Через несколько дней у иммунизированных мышей выделяют лимфоидные органы и готовят взвесь клеток. Выбирают миеломные клетки для гибридизации с клетками иммунизированных животных.

Клетки иммунизированного животного и миеломные клетки смешивают и центрифугируют. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а к осадку добавляют полиэтиленгликоль (0,5 мл 50%-ного раствора ПЭГ) и инкубируют. Зачем отмывают от клетки от ПЭГ. Далее клетки с миеломными клетками помещали в ГАТ-среду и культивировали.

После культивирования выделяли выжившие гибридомные клетки миеломы с клетками иммунизированного животного, которые сохраняли способность синтезировать и секретировать антитела.

Далее проводили клонирование гибридом и отбор нужных клонов. Выжившие в ГАТ клетки рассевали в специальные пластиковые планшеты, содержащие обычно 96 лунок емкостью примерно по 0,2 см³. В каждую лунку помещали в среднем по 10 гибридомных клеток и культивировали. После нескольких дней культивирования содержимое каждой лунки проверяли на присутствие антител нужной специфичности. Клетки из лунок, содержащих нужные антитела, клонировали, то есть повторно рассевали по таким же лункам, но из расчета 1 клетка на лунку, вновь культивировали и проверяли на присутствие нужных антител. Процедуру повторяли 1-2 раза. Таким образом, отбирали клоны, продуцирующие антитела только одной нужной специфичности, то есть моноклональные антитела.

После чего проводили выделение моноклональных антител из культуральной жидкости гибридомных клеток и проводили очистку моноклональных антител с помощью методов хроматографии, предпочтительно аффинной хроматографии.

Полученные таким образом, моноклональные антитела к фактору роста сосудистого эндотелия, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл используют в качестве матричного (первичного) раствора для последующего приготовления активированной - потенцированной формы лекарственного средства.

Предпочтительной для приготовления лекарственного средства является использование смеси трех водно-спиртовых разведении первичного матричного раствора антител, разведенных, соответственно, в 100¹², 100³⁰, и 100²⁰⁰ раз, что соответствует сотенным разведениям С12, С30 и С200, приготовленным по гомеопатической технологии. При выполнении заявленного лекарственного средства в твердой лекарственной форме на нейтральный носитель наносится смесь указанных компонентов.

Активированную - потенцированную форму антител к фактору роста сосудистого эндотелия готовят путем равномерного уменьшения концентрации в результате последовательного разведения 1 части упомянутого матричного раствора в 9 частях (для десятичного разведения D) или в 99 частях (для сотенного разведения С) или в 999 частях (для тысячного разведения М) нейтрального растворителя,. с многократным вертикальным встряхиванием ("динамизацией") каждого полученного разведения и использованием отдельных емкостей для каждого последующего разведения до получения требуемой потенции - кратности разведения по гомеопатическому методу (см., например, В. Швабе "Гомеопатические лекарственные средства", М., 1967 г., с.14-29).

Внешнюю обработку в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.

Например, для приготовления 12-го сотенного разведения С12 одну часть упомянутого матричного раствора антител к фактору роста сосудистого эндотелия с концентрацией 3,0 мг/мл разводят в 99 частях нейтрального водного или водно-спиртового растворителя и многократно (10 и более раз) вертикально встряхивают - потенцируют полученное 1-е сотенное С1 разведение. Из 1-го сотенного С1 разведения приготовляют 2-ое сотенное разведение С2. Данную операцию повторяют 11 раз, получая 12-е сотенное разведение С12. Таким образом, 12-е сотенное разведение С12 представляет собой раствор, полученный разбавлением последовательно в разных емкостях 12 раз 1-ой части исходного матричного раствора антител к фактору роста сосудистого эндотелия с концентрацией 3,0 мг/мл в 99-ти частях нейтрального растворителя, раствор, приготовленный разведением матричного раствора в 100¹² раз. Аналогичные операции с соответствующей кратностью разведения проводят для получения разведении С30 и С200.

При использовании в качестве биологически активного жидкого компонента смеси различных, преимущественно сотенных, разведении действующего вещества, приготовленных по гомеопатической технологии, каждый компонент состава (например, С12, C30, С200) приготовляют раздельно по описанной выше технологии до их предпоследнего разведения (соответственно, до получения С11, С29, С199) и затем вносят в соответствии с составом смеси в одну емкость по одной части каждого компонента и смешивают с требуемым количеством растворителя (соответственно, с 97 частями для сотенного разведения). При этом получают активированную - потенцированную форму антител к фактору роста сосудистого эндотелия в сверхмалой дозе, полученной сверхразведением матричного раствора, соответственно, в 100¹², 100³⁰ и 100²⁰⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных разведении С12, С30 и С200, приготовленных по гомеопатической технологии.

Возможно использование действующего вещества в виде смеси других различных разведении, например, десятичных и или сотенных, (D20, С30, С100 или С12, С30, С50 и т.д.), приготовленных по гомеопатической технологии, эффективность которых определяют экспериментально.

При потенцировании вместо встряхивания в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять внешнее воздействие ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.

Заявленное лекарственное средство может быть использовано и в твердой лекарственной форме, которая содержит эффективное количество гранул нейтрального носителя - лактозы, насыщенного путем пропитывания до насыщения смесью водных или водно-спиртовых растворов активированной - потенцированной формой антител к фактору роста сосудистого эндотелия, и фармацевтически приемлемые добавки, включающие, преимущественно, лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

Для получения твердой оральной формы заявленного лекарственного средства производят в установке кипящего слоя (например, типа «Huttlin Pilotlab» производства компании Hiittlin GmbH) орошение до насыщения вводимых в псевдоожиженный - кипящий слой гранул нейтрального вещества - лактозы (молочного сахара) с размером частиц 150÷300 мкм, предварительно полученным водным или водно-спиртовым раствором активированных - потенцированных форм антител к фактору роста сосудистого эндотелия, преимущественно, в соотношении 1 кг раствора антител на 5 или 10 кг лактозы (1:5 - 1:10) с одновременной сушкой в потоке подаваемого под решетку нагретого воздуха при температуре не выше 40°С. Расчетное количество 0,07÷0, 17 от массы твердой оральной формы) высушенных гранул, насыщенных активированной - потенцированной формой антител к фактору роста сосудистого эндотелия, загружают в смеситель и смешивают с микрокристаллической целлюлозой, вводимой в количестве 3,0÷8,0 масс. частей от общей массы загрузки - от массы твердой оральной формы. Затем в эту смесь добавляют 25÷45 масс. частей от общей массы загрузки «ненасыщенной» чистой лактозы (для снижения стоимости и некоторого упрощения и ускорения технологического процесса без снижения эффективности лечебного воздействия) и стеарат магния в количестве 0,8÷1,2 масс. частей от общей массы загрузки. Полученную таблеточную массу равномерно перемешивают и таблетируют прямым сухим прессованием (например, в таблет-прессе Korsch - XL 400) с формированием круглых таблеток массой 150÷500 мг. После таблетирования получают таблетки массой 300 мг, пропитанные водно-спиртовым раствором (3,0-6,0 мг/табл.) активированной - потенцированной формой антител к фактору роста сосудистого эндотелия в сверхмалой дозе, приготовленной из матричного раствора, разведенного в 100¹², в 100³⁰, в 100²⁰⁰, что эквивалентно смеси сотенных гомеопатических разведении С12, С30 и С200.

Для проведения экспериментальных исследований были использованы моноклональные антитела, приготовленные по заказу специализированной биотехнологической фирмой.

Пример 1

Для экспериментального исследования коррекции эндотелиальной дисфункции опыты проводили на белых крысах самцах линии Wistar массой 250-300 г, которые были разделены на 3 группы: 1 группа - контрольная получала дистиллированную воду 9 мл/кг/сут (ежедневно, внутрижелудочное введение.), 2 группа - получала L-NAME (12,5 мг/кг), 3 группа - получала L-NAME(12,5 мг/кг) + смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200 (9 мл/кг/сут.), каждая группа включала по 10 особей крыс.

Эндотелиальную дисфункцию у крыс вызывали (моделировали) путем внутрибрюшинного введения N-нитро-L-аргинин метиловый эфира (L-NAME) в дозе 12,5 мг/кг/сут. в течение 28 дней. На 29 день от начала эксперимента под наркозом (тиопентал - натрия 50 мг/кг) вводят катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляют в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряют непрерывно посредством датчика TSD104A и аппаратно-программного комплекса MP 100, производства Biopac System, Inc., США. Функциональные пробы: эндотелий зависимая вазодилатация (ЭЗВ)- внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг, эндотелий независимая вазодилатация (ЭНЗВ) - внутривенное введение нитропрусеида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг.

Степень развития эндотелиальной дисфункции оценивали с помощью коэффициента эндотелиальной дисфункции, являющегося отношением площади треугольника над трендом реакции восстановления артериального давления (АД) в ответ на введение нитропруссида (НП), при этом точками меньшего катета являются точка максимального падения АД и точка выхода уровня АД на плато при введении функциональной пробы с введением НП, к площади треугольника над трендом реакции восстановления АД в ответ на введение ацетилхолина (АХ), причем за меньший из катетов принимают разность между точкой окончания кардиального компонента и точкой восстановления АД при введении функциональной пробы с введением АХ, а большими катетами в этих треугольниках являются показатели времени восстановления сосудистой реакции на введение АХ и НП, выражаемое в секундах; площадь исчисляемых треугольников выражается в условных единицах (см., например, известную методику, описанную в патенте RU 2301015).

При статистической обработке данных рассчитывали среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считали достоверными при p<0,05.

Обработка полученных экспериментальных данных при проведении функциональных проб на эндотелийзависимое (ацетилхолин 40 мкг/кг в/в) и эндотелийнезависимое (нитропруссид 30 мг/кг в/в) расслабление сосудов у экспериментальных животных, позволили установить, что внутрибрюшинное введение L-Name в дозе 12,5 мг/кг в течение 28 дней вызывает повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции до 3,5±0,5 усл.ед. (Таблица 1), тогда как в контрольной группе животных (внутрижелудочное введение дистиллированной воды, в дозе 9 мл/кг/сут.) КЭД составил 1,2±0,1 усл.ед.

В группе животных, которым в течение 28 дней вводили L-Name в дозе 12,5 мг/кг и внутрижелудочно смесь растворов гомеопатических разведений моноклональных антител к VEGF - С12, С30, С200 КЭД составил - 1,7±0,1 усл.ед., что достоверно ниже, чем в группе животных, которым вводили L-Name.

Таким образом, полученные результаты подтверждают возможность коррекции L-Name-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс, вызванной введением L-Name в дозе 12,5 мг/кг, путем введения внутрижелудочно смеси растворов гомеопатических разведений антител к VEGF - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг, что выражается в снижении КЭД в данной группе животных до уровня 1,7±0,1 усл.ед., близкого к уровню КЭД в контрольной группе животных - 1,2±0,1 усл.ед.

Полученные данные позволяют сделать вывод о возможности эффективной коррекции эндотелиальной дисфункции и у людей.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и касается коррекции эндотелиальной дисфункции. Для этого вводят лекарственное средство, содержащее активированную потенцированную форму антител к фактору роста сосудистого эндотелия (VEGF). Активность лекарственного средства обусловлена процессом многократного последовательного разведения в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения. Способ обеспечивает эффективную коррекцию L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте. 5 з.п. ф-лы, 1 пр., 1 табл.

1. Лекарственное средство для коррекции эндотелиальной дисфункции, характеризующееся тем, что содержит активированную потенцированную форму антител к фактору роста сосудистого эндотелия.

2. Лекарственное средство по п.1, характеризующееся тем, что активированную - потенцированную форму антител к фактору роста сосудистого эндотелия используют в виде активированного - потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом многократного последовательного разведения в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения.

3. Лекарственное средство по п.1 или 2, характеризующееся тем, что выполнено в твердой лекарственной форме, которая содержит эффективное количество гранул нейтрального носителя, насыщенного раствором активированной - потенцированной формы антител к фактору роста сосудистого эндотелия, и фармацевтически приемлемые добавки.

4. Лекарственное средство по п.3, характеризующееся тем, что фармацевтически приемлемые добавки включают лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

5. Лекарственное средство по п.2, характеризующееся тем, что водный или водно-спиртовой раствор активированной - потенцированной формы антител к фактору роста сосудистого эндотелия получен путем многократного последовательного разведения в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения из матричного раствора антител к цитокинам с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.

6. Лекарственное средство по п.5, характеризующееся тем, что активированную - потенцированную форму антител к фактору роста сосудистого эндотелия используют в виде смеси различных, преимущественно сотенных, разведений по гомеопатической технологии.