ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ Российский патент 2015 года по МПК A61K39/395 A61P9/14 

Изобретение относится к области медицины, в частности кардиофармакологии, и может быть использовано для коррекции эндотелиальной дисфункции.

Из уровня техники известен способ коррекции эндотелиальной дисфункции смесью растворов гомеопатических разведений поликлональных антител к эндотелиальной синтазе оксида азота человека (RU 2306953, C1, A61K 39/395, 2007). Однако недостатком данного изобретения является то, что использование смеси растворов гомеопатических разведений поликлональных антител к NO-синтазе эффективно при эндотелиальной дисфункции, связанной с низким уровнем эндотелиальной NO-синтазы, и может не обеспечивать терапевтическую эффективность при эндотелиальной дисфункции с нормальной продукцией NO-синтазы.

Изобретение направлено на создание эффективного и безопасного лекарственного средства для коррекции эндотелиальной дисфункции, препятствующего возникновению воспаления стенки сосуда и развитию эндотелиальной дисфункции.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что лекарственное средство для коррекции эндотелиальной дисфункции содержит активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II.

Заявленное лекарственное средство может быть использовано для коррекции L-Name-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс самцов линии Wistar, вызванной внутрибрюшинным ежедневным введением 2 раза в сутки L-Name в дозе 12,5 мг/кг по 4,5 мл/кг (9 мл/кг/сут), путем введения внутрижелудочно активированной - потенцированной формы антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II в виде смеси растворов гомеопатических разведений С12, С30, С200.

Активированная - потенцированная форма антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II может быть использована в виде активированного - потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом многократного последовательного разведения в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения.

Кроме того, лекарственное средство может быть выполнено в твердой лекарственной форме, которая содержит эффективное количество гранул нейтрального носителя, насыщенного смесью активированной - потенцированной формы антител к С- концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II, и фармацевтически приемлемые добавки, которые включают лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

При этом водный или водно-спиртовой раствор активированной - потенцированной формы антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II может быть получен путем многократного последовательного разведения в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения из матричного раствора антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.

Кроме того, активированная - потенцированная форма антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II может быть использована в виде смеси различных разведений, приготовленных по гомеопатической технологии, преимущественно в виде смеси трех растворов, приготовленных из матричного раствора, разведенного соответственно в 100¹², 100³⁰ и 100²⁰⁰ раз, что эквивалентно сотенным разведениям С12, С30, С200, приготовленным по гомеопатической технологии.

Заявленное лекарственное средство рекомендуется принимать предпочтительно по 1-2 таблетке 2-6 раз в день.

Предложенная активированная - потенцированная форма антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II в лекарственном средстве (т.е. форма антител, приготовленная по гомеопатической технологии потенцирования путем многократного последовательного разведения в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения (см., например, В.Швабе "Гомеопатические лекарственные средства", М., 1967, с.14-29), которая обладает активностью в фармакологических моделях и/или клинических методах коррекции эндотелиальной дисфункции), обеспечивает увеличение eNOS, приводит к блокаде ангиотензиновых рецепторов - 1 типа, устраняет эффекты ангиотензина II (превращению оксида азота в пероксинитрат, стимуляции синтез эндотелина, стимуляции выработки цитокинов, в результате чего не возникает воспаления в сосудистой стенке, гиперактивации ренин-ангиотензин альдестероновой системы (РААС)), приводящих к формированию эндотелиальной дисфункции.

Полученное в соответствии с изобретением лекарственное средство представляет собой новый фармакологический препарат, который характеризуется наличием специфической фармакологической активности, отсутствием побочных эффектов, привыкания и пристрастия, экологической чистотой и низкой себестоимостью.

Кроме того, заявленное лекарственное средство расширяет арсенал препаратов, предназначенных для коррекции эндотелиальной дисфункции.

Лекарственное средство приготовляют следующим образом. Для приготовления лекарственного средства используют моноклональные или преимущественно поликлональные антитела, которые могут быть получены по известным технологиям - методикам, описанным, например, в книге: Иммунологические методы, под ред. Г.Фримеля. М.: Медицина, 1987, с.9-33; или, например, в статье Laffly E., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.

Поликлональные антитела могут быть получены активной иммунизацией животных. Для этого по специально разработанной схеме животным делают серию инъекций требуемыми в соответствии с изобретением веществами - антигенами: С-концевым фрагментом AT₁ рецептора ангиотензина II. В результате проведения такой процедуры получают моноспецифические антисыворотки с высоким содержанием антител, которые используют для получения активированных - потенцированных форм. При необходимости проводят очистку антител, присутствующих в антисыворотке, например, методом аффинной хроматографии, путем применения фракционирования солевым осаждением или ионообменной хроматографии.

Моноклональные антитела получают, например, с помощью гибридомной технологии. Причем начальная стадия процесса включает иммунизацию, основанную на принципах, уже разработанных при приготовлении поликлональных антисывороток. Дальнейшие этапы работы предусматривают получение гибридных клеток, продуцирующих клоны одинаковых по специфичности антител. Их выделение в индивидуальном виде проводится теми же методами, что и в случае поликлональных антисывороток.

Предпочтительным для приготовления заявленного лекарственного средства является использование поликлональных антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II, которые в качестве матричного (первичного) раствора с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл используют для последующего приготовления активированной - потенцированной формы.

Для получения поликлональных антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов может быть использован адъювант и С-концевой фрагмент AT₁ рецептора ангиотензина II, выбираемый, например, из следующей группы:

GKKFK RYFLQLLKYI PPKAKSHSNL STKMSTLSYR PSDNVSSSTK KPAPCFEVE

LNPF FYVFFGKNFK KYFLQLIKYI PPNVSTHPSL TTKMSSLSYR PPENIRLPTK KTAGSFDTE

QLLKYI РРКА

SSLSYR PPENIR

QLIKYI PPNVSTHP

SNL STKMSTLSYR PSDNVSSSTK KPAPCF

Возможно для получения поликлональных антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II использование в качестве иммуногена (антигена) С-концевого фрагмента рецептора AT1 ангиотензина II человека с добавленным к N концу Цистеином (С):

CGKKF KRYFL QLLKY IPPKA KSHSN LSTKM STLSY RPSDN VSSST ККРАР CFEVE

Перед отбором крови за 7-9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекции для повышения уровня антител. В процессе иммунизации у кроликов отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства растворимых антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. После окончания первого цикла иммунизации кроликов в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Для получения антисыворотки из иммунизированных кроликов собирают кровь в центрифужную пробирку объемом 50 мл. С помощью деревянного шпателя удаляют со стенок пробирки образовавшиеся сгустки и помещают палочку в сгусток, образовавшийся в центре пробирки. Кровь помещают в холодильник (температура 4°С) на ночь. На следующий день удаляют сгусток, прикрепившийся к шпателю, и центрифугируют оставшуюся жидкость при 13000 g в течение 10 мин. Супернатант (надосадочная жидкость) является антисывороткой. Полученная антисыворотка должна быть желтого цвета. Добавляют к антисыворотке 20% (весовая концентрация) NaN₃ до конечной концентрации 0,02% и хранят до использования в замороженном состоянии при температуре -20°С (или без добавления NaN₃ - при температуре -70°С). Для выделения из антисыворотки антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II производят абсорбцию на твердой фазе в следующей последовательности:

1. 10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 М NaCl, добавляют 6,26 г Na₂SO₄, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°С;

2. выпавший осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре;

3. после удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером;

4. фракцию антител определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.

Затем производят очистку антител, например, методом аффинной хроматографии путем прикрепления полученных антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II, который находится на нерастворимом матриксе с последующим элюированием концентрированными растворами соли.

Полученный, таким образом, буферный раствор поликлональных антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл, используют в качестве матричного (первичного) раствора для последующего приготовления активированной - потенцированной формы лекарственного средства.

Предпочтительной для приготовления лекарственного средства является использование смеси трех водно-спиртовых разведений первичного матричного раствора антител, разведенных соответственно в 100¹², 100³⁰ и 100²⁰⁰ раз, что соответствует сотенным разведениям С12, С30 и С200, приготовленным по гомеопатической технологии. При выполнении заявленного лекарственного средства в твердой лекарственной форме на нейтральный носитель наносится смесь указанных компонентов.

Активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II готовят путем равномерного уменьшения концентрации в результате последовательного разведения 1 части упомянутого матричного раствора в 9 частях (для десятичного разведения D) или в 99 частях (для сотенного разведения С) или в 999 частях (для тысячного разведения М) нейтрального растворителя с многократным вертикальным встряхиванием ("динамизацией") каждого полученного разведения и использованием отдельных емкостей для каждого последующего разведения до получения требуемой потенции - кратности разведения по гомеопатическому методу (см., например, В.Швабе "Гомеопатические лекарственные средства", М., 1967, с.14-29).

Внешнюю обработку в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.

Например, для приготовления 12-го сотенного разведения С 12 одну часть упомянутого матричного раствора антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II с концентрацией 3,0 мг/мл разводят в 99 частях нейтрального водного или водно-спиртового растворителя и многократно (10 и более раз) вертикально встряхивают - потенцируют полученное 1-е сотенное С1 разведение. Из 1-го сотенного С1 разведения приготовляют 2-ое сотенное разведение С2. Данную операцию повторяют 11 раз, получая 12-е сотенное разведение С 12. Таким образом, 12-е сотенное разведение С 12 представляет собой раствор, полученный разбавлением последовательно в разных емкостях 12 раз 1-ой части исходного матричного раствора антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II с. концентрацией 3,0 мг/мл в 99-ти частях нейтрального растворителя, раствор, приготовленный разведением матричного раствора в 100¹² раз. Аналогичные операции с соответствующей кратностью разведения проводят для получения разведений С30 и С200.

При использовании в качестве биологически активного жидкого компонента смеси различных, преимущественно сотенных, разведений действующего вещества, приготовленных по гомеопатической технологии, каждый компонент состава (например, С12, С30, С200) приготовляют раздельно по описанной выше технологии до их предпоследнего разведения (соответственно до получения С11, С29, С 199) и затем вносят в соответствии с составом смеси в одну емкость по одной части каждого компонента и смешивают с требуемым количеством растворителя (соответственно с 97 частями для сотенного разведения). При этом получают активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II в сверхмалой дозе, полученной сверхразведением матричного раствора соответственно в 100¹², 100³⁰ и 100²⁰⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных разведений С12, С30 и С200, приготовленных по гомеопатической технологии.

Возможно использование действующего вещества в виде смеси других различных разведений, например десятичных и/или сотенных (D20, С30, С100 или С12, С30, С50 и т.д.), приготовленных по гомеопатической технологии, эффективность которых определяют экспериментально.

При потенцировании вместо встряхивания в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять внешнее воздействие ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.

Заявленное лекарственное средство может быть использовано и в твердой лекарственной форме, которая содержит эффективное количество гранул нейтрального носителя - лактозы, насыщенного путем пропитывания до насыщения смесью водных или водно-спиртовых растворов активированной - потенцированной формой антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II, и фармацевтически приемлемые добавки, включающие преимущественно лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

Для получения твердой оральной формы заявленного лекарственного средства производят в установке кипящего слоя (например, типа «Huttlin Pilotlab» производства компании Huttlin GmbH) орошение до насыщения вводимых в псевдоожиженный - кипящий слой гранул нейтрального вещества - лактозы (молочного сахара) с размером частиц 150÷300 мкм, предварительно полученным водным или водно-спиртовым раствором активированных - потенцированных форм антител к С- концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II преимущественно в соотношении 1 кг раствора антител на 5 или 10 кг лактозы (1:5-1:10) с одновременной сушкой в потоке подаваемого под решетку нагретого воздуха при температуре не выше 40°С. Расчетное количество 0,07÷0,17 от массы твердой оральной формы) высушенных гранул, насыщенных активированной - потенцированной формой антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II, загружают в смеситель и смешивают с микрокристаллической целлюлозой, вводимой в количестве 3,0÷8,0 масс. частей от общей массы загрузки - от массы твердой оральной формы. Затем в эту смесь добавляют 25÷45 масс. частей от общей массы загрузки «ненасыщенной» чистой лактозы (для снижения стоимости и некоторого упрощения и ускорения технологического процесса без снижения эффективности лечебного воздействия) и стеарат магния в количестве 0,8÷1,2 масс. частей от общей массы загрузки. Полученную таблеточную массу равномерно перемешивают и таблетируют прямым сухим прессованием (например, в таблет-прессе Korsch - XL 400) с формированием круглых таблеток массой 150-500 мг. После таблетирования получают таблетки массой 300 мг, пропитанные водно-спиртовым раствором (3,0-6,0 мг/табл.) активированной - потенцированной формы антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II в сверхмалой дозе, приготовленной из матричного раствора, разведенного в 100¹², в 100³⁰, в 100²⁰⁰, что эквивалентно смеси сотенных гомеопатических разведений С12, С30 и С200.

Предпочтительно заявленную фармацевтическую композицию рекомендуется принимать по 1-2 таблетке 2-4 раза в день.

Для проведения экспериментальных исследований были использованы поликлональные антитела, приготовленные по заказу специализированной биотехнологической фирмой.

Пример 1.

Для экспериментального исследования коррекции эндотелиальной дисфункции опыты проводили на белых крысах самцах линии Wistar массой 250-300 г, которые были разделены на 3 группы: 1 группа - контрольная получала дистиллированную воду 9 мл/кг/сут (ежедневно, внутрижелудочное введение.), 2 группа - получала L-NAME (12,5 мг/кг), 3 группа - получала L-NAME(12,5 мг/кг)+ смесь растворов гомеопатических разведений поликлональных антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II - С12, С30, С200 (9 мл/кг/сут).

Эндотелиальную дисфункцию у крыс вызывали (моделировали) путем внутрибрюшинного введения N-нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME) в дозе 12,5 мг/кг/сут в течение 28 дней. На 29 день от начала эксперимента под наркозом (тиопентал - натрия 50 мг/кг) вводят катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляют в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряют непрерывно посредством датчика TSD104A и аппаратно-программного комплекса МР100, производства Biopac System, Inc., США. Функциональные пробы: эндотелий зависимая вазодилатация (ЭЗВ)- внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг, эндотелий независимая вазодилатация (ЭНЗВ) - внутривенное введение нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг.

Степень развития эндотелиальной дисфункции оценивали с помощью коэффициента эндотелиальной дисфункции, являющегося отношением площади треугольника над трендом реакции восстановления артериального давления (АД) в ответ на введение нитропруссида (НП) к площади треугольника над трендом реакции восстановления АД в ответ на введение ацетилхолина (АХ).

При статистической обработке данных рассчитывали среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считали достоверными при p<0,05.

Обработка полученных экспериментальных данных при проведении функциональных проб на эндотелийзависимое (ацетилхолин 40 мкг/кг в/в) и эндотелийнезависимое (нитропруссид 30 мг/кг в/в) расслабление сосудов у экспериментальных животных позволила установить, что внутрибрюшинное введение L-Name в дозе 12,5 мг/кг в течение 28 дней вызывает повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции до 3,5±0,5 усл.ед. (Таблица 1), тогда как в контрольной группе животных (внутрижелудочное введение дистиллированной воды, в дозе 9 мл/кг/сут) КЭД составил 1,2±0,1 усл.ед.

В группе животных, которым в течение 28 дней вводили L-Name в дозе 12,5 мг/кг и внутрижелудочно смесь растворов гомеопатических разведений антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II - С12, С30, С200 КЭД составил - 1,5±0,2 усл.ед., что достоверно ниже, чем в группе животных, которым вводили L-Name.

Таким образом, полученные результаты подтверждают возможность коррекции L-Name-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс, вызванной введением L-Name в дозе 12,5 мг/кг, путем введения внутрижелудочно смеси растворов гомеопатических разведений антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг, что выражается в снижении КЭД в данной группе животных до уровня 1,5±0,2 усл.ед., близкого к уровню КЭД в контрольной группе животных - 1,2±0,1 усл.ед.

Таблица 1 Динамика показателей АД и коэффициента эндотелиальной дисфункции при моделировании L-Name-индуцированной эндотелиальной дисфункции и ее коррекции смесью растворов гомеопатических разведений антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II - С12, С30, С200 в дозе 9 мл/кг/сут Группы животных Функциональная проба САД, мм рт.ст. ДАД, мм рт.ст. S сосудистой реакции при проведении ЭЗВД с АХ и ЭНВД с НП, усл.ед. КЭД, усл.ед. Контрольная (ежедневное, внутрижелудочное введение дистиллированной воды 9 мл/кг/сут) Исходные 159,2±5,4 124,2±4,7   1,2±0,1 АХ 96,9±6,7 52,0±3,0 3071,2±501,1 НП 113,8±6,1 55±2,4 3617,2±560,1 Получавшие L-NAME (12,5 мг/кг) Исходные 204,8±10* 164,2±5,9*   3,5±0,5* АХ 111,3±7,4 64,7±4,3* 3700,2±536,9 НП 118,2±9,9 61,4±4,4 11922,8±1838,9* L-NAME(12,5 мг/кг) + смесь растворов гомеопатических разведений антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II - С12, С30, С200 (9 мл/кг/сут) Исходные 226,8±12,1* 174,4±7,0*   1,5±0,2** АХ 114,9±5,5 67,1±4,8* 5074,7±905,3 НП 124,9±10 69,9±8,5 7101,5±1025,8** Примечание: * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой; ** - р<0,05 в сравнении с группой L-NAME. САД - систолическое артериальное давление, ДАД - диастолическое артериальное давление, S - площадь над кривой восстановления артериального давления при проведении фармакологических проб, КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции.

Полученные данные позволяют сделать вывод о возможности эффективной коррекции эндотелиальной дисфункции и у людей.

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и кардиологии, и касается коррекции эндотелиальной дисфункции. Для этого вводят лекарственное средство, содержащее активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II. Введение такого средства обеспечивает как профилактику, так и эффективное лечение эндотелиальной дисфункции, вплоть до полного восстановления нормальной функции эндотелия. 5 з.п. ф-лы, 1 пр., 1 табл.

1. Лекарственное средство для коррекции эндотелиальной дисфункции, характеризующееся тем, что содержит активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II.

2. Лекарственное средство по п.1, характеризующееся тем, что активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II используют в виде активированного - потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом многократного последовательного разведения в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения.

3. Лекарственное средство по п.1 или 2, характеризующееся тем, что выполнено в твердой лекарственной форме, которая содержит эффективное количество гранул нейтрального носителя, насыщенного раствором активированной - потенцированной формы антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II, и фармацевтически приемлемые добавки.

4. Лекарственное средство по п.3, характеризующееся тем, что фармацевтически приемлемые добавки включают лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

5. Лекарственное средство по п.1 или 2, характеризующееся тем, что водный или водно-спиртовой раствор активированной - потенцированной формы антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II получен путем многократного последовательного разведения в сочетании с внешним механическим воздействием - вертикальным встряхиванием каждого разведения из матричного раствора поликлональных антител к цитокинам с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.

6. Лекарственное средство по п.5, характеризующееся тем, что активированную - потенцированную форму антител к С-концевому фрагменту AT₁ рецептора ангиотензина II используют в виде смеси различных, преимущественно сотенных, разведений по гомеопатической технологии.