ПРОИЗВОДНОЕ 1',2',3'-ТРИМЕТОКСИБЕНЗО[4',5':4,5]-6,7-ДИГИДРОЦИКЛОГЕПТА-[3,2-f]-1H-1-МЕТИЛИНДОЛА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2013 года по МПК C07D209/56 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к области органической химии, к гетероциклическим соединениям, содержащим пятичленные кольца, конденсированные с другими ядрами, с одним атомом азота в качестве гетероатома, а именно к индолам, только с атомами водорода или радикалами, содержащими только атомы водорода и углерода, непосредственно связанные с атомами углерода гетероциклического кольца, с замещенными углеводородными радикалами, связанными с атомами углерода гетероциклического кольца, касается производного 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндола и его применения в качестве активного компонента противоопухолевых лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний.

В настоящее время онкологические заболевания являются одной из основных причин смерти во всем мире. В 2007 году зарегистрировано 7,9 миллиона случаев смерти от этой болезни. По прогнозам, число случаев смерти от онкологических заболеваний в мире будет продолжать расти и в 2030 году достигнет 12 миллионов. В связи с этим, синтез новых соединений и создание на их основе противоопухолевых препаратов, обладающих улучшенными фармакокинетическими свойствами, является актуальной задачей здравоохранения.

Известны химические соединения, противоопухолевое действие которых заключается в ингибировании митоза активно пролиферирующих опухолевых клеток.

Цитотоксическая и противоопухолевая активность известных антимитотических соединений обусловлена нарушением обратимости процесса полимеризации и деполимеризации белковых молекул α- и β-тубулина, что приводит к нарушению формирования митотического веретена, образование которого предшествует делению клетки (Biochem. Pharmacol., 1976, 25, 138).

Известно достаточно большое количество химических соединений, обладающих цитотоксической активностью по отношению ко многим видам опухолевых клеток. К таким соединениям относятся алкалоиды ряда колхицина, комбретастатин А-4 и его производные, а также 4-арилкумарины. Однако каждый из них имеет недостатки.

Недостатком комбретастатина А-4 (US 4996237 (А), опубл. 1991.02.26, кл. С07С 43/23, C07D 317/64, А61К 31/075) и его производных (US 2009186857 (А1), опубл. 2009.07.23, кл. А61К 31/66) является низкая эффективность за счет нежелательных побочных эффектов при применении in vivo вследствие их самопроизвольного превращения из активной цис-формы в неактивную транс-форму (Curr. Opin. Pharmacol., 2001, 1, 370).

4-арилкумарины проявляют низкую антипролиферацинную и апоптозиндуцирующую активность по сравнению с производными комбретастатина и колхицина [J. Med. Chem. 2003, 46, 5437; J. Med. Chem. 2011, 54, 3153].

Недостатком колхицина и его производных (например: WO 2011022805 (А1), опубл. 2011.03.03, кл. А61К 31/165, А61Р 35/00, С07С 233/32; WO 2010105172 (А1), опубл. 2010.09.16, кл. A01N 37/18, А61К 31/16; ЕР 2056812 А1, опубл. 2009.05.13, кл. А61К 31/165, А61Р 35/04; US 2004204370 (А1), опубл. 2004.10.14, кл. С07С 323/41, С07С 323/42, С07С 323/60) является возникновение побочных эффектов при их применении, в частности, значительная неспецифическая токсичность (Med. Res. Rev. 2008, 28, 155-183; Chem. Nat. Prod. 1998, 34, 343), что делает невозможным их использование в качестве противоопухолевых препаратов.

Колхицин, известный по A. Brossi Ed. The Alkaloids, Academic Press, New York, 1984, 23, по заявке WO 2011022805 (Al), опубл. 2011.03.03, кл. A61K 31/165, A61P 35/00, C07C 233/32 представлен формулой:

В задачу изобретения положено создание нового производного 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндола и его применение в качестве активного компонента противоопухолевых лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении апоптозиндуцирующей активности и активности при ингибировании пролиферации опухолевых клеток, снижении неспецифической токсичности.

Это достигается тем, что производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-H-1-метилиндола представлено общей формулой:

,

где Х - заместитель, Х= =O, -ОН, N₃, NHAc.

при Х= =O, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-оксоциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндол;

при Х=ОН, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндол;

при X=N₃, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-азидоциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндол.

при X=NHAc, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-ацетамидоциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндол.

Это достигается также тем, что производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндола применяют в качестве активного компонента противоопухолевого лекарственного средства для лечения онкологических заболеваний.

На фиг.1 представлена общая схема получения производного 1',2',3'-триметоксибензо [4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндола, в котором группа Х соответствует карбонильной группе.

На фиг.2 представлена общая схема получения производного 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидропиклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндола, в котором группа Х соответствует гидроксильной группе, или азидной группе, или ацетамидной группе.

На фиг.3 представлена Таблица 1 «Результаты биологических испытаний, отражающие активность при ингибировании пролиферации опухолевых клеток и апоптозиндупирующую активность производных 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндола по отношению к клеткам BJAB».

На фиг.1-3:

1a - 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-оксоциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндол, в котором группа Х соответствует карбонильной группе,

1b - 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндол, в котором группа Х соответствует гидроксильной группе,

1с - 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-азидоциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндол, в котором группа Х соответствует азидной группе,

1d - 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-ацетамидоциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндол, в котором группа Х соответствует ацетамидной группе.

Производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндола представлено общей формулой:

,

где Х - заместитель.

При синтезе 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндола путем введения в него карбонильной группы Х= =O, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо [4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-оксоциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндол.

При синтезе 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндола, путем введения в него гидроксильной группы Х=ОН, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндол.

При синтезе 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндола, путем введения в него азидной группы X=Na, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-азидоциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндол.

При синтезе 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндола, путем введения в него ацетамидной группы X=NHAc, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-ацетамидоциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндол.

Применяют производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидропиклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндола в качестве активного компонента противоопухолевого лекарственного средства для лечения онкологических заболеваний.

Получение производных 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндола осуществляют следующим образом.

Сначала синтезируют метиловый эфир 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-йодофенил)пропановой кислоты.

Для этого раствор брома (2 мл, 0.039 моль) в ледяной уксусной кислоте (10 мл) прикалывают к раствору 3-(3',4',5'триметоксифенил)пропановой кислоты (10 г, 0.039 моль) в уксусной кислоте (10 мл). Реакционную смесь перемешивают до исчезновения окраски брома (~2 ч), разбавляют водой (100 мл) и оставляют в холодильнике на 12 часов. Образовавшиеся белые кристаллы отделяют на фильтре Шотта, промывают водным раствором Na₂S₂O₃, водой и сушат при пониженном давлении при температуре 70°С. Полученный продукт (10.1 г, 0.03 моль, 78%) растворяют в CH₂Cl₂ (50 мл), прибавляют трифторацетат серебра (7.1 г, 0.032 моль), после чего прикалывают раствор йода (7.6 г, 0.03 ммоль) в CH₂Cl₂ (200 мл) в течение 6 ч при комнатной температуре. Перемешивание продолжают в течение часа. Реакционную смесь фильтруют через Celite®, фильтрат промывают насыщенным водным раствором Na₂S₂O₃ (100 мл), водой (100 мл), насыщенным водным раствором NaHCO₃ (100 мл), сушат над MgSO₄, растворитель удаляют при пониженном давлении. Полученный продукт (13.4 г, 97%, желтое твердое соединение) растворяют Et₂O (150 мл), раствор охлаждают до 0°С, после чего действуют -0.3 М раствором диазометана в Et₂O до достижения полной конверсии субстрата (ТСХ-контроль). Избыток диазометана удаляют действием уксусной кислоты (1 мл). Полученный раствор промывают насыщенным водным NaHCO₃ (3×100 мл), сушат над MgSO₄, растворитель удаляют при пониженном давлении. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент EtOAc/СуН, 1:5) метиловый эфир 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-йодофенил)пропановой кислоты (12.9 г, 72% после 3-х стадий) был получают в виде желтого масла, медленно кристаллизующегося при комнатной температуре. Т.пл.=63°С. R_f=0.43 (EtOAc/Cy, 1:4). ¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃, 25°С): δ = 2.47-2.59 (м, 2Н, CH₂C(O)), 3.32-3.45 (м, 2Н, ArCH₂), 3.71 (с, 3Н, С(О)OCH₃), 3.84 (с, 3Н, ArOCH₃), 3.87 (с, 3Н, ArOCH₃), 3.88 (с, 3Н, ArOCH₃). ¹³С ЯМР (75 МГц, CDCl₃, 25°С): δ = 32.0, 37.5, 51.8, 60.7, 60.9, 61.1, 92.9, 113.9, 137.4, 144.8, 151.5, 152.9, 172.6. ИК: □ = 957, 1006, 1052, 1084, 1170, 1195, 1263, 1288, 1322, 1375, 1403, 1456, 1733, 2840, 2943 см^-1. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 243 (15), 259 (20), 274 (15), 291 (50), 302 (14), 318 (6), 331 (100), 379 (57), 385 (8), 458 (13) [М⁺]. Масс-спектр высокого разрешения (EI): рассчитано для C13H16BrIO5 [М]+ 457.9225; найдено 457.923.

Затем синтезируют метиловый эфир 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1Н-индол-5''-ил)фенил)пропановой кислоты.

Для этого пинаколовый эфир 1-метил-1H-индол-5-илборной кислоты (3 г, 12 ммоль), метиловый эфир 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-йодофенил)пропановой кислоты (6 г, 13.2 ммоль), Cs₂CO₃ (5.9 г, 18 ммоль), Pd(OAc)₂ (81 мг, 0.36 ммоль) и PPh₃ (0.283 г, 1.08 ммоль) растворяли в безводном толуоле (20 мл) в атмосфере аргона и полученную смесь перемешивали при кипячении в течение 24 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через Celite® этилацетатом (100 мл) и удаляли растворители при пониженном давлении. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент EtOAc/CyH, 1:5) был выделен метиловый эфир 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1H-индол-5''-ил)фенил)пропановой кислоты (5.3 г, 96%) в виде твердого желтого соединения. Т.пл.=92°С. R_f=0.25 (EtOAc/CyH, 1:5). ¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃, 25°С): δ = 2.39-2.44 (м, 2Н, CH₂), 2.85-2.91 (м, 2Н, CH₂), 3.52 (с, 3Н, OCH₃), 3.54 (с, 3Н, OCH₃), 3.83 (с, 3Н, NCH₃), 3.94 (с, 3Н, OCH₃), 3.95 (с, 3Н, OCH₃), 6.48 (д, J=3.1 Гц, 1Н, 3''-Н), 7.01 (дд, ⁴J=1.5 Гц, ³J=8.4 Гц, 1Н, 6''-Н), 7.09 (д, ³J=3.1 Гц, 1Н, 2''-Н), 7.36 (д, ³J=8.4 Гц, 1Н, 7''-Н), 7.40 (д, ⁴J=1.5 Гц, 1Н, 4''-Н). ¹³С ЯМР (75 МГц, CDCl₃, 25°С): δ = 28.9, 32.9, 33.5, 51.4, 60.9, 60.9, 61.0, 101.1, 109.0, 114.7, 121.5, 123.2, 127.3, 128.3, 129.2, 134.7 (2С), 136.0, 145.5, 150.2, 151.4, 172.9. ИК: □ = 966, 1013, 1050, 1082, 1170, 1194, 1257, 1323, 1396, 1411, 1445, 1460, 1734, 2931 см^-1. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 205 (26), 221 (26), 234 (25), 250 (34), 264 (21), 278 (26), 294 (41), 308 (100), 351 (18), 382 (61), 388 (9), 461 (56) [М]⁺. Масс-спектр высокого разрешения (EI): рассчитано для C22H24BrNO5 [M]+ 461.0838; найдено 461.084.

Затем синтезируют 3-(2'-Бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1H-индол-5''-ил)фенил)пропановую кислоту.

Для этого к раствору метилового эфира 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1H-индол-5''-ил)фенил)пропановой кислоты (5 г, 11.2 ммоль) в ТГФ/МеОН (2:1, 75 мл) медленно прибавляют 1 н водный раствор LiOH (25 мл). Реакционную смесь перемешивают 1 ч при 50°С, после чего охлаждают до комнатной температуры, доводят до рН=6 действием 1 н водного раствора HCl, органические растворители удаляют при пониженном давлении. Остаток экстрагируют метил-трет-бугиловъш эфиром (4×50 мл), объединенный органический слой промывали насыщенным водным раствором NaCl (3×50 мл) и сушат над MgSO₄. После удаления растворителя при пониженном давлении и проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент EtOAc/CyH, 1:2) получают 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1'-метил-1Н-индол-5''-ил)фенил)пропановую кислоту (4.32 g, 89%) в виде бело-розового поликристаллического порошка. Т.пл.=159°С. R_f=0.25 (EtOH/EtOAc/CyH, 1:1:7). ¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃, 25°С): δ = 2.38-2.43 (м, 2Н, СН₂), 2.78-2.89 (м, 2Н, CH₂), 3.50 (с, 3Н, ОСН₃), 3.80 (с, 3Н, NCH₃), 3.92 (с, 3Н, OCH₃), 3.93 (с, 3Н, OCH₃), 6.44 (д, J=3.0 Гц, 1Н, 3''-Н), 6.97 (дд, ⁴J=1.4 Гц, ³J=8.4 Гц, 1Н, 6''-Н), 7.04 (д, ³J=3.0 Гц, 1Н, 2''-Н), 7.32 (д, ³J=8.4 Гц, 1Н, 7''-Н), 7.36 (д, ⁴J=1.4 Гц, 1Н, 4''-Н). ¹³С ЯМР (75 МГц, CDCl₃, 25°С): δ = 28.7, 32.9, 33.3, 60.9, 61.0, 61.1, 101.2, 109.1, 114.7, 121.5, 123.1, 127.2, 128.4, 129.2, 134.4, 134.8, 136.0, 145.6, 150.2, 151.5, 177.7. ИК: □ = 967, 1013, 1052, 1082, 1257, 1322, 1397, 1411, 1446, 1461, 1706, 2928 см^-1. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 194 (60), 205 (28), 221 (26), 236 (31), 250 (37), 264 (19), 278 (28), 294 (70), 309 (55), 338 (12), 353 (22), 373 (14), 388 (14), 447 (100) [М⁺]. Масс-спектр высокого разрешения (EI): рассчитано для C21H22BrNO5 [M]+ 461.0681; найдено 447.068.

Синтез 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-лигидро-1-оксоциклогепта[3,2-f]-1H-1-метилиндола (1а) осуществляют следующим образом.

3-(2'-Бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1Н-индол-6''-ил)фенил)пропановую кислоту (3 г, 6.70 ммоль) растворяют в безводном CH₂Cl₂ (25 мл) в атмосфере аргона. Раствор охлаждают до -10°С и прибавляют 1-хлоро-N,N,2-триметилпропениламин (0.93 мл, 7.04 ммоль). Реакционную смесь перемешивают 12 ч при 0°С. Полученный раствор разбавляют CH₂Cl₂ (335 мл) и добавляют ZnCl₂ (1.82 г, 13.4 ммоль) при 0°С. Температуру реакционной смеси медленно повышают до комнатной и смесь интенсивно перемешивают 2 ч. В реакционную смесь добавляют 100 мл насыщенного раствора NaHCO₃, органический слой отделяют, а водный слой экстрагируют CH₂Cl₂ (3×50 мл). Органический экстракт сушат над безводным MgSO₄, растворитель удаляют при пониженном давлении. Применяют колоночную хроматографию на силикагеле (элюент EtOAc/Cy, 1:2) для выделения 1.15 г продуктов реакции в виде белого поликристаллического порошка. К 0.6 г полученного продукта, растворенного в безводном толуоле (5 мл) в атмосфере аргона, добавляют 2,2'-азоизобутиронитрил (0.17 g, 0.7 ммоль) и трибутилоловогидрид (0.38 мл, 1.4 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при кипячении в течение 4 ч и каждый час к смеси добавляют трибутилоловогидрид (3×(0.38 мл, 1.4 ммоль)). По завершении реакции реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и в колбу добавляют 50 мл насыщенного водного раствора KF и полученную суспензию интенсивно перемешивают в течение 1 ч. Водный слой отделяют, экстрагируют EtOAc (3×50 мл), органический слой сушат над MgSO₄, растворитель удаляют при пониженном давлении. При помощи колоночной хроматографии на смеси силикагель-KF (9:1 массовое отношение) (элюент EtOAc/Cy, 2:3) выделяют соединение 1а (0.36 г) в виде бесцветного поликристаллического порошка. Т.пл.=203°С. R_f=0.3 (EtOAc/Cy, 2:3). ¹H ЯМР (300 MHz, CDCl₃, 25°C): δ = 2.44-2.71 (м, 1Н, CH₂), 2.79-3.13 (м, 3Н, CH₂), 3.36 (с, 3Н, OCH₃), 3.83 (с, 3Н, NCH₃), 3.89 (с, 3Н, OCH₃), 3.90 (с, 3Н, OCH₃), 6.53 (д, ³J=3.0 Hz, 1Н, 3'-Н), 6.60 (с, 1Н, 4-Н), 7.17 (д, ³J=3.0 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.60 (с, 1Н, 4'-Н), 7.78 (с, 1Н, 7'-Н). ¹³С ЯМР (75 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 30.2, 33.0, 47.7, 56.0, 60.7, 61.2, 101.4, 106.7, 109.2, 123.6, 124.7, 125.5, 130.8, 131.8, 133.9, 135.4, 136.0, 141.5, 152.4, 152.4, 207.4. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 194 (30), 205 (12), 222 (22), 234 (12), 250 (30), 265 (12), 276 (13), 293 (24), 308 (16), 322 (19), 336 (9), 351 (100) [М]⁺. Масс-спектр высокого разрешения (EI): вычислено для C₂₁H₂₁NO₄ [М]⁺ 351.1471; найдено 351.147.

Затем синтезируют 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта[3,2-f]-1Н-1-метилиндол (1b).

Для этого соединение 1а (0.34 г, 0.967 ммоль) растворяют в смеси ТГФ/МеОН (4:1, 12.5 мл). К полученному раствору медленно приливают Н₂О (2.5 мл) и прибавляют NaBH₄ (0.037 г, 0.967 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре, разбавляют водой (5 мл), органические растворители удаляют при пониженном давлении. Получившуюся суспензию экстрагируют метилтрет-бутиловым эфиром (4×10 mL), органический экстракт сушат над MgSO₄. После удаления растворителя при пониженном давлении получают 0.31 г (92%) соединения 1b в виде бесцветного поликристаллического порошка Т.пл.=145°С. R_f=0.3 (EtOAc/Cy, 1:1). В спектрах ЯМР зарегистрированных в CDCl₃ присутствуют два конформера с соотношением 10:1. Химические сдвиги для основного конформера: ¹H ЯМР (300 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 1.79-1.93 (м, 1Н, CH₂), 2.24-2.45 (м, 2Н, CH₂), 2.47-2.61 (м, 1Н, CH₂), 3.52 (с, 3Н, OCH₃), 3.79 (с, 3Н, NCH₃), 3.89 (с, 3Н, OCH₃), 3.91 (с, 3Н, OCH₃), 4.73 (дд, ³J=6.9 Hz, ³J=10.4 Hz, 1Н, 7-Н), 6.49 (д, ³J=3.1, 1Н, 3'-Н), 6.58 (с, 1Н, 4-Н), 7.03 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.61 (с, 1Н, 4'-Н), 7.70 (c, 1H, 7'-Н). ¹³С ЯМР (75 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 30.6, 32.9, 41.3, 56.0, 60.7, 61.1, 70.6, 101.0, 103.0, 107.3, 122.3, 124.4, 125.8, 127.00, 128.8, 135.5, 136.2, 136.2, 141.0, 150.9, 152.0. Химические сдвиги для не основного конформера: ¹H ЯМР (300 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 1.79-1.93 (м, 1Н, CH₂), 2.24-2.45 (м, 2Н, CH₂), 2.47-2.61 (м, 1Н, CH₂), 3.50 (с, 3Н, OCH₃), 3.79 (с, 3Н, NCH₃), 3.89 (с, 3Н, OCH₃), 3.91 (с, 3Н, OCH₃), 4.88 (м, 1Н, 7-Н), 6.49 (д, ³J=3.1, 1Н, 3'-Н), 6.65 (с, 1Н, 4-Н), 7.05 (д, ³J=3.0 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.14 (с, 1Н, 4'-Н), 7.78 (с, 1Н, 7'-Н). Масс-спектр (EI): m/z (%) = 191 (21), 206 (20), 218 (14), 234 (16), 250 (14), 263 (12), 277 (15), 294 (24), 304 (9), 322 (8), 335 (10), 353 (100) [М]⁺. Масс-спектр высокого разрешения (EI): вычислено для C21H23NO4 [М]+ 353.1627; найдено 353.162.

Затем синтезируют 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-азидоциклогепта[3,2-f]-1Н-1-метилиндол (1с).

Для этого к суспензии соединения 1b (0.250 г, 0.708 ммоль), Zn(N₃)₂·2Ру (0.164 г, 0.531 ммоль) и трифенилфосфина (0.371 г, 1.416 ммоль) в безводном толуоле (3 мл) по каплям добавляют диизопропилазодикарбоксилат (0.28 мл, 0.202 ммоль). После перемешивания в течение 0.5 ч при комнатной температуре, реакционную смесь разбавляют EtOAc, фильтруют через Селит и растворитель удаляют при пониженном давлении. При помощи колоночной хроматографии на силикагеле (элюент EtOAc/Cy, 1:5) выделяют 0.24 г (89%) продукта 1с в виде бесцветного поликристаллического вещества. Т.пл.=87°С. R_f=0.3, R_f=0.4 (EtOAc/Cy, 1:5). В спектрах ЯМР зарегистрированных в CDCl₃ присутствуют два конформера с соотношением 10:1. Химические сдвиги для основного конформера: ¹H ЯМР (300 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 1.91-2.01 (м, 1Н, CH₂, 2.19-2.66 (м, 3Н, CH₂), 3.57 (с, 3Н, OCH₃), 3.85 (с, 3Н, NCH₃), 3.91 (с, 3Н, OCH₃), 3.94 (с, 3Н, OCH₃), 4.60 (дд, ³J=6.5 Hz, ³J=11.3 Hz, 1Н, 7-Н), 6.51 (д, ³J=3.0 Hz, 1Н, 3'-Н), 6.60 (с, 1Н, 4-Н), 7.08 (д, ³J=3.0 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.50 (с, 1Н, 4'-Н), 7.73 (с, 1Н, 7'-Н). ¹³С ЯМР (75 MHz, CDCl₃, 25°C): δ = 30.5, 32.9, 38.9, 56.0, 60.7, 61.1, 61.8, 101.0, 104.2, 107.3, 122.6, 125.0, 125.6, 127.3, 129.2, 131.4, 134.6, 136.0, 141.2, 151.0, 152.3. Химические сдвиги для не основного конформера: ¹H ЯМР (300 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 1.91-2.01 (м, 1Н, CH₂), 2.19-2.66 (м, 3Н, CH₂), 3.54 (с, 3Н, OCH₃), 3.82 (с, 3Н, NCH₃), 3.90 (с, 3Н, OCH₃), 3.95 (с, 3Н, OCH₃), 4.89 (дд, ³J=6.5 Hz, ³J=11.3 Hz, 1Н, 7-Н), 6.53 (д, ³J=3.0 Hz, 1H, 3'-H), 6.58 (с, 1H, 4-Н), 7.09 (д, ³J=3.0 Hz, 1H, 2'-Н), 7.21 (с, 1H, 4'-Н), 7.86 (с, 1H, 7'-Н). В спектрах ЯМР зарегистрированных в CD₃COD присутствуют два конформера с соотношением 10:3. Химические сдвиги для основного конформера: ¹H ЯМР (300 MHz, CD₃OD, 25°С): δ = 1.83-1.98 (м, 1Н, CH₂), 2.15-2.59 (м, 3Н, CH₂), 3.48 (с, 3Н, OCH₃), 3.85 (с, 3Н, NCH₃), 3.87 (с, 3Н, OCH₃), 3.89 (с, 3Н, OCH₃), 4.51 (дд, ³J=6.2 Hz, ³J=11.2 Hz, 1Н, 7-Н), 6.44 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 3'-Н), 6.74 (с, 1Н, 4-Н), 7.17 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.50 (с, 1Н, 4'-Н), 7.61 (с, 1Н, 7'-Н). Химические сдвиги для не основного конформера: ¹H ЯМР (300 MHz, CD₃OD, 25°С): δ = 1.83-1.98 (м, 1Н, CH₂), 2.15-2.59 (м, 3Н, CH₂), 3.47 (с, 3Н, OCH₃), 3.84 (с, 3Н, NCH₃), 3.86 (с, 3Н, OCH₃), 3.88 (с, 3Н, OCH₃), 4.91-5.00 (м, 1Н, 7-Н), 6.45 (д, ³J=2.9 Hz, 1Н, 3'-Н), 6.68 (с, 1Н, 4-Н), 7.19 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.34 (с, 1Н, 4'-Н), 7.70 (с, 1Н, 7'-Н Масс-спектр (EI): m/z (%) = 192 (28), 205 (21), 220 (18), 233 (14), 249 (16), 263 (17), 276 (12), 291 (32), 307 (64), 319 (8), 335 (100), 350 (8), 378 (35) [M]⁺. Масс-спектр высокого разрешения (EI): вычислено для C21H22N4O3[M]+ 378.1692; найдено 378.169.

Затем синтезируют 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-ацетамидоциклогепта[3,2-f]-1Н-1-метилиндол (1d).

Для этого 1 М раствора LiAlH₄ в Et₂O (0.28 мл, 0.28 ммоль) прибавляют по каплям к соединению 1с (0.07 г, 0.185 ммоль) в ТГФ (1 мл). После перемешивания в течение 24 ч к реакционной смеси последовательно прибавляют воду (5 мл) и 2 М водный раствор NaOH (5 мл). Водную фазу экстрагируют метилтрет-бутиловым эфиром (3×15 мл), органический экстракт сушат над MgSO₄ и растворитель удаляют при пониженном давлении. Полученный продукт растворяют в CH₂Cl₂ (1 мл) и прибавляют к раствору пиридин (0.06 мл, 0.74 ммоль) и уксусный ангидрид (0.06 мл, 0.64 ммоль). Реакцию проводят в атмосфере аргона. Через 0.5 ч к реакционной смеси добавляют воду (10 мл), органический слой отделяют, а водный слой экстрагируют CH₂Cl₂ (3×15 мл). Органический экстракт промывают 10% раствором HCl (10 мл) и насыщенным раствором NaCl (10 мл), сушат над MgSO₄, легколетучие продукты удаляют при пониженном давлении. При помощи колоночной хроматографии на силикагеле (элюент CH₂Cl₂/МеОН, 20:1) выделяют 0.063 г (87%) соединения Id в виде бесцветных кристаллов. Т.пл.=183°С. R_f=0.33, R_f=0.38 (CH₂Cl₂/MeOH, 20:1). В ЯМР спектрах, зарегистрированных в CDCl₃ наблюдается 3 набора сигналов, относящихся к трем конформерам с соотношением 10:7:3. Набор сигналов с наибольшей интегральной интенсивностью: ¹H ЯМР (300 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 1.70-1.83 (м, 1Н, 6-Н), 2.08 (с, 3Н, С(О)CH₃), 2.12-2.64 (м, 2Н, 5-Н), 3.43 (с, 3Н, OCH₃), 3.79 (с, 3Н, NCH₃), 3.88 (с, 3Н, OCH₃), 3.93 (с, 3Н, OCH₃), 4.78-5.04 (м, 1Н, 6-Н), 5.93-5.99 (м, 1Н, 7-Н), 6.46 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 3'-Н), 6.55 (с, 1Н, 4-Н), 7.01 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.16 (с, 1Н, 4'-Н), 7.74 (с, 1Н, 7'-Н). Набор сигналов со средней интегральной интенсивностью: ¹H ЯМР (300 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 1.57 (с, 3Н, С(О)CH₃), 2.26-2.64 (м, 2Н, 5-Н), 3.50 (с, 3Н, OCH₃), 3.79 (с, 3Н, NCH₃), 3.92 (с, 3Н, OCH₃), 3.93 (с, 3Н, OCH₃), 5.23-5.41 (м, 2Н, 7-Н, 6-Н), 6.48 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 3'-Н), 6.65 (с, 1Н, 4-Н), 7.05 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.30 (с, 1Н, 4'-Н), 7.71 (с, 1Н, 7'-Н). Набор сигналов с наименьшей интегральной интенсивностью: ¹H ЯМР (300 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 1.69 (с, 3Н, С(О)CH₃), 1.70-1.83 (м, 1Н, 6-Н), 2.26-2.64 (м, 2Н, 5-Н), 3.46 (с, 3Н, OCH₃), 3.80 (с, 3Н, NCH₃), 3.91 (с, 3Н, OCH₃), 3.94 (с, 3Н, OCH₃), 4.38-4.49 (м, 1Н, 6-Н), 5.82-5.88 (м, 1Н, 7-Н), 6.50 (д, ³J=3.0 Hz, 1Н, 3'-Н), 6.60 (с, 1Н, 4-Н), 7.07 (д, ³J=3.0 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.32 (с, 1Н, 4'-Н), 7.71 (с, 1Н, 7'-Н). В ЯМР спектрах, зарегистрированных в CD₃OD наблюдался один набор сигналов: ¹H ЯМР (300 MHz, CD₃OD, 25°С): δ = 1.84-1.97 (м, 1Н, 6-Н), 2.05 (с, 3Н, С(О)CH₃), 2.17-2.35 (м, 2Н, 5-Н), 2.42-2.53 (м, 1Н, 6-Н), 3.42 (с, 3Н, OCH₃), 3.82 (с, 3Н, NCH₃), 3.88 (с, 6Н, OCH₃), 4.83 (дд, ³J=6.0 Hz, ³J=11.8 Hz, 1Н, 7-Н), 6.42 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 3'-Н), 7.13 (д, ³J=3.0 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.32 (с, 1Н, 4'-Н), 7.57 (с, 1Н, 7'-Н). ¹³С ЯМР (75 MHz, CD₃OD, 25°С): δ = 22.8, 31.7, 32.9, 40.3, 50.8, 56.6, 61.2, 61.6, 101.7, 104.1, 108.9, 123.1, 126.8, 127.7, 128.7, 130.2, 134.9, 136.7, 137.8, 142.3, 152.2, 153.5, 172.4. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 191 (28), 206 (30), 218 (22), 234 (26), 248 (13), 261 (20), 277 (28), 291 (30), 304 (59), 320 (52), 335 (76), 394 (100) [М]⁺. Масс-спектр высокого разрешения (EI): вычислено для C₂₃H₂₆N₂O₄ [М]⁺ 394.1892; найдено 394.188.

Биологические испытания.

Заявляемые производные 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндола были испытаны с целью определения их активности при ингибировании пролиферации опухолевых клеток, апоптозиндуцирующей активности, а также неспецифической токсичности по отношению к клеточной линии лимфомы Беркитта BJAB.

Клетки BJAB культивировали на питательной среде RPMI 1640 (GIBCO, Invitrogen, Karlsruhe, Germany) с добавлением 10% (по объему) инактивированной нагреванием, эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 0.56 г/л L-глутамина, 100,000 I.U. пенициллина и 0.1 г/л стрептомицина. Клетки пассировали 2 раза в неделю. За 24 ч до анализа количество клеток доводили до концентрации 3×10⁵ клеток/мл для стандартизации условий роста. Для оценки пролиферации и апоптоза клетки разводили до количества 1×10⁵ клеток/мл непосредственно перед воздействием соответствующими соединениями.

Оценка выхода лактатдегидрогеназы (ЛДГ): измерение неспецифичесой цитотоксичности:

Цитотоксичность различных соединений измеряли по выходу ЛДГ с использованием стандартного набора реактивов фирмы Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany). За 100% клеточной гибели принимали максимальную активность фермента ЛДГ, вышедшего в среду инкубации при лизисе клеток 0.1% Тритоном Х-100.

Оценка пролиферации: определение количества клеток и клеточной выживаемости:

Выживаемость клеток определяли с использованием системы для подсчета и анализа клеток CASYR (Reutlingen, Germany). Система была настроена под используемые клетки. Система позволяет определять одновременно 3 группы клеток: клеточные остатки, мертвые клетки и живые клетки. Клетки рассеивали в концентрации 1×10⁵ на 1 мл и добавляли различные концентрации аналогов колхицина; клетки, не подвергавшиеся воздействию, служили контролем. После инкубации в течение 24 ч клетки ресуспендировали в полной среде, и 100 мкл каждого образца тщательно разводили в 10 мл CASYRтона (готового к использованию изотонического раствора) для последующего подсчета клеток. Ингибирование пролиферации представляли как показатель IC₅₀, который означает концентрацию соединения, вызывающую снижение числа живых клеток на 50%. Концентрацию клеток 2×10⁵ клеток/мл принимали за 100%.

Оценка апоптоза: измерение уровня фрагментации ДНК:

Апоптотическую гибель клеток определяли методом анализа клеточного цикла, который детектирует фрагменты ДНК на уровне единичной клетки. Клетки рассеивали в количестве 1×10⁵ клеток/мл и добавляли различные концентрации аналогов колхицина. После инкубации в течение 72 ч при температуре 37°С клетки центрифугировали на 150 об/мин в течение 5 мин, отмывали фосфатным буфером (PBS) при 4°С и фиксировали смесью PBS и 2% формальдегида (1:1 по объему) на льду в течение 30 мин. Затем клетки осаждали, инкубировали с раствором этанола и PBS (2:1 по объему) 15 мин, снова осаждали и ресуспендировали в PBS, содержащем 40 мкг/мл рибонуклеазы (RNase). РНК расщепляли в течение 30 мин при температуре 37°С, после чего клетки опять осаждали и ресуспендировали в PBS, содержащем 50 мкг/мл пропидий йодида. Фрагментация ядерной ДНК количественно оценивалась с помощью проточной цитометрии по гиподиплоидной ДНК. Сбор и анализ данных производился на приборе FACScalibur (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany) с программным обеспечением CellQuest. Данные представляли в виде процента гипоплоидии (subGl), который отражает число апоптотических клеток. Уровень апоптоза оценивали по показателю АС₅₀, который означает апоптоз 50% клеток.

Результаты биологических испытаний представлены в Таблице 1. Из таблицы 1 видно, что соединения 1a-d не вызывают некроз опухолевых клеток BJAB в концентрации 100 мкМ (по данным оценки выхода лактатдегидрогеназы). Это означает, что соединения 1a-d не проявляют неспецифической токсичности по отношению к BJAB клеткам в концентрациях, значительно превышающих терапевтические.

Приведенные данные демонстрируют, что заявляемые производные 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндола обладают более высокими значениями активности при ингибировании пролиферации опухолевых клеток, большими значениями апоптозиндуцирующей активности и меньшей неспецифической токсичностью по сравнению с колхицином.

Заявляемые производные 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндола могут быть использованы для лечения онкологических заболеваний, связанных с неоваскуляризацией новообразований. Это относится, в частности, к лимфомам, к солидным (твердым) опухолям типа карцином и аденокарцином молочной железы, раку легких и т.д. Кроме того, они могут применяться в терапии в сочетании с другими химиотерапевтическими препаратами, а также после хирургических операций и при облучении.

Применение предложенных производных 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндола в качестве активного компонента лекарственного средства для лечения онкологических заболеваний обеспечивает повышение апоптозиндуцирующей активности и активности при ингибировании пролиферации опухолевых клеток, снижение неспецифической токсичности.

Изобретение относится к новым производным 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндола формулы:

,

где Х означает О, ОН, N₃, NHAc, которые могут быть использованы в качестве активного компонента противоопухолевого лекарственного средства. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндола общей формулы:
,
где Х - заместитель, Х= =O, -ОН, N₃, NHAc.

2. Производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндола по п.1, отличающееся тем, что при Х= =O производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-оксоциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндол.

3. Производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндола по п.1, отличающееся тем, что при Х=ОН производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндол.

4. Производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндола по п.1, отличающееся тем, что при Х=N₃ производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-азидоциклогепта-[3,2-f]-1H-1-метилиндол.

5. Производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндола по п.1, отличающееся тем, что при Х=NHAc производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-ацетамидоциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндол.

6. Применение производного 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[3,2-f]-1Н-1-метилиндола по пп.1-5 в качестве активного компонента противоопухолевого лекарственного средства.