ПРОИЗВОДНОЕ 1',2',3'-ТРИМЕТОКСИБЕНЗО[4',5':4,5]-6,7-ДИГИДРОЦИКЛОГЕПТА-[2,3-e]-1H-1-МЕТИЛИНДОЛА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2013 года по МПК C07D209/56 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к области органической химии, к гетероциклическим соединениям, содержащим пятичленные кольца, конденсированные с другими ядрами, с одним атомом азота в качестве гетероатома, а именно к индолам, только с атомами водорода или радикалами, содержащими только атомы водорода и углерода, непосредственно связанные с атомами углерода гетероциклического кольца, с замещенными углеводородными радикалами, связанными с атомами углерода гетероциклического кольца, касается производного 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-e]-1H-1-метилиндола и его применения в качестве активного компонента противоопухолевых лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний.

В настоящее время онкологические заболевания являются одной из основных причин смерти во всем мире. В 2007 году зарегистрировано 7,9 миллиона случаев смерти от этой болезни. По прогнозам, число случаев смерти от онкологических заболеваний в мире будет продолжать расти и в 2030 году достигнет 12 миллионов. В связи с этим, синтез новых соединений и создание на их основе противоопухолевых препаратов, обладающих улучшенными фармакокинетическими свойствами, является актуальной задачей здравоохранения.

Известны химические соединения, противоопухолевое действие которых заключается в ингибировании митоза активно пролиферирующих опухолевых клеток.

Цитотоксическая и противоопухолевая активность известных антимитотических соединений обусловлена нарушением обратимости процесса полимеризации и деполимеризации белковых молекул α- и β-тубулина, что приводит к нарушению формирования митотического веретена, образование которого предшествует делению клетки (Biochem. Pharmacol., 1976, 25, 138).

Известно достаточно большое количество химических соединений, обладающих цитотоксической активностью по отношению ко многим видам опухолевых клеток. К таким соединениям относятся алкалоиды ряда колхицина, комбретастатин A-4 и его производные, а также 4-арилкумарины. Однако каждый из них имеет недостатки.

Недостатком комбретастатина A-4 (US 4996237 (A), опубл. 1991.02.26, кл. С07С 43/23, C07D 317/64, А61К 31/075) и его производных (US 2009186857 (A1), опубл. 2009.07.23, кл. A61K 31/66) является низкая эффективность за счет нежелательных побочных эффектов при применении in vivo вследствие их самопроизвольного превращения из активной цис-формы в неактивную транс-форму (Curr. Opin. Pharmacol., 2001, 1,370).

4-арилкумарины проявляют низкую антипролиферацинную и апоптозиндуцирующую активность по сравнению с производными комбретастатина и колхицина [J. Med. Chem. 2003, 46, 5437; J. Med. Chem. 2011, 54, 3153].

Недостатком колхицина и его производных (например: WO 2011022805 (A1), опубл. 2011.03.03, кл. А61К 31/165, A61P 35/00, C07C 233/32; WO 2010105172 (A1), опубл. 2010.09.16, кл. A01N 37/18, A61K 31/16; EP 2056812 А1, опубл. 2009.05.13, кл. A61K 31/165, A61P 35/04; US 2004204370 (A1), опубл. 2004.10.14, кл. С07С 323/41, С07С 323/42, С07С 323/60) является возникновение побочных эффектов при их применении, в частности, значительная неспецифическая токсичность (Med. Res. Rev. 2008, 28, 155-183; Chem. Nat. Prod. 1998, 34, 343), что делает невозможным их использование в качестве противоопухолевых препаратов.

Колхицин, известный по A. Brossi Ed. The Alkaloids, Academic Press, New York, 1984, 23, по заявке WO 2011022805 (A1), опубл. 2011.03.03, кл. A61K 31/165, A61P 35/00, C07C 233/32 представлен формулой:

В задачу изобретения положено создание нового производного 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола и его применение в качестве активного компонента противоопухолевых лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении апоптозиндуцирующей активности и активности при ингибировании пролиферации опухолевых клеток, снижении неспецифической токсичности.

Это достигается тем, что производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола представлено общей формулой:

где Х - заместитель, Х= =O, -ОН, N₃, NHAc;

при Х= =O, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-оксоциклогепта[2,3-е]1Н-1-метилиндол;

при Х=ОН, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта[2,3-е]-1Н-1-метилиндол;

при X=N₃, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-азидоциклогепта[2,3-е]-1Н-1-метилиндол;

при X=NHAc, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-ацетамидоциклогепта[2,3-е]-1Н-1-метилиндол.

Это достигается также тем, что производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола применяют в качестве активного компонента противоопухолевого лекарственного средства для лечения онкологических заболеваний.

На фиг.1 представлена общая схема получения производного 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола, в котором группа Х соответствует карбонильной группе.

На фиг.2 представлена общая схема получения производного 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола, в котором группа Х соответствует гидроксильной группе, или азидной группе, или ацетамидной группе.

На фиг.3 представлена Таблица 1 «Результаты биологических испытаний, отражающие активность при ингибировании пролиферации опухолевых клеток и апоптозиндуцирующую активность производных 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола по отношению к клеткам BJAB».

На фиг.1-3:

1a - 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-оксоциклогепта[2,3-е]-1H-1-метилиндол, в котором группа Х соответствует карбонильной группе,

1b - 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта[2,3-е]-1Н-1-метилиндол, в котором группа Х соответствует гидроксильной группе,

1с - 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-азидоциклогепта[2,3-е]-1H-1-метилиндол, в котором группа Х соответствует азидной группе,

1d - 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-ацетамидоциклогепта[2,3-е]-1H-1-метилиндол, в котором группа Х соответствует ацетамидной группе,

Производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-1H-1-метилиндола по 1 варианту представлено общей формулой:

где Х - заместитель.

При синтезе 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола путем введения в него карбонильной группы Х= =O, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-оксоциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндол.

При синтезе 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола путем введения в него гидроксильной группы Х= ОН, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндол.

При синтезе 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола путем введения в него азидной группы Х=N₃, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-азидоциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндол.

При синтезе 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола путем введения в него ацетамидной группы Х=NHAc, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-ацетамидоциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндол.

Применяют производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола в качестве активного компонента противоопухолевого лекарственного средства для лечения онкологических заболеваний.

Получение производного 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола осуществляют следующим образом.

Сначала синтезируют метиловый эфир 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-йодофенил)пропановой кислоты. Для этого раствор брома (2 мл, 0.039 моль) в ледяной уксусной кислоте (10 мл) прикалывают к раствору 3-(3',4',5'триметоксифенил)пропановой кислоты (10 г, 0.039 моль) в уксусной кислоте (10 мл). Реакционную смесь перемешивают до исчезновения окраски брома (~2 ч), разбавляют водой (100 мл) и оставляют в холодильнике на 12 часов. Образовавшиеся белые кристаллы отделяют на фильтре Шотта, промывают водным раствором Na₂S₂O₃, водой и сушат при пониженном давлении при температуре 70°С. Полученный продукт (10.1 г, 0.03 моль, 78%) растворяют в CH₂Cl₂ (50 мл), прибавляют трифторацетат серебра (7.1 г, 0.032 моль), после чего прикалывают раствор йода (7.6 г, 0.03 ммоль) в СН2С12 (200 мл) в течение 6 ч при комнатной температуре. Перемешивание продолжают в течение часа. Реакционную смесь фильтруют через Celite®, фильтрат промывают насыщенным водным раствором Na₂S₂O₃ (100 мл), водой (100 мл), насыщенным водным раствором МаНСОз (100 мл), сушат над MgSO₄, растворитель удаляют при пониженном давлении. Полученный продукт (13.4 г, 97%, желтое твердое соединение) растворяют Et₂O (150 мл), раствор охлаждали до 0°С, после чего действуют ~0.3 М раствором диазометана в Et₂O до достижения полной конверсии субстрата (ТСХ-контроль). Избыток диазометана удаляют действием уксусной кислоты (1 мл). Полученный раствор промывают насыщенным водным NaHCO₃ (3×100 мл), сушат над MgSO₄, растворитель удаляют при пониженном давлении. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент EtOAc/СуН, 1:5) метиловый эфир 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-йодофенил)пропановой кислоты (12.9 г, 72% после 3-х стадий) получают в виде желтого масла, медленно кристаллизующегося при комнатной температуре. Т.пл.=63°С. R_f=0.43 (EtOAc/Cy, 1:4). ¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃, 25°С): δ = 2.47-2.59 (м, 2Н, CH₂C(O)), 3.32-3.45 (м, 2Н, ArCH₂, 3.71 (с, 3Н, С(О)OCH₃), 3.84 (с, 3Н, ArOCH₃), 3.87 (с, 3Н, ArOCH₃), 3.88 (с, 3Н, ArOCH₃). ¹³С ЯМР (75 МГц, CDCl₃, 25°С): (δ = 32.0, 37.5, 51.8, 60.7, 60.9, 61.1, 92.9, 113.9, 137.4, 144.8, 151.5, 152.9, 172.6. ИК: □ = 957, 1006, 1052, 1084, 1170, 1195, 1263, 1288, 1322, 1375, 1403, 1456, 1733, 2840, 2943 см^-1. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 243 (15), 259 (20), 274 (15), 291 (50), 302 (14), 318 (6), 331 (100), 379 (57), 385 (8), 458 (13) [М]⁺. Масс-спектр высокого разрешения (EI): рассчитано для C₁₃H₁₆BrIO₅ [М⁺] 457.9225; найдено 457.923.

Затем синтезируют метиловый эфир 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1H-индол-5''-ил)фенил)пропановой кислоты. Для этого пинаколовый эфир 1-метил-1H-индол-5-илборной кислоты (3 г, 12 ммоль), метиловый эфир 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-йодофенил)пропановой кислоты (6 г, 13.2 ммоль), Cs₂CO₃ (5.9 г, 18 ммоль), Pd(ОАс)₂ (81 мг, 0.36 ммоль) и PPh₃ (0.283 г, 1.08 ммоль) растворяют в безводном толуоле (20 мл) в атмосфере аргона и полученную смесь перемешивают при кипячении в течение 24 часов. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через Celite® этилацетатом (100 мл) и удаляют растворители при пониженном давлении. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент EtOAc/CyH, 1:5) получают метиловый эфир 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1H-индол-5''-ил)фенил)пропановой кислоты (5.3 г, 96%) в виде твердого желтого соединения. Т.пл.=92°С. Ry=0.25 (EtOAc/CyH, 1:5). ¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃, 25°С): δ = 2.39-2.44 (м, 2Н, CH₂), 2.85-2.91 (м, 2Н, CH₂), 3.52 (с, 3Н, OCH₃), 3.54 (с, 3Н, OCH₃), 3.83 (с, 3Н, NCH₃), 3.94 (с, 3Н, OCH₃), 3.95 (с, 3Н, OCH₃), 6.48 (д, J=3.1 Гц, 1Н, 3''-Н), 7.01 (дд, ⁴J=1.5 Гц, ³J=8.4 Гц, 1Н, 6''-Н), 7.09 (д, ³J=3.1 Гц, 1Н, 2''-Н), 7.36 (д, ³J=8.4 Гц, 1Н, 7''-Н), 7.40 (д, ⁴J=1.5 Гц, 1Н, 4''-Н). ¹³С ЯМР (75 МГц, CDCl₃, 25°С): δ = 28.9, 32.9, 33.5, 51.4, 60.9, 60.9, 61.0, 101.1, 109.0, 114.7, 121.5, 123.2, 127.3, 128.3, 129.2, 134.7 (2С), 136.0, 145.5, 150.2, 151.4, 172.9. ИК: □ = 966, 1013, 1050, 1082, 1170, 1194, 1257, 1323, 1396, 1411, 1445, 1460, 1734, 2931 см^-1. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 205 (26), 221 (26), 234 (25), 250 (34), 264 (21), 278 (26), 294 (41), 308 (100), 351 (18), 382 (61), 388 (9), 461 (56) [M⁺]. Масс-спектр высокого разрешения (EI): рассчитано для C₂₂H₂₄BrNO₅ [M]+ 461.0838; найдено 461.084.

Затем синтезируют 3-(2'-Бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1H-индол-5''-ил)фенил)пропановая кислоту. Для этого к раствору метилового эфира 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1H-индол-5''-ил)фенил)пропановой кислоты (5 г, 11.2 ммоль) в ТГФ/МеОН (2:1, 75 мл) медленно прибавляют 1н водный раствор LiOH (25 мл). Реакционную смесь перемешивают 1 ч при 50°С, после чего охлаждают до комнатной температуры, доводят до рН=6 действием 1 н водного раствора HCl, органические растворители удаляют при пониженном давлении. Остаток экстрагируют метал-трет-бутиловым эфиром (4×50 мл), объединенный органический слой промывают насыщенным водным раствором NaCl (3×50 мл) и сушат над MgSO₄. После удаления растворителя при пониженном давлении и проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент EtOAc/СуН, 1:2) получают 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1Н-индол-5''-ил)фенил)пропановая кислота (4.32 g, 89%) в виде бело-розового поликристаллического порошка. Т.пл. = 159°С. Ry=0.25 (EtOH/EtOAc/CyH, 1:1:7). ¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃, 25°С): δ = 2.38-2.43 (м, 2Н, CH₂), 2.78-2.89 (м, 2Н, CH₂), 3.50 (с, 3Н, OCH₃), 3.80 (с, 3Н, NCH₃), 3.92 (с, 3Н, OCH₃), 3.93 (с, 3Н, OCH₃), 6.44 (д, J=3.0 Гц, 1Н, 3''-Н), 6.97 (дд, ⁴J=1.4 Гц, ⁴J=8.4 Гц, 1Н, 6''-Н), 7.04 (д, ³J=3.0 Гц, 1Н, 2''-Н), 7.32 (д, ³J=8.4 Гц, 1Н, 7''-Н), 7.36 (д, ⁴J=1.4 Гц, 1Н, 4''-Н). ¹³С ЯМР (75 МГц, CDCl₃, 25°С): δ = 28.7, 32.9, 33.3, 60.9, 61.0, 61.1, 101.2, 109.1, 114.7, 121.5, 123.1, 127.2, 128.4, 129.2, 134.4, 134.8, 136.0, 145.6, 150.2, 151.5, 177.7. ИК: □ = 967, 1013, 1052, 1082, 1257, 1322, 1397, 1411, 1446, 1461, 1706, 2928 см^-1. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 194 (60), 205 (28), 221 (26), 236 (31), 250 (37), 264 (19), 278 (28), 294 (70), 309 (55), 338 (12), 353 (22), 373 (14), 388 (14), 447 (100) [М]⁺. Масс-спектр высокого разрешения (EI): рассчитано для C₂₁H₂₂BrNO₅ [M]⁺ 461.0681; найдено 447.068.

Синтез 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-оксоциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола (1а) осуществляют следующим образом.

3-(2'-Бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1Н-индол-6''-ил)фенил)пропановую кислоту (3 г, 6.70 ммоль) растворяют в безводном CH₃Cl₂ (25 мл) в атмосфере аргона. Раствор охлаждают до -10°С и прибавляют 1-хлоро-N,N,2-триметилпропениламин (0.93 мл, 7.04 ммоль). Реакционную смесь перемешивают 12 ч при 0°С. Полученный раствор разбавляют CH₂Cl₂ (335 мл) и добавляют ZnCl₂ (1.82 г, 13.4 ммоль) при 0°С. Температуру реакционной смеси медленно повышают до комнатной и смесь интенсивно перемешивают 2 ч. В реакционную смесь добавляют 100 мл насыщенного раствора NaHCO₃, органический слой отделяют, а водный слой экстрагируют CH₂Cl₂ (3×50 мл). Органический экстракт сушат над безводным MgSO₄, растворитель удаляют при пониженном давлении. Применяют колоночную хроматографию на силикагеле (элюент EtOAc/Су, 1:2) для выделения 1.15 г продуктов реакции в виде белого поликристаллического порошка. К 0.6 г полученного продукта, растворенного в безводном толуоле (5 мл) в атмосфере аргона, добавляют 2,2'-азоизобутиронитрил (0.17 г, 0.7 ммоль) и трибутилоловогидрид (0.38 мл, 1.4 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при кипячении в течение 4 ч и каждый час к смеси добавляют трибутилоловогидрид (3×(0.38 мл, 1.4 ммоль)). По завершении реакции реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и в колбу добавляют 50 мл насыщенного водного раствора KF и полученную суспензию интенсивно перемешивают в течение 1 ч. Водный слой отделяют, экстрагируют EtOAc (3×50 мл), органический слой сушат над MgSO₄, растворитель удаляют при пониженном давлении. При помощи колоночной хроматографии на смеси силикагель-KF (9:1 массовое отношение) (элюент EtOAc/Cy, 2:3) выделяют соединение 1а (0.09 г) в виде бесцветного поликристаллического порошка. Т.пл.=142°С. R_f=0.38 (EtOAc/Cy, 2:3). ¹H ЯМР (400 MHz, CDCl₃, 25°C): δ = 2.56-2.67 (м, 1Н, СН₂), 2.82-3.16 (м, 3Н, CH₂), 3.40 (с, 3Н, OCH₃), 3.83 (с, 3Н, NCH₃), 3.89 (с, 6Н, OCH₃), 6.61 (с, 1Н, 4-Н), 6.63 (дд, ³J=3.1 Hz, ⁵J=0.7 Hz, 1Н, 3'-Н), 7.12 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.41 (д, ³J=8.6 Hz, 1Н, 6'-Н), 7.45 (дд, ³J=8.6 Hz, ⁵J=0.7 Hz, 1Н, 7'Н). ¹³С ЯМР (101 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 30.20, 33.0, 49.3, 56.0, 60.8, 61.2, 101.2, 107.0, 111.4, 124.9, 125.5, 125.9, 126.2, 130.5, 130.6, 135.7, 136.2, 141.5, 152.4, 152.4, 207.0. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 194 (35), 206 (23), 220 (24), 234 (15), 251 (33), 266 (12), 276 (16), 293 (30), 307 (19), 322 (21), 336 (11), 351 (100) [М]⁺. Масс-спектр высокого разрешения (EI): вычислено для C₂₁H₂₁NO₄ [М]+ 351.1471; найдено 351.147.

Затем синтезируют 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндол (1b).

Для этого соединение 1а (0.34 г, 0.967 ммоль) растворяют в смеси ТГФ/МеОН (4:1, 12.5 мл). К полученному раствору медленно приливают Н₂О (2.5 мл) и прибавляют NaBH₄ (0.037 г, 0.967 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре, разбавляют водой (5 мл), органические растворители удаляют при пониженном давлении. После удаления растворителя при пониженном давлении получают 0.31 г (92%) соединения 1b в виде бесцветного поликристаллического порошка Т.пл.=133°С. R_f=0.4 (EtOAc/Cy, 1:1 В спектрах ЯМР зарегистрированных в CDCl₃ присутствуют два конформера с соотношением 5:3. Химические сдвиги для основного конформера: ¹H ЯМР (300 MHz, CDCl₃, 25°C): δ = 2.22-2.54 (м 4Н, CH₂), 3.58 (с, 3Н, OCH₃), 3.80 (с, 3Н, NCH₃), 3.90 (с, 3Н, OCH₃), 3.92 (с, 3 Н, OCH₃), 4.92-4.97 (м, 1Н, 7-Н), 6.59 (с, 1Н, 4-Н), 7.05 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 3'-Н), 7.10 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.27 (д, ³J=8.7 Hz, 1Н, 6'-Н), 7.34 (д, ³J=8.7 Hz, 1Н, 7'-Н). Химические сдвиги для не основного конформера: ¹H ЯМР (300 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 2.22-2.54 (м, 4Н, CH₂), 3.55 (с, 3Н, OCH₃), 3.81 (с, 3Н, NCH₃), 3.90 (с, 3Н, OCH₃), 3.92 (с, 3Н, OCH₃), 5.35-5.40 (м, 1Н, 7-Н), 6.53 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 3'-Н), 6.67 (с, 1Н, 4-Н), 7.06 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.31 (д, ³J=8.7 Hz, 1Н, 6'-Н), 7.43 (д, ³J=8.7 Hz, 1Н, 7'-Н). В ЯМР-спектрах, зарегистрированных в CD₃OD присутствует набор сигналов для одного конформера: ¹H ЯМР (300 MHz, CD₃OD, 25°С): δ = 2.18-2.49 (м, 4Н, CH₂), 3.51 (с, 3Н, OCH₃), 3.84 (с, 3Н, NCH₃), 3.90 (с, 3Н, OCH₃), 3.91 (с, 3Н, OCH₃), 4.80-4.86 (м, 1Н, 7-Н), 6.75 (с, 1Н, 4-Н), 7.10 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 3'-Н), 7.14 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.25 (д, ³J=8.5 Hz, 1Н, 6'-Н), 7.31 (д, ³J=8.5 Hz, 1Н, 7'-Н). ¹³С ЯМР (75 MHz, CD₃OD, 25°С): δ = 31.6, 32.9, 42.2, 56.6, 61.0, 61.6, 73.3, 103.0, 108.0, 108.9, 124.6 (d), 124.7, 126.0, 127.8, 129.2, 134.7, 137.5, 138.6, 142.1, 151.7, 153.4. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 191 (16), 206 (15), 218 (13), 234 (14), 250 (13), 264 (9), 278 (13), 293 (19), 309 (9), 324 (11), 335 (11), 353 (100) [М⁺]. Масс-спектр высокого разрешения (EI): вычислено для C₂₁H₂₃NO₄ [M]⁺ 353.1627; найдено 353.162.

Затем синтезируют 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-азидоциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндол (1с).

Для этого к суспензии соединения 1b (0.250 г, 0.708 ммоль), Zn(N₃)₂·2Py (0.164 г, 0.531 ммоль) и трифенилфосфина (0.371 г, 1.416 ммоль) в безводном толуоле (3 мл) по каплям добавляют диизопропилазодикарбоксилат (0.28 мл, 0.202 ммоль). После перемешивания в течение 0.5 ч при комнатной температуре реакционную смесь разбавляют EtOAc, фильтруют через Селит и растворитель удаляют при пониженном давлении. При помощи колоночной хроматографии на силикагеле (элюент EtOAc/Cy, 1:5) выделяют 0.24 г (89%) продукта 1с в виде бесцветного масла R_f=0.43, R_f=0.48 (EtOAc/Cy, 1:5). В спектрах ЯМР зарегистрированных в CDCl₃ присутствуют два конформера с соотношением 5:3. Химические сдвиги для основного конформера: ¹Н ЯМР (300 MHz, CDCl₃ 25°С): δ = 2.15-2.55 (м, 4Н, CH₂), 3.61 (с, 3Н, OCH₃), 3.82 (с, 3Н, NCH₃), 3.90 (с, 3Н, OCH₃), 3.93 (с, 3Н, OCH₃), 4.75-4.84 (м, 1Н, 7-Н), 6.60 (с, 1Н, 4-Н), 7.06-7.11 (м, 2Н, 3'-Н, 6'-Н), 7.31-7.39 (м, 2Н, 2'-Н, 7'-Н). Химические сдвиги для не основного конформера: ¹H ЯМР (300 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 2.15-2.55 (м, 4Н, CH₂), 3.58 (с, 3Н, OCH₃), 3.83 (с, 3Н, NCH₃), 3.90 (с, 3Н, OCH₃), 3.93 (с, 3Н, OCH₃), 5.36-5.42 (м, 1Н, 7-Н), 6.53 (д, ³J=3.1 Hz, 1Н, 3'-Н), 6.60 (с, 1Н, 4-Н), 7.08 (д, ³J=3.1 Hz, 1H, 2'-Н), 7.31 (д, ³J=8.4 Hz, 1H, 6'-Н), 7.49 (д, ³J=8.4 Hz, 1H, 7'-Н). Химические сдвиги в ¹³С ЯМР спектре приведены для смеси конформеров: ¹³С ЯМР (75 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 30.8, 31.0, 32.9, 33.0, 38.7, 38.8, 55.9, 56.0, 60.1, 60.7, 60.8, 61.1, 62.7, 98.2, 101.0, 107.4, 107.5, 108.0, 108.6, 124.0, 124.2, 125.0, 125.9, 126.7, 127.0, 127.6, 128.2, 128.7, 128.9, 129.1, 135.0, 135.6, 136.8, 141.2, 150.9, 151.0, 152.1, 152.4. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 193 (26), 206 (23), 221 (18), 234 (13), 249 (15), 264 (16), 277 (17), 291 (23), 307 (66), 320 (9), 335 (100), 350 (9), 378 (22) [М]⁺. Масс-спектр высокого разрешения (EI): вычислено для C₂₁H₂₂N₄O₃ [M⁺] 378.1692; найдено 378.169.

Затем синтезируют 1',2',3'-гриметоксибеизо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-ацетамидоциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндол (1d).

Для этого 1 М раствора LiAlH₄ в Et₂O (0.28 мл, 0.28 ммоль) прибавляют по каплям к соединению 1с (0.07 г, 0.185 ммоль) в ТГФ (1 мл). После перемешивания в течение 24 ч к реакционной смеси последовательно прибавляют воду (5 мл) и 2 М водного раствора NaOH (5 мл). Водную фазу экстрагируют метилтрет-бутиловым эфиром (3×15 мл), органический экстракт сушат над MgSO₄ и растворитель удаляют при пониженном давлении. Полученный продукт растворяют в CH₂Cl₂ (1 мл) и прибавляют к раствору пиридин (0.06 мл, 0.74 ммоль) и уксусный ангидрид (0.06 мл, 0.64 ммоль). Реакцию проводят в атмосфере аргона. Через 0.5 ч к реакционной смеси добавляют воду (10 мл), органический слой отделяют, а водный слой экстрагируют CH₂Cl₂ (3×15 мл). Органический экстракт промывают 10% раствором HCl (10 мл) и насыщенным раствором NaCl (10 мл), сушат над MgSO₄ легколетучие продукты удаляют при пониженном давлении. При помощи колоночной хроматографии на силикагеле (элюент CH₂Cl₂/МеОН, 20:1) выделяют 0.063 г (87%) получают соединение 1d в виде бесцветных кристаллов. Т.пл.=175°С. R_f=0.30, R_f=0.33 (CH₂Cl₂/MeOH, 30:1). В ЯМР спектрах, зарегистрированных в CDCl₃ присутствуют два набора сигналов с соотношением 5:1. Химические сдвиги для основного конформера: ¹H ЯМР (600 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 1.56 (с, 3Н, С(О)CH₃), 2.64-2.25 (м, 4Н), 3.56 (с, 3Н, OCH₃), 3.80 (с, 3Н, NCH₃), 3.92 (с, 6Н, OCH₃), 5.75 (м, 1Н, 7-Н), 6.67 (с, 1Н, 4-Н), 6.71 (д, J=2.9 Hz, 1Н, 3'-Н), 7.07 (д, J=2.9 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.30 (д, ³J=8.5 Hz, 1Н), 7.37 (д, ³J=8.5 Hz, 1Н, 7'-Н). ¹³С ЯМР (150 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 23.3, 31.2, 33.0, 40.9, 47.7, 56.1, 60.4, 61.2, 99.3, 108.0, 108.1, 124.9, 125.2, 126.9, 127.3, 129.0, 131.0, 136.0, 136.4, 141.4, 151.1, 152.5, 168.2. Химические сдвиги для не основного конформера: ¹H ЯМР (600 MHz, CDCl₃, 25°С): δ = 1.24 (с, 3Н, С(О)CH₃), 2.64-2.25 (м, 4Н), 3.49 (с, 3Н, OCH₃), 3.78 (с, 3Н, OCH₃), 3.88 (с, 3Н, NCH₃), 3.93 (с, 3Н, OCH₃), 5.00 (м, 1Н, 7-Н), 6.56 (с, 1Н, 4-Н), 6.63 (д, J=2.5 Hz, 1Н, 3'-Н), 7.04 (д, J=2.5 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.25 (д, ³J=8.4 Hz, 1Н), 7.35 (д, ³J=8.4 Hz, 1Н, 7'-Н. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 193 (28), 206 (31), 219 (20), 234 (26), 248 (14), 262 (21), 277 (32), 290 (19), 305 (60), 320 (52), 335 (63), 394 (100) [М⁺]. Масс-спектр высокого разрешения (EI): вычислено для C₂₃H₂₆H₂O₄ [М]⁺ 394.1892; найдено 394.189.

Биологические испытания.

Заявляемые производные 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола были испытаны с целью определения их активности при ингибировании пролиферации опухолевых клеток, апоптозиндуцирующей активности, а также неспецифической токсичности по отношению к клеточной линии лимфомы Беркитта BJAB.

Клетки BJAB культивировали на питательной среде RPMI 1640 (GIBCO, Invitrogen, Karlsruhe, Germany) с добавлением 10% (по объему) инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 0.56 г/л L-глутамина, 100,000 I.U. пенициллина и 0.1 г/л стрептомицина. Клетки пассировали 2 раза в неделю. За 24 ч до анализа количество клеток доводили до концентрации 3×10⁵ клеток/мл для стандартизации условий роста. Для оценки пролиферации и апоптоза клетки разводили до количества 1×10⁵ клеток/мл непосредственно перед воздействием соответствующими соединениями.

Оценка выхода лактатдегидрогеназы (ЛДГ): измерение неспецифичесой цитотоксичности:

Цитотоксичность различных соединений измеряли по выходу ЛДГ с использованием стандартного набора реактивов фирмы Boehringer Mannheim® {Mannheim, Germany). За 100% клеточной гибели принимали максимальную активность фермента ЛДГ, вышедшего в среду инкубации при лизисе клеток 0.1% Тритоном Х-100. Оценка пролиферации: определение количества клеток и клеточной выживаемости:

Выживаемость клеток определяли с использованием системы для подсчета и анализа клеток CASYR (Reutlingen, Germany). Система была настроена под используемые клетки. Система позволяет определять одновременно 3 группы клеток: клеточные остатки, мертвые клетки и живые клетки. Клетки рассеивали в концентрации 1×10⁵ на 1 мл и добавляли различные концентрации аналогов колхицина; клетки, не подвергавшиеся воздействию, служили контролем. После инкубации в течение 24 ч клетки ресуспендировали в полной среде, и 100 мкл каждого образца тщательно разводили в 10 мл CASYRтонa (готового к использованию изотонического раствора) для последующего подсчета клеток. Ингибирование пролиферации представляли как показатель IC₅₀, который означает концентрацию соединения, вызывающую снижение числа живых клеток на 50%. Концентрацию клеток 2×10⁵ клеток/мл принимали за 100%.

Оценка апоптоза: измерение уровня фрагментации ДНК:

Апоптотическую гибель клеток определяли методом анализа клеточного цикла, который детектирует фрагменты ДНК на уровне единичной клетки. Клетки рассеивали в количестве 1×10⁵ клеток/мл и добавляли различные концентрации аналогов колхицина. После инкубации в течение 72 ч при температуре 37°С клетки центрифугировали на 150 об/мин в течение 5 мин, отмывали фосфатным буфером (PBS) при 4°С и фиксировали смесью PBS и 2% формальдегида (1:1 по объему) на льду в течение 30 мин. Затем клетки осаждали, инкубировали с раствором этанола и PBS (2:1 по объему) 15 мин, снова осаждали и ресуспендировали в PBS, содержащем 40 мкг/мл рибонуклеазы (RNase). РНК расщепляли в течение 30 мин при температуре 37°С, после чего клетки опять осаждали и ресуспендировали в PBS, содержащем 50 мкг/мл пропидий йодида. Фрагментация ядерной ДНК количественно оценивалась с помощью проточной цитометрии по гиподиплоидной ДНК. Сбор и анализ данных производился на приборе FACScalibur (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany) с программным обеспечением CellQuest. Данные представляли в виде процента гипоплоидии (subG1), который отражает число апоптотических клеток. Уровень апоптоза оценивали по показателю АС₅₀, который означает апоптоз 50% клеток.

Результаты биологических испытаний представлены в Таблице 1. Из таблицы 1 видно, что соединения 1а-с не вызывают некроз опухолевых клеток BJAB в концентрации 100 мкМ (по данным оценки выхода лактатдегидрогеназы). Соединение 1d вызывает некроз не более 4% опухолевых клеток BJAB в концентрации 100 мкМ. Это означает, что соединения 1a-d не проявляют неспецифической токсичности по отношению к BJAB клеткам в концентрациях, значительно превышающих терапевтические.

Приведенные данные демонстрируют, что заявляемые производные 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола обладают более высокими значениями активности при ингибировании пролиферации опухолевых клеток, большими значениями апоптозиндуцирующей активности и меньшей неспецифической токсичностью по сравнению с колхицином.

Заявляемые производные 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола могут быть использованы для лечения онкологических заболеваний, связанных с неоваскуляризацией новообразований. Это относится, в частности, к лимфомам, к солидным (твердым) опухолям типа карцином и аденокарцином молочной железы, раку легких и т.д. Кроме того, они могут применяться в терапии в сочетании с другими химиотерапевтическими препаратами, а также после хирургических операций и при облучении.

Применение предложенных производных 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндолов в качестве активного компонента лекарственного средства для лечения онкологических заболеваний обеспечивает повышение апоптозиндуцирующей активности и активности при ингибировании пролиферации опухолевых клеток, снижение неспецифической токсичности.

Изобретение относится к новому производному 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола формулы:

где Х означает О, ОН, N₃, NHAc, который может быть использован в качестве активного компонента противоопухолевого лекарственного средства. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола общей формулы:
,
где Х - заместитель, Х= =O, -ОН, N₃, NHAc.

2. Производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола по п.1, отличающееся тем, что при Х= =O производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-оксоциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндол.

3. Производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола по п.1, отличающееся тем, что при Х=ОН производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндол.

4. Производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола по п.1, отличающееся тем, что при Х=N₃ производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-азидоциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндол.

5. Производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола по п.1, отличающееся тем, что при X=NHAc производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-ацетамидоциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндол.

6. Применение производного 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола по пп.1-5 в качестве активного компонента противоопухолевого лекарственного средства.