СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЕМКОСТИ ОПТИЧЕСКИМ МЕТОДОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА С ПРОИЗВОДНЫМИ БИПИРИДИНА Российский патент 2025 года по МПК G01N21/29 

Настоящее изобретение относится к области оптических методов анализа, в частности к определению концентрации аналита в пробе, конкретно для анализа суммарной антиоксидантной емкости различных объектов: продуктов питания, объектов фармации, а также контроля состава сырья, пищевых продуктов и объектов фармации, содержащих вещества с антиоксидантным действием.

В условиях техногенного развития общества, ухудшения экологической ситуации, роста патологических состояний населения оценка содержания антиоксидантов в различных объектах становится все более востребованной, особенно при диагностике, профилактике и лечении заболеваний, связанных с окислительным действием активированных кислородных метаболитов в организме человека. Поскольку главной задачей современной химии, инженерии и медицины является переход к миниатюризации устройств, важным является разработка простых, информативных и универсальных способов определения антиоксидантной емкости, простых в изготовлении, с возможностью использования in site, у постели больного, к которым можно отнести колориметрические способы и устройства для полуколичественной оценки суммарной концентрации антиоксидантов в различных объектах или антиоксидантной емкости. Полуколичественные оптические способы определения антиоксидантной емкости обладают важными преимуществами – простота и экспрессность анализа, доступность материалов и реагентов, производственная масштабируемость и универсальность.

Известны изобретения, представляющие способы определения содержания антиоксидантов с использованием оптических сенсоров, включающих реагент неокупроин меди (II) (Cu(II)-Nc)[Патент US 20120276645 A1 от 1.11.2012, приоритет от 28.04.2011] ихромогенный окислитель Fe(III)-о-фенантролина (Fe(III)-phen) [Ferric-o-phenanthroline adsorbedon a Nafion membrane: A novel optical sensor for antioxidant capacity measurement of food extracts / M. Benera, R. Apak // Sensor sand Actuators B: Chemical. - V. 247. - 2017. - pp. 155-162], иммобилизованные на полимерной катионообменной мембране Нафион. В присутствии антиоксиданта происходит восстановление модельных окислителей Cu(II) до Cu(I), при этом на мембране образуется окрашенный желто-оранжевый комплекс Cu(I)-Nc (λ_max=450 нм), и Fe(III) до Fe(II) с образованием оранжево-красного комплекса Fe(II)-phen(λ_max=510 нм). Регистрацию оптической плотности в обоих случаях проводят с использованием лабораторного прибора спектрофотометра или специального программного обеспечения. В качестве модельного антиоксиданта используют тролокс. Определение содержания антиоксидантов с использованием сенсоров проводят в водно-этанольной или водно-метанольной средах.

К недостаткам данных способов можно отнести сложность изготовления и длительное время подготовки сенсора, к которой относится выдерживание в течение 30 минут мембраны Нафион в растворе модельного окислителя при постоянном перемешивании для равномерного распределения окислителя на мембране; длительность самого анализа из-за физической диффузии антиоксиданта к поверхности мембраны, а также возможных стерических затруднениях, вызванных наличием объемных заместителей в молекуле антиоксидантов, например, полифенолов, и иммобилизованным окислителем, замедляющим перенос электрона, в результате чего на практике необходимо выдерживать сенсор в растворе определяемого вещества в течении 30 минут при постоянном перемешивании. Использование лабораторного оборудования для регистрации оптической плотности сенсора ограничивает использование таких сенсоров in site вне специализированной лаборатории. Кроме того, применение катионообменной мембраны Нафион усложняет определение соединений, находящихся в растворе в анионной форме, например, аскорбиновой кислоты, в результате чего значения ТЕАС, полученные с использованием сенсора, могут быть в 2 раза ниже значений, полученных в растворе.

В литературе известен способ определения антиоксидантной емкости с использованием устройства на бумажной основе, изготовленного методом ламинирования, в качестве реагента выбран стабильный радикал 2,2-дифенил-1-(2,4,6-тринитрофенил)гидразила (DPPH) [Paper-based DPPH AssayforAntioxidantActivityAnalysis / K. Sirivibulkovit, S. Nouanthavong, Y. Sameenoi // Analytical Sciences. - V. 34. - 2018. - pp. 795-800]. Устройство состоит из 3 слоев. Средний слой, состоящий из фильтровальной бумаги Whatman №4 размером 1×1 см, ламинируют, оставляя круглые тестовые зоны диаметром 5 мм, в которые добавляют реагент DPPH. При введении антиоксиданта в тестовую зону происходит ингибирование DPPH^•-радикалов, что приводит к изменению цвета от темно-фиолетового до бледно-желтого. Содержание антиоксидантов рассчитывается обратно пропорционально интенсивности фиолетовой окраски DPPH. В качестве модельного антиоксиданта выбрана галловая кислота.

Недостатком предложенного способа является сложность и многостадийность изготовления бумажного устройства, что затрудняет его производственное масштабирование и широкое распространение, а также длительность процедуры анализа, поскольку при добавлении антиоксиданта в тестовую зону необходимо 30-минутное выдерживание устройства в темном месте для достижения полноты протекания реакции. Определение содержания антиоксидантов в данной работе проводили с использованием программного обеспечения, для регистрации окраски устройства в работе использовали офисный сканер. В данном случае изменение устройства для регистрирования окраски, например, на камеру смартфона или фотоаппарат, могут внести погрешность в результат анализа ввиду различий в настройках камеры и характеристиках самих устройств, а также значительное влияние на передачу цвета будет влиять освещение помещения.

Наиболее близким решением является способ определения антиоксидантной емкости с использованием оптической тест-системы для экспрессной оценки содержания антиоксидантов в пищевых продуктах и объектах фармации с использованием комплекса железа с 2,2'-бипиридином [Тест-системы для экспрессной оценки содержания антиоксидантов в пищевых продуктах и объектах фармации / Е.Р. Газизуллина // Магистерская диссертация. ФГАОУ ВО УрФУ им. Б.Н. Ельцина - 83 с., 2022].

Тест-система состоит из сенсора на бумажной основе, пропитанного реагентом Fe(III)-bipy, расположенного в пластиковом корпусе. При добавлении на сенсор пробы, содержащей антиоксиданты, наблюдается появление розовой окраски за счет образования комплекса Fe(II)-bipy. Для полуколичественного определения антиоксидантной емкости окраску сенсора сравнивают с калибровочной полоской, представляющей шкалу зависимости степени окраски сенсора от концентрации добавленного модельного антиоксиданта. Анализ проводится в смеси ацетатного буфера рН 3.6 и этанола в соотношении 1:3.

В выбранных условиях анализа полифенолы способны хелатировать ионы металлов переменной валентности, в том числе ионы железа, образуя окрашенные комплексные соединения от желтого до зеленого цвета, что может внести искажение в результат анализа. Кроме того, комплекс Fe(III)-bipy имеет низкую константу устойчивости, что может повлиять на воспроизводимость результатов анализа, а также на стабильность комплекса при хранении. Использование низких рН сужает круг анализируемых объектов.

Таким образом, общей проблемой существующих способов определения антиоксидантной емкости различных объектов является сложность и многостадийность изготовления сенсоров и устройств, используемых для оценки антиоксидантной емкости, необходимость в лабораторном оборудовании или специальном программном обеспечении для регистрации изменения интенсивности окраски реагента, а также длительное время анализа и наличие побочных реакций, усложняющих интерпретацию результата.

Техническим решением настоящего изобретения является получение достоверной качественной и количественной информации об антиоксидантной емкости различных объектов с использованием оптического способа.

Преимуществом данной работы является экспрессность анализа, время анализа не превышает 3 минут, отсутствие стадии подготовки сенсора к анализу, простота изготовления устройства, простота анализа, производственная масштабируемость, возможность проведения анализа в широком диапазоне рН от 3,6до 9 рН, возможность использования различных органических растворителей, таких как этанол, ацетон, ацетонитрил и их смесей, что значительно увеличивает круг анализируемых объектов. Использование нейтральных сред и органических растворителей позволяет выбрать условия анализа, при которых можно значительно снизить образование комплексов железа с полифенолами образца, имеющие окраску от желтого до зеленого цвета и вносящие искажение в результат анализа. Используемый для анализа пластиковый корпус позволяет размещать от одного до четырех сенсоров одновременно, что дает возможность проведения анализа сразу в четырех параллелях, либо четырех объектов одновременно. Предел обнаружения составил 1 мкМ. Минимальный объем анализируемого образца составляет 20 мкл. Результат анализа - антиоксидантная емкость оценивается по калибровочной полоске, без использования специализированного лабораторного оборудования, программного обеспечения и дополнительных устройств для оценки степени окраски сенсора.

Решение задачи достигается использованием комплексов железа с направленно функционализированными производными бипиридина в качестве модели окислителя. Комплексы имеют сопоставимые константы устойчивости как с Fe(II), так и с Fe(III). Условная константа устойчивости комплекса в зависимости от производного варьируется от 3.80·10²⁰ до 8.15·10²⁰, что выше, чем константа устойчивости Fe(II)-bipy(Условная константа устойчивости=1·10¹⁸).Fe(II) с производными бипиридина образуют окрашенные комплексы с высокими молярными коэффициентами светопоглощения (Молярный коэффициент светопоглощения = (15.21-18.38)·10³ л/моль·см), что позволяет проводить анализ с высокой точностью. Проведение анализа в органических растворителях и смесях органических растворителей, таких как этанол, ацетонитрил, ацетон позволяют выбрать условия, при которых возможно значительно уменьшить образование комплекса железа с полифенолами образца и, тем самым, нивелировать возникновение дополнительной окраски.

Пластиковый корпус с четырьмя отделениями для размещения бумажных сенсоров позволяет проводить анализ сразу в четырех параллелях, или проводить анализ четырех объектов одновременно, что ускоряет процедуру анализа.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что определение антиоксидантной емкости объектов проводят оптическим методом с использованием бумажного сенсора, находящегося в пластиковом корпусе, на который приливаю треагент, содержащий комплекс Fe(III) c производными бипиридина и объект анализа. Для полуколичественного определения антиоксидантной емкости окраску сенсора после реакции сравнивают с окраской калибровочной полоски (Фиг. 1).

Бумажный сенсор представляет бумагу для хроматографии размером 5×20 мм, пропитанную реагентом - комплексом Fe(III) с производным бипиридина. Сенсор располагается в пластиковом корпусе 40×18 мм, сконструированный в программе Tinkercad, напечатанный по технологии SLA LCD из фотополимерной смолы на 3d-принтере, состоящий из 4 отделений (Фиг. 1. I).

При добавлении объекта анализа, содержащего антиоксиданты, на сенсор происходит восстановление Fe(III) до Fe(II) антиоксидантами образца, образуется ярко окрашенный комплекс Fe(II) с производным бипиридина (Фиг. 1. II).

Для полуколичественного определения антиоксидантной емкости разработана калибровочная полоска (Фиг. 1.III), представляющая шкалу зависимости степени окраски сенсора от концентрации добавленного модельного антиоксиданта. В качестве модельного антиоксиданта выбрана аскорбиновая кислота.

Калибровочную полоску изготавливали следующим образом: на пропитанную реагентом под ложку из бумаги для хроматографии были нанесены растворы модельного антиоксиданта в диапазоне концентраций (1·10^-6 - 3·10^-3) М. Окраска полосок зафиксирована полупрофессиональной камерой. Обработку цвета проводили с использованием программы Adobe Photoshop (Фиг. 2).

Для упрощения интерпретации результатов анализа были определены диапазоны концентраций, соответствующие низкому (С_АО<1⋅10^-4 М), среднему (С_АО=1⋅10^-4-1⋅10^-3 М) и высокому содержанию антиоксидантов (С_АО>1⋅10^-3М). Диапазоны концентраций были выбраны на основании литературных данных и результатов лабораторных исследований.

Необходимый объем пробы для анализа варьируется от 10 до 40 мкл. Предел обнаружения и определения АОЕ составил 1мкМ.

На фиг. 1 представлена схема проведения анализа с использованием тест-системы.

На фиг. 2 приведена схема калибровочной полоски.

На фиг. 3 представлена схема определения антиоксидантной емкости 0,1 мМ раствора галловой кислоты (реагент 1мМ комплекс Fe(III) и 4-(3-бромофенил)-1-(пиридин-2-ил)-6,7-дигидро-5Н-циклопента[с]пиридина).

На фиг. 4 представлена схема определения антиоксидантной емкости водно-ацетонитрильного настоя специи «Орегано» (реагент 1мМ комплекс Fe(III) и 4-(2-бромофенил)-1-(пиридин-2-ил)-6,7-дигидро-5Н-циклопента[с]пиридина).

На фиг. 5 приведена схема определения антиоксидантной емкости 0,1 мМ раствора кверцетина (реагент 1мМ комплекс Fe(III) и 4-(4-хлорфенил)-1-(пиридин-2-ил)-6,7-дигидро-5Н-циклопента[с]пиридина).

На фиг. 6 представлена схема определения антиоксидантной емкости раствора витаминного препарата «Ундевит» (реагент 5мМ комплекс Fe(III)и 2-(2-(2-(4-(2,2'-бипиридин-5-ил)фенокси)этокси)этокси)этанола).

На фиг. 7 приведена схема синтеза производных бипиридина.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Определение антиоксидантной емкости 0,1 мМ раствора галловой кислоты проводили следующим образом: для подготовки сенсора на полоску из бумаги для хроматографии размером 5×20мм, расположенную в пластиковом корпусе, наносили50 мкл1мМ раствора реагента, состоящего из комплекса Fe(III) и 4-(3-бромофенил)-1-(пиридин-2-ил)-6,7-дигидро-5Н-циклопента[с]пиридина в соотношении 1:3, растворенного в смеси ацетон - ацетонитрил 4:1. Далее приливали20 мкл 0,1 мМ раствора галловой кислоты. Наблюдалось изменение окраски сенсора от белого до розового цвета (Фиг. 3). Для количественного определения антиоксидантной емкости раствора окраску сенсора сравнивали с калибровочной полоской. В качестве модельного антиоксиданта выбрана аскорбиновая кислота. Значение антиоксидантной емкости составило 1⋅10^-4 моль-экв АК/дм³.

Пример 2

Определение антиоксидантной емкости настоя специи орегано проводили следующим образом: для подготовки сенсора на полоску из бумаги для хроматографии размером 5×20 см, расположенной в пластиковом корпусе, наносят 50 мкл 1мМ раствора реагента, состоящего из комплекса Fe(III) и 4-(2-бромофенил)-1-(пиридин-2-ил)-6,7-дигидро-5Н-циклопента[с]пиридина в соотношении 1:3, растворенного в смеси ацетон - ацетонитрил 1:4. В качестве объекта анализа использовали водно-ацетонитрильный настой специи «Орегано» (KotanyiGmbH, Австралия). Для приготовления настоя 1 грамм предварительно измельчённого в ступке сырья настаивали 1 час в 20 мл смеси вода-ацетонитрил в соотношении 1:1. 40 мкл раствора приливали на сенсор, при этом наблюдается изменение окраски сенсора от белого до малинового цвета (Фиг. 4). Для количественного определения антиоксидантной емкости раствора окраску сенсора сравнивали с калибровочной полоской. В качестве модельного антиоксиданта использовали аскорбиновую кислоту. Значение антиоксидантной емкости составило 3·10^-4 моль-экв АК/дм³, что соответствует среднему содержанию антиоксидантов.

Пример 3

Определение антиоксидантной емкости 0,1 мМ раствора кверцетина проводили следующим образом: для подготовки сенсорана полоску из бумаги для хроматографии размером 5×20 мм, расположенной в планшете, наносят 50 мкл 5мМ раствора реагента, состоящего из комплекса Fe(III) и 4-(4-хлорфенил)-1-(пиридин-2-ил)-6,7-дигидро-5Н-циклопента[с]пиридина в соотношении 1:3, растворенного в ацетонитриле. 40 мкл раствора кверцетина приливали на сенсор, при этом наблюдалось изменение окраски сенсора от белого до розового цвета (Фиг. 5). Для количественного определения антиоксидантной емкости раствора окраску сенсора сравнивали с калибровочной полоской. В качестве модельного антиоксиданта использовали аскорбиновую кислоту. Значение антиоксидантной емкости составило 1·10^-4 моль-экв АК/дм³.

Пример 4

Определение антиоксидантной емкости витаминного препарата «Ундевит» проводили следующим образом: для подготовки сенсора на полоску из бумаги для хроматографии размером 5×20 см, расположенной в пластиковом корпусе, наносят 50 мкл5мМ раствора реагента, состоящего из комплекса Fe(III) и 2-(2-(2-(4-(2,2’-бипиридин-5-ил)фенокси)этокси)этокси)этанола в соотношении 1:3, растворенный в этаноле. Пробоподготовку витаминного препарата «Ундевит» (АО «Фармстандарт»), содержащий антиоксиданты разной липофильности аскорбиновую кислоту и α-токоферол, проводили следующим образом: 1 драже растирали в ступке, порошок переносили в мерную колбу и растворяли в 50 мл смеси этанол-дистиллированная вода1:1. 40 мкл раствора приливали на сенсор, при этом наблюдается изменение окраски сенсора от белого до винно-красного цвета (Фиг. 6). Для количественного определения антиоксидантной емкости раствора окраску сенсора сравнивали с калибровочной полоской. В качестве модельного антиоксиданта использовалась аскорбиновая кислота. Значение антиоксидантной емкости составило 3⋅10^-3 моль-экв АК/дм³, что соответствует высокому содержанию антиоксидантов.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Для подтверждения возможности осуществления изобретения приводится способ получения направленно функционализированных производных бипиридина.

Графически схема синтеза представлена на Фиг. 7.

Соединения 1a,b, 2a,b [Kozhevnikov V.N., Kozhevnikov D.N., Shabunina O.V., Rusinov V.L., Chupakhin O.N. Anefficientrouteto 5-(hetero)aryl-2,4'- and 2,2'-bipyridinesthroughreadilyavailable 3-pyridyl-1,2,4-triazines. Tetrahedron Lett., 2005, Vol. 46, P. 1791-1793. doi 10.1016/j.tetlet.2005.01.135], 3a [Shabunina O.V., Kapustina D.Yu., Krinochkin A.P., Kim G.A., Kopchuk D.S., Zyryanov G.V., FiL., Chupakhin O.N. π-Extended fluorophore sbasedon 5-aryl-2,2’-bipyridines: synthesis and photophysical studies. Mendeleev Commun., 2017, Vol. 27, P. 602-604. doi 10.1016/j.mencom.2017.11.021] были синтезированы по описанным методикам.

Синтез 1,2,4-триазина 2с

Растворили гидразон 1с (485 мг, 2.0 ммоль), синтезированный по описанной для аналогичных соединений методике [Kozhevnikov V.N., Kozhevnikov D.N., Shabunina O.V., Rusinov V.L., Chupakhin O.N. Anefficientrouteto 5-(hetero)aryl-2,4'- and 2,2'-bipyridinesthroughreadilyavailable 3-pyridyl-1,2,4-triazines. Tetrahedron Lett., 2005, Vol. 46, P. 1791–1793. doi 10.1016/j.tetlet.2005.01.135] в этаноле (50 мл), добавили к раствору 2-пиридилкарбальдегид (0.19 мл, 2.0 ммоль) и выдерживали полученную смесь в течение 12 часов при комнатной температуре. Затем растворитель был удалён при пониженном давлении. К полученному остатку была добавлена ледяная уксусная кислота (15 мл) и полученная суспензия кипятилась в течение 5 мин. Затем растворители были удалены при пониженном давлении, к остатку был добавлен этанол (15 мл). Полученная суспензия была отфильтрована, осадок промыт этанолом (15 мл) и высушен. Полученный 1,2,4-триазин 2с был использован на следующей стадии без дополнительной очистки.

6-(3-Бромфенил)-3-(2-пиридил)-1,2,4-триазин (2с)

Жёлтый порошок. Выход 360 мг (1.15 моль, 57%). ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д.): 7.44-7.53 (м, 2H, H-5(Py), H-5(C₆H₄Br)), 7.70-7.74 и 8.09-8.24 (оба м, 1H, Н-4(C₆H₄Br) и Н-6(C₆H₄Br)), 7.96 (ддд, 1Н, ³J 7.6, 7.6 Гц, ⁴J 1.6 Гц, H-4(Py)), 8.35-8.40 (м, 1Н, Н-2(C₆H₄Br)), 8.73-8.78 (м, 1Н, Н-3(Py)), 8.89-8.93 (м, 1Н, Н-6(Py)), 9.17 (c, 1H, H-5). ESI-MS, m/z: найдено 313.01, вычислено 313.01 [М+Н]⁺.

Получение бипиридинов 3b,c

Смесь 1.0 ммоль соответствующего триазина 2b,c и 0.80 мл (5.0 ммоль) 1-(4-морфолин)циклопентена перемешивали при 200°C в отсутствие растворителя в атмосфере аргона в течение 2 ч. Затем добавили дополнительно 0.40 мл (2.5 ммоль) енамина и перемешивали смесь в тех же условиях 1 ч. Реакционную массу охладили до комнатной температуры, после чего очищали методом колоночной хроматографии (силикагель, элюент - смесь хлороформ: этилацетат (9:1), R_f = 0.7). Полученный продукт был перекристаллизован из этанола.

6,7-Дигидро-1-(2-пиридил)-4-(4-хлорфенил)-5H-циклопента[c]пиридин (3b)

Бежевый порошок. Выход 181.0 мг (0.59 моль, 59%). ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д.): 2.03-2.15 (м, 2Н, CH₂-6), 3.00 (т, 2Н, ³J 7.6 Гц, CH₂-7), 3.46 (т, 2Н, ³J 7.6 Гц, CH₂-5), 7.26-7.31 (м, 1Н, H-5(Py)), 7.39-7.49 (м, 4Н, С₆Н₄Cl), 7.82 (ддд, 1Н, ³J 7.6, 7.6 Гц, ⁴J 1.6 Гц, H-4(Py)), 8.17-8.22 (м, 1Н, H-3(Py)), 8.50 (c, 1H, H-3), 8.69-8.73 (м, 1Н, H-6(Py)). ESI-MS, m/z: найдено 307.10, вычислено 307.10 [М+Н]⁺. Найдено, %: C 74.50, H 5.02, N 9.25. Вычислено для C₁₉H₁₅ClN₂: C 74.38, H 4.93, N 9.13.

4-(3-Бромфенил)-6,7-дигидро-1-(2-пиридил)-5H-циклопента[c]пиридин (3c)

Бежевый порошок. Выход 196.0 мг (0.56 моль, 56%). ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д.): 2.05-2.15 (м, 2Н, CH₂-6), 3.02 (т, 2Н, ³J 7.6 Гц, CH₂-7), 3.46 (т, 2Н, ³J 7.6 Гц, CH₂-5), 7.26-7.32 (м, 1Н, H-5(Py)), 7.35 (дд, 1Н, ³J 7.6, 7.6 Гц, Н-5(C₆H₄Br)), 7.40-7.44 и 7.51-7.56 (оба м, 1Н, Н-4(C₆H₄Br) и Н-6(C₆H₄Br)), 7.64 (дд, 1Н, ⁴J 1.6, 1.6 Гц, Н-2 (C₆H₄Br)), 7.82 (ддд, 1Н, ³J 7.6, 7.6 Гц, ⁴J 1.6 Гц, H-4(Py)), 8.17-8.22 (м, 1Н, H-3(Py)), 8.50 (c, 1H, H-3), 8.69-8.73 (м, 1Н, H-6(Py)). ESI-MS, m/z: найдено 351.05, вычислено 351.05 [М+Н]⁺. Найдено, %: C 65.11, H 4.41, N 8.13. Вычислено для C₁₉H₁₅BrN₂: C 64.97, H 4.30, N 7.98.

Заявленные соединения представляет собой бежевое порошкообразное вещество, растворимые в метаноле, хлороформе, толуоле, частично растворимые в ацетонитриле и этаноле, нерастворимые в воде и гексане.

Синтез соединения 5 (5'-гидроксиметил-5-(4-хлорфенил)-2,2'-бипиридин)

Эфир 4 (750 мг, 2.3 ммоль) растворяли в смеси 60 мл этанола/хлороформа (8:1), добавляли NaBH₄ (437 мг, 11.6 ммоль), полученную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 8 часов. Затем добавляли дополнительную порцию NaBH₄ (219 мг, 5.8 ммоль) и полученную смесь кипятили с обратным холодильником еще 8 часов. К реакционной смеси добавляли воду (100 мл) и продукт 5 экстрагировали DCM (3 × 25 мл). Экстракт сушили безводным сульфатом натрия. Продукт 5 использовали на следующем этапе без дополнительной очистки (355 мг, 52%). ЯМР ¹H (500 MHz, CDCl₃) δ 4.82 (с, CH₂OH, 1H), 7.45-7.50 и 7.56-7.60 (оба м, C₆H₄Cl, 2H), 7.66 (дд, 3J 8.0 Hz, 4J 2.4 Hz, H-4'(Py), 1H), 7.98 (дд, 3J 8.4 Hz, 4J 2.4 Hz, H-4(Py), 1H), 8.43 (д, 3J 8.0 Hz, H-3'(Py), 1H), 8.47 (дд, 3J 8.4 Hz, 4J 0.6 Hz, H-3(Py), 1H), 8.68 (д, 4J 2.4 Hz, H-6'(Py), 1Н), 8.80 (д, 4J 2.4 Hz, H-6(Py), 1Н). ESI-MS вычислено для (C₁₇H₁₃ClN₂O) [M+H]⁺: 297.08, найдено: 297.08.

Синтез соединения 6 (5-(4-хлорфенил)-2,2'-бипиридин-5'-карбальдегид)

Гидроксиметил бипиридин 5 (162 мг, 0.55 ммоль) растворяли в 1,2-дихлорэтане (40 мл). К полученному раствору добавляли активированный MnO₂ (475 мг, 5.5 ммоль), полученную смесь перемешивали с обратным холодильником в течение 24 часов. Затем полученную суспензию отфильтровывали, растворитель удаляли при пониженном давлении, получая соответствующий альдегид 6. Продукт очищали колоночной хроматографией (силикагель, элюент - смесь хлороформ: этилацетат (9:1), Rf = 0.7). Аналитический образец перекристаллизовывали из этанола (105 мг, 65%).ЯМР ¹H (500 MHz, CDCl₃) δ 7.47-7.51 (м, C₆H₄Cl, 2H), 7.58-7.62 (м, C₆H₄Cl, 2H), 8.03 (дд, 3J 8.4 Hz, 4J 2.4 Hz, H-4'(Py), 1H), 8.31 (дд, 3J 8.0 Hz, 4J 2.0 Hz, H-4(Py), 1H), 8.59 (д, 3J 8.0 Hz, H-3(Py), 1H), 8.65 (д, 3J 8.4 Hz, H-3'(Py), 1H), 8.93 (д, 4J 2.0 Hz, H-6(Py), 1Н), 9.14 (д, 4J 2.4 Hz, H-6'(Py), 1Н), 10.18 (с, COH, 1H). ЯМР 13C (100 MHz, CDCl₃) δ 121.3, 122.2, 128.4, 129.5, 131.1, 134.9, 135.2, 135.7, 136.4, 136.9, 147.8, 151.7, 153.8, 160.3, 190.5. ESI-MS вычислено для (C₁₇H₁₁ClN₂O) [M+H]⁺: 295.06, найдено: 295.06. Найдено, %: C 69.39, H 3.87, N 9.38. Вычислено для C₁₉H₁₅BrN₂: C 69.28, H 3.76, N 9.50.

Синтез соединения 8 (5-(4-гидроксифенил)-2,2'-бипиридин)

Смесь бипиридина7 (745 мг, 3.0 ммоль) и гидрохлорида пиридина (3467 мг, 30.0 ммоль) перемешивали при 200°С в отсутствие растворителя в атмосфере аргона в течение 2 часов. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры и к остатку добавляли воду (70 мл). Полученное твердое вещество фильтровали и промывали водой. Сырой продукт использовали непосредственно на следующей стадии без дополнительной очистки (497 мг, 67%). ЯМР ¹H (400 MHz, CDCl₃) δ 5.76 (бр. с, OH, 1H), 6.93-7.00 (м, C₆H₄OH, 2H), 7.30-7.35 (м, H-5', 1H), 7.51-7.57 (м, C6H4OH, 2H), 7.84 (ддд, 3J 7.6, 7.6 Hz, 4J 1.6 Hz, H-4', 1H), 7.97 (дд, 3J 8.0 Hz, 4J 2.4 Hz, H-4, 1H), 8.40-8.45 (м, H-3, H-3', 2H), 8.68-8.72 (м, H-6', 1H), 8.68-8.72 (м, H-6, 1H). ЯМР 13C (100 MHz, CDCl₃) δ 116.3, 121.3 (2C), 123.7, 128.4, 129.5, 134.8, 136.4, 137.2, 147.1, 149.2, 154.0, 155.9, 156.8. ESI-MS вычислено для (C₁₆H₁₂N₂O) [M+H]⁺: 249.10, найдено: 249.10.

Синтез соединения 9 (2-(2-(2-(4-(2,2'-бипиридин-5-ил)фенокси)этокси)этокси)этанол)

Смесь бипиридина 8 (479 мг, 1.93 ммоль) и Tos-PEG3-ОН (705 мг, 2.32 ммоль) растворяли в безводном ДМФ (40 мл). К раствору добавляли карбонат калия (1333 мг, 9.65 ммоль) и йодид калия (320 мг, 1.93 ммоль) и полученную смесь перемешивали при 120°C в течение 16 часов. Затем растворитель удаляли при пониженном давлении. К остатку добавляли воду (50 мл) и хлороформ (50 мл), органический слой сушили над безводным Na₂SO₄, растворитель удаляли при пониженном давлении. Продукт выделяли колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя сначала смесью 10% этилацетата и 90% хлороформа, затем этилацетатом (Rf = 0,4). Аналитический образец продукта получали перекристаллизацией из этанола (337 мг, 46%).ЯМР ¹H (500 MHz, CDCl₃) δ 2.31 (т, 3J 6.0 Hz, OH, 1H), 3.62-3.65 (м, CH₂, 2H), 3.71-3.78 (м, CH₂, 6H), 3.89-3.93 (м, CH₂, 2H), 4.18-4.22 (м, CH₂, 2H), 7.03-7.07 (м, C₆H₄O, 2H), 7.29-7.33 (м, H-5'(Py), 1H), 7.56-7.61 (м, C₆H₄O, 2H), 7.83 (ддд, 3J 7.6, 7.6 Hz, 4J 1.6 Hz, H-4'(Py), 1Н), 7.97 (дд, 3J 8.0 Hz, 4J 2.4 Hz, H-4(Py), 1H), 8.40-8.45 (м, H-3(Py), H-3'(Py), 2H), 8.68-8.71 (м, H-6'(Py), 1H), 8.87-8.89 (м, H-6(Py), 1H). ЯМР 13C (100 MHz, CDCl₃) δ 61.8, 67.5, 69.7, 70.9, 72.5, 115.3, 121.0 (2C), 123.6, 128.2, 130.3, 134.7, 136.1, 136.9, 147.3, 149.2, 154.4, 156.0, 159.1. ESI-MS вычислено для (C₂₂H₂₄N₂O₄) [M+H]⁺: 381.18, найдено: 381.18. Найдено, %: C 69.31, H 6.20, N 7.53. Вычислено для C₂₂H₂₄N₂O₄: C 69.46, H 6.36, N 7.36.

Настоящее изобретение относится к области оптических методов анализа. Раскрыт способ определения антиоксидантной емкости раствора оптическим методом с использованием бумажного сенсора, находящегося в пластиковом корпусе, на который наносят реагент, содержащий окисленную форму металла в составе комплексного соединения, и объект анализа, оценку антиоксидантной емкости проводят, сравнивая интенсивность окраски бумажного сенсора после реакции между антиоксидантами объекта анализа и реагентом с окраской калибровочной полоски, представляющей шкалу зависимости степени окраски сенсора от концентрации добавленного модельного антиоксиданта, и разграниченную на диапазоны концентраций, соответствующие низкому С_АО<1⋅10^-4 М, среднему С_АО=1⋅10^-4-1⋅10^-3 М и высокому содержанию антиоксидантов С_АО>1⋅10^-3 М, при этом в качестве реагента используют комплекс окисленной формы металла с производными бипиридина, растворенными в органическом растворителе или смесях органических растворителей. Изобретение обеспечивает получение достоверной качественной и количественной информации об антиоксидантной емкости различных объектов с использованием оптического способа. 3 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 пр.

1. Способ определения антиоксидантной емкости раствора оптическим методом с использованием бумажного сенсора, находящегося в пластиковом корпусе, на который наносят реагент, содержащий окисленную форму металла в составе комплексного соединения, и объект анализа, оценку антиоксидантной емкости проводят, сравнивая интенсивность окраски бумажного сенсора после реакции между антиоксидантами объекта анализа и реагентом с окраской калибровочной полоски, представляющей шкалу зависимости степени окраски сенсора от концентрации добавленного модельного антиоксиданта, и разграниченную на диапазоны концентраций, соответствующие низкому С_АО<1⋅10^-4 М, среднему С_АО=1⋅10^-4-1⋅10^-3 М и высокому содержанию антиоксидантов С_АО>1⋅10^-3 М, отличающийся тем, что в качестве реагента используют комплекс окисленной формы металла с производными бипиридина, растворенными в органическом растворителе или смесях органических растворителей.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют пластиковый корпус, выполненный из фотополимерной смолы, который позволяет расположить от одного до четырех бумажных сенсоров.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве реагента используют комплекс Fe(III) с галогенпроизводными бипиридина или комплекс Fe(III) с производными бипиридина, содержащими фрагмент триэтиленгликоля.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве растворителей используют этиловый спирт, или ацетонитрил, или ацетон, или смеси ацетон - ацетонитрил.