СПОСОБ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЁЗА Российский патент 2022 года по МПК G01N33/569 G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике и может быть использовано для диагностики острого и хронического бруцеллеза. Сущность изобретения состоит в определении с использованием иммуноферментного анализа уровня содержания интерферона-гамма (INF-γ), вырабатываемого сенсибилизированными Т-лимфоцитами, в ответ на специфическую стимуляцию in vitro (ex vivo) бруцеллезным антигеном.

Известно, что в соответствии с действующими нормативными документами для лабораторной диагностики бруцеллеза у людей применяются три группы методов: первая - тесты, позволяющие выявить возбудителя инфекции и его растворимые антигены; вторая - методы определения специфических антител; третья - тесты, свидетельствующие о сенсибилизации организма [1, 2].

Полиморфизм клинического течения бруцеллеза, с учетом сохраняющегося неблагополучия современной эпидемиологической ситуации в ряде регионов Российской Федерации и мира, актуализирует проблему совершенствования методов и методических подходов для диагностики и верификации бруцеллезной инфекции.

Наиболее широко в клинической лабораторной диагностике бруцеллеза используются иммунологические методы. Иммунодиагностика основана на выявлении «продуктов» (биомаркеров) иммуновоспалительных реакций, образованных при взаимодействии системы иммунитета с антигенными субстанциями бруцелл: специфических антител, пула антигенреактивных лейкоцитов и биомаркеров (аналитов), отражающих наличие и интенсивность иммунологической реактивности по отношению к антигенам возбудителей инфекции [3].

Диагностическая точность (чувствительность, специфичность) иммуно-серологических методов диагностики бруцеллеза варьирует в диапазоне 65-95%. Высокие титры антител почти всегда указывают на наличие бруцеллезной инфекции, однако иммуноглобулины в низких титрах или их полное отсутствие не исключают возможности заболевания. Ложноположительные результаты ИФА на наличие специфических иммуноглобулинов нередко регистрируют у больных с ревматоидным воспалением соединительной ткани [4-6], а также у лиц с наличием антител к бактериям, имеющим общие с бруцеллами антигенные детерминанты [2].

В литературе описано достаточное количество случаев, демонстрирующих ненадежность регламентированных серологических тестов для диагностики бруцеллеза [7-11].

Недостаточная эффективность существующих методов диагностики бруцеллеза, особенно при выявлении хронической формы течения инфекции, в последующем могут привести к назначению неадекватной этиотропной и патогенетической терапии, что инициирует хронизацию бруцеллезного процесса с высоким риском формирования необратимых органных поражений и инвалидности у больных.

Учитывая ведущую роль Т-клеточного иммунитета (реакций гиперчувствительности замедленного типа, аллергическая реакция IV типа) в формировании иммунологической защиты от бруцеллеза, оценку реакции Т-лимфоцитов в ответ на антигенную стимуляцию можно считать наиболее информативным и объективным подходом при анализе специфической иммунологической перестройки (специфической сенсибилизации) организма при бруцеллезной инфекции и иммунизации.

МУК 3.1.7.3402-16 регламентирован способ оценки лимфоцит-опосредованной сенсибилизации с использованием кожного аллерготестирования (проба Бюрне). Однако применение этого метода сопряжено с высоким риском возникновения общих и местных реакций на дополнительную антигенную нагрузку. У лиц, с выраженной сенсибилизацией к бруцеллезным антигенам, особенно при остром течении инфекции, возможно развитие реакции в виде повышения температуры, озноба, головной боли, лимфангита, артралгии и др. [2, 12]. Не рекомендуется постановка кожных аллергических проб детям до трех лет и беременным [13].

Известен способ диагностики бруцеллеза, основанный на выявлении степени специфической сенсибилизации организма путем оценки интенсивности in vitro дегрануляции (активации) базофилов, экспрессии клетками маркера CD63 при стимуляции комплексом антигенов бруцелл. Для выявления маркера активации базофилов используется реагент для окраски (Staining Reagent) состоящий из смеси моноклональных антител к поверхностным маркерам CD63 человека, конъюгированных с флуоресцеин изотиоцианитом (анти-CD63-FITC) и к хемокиновому рецептору CCR, меченому фикоэритрином (анти-CCR3-РЕ). CCR3 конститутивно экспрессируется на базофилах. При проведении реакции используют два независимых позитивных контроля: антитела к высокоафинному рецептору IgE - FcεR1 или пептид хемотаксический - N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) - триплед, вызывающий спонтанную активацию базофилов неиммунологическим путем [14-16]. К недостаткам метода можно отнести риск получения ложноотрицательных результатов (низкая диагностическая чувствительность - менее 75%) у лиц с вторично-хроническим бруцеллезом, так как в основе метода лежит детекция реагинового типа гиперчувствительности (I тип, опосредованный IgE и/или lgG4), то есть тех иммуновоспалительных реакций, которые формируются в организме преимущественно в ранний (острый) период инфекции.

Известен способ диагностики бруцеллеза и оценки специфического иммунитета, основанный на выявлении с использованием цитометрического анализа интенсивности экспрессии Т-лимфоцитами активационных молекул CD3⁺CD69⁺, CD3⁺CD25⁺, CD3⁺CD95⁺, CD3⁺HLA-DR⁺ и др. после клеточной антигенспецифической стимуляции in vitro (КАСТ-тест). Методический подход имеет высокую диагностическую информативность (диагностическая чувствительность и специфичность ≥95%) [17-20], однако для его применения необходимо дорогостоящее и исключительно импортное оборудование, наборы реагентов и расходные материалы: проточный цитофлуориметр, моноклональные антитела и другие реактивы для цитометрии, что существенно снижает возможность широкого использования в лабораторной практике этого методического подхода.

Предлагаемый нами способ иммунодиагностики бруцеллеза основан на применении КАСТ-теста с последующим учетом результатов реакции с помощью более экономически доступного и широко распространенного в диагностических лабораториях метода - ИФА.

Способ основан на измерении в плазме крови с использованием ИФА концентрации INF-γ, вырабатываемого сенсибилизированными Т-лимфоцитами в ответ на специфические антигены бруцелл. В качестве специфического антигена используется «Бруцеллезный антиген для клеточных тестов in vitro» производства ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора [21].

В основу метода положена способность сенсибилизированных Т-лимфоцитов (имеющих специфические рецепторы) активироваться при взаимодействии с комплементарным антигеном и продуцировать in vitro различные цитокины, в том числе INF-γ. После формирования антигенспецифического иммунитета, эффекторные Т-лимфоциты (CD3⁺CD4⁺Th1, CD3⁺CD8⁺CTL) высвобождают INF-γ в ответ на антигенную стимуляцию.

Наиболее близок к предлагаемому способу иммунодиагностики бруцеллеза можно считать квантифероновый тест (QuantiFERON, QF-тест) для диагностики латентной туберкулезной инфекции и активного туберкулеза у людей. При котором оценивается клеточно-опосредованный иммунный ответ у ТБ-инфицированных людей путем оценки антигениндуцированного высвобождения гамма-интерферона в условиях in vitro. Для постановки квантиферонового теста используется смесь пептидов (белки ESAT-6, CFP-10) возбудителя туберкулеза. Результат QF-теста учитывается с использованием ИФА через 48 часов [22-25].

Заявляемый способ отличается наличием возможности через 24 ч после постановки реакции определять у лиц, иммунных к возбудителю бруцеллеза (больные бруцеллезом, вакцинированные против бруцеллеза) антигенспецифическую реактивность Т-лимфоцитов, которая выражается в интенсивности индуцированной бруцеллезным антигеном in vitro продукции INF-γ. Учет реакции производят с использованием ИФА.

Технически предлагаемый способ включает в себя два этапа. На первом этапе подготавливают две пластиковые круглодонные пробирки объемом 3-5 мл: 1 пробирка (фоновая проба) - вносят 50 мкл стерильного изотонического раствора NaCl и 500 мкл гепаринизированной крови; 2 пробирка (проба с антигеном, опытная проба) - 50 мкл рабочего разведения бруцеллезного антигена (1/200) и 500 мкл гепаринизированной крови. Пробы перемешивают с помощью перемешивающего устройства в течение 5 сек и закрывают целлюлозными пробками с последующей инкубацией при 37±1°С в условиях повышенного содержания CO₂ (5-10%) в течение 24 часов. На втором этапе пробирки после инкубации центрифугируют 10 мин при 3 тыс. об/мин. Затем отбирают надосадочную жидкость из каждой пробы соответственно в отдельную фоновую и опытную пробирки. Учет результатов: определение концентрации гамма-интерферона в пробе проводят с использованием ИФА, согласно инструкции к тест-системе. Уровень антигениндуцированной продукции лимфоцитами гамма-интерферона рассчитают по разнице между значениями после инкубации с бруцеллезным антигеном и стерильным изотоническим раствором натрия хлорида (из значения, полученного при анализе опытной пробы вычитают значения фоновой пробы). Полученные результаты в пкг/мл переводят в МЕ/мл по формуле:

где:

х - результата теста в МЕ/мл;

С - значения (в пкг/мл), полученные при анализе фоновой пробы;

D -значения (в пкг/мл), полученные при анализе опытной пробы

Оценка результатов:

- значения от 0 до 0,90 - отрицательный результат;

- значения от 0,91 до 1,00 - сомнительный результат;

- значения более 1,00 - положительный результат.

Интерпретация результатов: увеличение концентрации гамма-интерферона (значение КП более 1,0 МЕ/мл) свидетельствует о наличии у обследуемого пула премированных (сенсибилизированных) Т-лимфоцитов, несущих антигенспецифические рецепторы (рецепторы к антигенам бруцелл), которые сформировались при взаимодействии антигенов бруцелл с иммунной системой организма в результате инфекционного процесса или формирования поствакцинального иммунитета.

Возможность практического применения предлагаемого способа иллюстрируется примером его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример: обследовали 34 больных бруцеллезом (с верифицированными диагнозами острый (n=18) и хронический (n=16) бруцеллез) на наличие возможности выявления у них с использованием КАСТ и ИФА антигениндуцированной продукции INF-γ. Для оценки специфичности предлагаемого теста производили постановку реакции с антигенами гетерологичных бактерий: Mycobacterium tuberculosis - туберкулин (ФГУП «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток по производству бактерийных препаратов» Россия), Francisella tularensis - тулярин (АО «НПО «Микроген»), Bacillus anthracis - антраксин (ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора). Анализ результатов исследований указывает на отсутствие неспецифических реакций интеферонового теста, у больных острым бруцеллезом значения результатов теста находились в диапазоне 1,27÷13,06 МЕ/мл, хроническим бруцеллезом - 3,58÷17,83 МЕ/мл. (Таблица №1)

Таким образом, предлагаемый способ позволяет проводить иммунологическую диагностику бруцеллеза, основанную на анализе методом ИФА уровня содержания интерферона-гамма, вырабатываемого сенсибилизированными Т-лимфоцитами, в ответ на специфическую стимуляцию in vitro (ex vivo) бруцеллезным антигеном.

Предлагаемый способ реально осуществим. К достоинствам заявляемого способа иммунологической диагностики бруцеллеза можно отнести следующее:

- способ позволяет проводить диагностику острого и хронического бруцеллеза вне зависимости от наличия и уровня сероконверсии;

- способ позволяет количественно учесть интенсивность Т-клеточно-опосредованной сенсибилизации;

- тест может быть использован для исследования активности формирования адаптивного Т-клеточного иммунитета, как наиболее эффективного в иммунологической защите против бруцелл;

- предлагаемый способ обеспечен специфичностью, так как предполагает использование специфического бруцеллезного антигена, а способ учета результатов (учет результатов относительно фоновых значений) сводит к минимуму получение ложноположительных результатов.

Используемая литература

1. МУК 4.2.3010-12 Порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней URL: https://www.rospotrebnadzor.ru/documents/details.php?ELEMENT_ID=5119 (дата обращения 18.11.2021).

2. МУК 3.1.7.3402-16 Эпидемиологический надзор и лабораторная диагностика бруцеллеза» https://www.rospotrebnadzor.ru/upload/iblock/d19/muk-3.1.7.3402_16.pdf (дата обращения 18.11.2021).

3. Клиническая лабораторная диагностика: учебник / Под ред. В.В. Долгова, ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования». - М.: ФГБОУ ДПО РМАНПО, 2016. - 668 с. ISBN 978-5-7249-2608-9.

4. Gomez М.С., Nieto J.A., Rosa С., Geijo P., Escribano M.A., Munoz A., Lopez C. Evaluation of seven tests for diagnosis of human brucellosis in an area where the disease is endemic // Clin. Vaccine Immunol. 2008. Vol. 15, N 6. P. 1031-1033. https://doi.org/10.1128/CVI.00424-07.

5. Mantur В., Parande A., Amamath S., Patil G., Walvekar R., Desai A. et al. ELISA versus conventional methods of diagnosing endemic brucellosis // Am. J. Trop.Med. Hyg. 2010. Vol. 83, N 2. P. 314-318. DOI: https://doi.org/10.4269/ajtmh.2010.09-0790.

6. Solis Garcia Del Pozo J., Lorente Ortuno S., Navarro E., Solera, J. Detection of IgM antibrucella antibody in the absence of IgGs: a challenge for the clinical interpretation of brucella serology // PLoS Negl. Trop.Dis. 2014. Vol. 8, N 12. P. e3390. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0003390.

7. Чистякова H.B. Трудности диагностики бруцеллеза в клинике внутренних болезней / Н.В. Чистякова, М.А. Коновалова, О.А. Бокерия и др. // Клиническая медицина. - 2004. - №6. - С. 67-68.

8. Corbel M.J. Brucellosis: an overview. Emerg. Infect. Dis., 1997, no. 3, pp. 213-221. doi: 10.3201/eid0302.970219

9. Naha K., Dasari S., Pandit V., Seshadri S. A rare case of seronegative culture-proven infection with Brucella suis. Australas Med. J., 2012, vol. 5, no. 7, pp. 340-343. doi: 10.4066/AMJ.2012.1177

10. Potasman I., Even L., Banai M., Cohen E., Angel D., Jaffe M. Brucellosis: an unusual diagnosis for a seronegative patient with abscesses, osteomyelitis, and ulcerative colitis. Rev. Infect. Dis., 1991, vol. 13, pp. 1039-1042.

11. Tekin-Koruk S., Duygu F., Gursoy В., Karaagac L., Bayraktar M. A rare case of seronegative neurobrucellosis. Ann. SaudiMed., 2010, vol. 30, no. 5, pp. 412-414. doi: 10.4103/0256-4947.67084

12. Бруцеллез. Современное состояние проблемы / под ред. Г.Г. Онищенко, А.Н. Куличенко. - Ставрополь: ООО «Губерния», 2019. - 336 с.

13. Иммунопатология и аллергология. Алгоритмы диагностики и лечения / под ред. P.M. Хаитова. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. - 112 с.

14. Патент РФ №2574207 С1. Опубликован: 10.02.2016 Бюл. №4.

15. Пономаренко Д.Г. Новый подход к аллергодиагностике бруцеллеза / Д.Г. Пономаренко, О.В. Логвиненко, Н.С. Саркисян и др. // Инфекция и иммунитет. - 2013. - №1 - С. 89-92.

16. Applicazione dellatecnologia di stimolazioneantigenicadelle cellule per la diagnosi di brucellosi / D.G. Ponomarenko, E.L. Rakitina, O.V. Logvinenko, M.V. Kostjuchenko, N.S. Sarkisjan, N.I. Kovalevich // ItalianScience Review. 2014; 1(10). PP. 178-181.

17. Патент РФ №2714136 C1. Опубликован: 12.02.2020 Бюл. №5.

18. Новый подход к комплексной оценке иммуно-биологической реактивности контингента, подлежащего вакцинации (ревакцинации) против бруцеллеза / Пономаренко Д.Г. // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. - 2015. - №3. - С. 28-31.

19. Использование антигенспецифических клеточных тестов in vitro для оценки иммунологической реактивности у лиц, подлежащих вакцинации и ревакцинации против бруцеллеза / Костюченко М.В., Ракитина Е.Л., Пономаренко Д.Г., Логвиненко О.В. // Инфекция и иммунитет. - 2017. - № S. - С. 267.

20. Перспектива оценки антигенреактивности лимфоцитов in vitro для диагностики острого бруцеллеза / Костюченко М.В., Пономаренко Д.Г., Ракитина Е.Л., Логвиненко О.В., Санникова И.В., Дейнека Д.А., Голубь О.Г. // Инфекция и иммунитет. - 2017. - Т. 7. №1. - С. 91-96.

21. Патент РФ №2708561 С1. Опубликован: 09.12.2019 Бюл. №34.

22. Regulation of Interferon-γ During Innate and Adaptive Immune Responses // Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. - 2007. - Vol. 96. - P. 41-101. - ISBN 978-0-12-373709-0. - doi: 10.1016/S0065-2776(07)96002-2.

23. Pottumarthy S., Morris A.J., Harrison A.C., Wells V.C. Evaluation of the tuberculin gamma interferon assay: potential to replace the Mantoux skin test. J Clin Microbiol. 1999 Oct; 37(10):3229-32. doi: 10.1128/JCM.37.10.3229-3232.1999. PMID: 10488182; PMCID: PMC85534.

24. Lempp J.M., Zajdowicz M.J., Hankinson A.L., Toney S.R., Keep L.W., Mancuso J.D., Mazurek G.H. Assessment of the QuantiFERON-TB Gold In-Tube test for the detection of Mycobacterium tuberculosis infection in United States Navy recruits. PLoS One. 2017 May 17; 12(5):e0177752. doi: 10.1371/journal.pone.0177752. PMID: 28545136; PMCID: PMC5435309.

25. Новые технологии в диагностике туберкулеза - квантифероновый тест (QuantiFERON®-Tb Gold it) // Главврач Юга России. 2013. №1 (32). С. 55-58.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для иммунологической диагностики острого и хронического бруцеллеза у людей in vitro. Проводят анализ методом ИФА уровня содержания интерферона-гамма, вырабатываемого сенсибилизированными Т-лимфоцитами крови, в ответ на специфическую стимуляцию ex vivo бруцеллезным антигеном. Уровень содержания интерферона-гамма Х вычисляют по формуле: , где: Х - результат теста, МЕ/мл; С – значения, пкг/мл, полученные при анализе фоновой пробы; D – значения, пкг/мл, полученные при анализе опытной пробы. При значении Х более 1,0 МЕ/мл диагностируют бруцеллез. Способ обеспечивает возможность проводить диагностику острого и хронического бруцеллеза вне зависимости от наличия и уровня сероконверсии, за счет возможности количественно учесть интенсивность Т-клеточно-опосредованной сенсибилизации путем определения уровня содержания интерферона-гамма, вырабатываемого сенсибилизированными к бруцеллезному антигену Т-лимфоцитами. 1 табл., 1 пр.

Способ иммунологической диагностики острого и хронического бруцеллеза у людей in vitro, включающий анализ методом ИФА уровня содержания интерферона-гамма, вырабатываемого сенсибилизированными Т-лимфоцитами крови, в ответ на специфическую стимуляцию ex vivo бруцеллезным антигеном, в котором уровень содержания интерферона-гамма Х вычисляют по формуле:

, где:

Х - результат теста, МЕ/мл;

С – значения, пкг/мл, полученные при анализе фоновой пробы;

D – значения, пкг/мл, полученные при анализе опытной пробы,

и при значении Х более 1,0 МЕ/мл диагностируют бруцеллез.