БИОГЕЛЬ Российский патент 2014 года по МПК A61K47/48 A61K38/38 A61K38/36 A61K9/14 A61K9/10 A61P7/04 A61L24/10 

Настоящее изобретение относится к биогелю и к наборам, агентам и способам формирования биогеля. В предпочтительном аспекте, биогель представляет собой тканевый клей. Указанный биогель или тканевый клей можно применять по ряду назначений, включая гемостаз, закрытие ран, тканевую инженерию или направленную доставку лекарственных средств.

В процессе свертывания крови фибриноген превращается в фибрин при участии тромбина. Фибриноген включает два набора из трех различных цепей (α, β и γ), связанных друг с другом дисульфидными связями. Вместе эти цепи образуют центральный глобулярный домен (Е-домен), соединенный с двумя крайними глобулярными доменами (D-доменами). Тромбин расщепляет четыре пептидные связи аргинин-глицин в центральном Е-домене фибриногена с высвобождением А-пептида из каждой из двух α-цепей и В-пептида каждой из двух β-цепей. Пептиды А- и В-называют фибринопептидами. Молекулу фибриногена без этих фибринопептидов, называют мономером фибрина. Мономеры фибрина самопроизвольно собираются в упорядоченные волокнистые структуры, называемые фибрином. Фибрин стабилизируется благодаря образованию ковалентных поперечных сшивок между боковыми цепями разных молекул в волокне фибрина. Пептидные связи образуются между определенными боковыми цепями глутамина и лизина в реакции переамидирования, катализируемой Фактором XIIIa.

Тромбоциты после активации также образуют существенную часть сгустка крови. Тромбоциты прикрепляются к открытой поверхности раны и становятся активированными. Гликопротеин GPIIb/IIIa мембраны тромбоцита претерпевает изменение конформации, которое позволяет ему связывать фибриноген. Фибриноген может связываться с более чем одним тромбоцитом, благодаря чему происходит агрегация тромбоцитов друг с другом. Агрегаты тромбоцитов образуют основную структуру тромба, формирующуюся внутри сетки из фибрина.

Фибриновый тканевый клей (ФТК) - это название продуктов, полученных путем имитации последнего этапа каскада коагуляции, в результате которого образуется фибриновый тромб. Доступные для приобретения наборы ФТК позволяют быстро получать сильные, биоразрушаемые гели, которые применяют для гемостаза, доставки лекарственных средств и в качестве хирургических клеев и покрытий для тканей. Фибриноген, Фактор XIII, тромбин и ионы кальция, как правило, доставляют с помощью впрыскивающего устройства, в котором фибриноген и Фактор XIII отделены от ионов кальция и тромбина при хранении. Смешивание компонентов во время впрыскивания из шприца приводит к тромболизу фибриногена с образованием фибрина, который самопроизвольно собирается в гель, в котором затем активированный ионами кальция Фактор XIII образует поперечные сшивки. Тем не менее, во многих ФТК применяют бычий тромбин, который может вызывать анафилактические и аутоиммунные реакции у пациентов.

Zhang и др. (Bioconjugate Chem. 2002 (13): 640-646) описывают получение гидрогелей на основе фибриногена с помощью фотоактивируемого высвобождения ионов кальция из липосом и последующей активации катализируемого трансглутаминазой образования поперечных сшивок в фибриногене. Однако получение таких гидрогелей затруднительно и требует специализированного состава липосомы и Фактора XIII.

Hidas и др. (Urology 67(4), 2006: 697-700) описывают применение тканевого клея на основе альбумина и глутаральдегида в бесшовной нефрон-сберегающей хирургии. Смешивали бычий сывороточный альбумин и глутаральдегид. Взаимодействие с глутаральдегидом вызывает связывание друг с другом молекул лизина бычьего сывороточного альбумина, белков внеклеточного матрикса и поверхностей клеток, что приводит к образованию прочной ковалентной связи.

Однако недостатком этого клея является токсичность глутаральдегида и риск того, что бычий сывороточный альбумин может вызвать аллергическую реакцию у пациентов.

Соответственно, существует потребность в создании геля или тканевого клея, который не требует применения токсичных агентов, который сводит к минимуму риск аллергической реакции и который можно легко получить из компонентов, которые легко хранить в стабильном состоянии.

Согласно настоящему изобретению предложен набор для формирования (получения) биогеля, который включает: множество связывающих фибриноген групп (молекул), иммобилизованных на каждом носителе; и фибриноген, при этом каждая молекула фибриногена может связывать по меньшей мере две связывающие фибриноген молекулы.

Термин "биогель" в данной заявке включает гель, содержащий один или более компонентов, которые представляют собой природные или рекомбинантные биологические молекулы (или полученные путем химического синтеза биологические молекулы), или молекулы, которые получены из биологических молекул (например, производные, которые сохраняют одну или более функций исходной биологической молекулы).

Биогель можно получить путем осуществления контакта фибриногена и носителей. Поскольку на каждом носителе иммобилизовано множество связывающих фибриноген групп и поскольку каждая молекула фибриногена может связывать по меньшей мере две связывающие фибриноген группы, молекулы фибриногена оказываются связанными вместе через носители. Между молекулами фибриногена и связывающими фибриноген группами образуются нековалентные связи.

Соответственно, настоящее изобретение также обеспечивает способ формирования биогеля, который включает осуществление контакта молекул фибриногена с множеством носителей, при этом каждый носитель включает множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на указанном носителе, и каждая молекула фибриногена может связывать по меньшей мере две связывающие фибриноген молекулы, благодаря чему происходит связывание молекул фибриногена через носители в результате образования нековалентных связей между связывающими фибриноген группами и молекулами фибриногена.

Дополнительно настоящее изобретение обеспечивает биогель, который включает молекулы фибриногена и множество носителей, при этом каждый носитель включает множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, и каждая молекула фибриногена связана с по меньшей мере двумя связывающими фибриноген группами благодаря чему происходит связывание молекул фибриногена через носители в результате образования нековалентных связей между связывающими фибриноген группами и молекулами фибриногена.

Вместо связывающих фибриноген групп носители могут включать множество предшественников связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на каждом носителе, при этом каждый предшественник связывающей фибриноген группы может быть превращен в связывающую фибриноген группу. Для формирования биогеля с применением таких носителей необходимо превратить предшественники связывающих фибриноген групп в связывающие фибриноген группы таким образом, чтобы связывающие фибриноген группы могли затем связаться с молекулами фибриногена.

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также набор для формирования биогеля, который включает: множество носителей, множество предшественников связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на каждом носителе, при этом каждый предшественник связывающей фибриноген группы может быть превращен в связывающую фибриноген группу; и фибриноген, при этом каждая молекула фибриногена может связывать по меньшей мере две связывающие фибриноген группы.

Дополнительно настоящее изобретение обеспечивает способ формирования биогеля, который включает: обеспечение множества носителей, причем каждый носитель включает множество предшественников связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе; превращение предшественников связывающих фибриноген групп в связывающие фибриноген группы; и осуществление контакта молекул фибриногена со связывающими фибриноген группами, при этом каждая молекула фибриногена может связывать по меньшей мере две связывающие фибриноген группы, благодаря чему происходит связывание молекул фибриногена через носители в результате образования нековалентных связей между связывающими фибриноген группами и молекулами фибриногена.

Биогель согласно настоящему изобретению необязательно должен быть способен к адгезии на тканевом субстрате. Тем не менее в предпочтительных аспектах, биогель согласно настоящему изобретению представляет собой тканевый клей. Термин "тканевый клей" (адгезив) в данной заявке обозначает вещество, которое может прилипать к тканевому субстрату, например, к коже или поверхности слизистой. Биогели или тканевые клеи согласно настоящему изобретению можно применять для гемостаза, в качестве изолирующих покрытий (силантов), в тканевой инженерии (например, в качестве подложки) или для направленной доставки лекарственных препаратов.

Носитель может представлять собой растворимый или нерастворимый носитель, но не является тромбоцитом. Носитель должен быть пригодным для местного введения в участок ткани субъекта, например, в участок кровоточащей раны или участок слизистой. Растворимый носитель может подходить скорее для внутривенного, чем для местного введения. Носитель может включать растворимый или нерастворимый белок, терапевтическое лекарственное средство, полимер (например, биосовместимый полимер, такой как полиэтиленгликоль), или комбинацию любых из перечисленных носителей.

Примерами белковых носителей являются фермент или белок, который не является ферментом, такой как сывороточный альбумин человека.

Нерастворимый носитель может представлять собой микрочастицу (включая твердую, полую или пористую микрочастицу, предпочтительно по существу сферическую микрочастицу). Указанная микрочастица может состоять из любого пригодного вещества, например, поперечно сшитого белка.

Одним из пригодных белков является альбумин (полученный из сыворотки или рекомбинантный, имеющий последовательность альбумина человека или альбумина, не являющегося человеческим). Микрочастицы, пригодные для применения в качестве нерастворимых носителей, в настоящем изобретении могут быть получены путем распылительной сушки сывороточного альбумина человека с применением хорошо известной технологии распылительной сушки, например, описанной в WO 92/18164.

Альтернативы применению микрочастиц в качестве носителей включают липосомы, синтетические полимерные частицы (такие как полимолочная кислота, полигликолиевая кислота и сполимер молочной и гликолиевой кислота, или фрагменты клеточных мембран.

Термин "фибриноген" в данной заявке включает природный фибриноген, рекомбинантный фибриноген или производное фибриногена, способное к превращению под действием тромбина с образованием фибрина (например, природный или рекомбинантный мономер фибрина, или производное мономера фибрина, способные или неспособные к самопроизвольной сборке). Фибриноген должен быть способен связывать по меньшей мере две связывающие фибриноген группы. Фибриноген может быть получен из любого источника и из любого вида (включая бычий фибриноген), но предпочтительным является фибриноген человека. Фибриноген человека можно получить из аутологичной или донорской крови. Аутологичный фибриноген является предпочтительным, поскольку его применение позволяет снизить риск инфекции при введении биогеля (или клея) согласно настоящему изобретению субъекту.

Предпочтительно, связывающая фибриноген группа связывается с фибриногеном с константой диссоциации (K_D), лежащей в интервале между 10^-9 и 10^-6 М, например, приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или более нМ. K_D, равная приблизительно 100 нМ, является предпочтительной. Константа диссоциации может быть измерена в равновесном состоянии. Например, меченный радиоактивным изотопом фибриноген в известной концентрации можно инкубировать с микросферами, с которыми была связана поперечными связями связывающая фибриноген группа. Как правило, 5 мкМ пептида связано поперечными связями с 1 г микросфер, или 15-40 мкмоль пептида связано поперечными связями с 1 г микросфер. Связанные с пептидом микросферы разбавляют до 0.5 мг/мл и инкубируют в изотоническом буфере при pH 7.4 (например, в буфере 0.01 М Hepes, содержащем 0.15 М NaCl) с меченным радиоактивным изотопом фибриногеном при концентрациях, лежащих в диапазоне между 0.05 и 0.5 мг/мл, в течение вплоть до 1 ч при 20°С. Фибриноген, связанный со связывающей фибриноген группой на микросферах, можно отделить от свободного фибриногена путем центрифугирования и измерить количество свободного и связанного фибриногена. Константу диссоциации можно затем рассчитать с помощью анализа Скэтчарда путем нанесения на график концентрации связанного фибриногена в зависимости от отношения концентраций связанного фибриногена к свободному, при этом тангенс угла наклона к оси абсцисс касательной к кривой представляет собой K_D.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения является предпочтительным то, что связывающая фибриноген группа избирательно связывается с фибриногеном. В других вариантах реализации является предпочтительным то, что связывающая фибриноген группа может связываться с фибриногеном и отдельно с мономером фибрина и/или фибрином. Связывание фибриногена и мономера фибрина и/или фибрина предпочтительно является избирательным.

Предпочтительно, связывающая фибриноген группа представляет собой связывающий фибриноген пептид или аналог такого пептида. Можно применять любой пригодный связывающий фибриноген пептид. Например, указанный пептид может обладать способностью к связыванию с участком фибриногена, который в природе связывается с фибрином или с гликопротеинами мембран тромбоцитов GPIIb-IIIa. Связывание фибрина с фибриногеном обсуждается в Mosesson и др. 2001, Ann. N.Y. Acad. Sci., 936, 11-30. Связывание GPIIb-IIIa с фибриногеном обсуждается в Bennett, 2001, Annals of NY Acad. Sci., 936, 340-354.

Пептид может обладать способностью к связыванию с карбокси- и/или аминоконцевым доменом α-цепи фибриногена. В частности, пептид может обладать способностью к связыванию с RGD-содержащим мотивом в одном из доменов или в обоих доменах (таким как RGDF (SEQ ID NO:1) с аминокислотами 95-98 или RGDS (SEQ ID NO:2) с аминокислотами 572-575). Пептид может обладать способностью к связыванию с карбоксиконцевым доменом γ-цепи фибриногена, предпочтительно с 12 концевыми аминокислотами в этом домене (последовательность HHLGGAKQAGDV (SEQ ID NO:3)). Пептид может обладать способностью к связыванию с D-доменом γ-цепи фибриногена, например с сегментом β-цепи D-домена.

Связывающий фибриноген пептид может включать последовательность, производную от участка связывания фибриногена GPIIb или GPIIIa. Например, пептид может включать последовательность AVTDVNGDGRHDLLVGAPLYM (SEQ ID NO:4), которая соответствует последовательности остатков аминокислот 294-314 GPIIb, или ее фрагмент или производное, сохраняющих способность к связыванию фибриногена. Фрагментами, для которых известно, что они не утратили способность к связыванию фибриногена, являются TDVNGDGRHDL (296-306) (SEQ ID NO:5), GDGRHDLLVGAPL (300-312) (SEQ ID NO:6) и GAPL (SEQ ID NO:7). Пригодные производные TDVNGDGRHDL включают: T(D,E)VNG(D,E)GRH(D,E)L (SEQ ID NO:8); TD(V,L)NGDGRHDL (SEQ ID NO:9); TDV(N,Q)GDGRHDL (SEQ ID NO:10); TDVNGDG(R,K)HDL (SEQ ID NO:11).

Связывающий фибриноген пептид может включать последовательность из остатков 95-223 GPIIIa, или ее фрагмент или производное, которые сохраняют способность к связыванию фибриногена. Например, остатки 211-222, включающие последовательность SVSRNRDAPEGG (SEQ ID NO:12), считают важным фибриноген-связывающим доменом в GPIIIa. Другие пригодные участки GPIIIa включают остатки 109-171 и 164-202.

Связывающий фибриноген пептид может включать последовательность остатков, которые под действием тромбина оказываются доступными для связывания фибриногена, и которые связывают фибриноген на первом этапе реакции полимеризации с образованием фибрина. Тромбин отщепляет пептиды (с высвобождением фибринопептидов А и В) от N-концов цепей α и β фибриногена, в результате чего становятся доступными последовательности NH₂-GPR- (SEQ ID NO:13) и NH₂-GHR- (SEQ ID NO:14) соответственно. Соответственно, предпочтительный пример связывающего фибриноген пептида включает последовательность аминокислот NH₂-G(P,H)RX- (SEQ ID NO:15) в аминоконцевой области, где Х представляет собой любую аминокислоту, и (Р,Н) означает, в данном положении находится либо пролин, либо гистидин. Предпочтительно пептид включает последовательность NH₂-GPRP- (SEQ ID NO:16) в аминоконцевой области.

Предпочтительно, связывающий фибриноген пептид имеет длину 4-30, более предпочтительно 4-10 остатков аминокислот.

Предшественник связывающей фибриноген группы не должен связываться с фибриногеном со связыванием молекул фибриногена друг с другом через носители, включающие иммобилизованные предшественники связывающих фибриноген групп, при контакте носителей с фибриногеном.

Предпочтительно, константа диссоциации предшественника связывающей фибриноген группы и фибриногена больше 1×10^-6 М. Предшественник связывающей фибриноген группы может представлять собой пептид или аналог пептида, но предпочтительно пептид. Предшественник связывающей фибриноген группы не может быть фибриногеном или включать фибриноген.

В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения, предшественник связывающей фибриноген группы включает связывающий фибриноген пептид, соединенный аминоконцевым участком с блокирующим компонентом (предпочтительно, пептидом), который блокирует или ингибирует (т.е. снижает) связывание фибриногена со связывающим фибриноген пептидом. Расщепление предшественника связывающей фибриноген группы превращающим агентом (предпочтительно, фактором свертывания крови, таким как тромбин) открывает для взаимодействия связывающий фибриноген пептид, связанный с носителем, превращая тем самым предшественник связывающей фибриноген группы в связывающую фибриноген группу. В таких вариантах реализации, блокирующий компонент блокирует или ингибирует способность связывающего фибриноген пептида связывать фибриноген до тех пор, пока не происходит его отщепление. Предпочтительно блокирующий компонент представляет собой пептид длиной 1-30 остатков аминокислот.

Очевидно, что в таких вариантах реализации предшественник связывающей фибриноген группы должен включать сайт расщепления, который избирательно распознается превращающим агентом и располагается между связывающим фибриноген пептидом и блокирующим компонентом. Тромбин является предпочтительным превращающим агентом. Тем не менее, для расщепления предшественника связывающей фибриноген группы можно применять другие сериновые протеазы или факторы свертывания крови. Известно, что тромбин расщепляет пептидные связи со стороны карбоксильного конца от остатков аргинина и обычно между остатками аргинина и глицина.

В особенно предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения, предшественник связывающей фибриноген группы представляет собой пептид, который включает последовательность аминокислот NH₂-ZYXR/GPRP- (SEQ ID NO:17) в аминоконцевой области, при этом "/" представляет собой сайт расщепления тромбином, и Х представляет собой любую аминокислоту, но предпочтительно является пролином, Y представляет собой любую аминокислоту, но предпочтительно является аспарагиновой кислотой или аланином, и Z представляет собой по меньшей мере одну аминокислоту, которая предпочтительно является лейцином или пролином. Примерами являются: NH₂-LVPR/GPRP- (SEQ ID NO:18), NH₂-ADPR/GPRP- (SEQ ID NO:19), NH₂-LDPR/GPRP- (SEQ ID NO:20), или NH₂-LVPR/GPRV- (SEQ ID NO:21).

Связывающие фибриноген группы или их предшественники могут быть связаны с носителем любыми пригодными средствами, но, как правило, они связаны ковалентно. Примерами предпочтительных ковалентных связей являются дисульфидная связь, тиоэфирная связь или амидная связь. Пригодная ковалентная связь может быть образована, если связывающие фибриноген группы или их предшественники представляют собой пептиды, которые включают цистеин, и носитель включает реакционноспособную тиольную группу. Это обеспечивает возможность связывания пептида связаться с носителем путем связывания -SH-группы цистеина с реакционноспособной тиольной группой на носителе. Предпочтительно, в связывающий фибриноген пептид или пептид предшественник вводят концевую группу цистеина для обеспечения связывания поперечными связями пептид с тиольной реакционноспособной группой на носителе. В качестве альтернативы, ковалентная связь может образоваться, когда связывающая фибриноген группа или ее предшественник представляет собой пептид, который включает малеимидную группу (предпочтительно в карбоксильном конце, например, присоединенную к карбоксиконцевому лизину пептида), и носитель включает сульфгидрильную группу. Пептид можно затем связать с носителем путем обеспечения контакта малеимидной группы пептида с сульфгидрильной группой носителя.

Как правило, необходимо наличие спейсера между связывающими фибриноген группами или их предшественниками и носителем для обеспечения того, что фибриноген-связывающая активность связывающих фибриноген групп (при необходимости, превращенных из предшественников связывающих фибриноген групп) не подвергается отрицательному влиянию носителя. Пригодные спейсеры представляют собой пептиды или непептидные молекулы, такие как полиэтиленгликоль.

Если связывающие фибриноген группы или их предшественники представляют собой пептиды, которые включают связывающий фибриноген пептид, и указанные молекулы или их предшественники связаны с нерастворимым носителем по концевому остатку аминокислоты, спейсерная последовательность предпочтительно находится между концевым остатком аминокислоты и связывающим фибриноген пептидом указанных молекул или их предшественников. Спейсерная последовательность может, например, иметь длину 1-20, предпочтительно 5-20 остатков аминокислот. Спейсерная последовательность GGGGGG (SEQ ID NO:22) или GGGGG (SEQ ID NO:23) является предпочтительной.

Очевидно, что количество связывающих фибриноген групп или их предшественников на носитель и относительные количества носителя (с множеством связывающих фибриноген групп или их предшественников на носитель) и фибриногена, которые требуются для получения оптимального биогеля (или тканевого клея), могут быть разными в различных препаратах носителя и фибриногена. Следовательно, может быть необходимо или желательно проверять каждую новую партию носителя или фибриногена с целью определения оптимальных относительных количеств носителя и фибриногена, которые следует использовать для формирования биогеля.

Предпочтительно, каждый носитель имеет, в среднем, по меньшей мере пять связывающих фибриноген групп или их предшественников на носитель. Теоретически, не существует верхнего предела для количества связывающих фибриноген групп или их предшественников на носитель. Оптимальное количество, видимо, зависит от множества факторов, таких как природа носителя и количество на каждом носителе реакционноспособных групп для присоединения связывающих фибриноген групп или их предшественников. Тем не менее является предпочтительным, чтобы каждый носитель содержал в среднем вплоть до 100 связывающих фибриноген групп или их предшественников на носитель. Предпочтительный диапазон включает 10-20 связывающих фибриноген групп или их предшественников на носитель.

Предпочтительно, используют такое количество фибриногена, что присутствует по меньшей мере одна четверть (предпочтительно по меньшей мере половина) от количества молей фибриногена по сравнению с количеством молей связывающих фибриноген групп или их предшественников. Предпочтительно, количество молей фибриногена по отношению к количеству молей связывающих фибриноген групп или их предшественников лежит в диапазоне от 1:4 до 4:1.

Для оценки вязкоупругих свойств биогеля, полученного согласно настоящему изобретению можно применять динамические измерения колебаний. Динамический модуль упругости (G') и модуль потерь (G") в вязкоупругих твердых телах служат мерой накопленной энергии, представляющей упругую часть, и энергии, рассеиваемой в виде теплоты, представляющей вязкую часть. Тангенс дельта представляет собой отношение модуля потерь (G") к динамическому модулю упругости (G'). Следовательно, он представляет собой количественное выражение вкладов упругой и вязкой компонент, при этом значение выше 1 свидетельствует о подобном жидкости вязком поведении, и значение ниже 1 указывает на упругое поведение. Биогели согласно настоящему изобретению предпочтительно имеют значение тангенса дельта меньше 1. Это свидетельствует о том, что компоненты указанного геля связаны перекрестными связями. Тангенс дельта можно определить при частоте, равной 1 Гц, и постоянной деформации, равной 1%. Пригодные способы измерения тангенса дельта описаны более подробно в примерах ниже.

Компоненты набора согласно настоящему изобретению можно хранить отдельно друг от друга, либо некоторые или все компоненты набора можно хранить вместе при условии, что компоненты, которые хранятся вместе, не будут реагировать друг с другом. Очевидно, что для вариантов реализации настоящего изобретения, в которых указанный набор включает носители с иммобилизованными связывающими фибриноген группами, фибриноген следует хранить отдельно от носителей, таким образом, чтобы он не реагировал с носителями. Важным преимуществом наборов согласно настоящему изобретению, которые включают фибриноген и носители с иммобилизованными предшественниками связывающих фибриноген групп, которые не связывают фибриноген, является то, что носители и фибриноген можно хранить вместе.

Компоненты набора согласно настоящему изобретению можно хранить отдельно друг от друга в устройстве (например, шприце) для доставки компонентов в ткань или другое место. Устройство может иметь такую конструкцию, чтобы компоненты контактировали друг с другом после доставки в ткань или другое место.

Набор согласно настоящему изобретению может включать инструкции по применению компонентов набора для формирования биогеля или тканевого клея.

Наборы согласно настоящему изобретению имеют преимущества, состоящие в том, что для формирования биогеля не требуется применение токсичных агентов, биогель (или тканевый клей) легко получить путем применения компонентов наборов, и компоненты легко хранить в стабильном состоянии. Также очевидно, что для формирования биогеля или тканевого клея с применением набора согласно настоящему изобретению не требуется присутствие тромбина (или других ферментов). Наборы согласно настоящему изобретению, которые не включают тромбин, являются особенно предпочтительными, поскольку риск развития аллергической реакции на биогель или тканевый клей, полученный с применением таких наборов, снижен по сравнению с биогелем или тканевым клеем, полученным с использованием экзогенного тромбина. Дополнительное преимущество наборов согласно настоящему изобретению, которые не включают тромбин (или другие ферменты), состоит в том, что не требуется хранить компоненты указанного набора при условиях, которые обеспечивают сохранение активности ферментов.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, предшественники связывающих фибриноген групп можно превращать в связывающие фибриноген группы с помощью превращающего агента, который присутствует в том месте, куда вводят носители, включающие иммобилизованные предшественники связывающих фибриноген групп. Это обеспечивает преимущество, состоящее в том, что не требуется включать в набор превращающий агент. Следовательно, не требуется хранить компоненты набора при условиях, позволяющих сохранить активность превращающего агента.

Предпочтительно, превращающий агент представляет собой агент, присутствующий в поврежденном участке (ране). Термин "агент, присутствующий в ране" в данной заявке означает агент, который присутствует в участке образования раны. В предпочтительном варианте реализации, указанный агент, присутствующий в ране, представляет собой фактор свертывания крови. Примеры пригодных факторов свертывания крови включают тромбин, Фактор VIIa, Фактор Ха или Фактор XIa. Предпочтительно, фактор свертывания крови представляет собой тромбин.

Согласно другим вариантам реализации, набор согласно настоящему изобретению может дополнительно включать превращающий агент для превращения предшественников связывающих фибриноген групп в связывающие фибриноген группы. Указанный превращающий агент должен находиться отдельно от носителя. В таких вариантах реализации, превращающий агент может представлять собой агент, присутствие которого не ожидается в участке введения носителей. В качестве альтернативы, превращающий агент может представлять собой агент, который присутствует в участке, куда вводят носители. Превращающий агент может представлять собой фактор свертывания крови, такой как тромбин, Фактор VIIa, Фактор Ха или Фактор XIa.

Набор согласно настоящему изобретению, включающий носители с иммобилизованными связывающими фибриноген группами, может дополнительно включать фактор свертывания крови. Набор согласно настоящему изобретению, включающий предшественников связывающих фибриноген групп, которые можно превратить в связывающие фибриноген группы с помощью фактора свертывания крови, может включать фактор свертывания крови, который не превращает предшественников связывающих фибриноген групп в связывающие фибриноген группы. В таких вариантах реализации, указанный фактор свертывания крови (не превращающий предшественники связывающих фибриноген групп) может быть представлен в виде отдельного компонента набора или с носителем и/или фибриногеном. Фактор свертывания крови может быть иммобилизован на носителе, например, связан с каждым предшественником связывающей фибриноген группы.

Если набор согласно настоящему изобретению включает фактор свертывания крови (например, тромбин), последний предпочтительно представляет собой фактор свертывания крови, который предпочтительнее содержит последовательность фактора свертывания человека, а не фактора свертывания другого вида (такого как бычий фактор свертывания крови), что позволяет снизить риск аллергической реакции на фактор свертывания крови.

Биогель или тканевый клей согласно настоящему изобретению можно получить (сформировать) перед введением в участок ткани или in situ в участке ткани, например, в участке образования раны. Биогель или тканевый клей в участке ткани предпочтительно включает носитель для топического введения.

Очевидно, что тромбин может присутствовать в участке ткани, в который вводят или в котором формируют биогель или тканевый клей согласно настоящему изобретению. Например, если участок ткани представляет собой участок кровоточащей раны, тромбин хозяина, скорее всего, присутствует в месте образования раны. Конечно, тромбин может присутствовать в качестве альтернативы или дополнения, если он поставляется вместе с набором согласно настоящему изобретению.

Применение связывающих фибриноген групп, способных связываться с фибриногеном и отдельно с мономером фибрина и/или фибрином, может быть преимущественным, если биогель или клей согласно настоящему изобретению формируется в присутствии тромбина, или его приводят в контакт с тромбином после образования. Если тромбин присутствует одновременно с фибриногеном и носителями, включающими иммобилизованные связывающие фибриноген группы, тромбин превратит по меньшей мере некоторое количество фибриногена в мономеры фибрина. Очевидно, что в таких условиях предпочтительно, чтобы связывающие фибриноген группы также связывались с фибриновыми мономерами, что обеспечивает связывание мономеров фибрина, образованных под действием тромбина друг с другом через носители.

Если биогель или клей согласно настоящему изобретению приводят в контакт с тромбином после формирования, может являться преимуществом, если фибриноген, связанный со связывающими фибриноген группами, способен к превращению в мономер фибрина, и связывающие фибриноген группы остаются связанными с мономером фибрина. В таких условиях нековалентные связи, образованные между фибриногеном и связывающими фибриноген группами, не будут разрушены при превращении фибриногена в мономер фибрина. Также может являться преимуществом, если по меньшей мере некоторое количество мономеров фибрина, связанных со связывающими фибриноген группами, способны ассоциировать с образованием фибрина, оставаясь при этом связанными со связывающими фибриноген группами. В таких условиях образование фибрина может повысить прочность биогеля или тканевого клея.

В случае присутствия тромбина (например, из набора согласно настоящему изобретению или тромбин хозяина в участке образования раны) является предпочтительным предварительный контакт носителей и фибриногена друг с другом перед приведением их в контакт с тромбином, или осуществление контакта носителей, фибриногена и тромбина друг с другом по существу одновременно.

Несмотря на возможность формирования биогеля или тканевого клея при осуществлении контакта тромбина и фибриногена друг с другом перед контактом с носителями, ожидается, что они будут менее полезны, чем биогель или тканевый клей, сформированный путем осуществления контакта носителей и фибриногена друг с другом перед контактом с тромбином, или путем осуществления контакта носителей, фибриногена и тромбина друг с другом по существу в одно и то же время. Это произойдет, потому что тромбин должен превратить молекулы фибриногена в мономеры фибрина, которые затем агрегируют с образованием нерастворимого фибрина перед контактом с носителями. Тем не менее при некоторых обстоятельствах может быть целесообразным получение биогеля или тканевого клея путем осуществления контакта тромбина и фибриногена перед контактом с носителями, например, если тромбин неактивен до или после контакта с носителями.

Также согласно настоящему изобретению предложен способ формирования биогеля, который включает осуществление контакта множества носителей с молекулами фибриногена и тромбина, при этом на каждом носителе иммобилизовано множество связывающих фибриноген групп, и каждая молекула фибриногена может связывать по меньшей мере две связывающие фибриноген группы, с формированием биогеля, в котором мономеры фибрина связаны друг с другом через носители нековалентными связями между связывающими фибриноген группами и фибриновыми мономерами.

Биогель может включать или не включать фибрин. Следовательно, мономеры фибрина могут быть частью фибрина в биогеле, либо мономеры фибрина могут не быть частью фибрина в биогеле.

Также согласно настоящему изобретению предложен биогель, который включает мономеры фибрина и множество носителей, причем каждый носитель включает множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, при этом мономеры фибрина связаны друг с другом через носители нековалентными связями между связывающими фибриноген группами и фибриновыми мономерами.

Дополнительно согласно настоящему изобретению предложен биогель, который включает фибрин и множество носителей, причем каждый носитель включает множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, при этом фибриновые мономеры указанного фибрина связаны друг с другом через носители нековалентными связями между связывающими фибриноген группами и фибриновыми мономерами.

В предпочтительном варианте реализации, биогель представляет собой тканевый клей.

Набор согласно настоящему изобретению может включать Фактор XIII и возможно ионы кальция и тромбин для активации Фактора XIII с образованием Фактора XIIIa (в этом случае ионы кальция и тромбин должны находиться отдельно от Фактора XIII). В качестве альтернативы или дополнения, Фактор XIIIa может присутствовать в участке ткани, куда вводят или в котором формируют биогель или тканевый клей согласно настоящему изобретению. Например, если участок ткани представляет собой участок кровоточащей раны, Фактор XIIIa хозяина скорее всего присутствует в месте образования раны.

Если Фактор XIIIa приводят в контакт с биогелем или тканевым клеем согласно настоящему изобретению, который включает фибрин, прочность биогеля или тканевого клея можно дополнительно повысить с помощью реакции Фактора XIIIa с фибрином, которая обеспечивает ковалентное перекрестное связывание фибрина.

Также согласно настоящему изобретению предложен способ формирования биогеля, который включает: осуществление контакта множества носителей с молекулами фибриногена и тромбина, при этом на каждом носителе иммобилизовано множество связывающих фибриноген групп, и каждая молекула фибриногена может связывать по меньшей мере две связывающие фибриноген группы, с формированием биогеля, включающего фибрин, в котором фибриновые мономеры указанного фибрина связаны друг с другом через носители нековалентными связями между связывающими фибриноген группами и фибриновыми мономерами; и осуществление контакта биогеля с Фактором XIIIa, что обеспечивает ковалентное связывание фибриновых мономеров указанного друг с другом пептидными связями.

Дополнительно согласно настоящему изобретению предложен биогель, который включает фибрин и множество носителей, причем каждый носитель включает множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, при этом фибриновые мономеры указанного фибрина ковалентно связаны друг с другом пептидными связями и фибриновые мономеры указанного фибрина связаны друг с другом через носители нековалентными связями между связывающими фибриноген группами и фибриновыми мономерами.

В предпочтительном аспекте, биогель представляет собой тканевый клей.

Набор согласно настоящему изобретению может дополнительно включать агент, способствующий заживлению раны. Пригодные примеры включают факторы роста, такие как фактор роста тромбоцитов. Указанный агент может представлять собой отдельный компонент набора или может быть иммобилизован на носителе.

Набор согласно настоящему изобретению может дополнительно включать противомикробный агент, например, антибиотик. Указанный противомикробный агент может представлять собой отдельный компонент набора или может быть иммобилизован на носителе.

Очевидно, что если носители, включающие множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на каждом носителе, вводят в участок ткани, в котором присутствует фибриноген хозяина (например, в участок кровоточащей раны), носители будут реагировать с фибриногеном хозяина с образованием биогеля или тканевого клея in situ в указанном участке ткани.

Аналогично, если носители, включающие множество предшественников связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на каждом носителе, вводят в участок ткани, в котором присутствуют превращающий агент для превращения предшественников связывающих фибриноген групп в связывающие фибриноген группы и фибриноген хозяина (например, в участке кровоточащей раны), происходит превращение предшественников связывающих фибриноген групп в связывающие фибриноген группы, и носители будут затем реагировать с фибриногеном хозяина с образованием биогеля или тканевого клея in situ в указанном участке ткани. Например, предшественники связывающих фибриноген групп могут превращаться в связывающие фибриноген группы под действием тромбина хозяина или другого фактора свертывания крови.

Соответственно, дополнительно согласно настоящему изобретению предложен биогель, который включает носители для топического введения, причем каждый носитель включает множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, и эндогенный фибриноген, при этом каждая молекула эндогенного фибриногена связана с по меньшей мере двумя связывающими фибриноген группами благодаря чему происходит связывание молекул фибриногена друг с другом через носители нековалентными связями между связывающими фибриноген группами и молекулами эндогенного фибриногена.

Термин "эндогенный фибриноген" в данной заявке означает, что указанный фибриноген представляет собой фибриноген хозяина, который присутствует в участке, куда вводят носители. Как правило, фибриноген хозяина будет присутствовать, потому что кровь хозяина присутствует в месте образования раны.

Также согласно настоящему изобретению предложено применение носителя для формирования биогеля, носитель включает множество связывающих фибриноген групп или предшественников связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе.

Предпочтительно, биогель представляет собой тканевый клей.

Носитель можно применять для формирования биогеля или тканевого клея для гемостаза, в качестве изолирующего покрытия, для направленной доставки лекарственных препаратов или для тканевой инженерии.

Введение носителя для формирования биогеля или тканевого клея имеет преимущество, заключающееся в том, что риск аллергической реакции хозяина сведен к минимуму, потому что не требуется экзогенный фибриноген или тромбин, не требуются токсичные агенты и носитель без труда можно хранить в стабильном состоянии.

Также настоящее изобретение обеспечивает способ остановки кровотечения в месте, в котором присутствует фибриноген хозяина, который включает топическое введение множества носителей в указанное место, при этом каждый носитель включает множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, и молекулы фибриногена хозяина в этом месте могут связывать по меньшей мере две связывающие фибриноген группы.

Дополнительно настоящее изобретение обеспечивает способ остановки кровотечения на участке, где присутствует фибриноген хозяина и фактор свертывания крови, который включает топическое введение множества носителей в указанный участок, при этом каждый носитель включает множество предшественников связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, и предшественники связывающих фибриноген групп способны к превращению в связывающие фибриноген группы под действием фактора свертывания крови хозяина, и молекулы фибриногена хозяина в данном участке могут связывать по меньшей мере две связывающие фибриноген группы.

Дополнительно согласно настоящему изобретению предложено применение множества носителей в изготовлении медикамента (например, биогеля или тканевого клея) для остановки кровотечения, или для лечения или изолирования (покрытия) раны, при этом каждый носитель включает множество связывающих фибриноген групп или предшественников связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе.

Также согласно настоящему изобретению предложено применение множества носителей, причем каждый носитель включает множество связывающих фибриноген групп или предшественников связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, для формирования биогеля.

Дополнительно предусмотрено, согласно настоящему изобретению, множество носителей для применения (например, в качестве биогеля или тканевого клея) для остановки кровотечения, или для лечения или изолирования раны, при этом каждый носитель включает множество связывающих фибриноген групп или предшественников связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе.

Носители могут быть нерастворимыми или растворимыми. Носители можно вводить топически.

Если носитель представляет собой растворимый носитель, предпочтительной лекарственной формой для топического введения указанного носителя, включающего иммобилизованные связывающие фибриноген группы или предшественники связывающих фибриноген групп, является жидкая лекарственная форма, предпочтительно в изотоническом буфере при физиологическом рН.

Если носитель представляет собой нерастворимый носитель, предпочтительной лекарственной формой для топического применения указанного носителя, включающего иммобилизованные связывающие фибриноген группы или предшественники связывающих фибриноген групп, является форма порошка, который можно распылять, например, на участок ткани.

Носитель в форме порошка может быть получен любым подходящим способом, включая способы, включающие распылительную сушку, или лиофилизацию суспензии носителя, включающего множество связывающих фибриноген групп или предшественников связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на каждом носителе (например, суспендированных в изотоническом буфере при физиологическом рН). Предпочтительно использовать распылительную сушку, так как это может быть более быстрым и легко масштабируемым способом сушки, чем лиофилизация. Пригодные способы распылительной сушки описаны в WO 92/18164.

Согласно настоящему изобретению, предусмотрен агент для формирования биогеля, причем указанный агент включает растворимый носитель, при этом множество связывающих фибриноген групп или предшественников связывающих фибриноген групп иммобилизованы на каждом носителе.

Также согласно настоящему изобретению предложен агент для формирования биогеля, причем указанный агент включает нерастворимый носитель, включающий множество связывающих фибриноген групп или предшественников связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на каждом носителе, при этом агент находится в форме порошка, полученного способом, отличным от лиофилизации.

Также согласно настоящему изобретению предложен способ получения агента в форме порошка, где указанный агент включает нерастворимый носитель, включающий множество связывающих фибриноген групп или предшественников связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на каждом носителе, при этом способ включает распылительную сушку суспензии указанного агента.

Предпочтительно, указанный агент пригоден для местного применения. Если агент включает растворимый носитель с множеством предшественников связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на каждом носителе, указанный агент может быть пригоден для внутривенного введения.

Носитель или агент может быть представлен в виде компонента набора. Указанный набор может дополнительно включать фактор свертывания крови, агент, способствующий заживлению раны, или противомикробный агент. Фактор свертывания крови, агент, способствующий заживлению раны, или противомикробный агент могут представлять собой отдельные компоненты набора, или могут быть иммобилизованы на носителе. В некоторых предпочтительных вариантах реализации, фактор свертывания крови, агент, способствующий заживлению раны, или противомикробный агент могут быть частью предшественника связывающей фибриноген группы, благодаря чему они высвобождаются, когда предшественник связывающей фибриноген группы превращается в связывающую фибриноген группу.

Набор согласно настоящему изобретению может быть набором с отделениями, в котором компоненты набора, которые желательно хранить отдельно друг от друга, содержатся в отдельных ячейках (отсеках) или контейнерах. Набор согласно настоящему изобретению может включать инструкции для применения компонентов набора для реализации способа согласно настоящему изобретению.

Биогель или тканевый клей согласно настоящему изобретению можно топически вводить в участок ткани, например, в кожу или слизистую оболочку. Биогель или тканевый клей согласно настоящему изобретению можно применять для гемостаза, в качестве изолирующего покрытия, для направленной доставки лекарственных препаратов или для тканевой инженерии.

Биогель или тканевый клей согласно настоящему изобретению можно вводить путем формирования геля или клея перед приведением геля или клея в контакт с участком введения, или путем формирования биогеля или тканевого клея на участке введения.

Также очевидно, что агент, включающий растворимый носитель, в котором множество предшественников связывающих фибриноген групп, каждый из которых может быть превращен в связывающую фибриноген группу, иммобилизованы на каждом носителе, можно вводить внутривенно, например, для остановки кровотечения или для доставки лекарственных препаратов. Предпочтительная лекарственная форма для внутривенного введения представляет собой 20% водный изотонический раствор. В предпочтительном варианте реализации, предшественники способны к превращению под действием тромбина.

Дополнительно согласно настоящему изобретению предложен способ остановки кровотечения, который включает внутривенное введение агента, включающего растворимый носитель, при этом множество предшественников связывающих фибриноген групп, каждый из которых может быть превращен в связывающую фибриноген группу, иммобилизованы на каждом носителе.

Дополнительно согласно настоящему изобретению предложен способ доставки лекарственного препарата субъекту, который включает внутривенное введение агента, включающего растворимый носитель, субъекту, при этом множество предшественников связывающих фибриноген групп, каждый из которых может быть превращен в связывающую фибриноген группу, иммобилизованы на каждом носителе, и при этом носитель включает лекарственный препарат, или лекарственный препарат иммобилизован на носителе.

Безусловно, лекарственные формы для топического или внутривенного введения должны быть стерильными.

Биогель или тканевый клей согласно настоящему изобретению может дополнительно включать агент, способствующий заживлению раны, или противомикробный агент.

Также согласно настоящему изобретению предложен способ остановки кровотечения, который включает топическое введение биогеля или тканевого клея согласно настоящему изобретению в участок кровотечения.

Также согласно настоящему изобретению предложен способ лечения или изолирования раны, который включает введение (предпочтительно топическое) биогеля или тканевого клея согласно настоящему изобретению в участок образования раны.

Также согласно настоящему изобретению предложен биогель или тканевый клей согласно настоящему изобретению для применения в качестве медикамента.

Дополнительно согласно настоящему изобретению предложено применение биогеля или тканевого клея согласно настоящему изобретению в производстве медикамента для остановки кровотечения, или для лечения или изолирования раны.

Также согласно настоящему изобретению предложен биогель или тканевый клей согласно настоящему изобретению для остановки кровотечения, или для лечения или изолирования раны.

Применение биогеля или тканевого клея согласно настоящему изобретению может представлять собой топическое применение. Если биогель или тканевый клей получен с применением растворимого носителя и связывающие фибриноген группы получены из предшественников связывающих фибриноген групп, применение может быть внутривенным.

Предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения описаны исключительно в качестве примеров.

Согласно первому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения, множество пептидов, каждый из которых включает последовательность связывания фибриногена в аминоконцевом участке (например, пептиды, имеющие последовательность GPRPGGGGGGC (SEQ ID NO:24)), связаны по своим карбоксильным концам с носителем, который представляет собой растворимый белок (такой как альбумин). Биогель получают путем осуществления контакта связанного с пептидом носителя с фибриногеном. Указанный биогель затем можно применять топически, в форме повязки на рану.

Согласно второму предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения, связанный с пептидом носитель согласно первому предпочтительному варианту реализации и фибриноген смешивают в участке образования раны с формированием биогеля in situ.

Согласно третьему предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения, связанный с пептидом носитель согласно первому предпочтительному варианту реализации вводят в участок образования раны, в котором присутствует фибриноген из крови хозяина с получением биогеля in situ.

Согласно четвертому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения, множество пептидов, каждый из которых включает последовательность, связывающую фибриноген, соединенную по аминоконцевой области с блокирующей пептидной последовательностью (например, пептиды, имеющие последовательность LVPRGPRPGGGGGGC (SEQ ID NO:25)), связаны по своим карбоксильным концам с носителем, который представляет собой растворимый белок (такой как альбумин). Связанный с пептидом носитель может быть объединен с фибриногеном с последующим нанесением на рану в виде единой смеси. Тромбин хозяина, присутствующий в участке с раной, расщепляет пептиды с высвобождением блокирующих пептидов, при этом открывается доступ к последовательности, связывающей фибриноген. Носитель с доступной последовательностью, связывающей фибриноген, реагирует с фибриногеном с формированием биогеля in situ.

В качестве альтернативы, связанный с пептидом носитель из четвертого предпочтительного варианта реализации можно вводить внутривенно. Тромбин хозяина в месте раны расщепляет пептиды с высвобождением блокирующих пептидов, при этом обеспечивается доступ к последовательности, связывающей фибриноген. Носитель с доступными последовательностями, связывающими фибриноген, реагирует с фибриногеном хозяина для остановки кровотечения в месте образования раны.

Биогель из четырех предпочтительных вариантов реализации, описанных выше, может представлять собой тканевый клей.

Нерастворимый носитель (например, альбуминовую микросферу) можно применять вместо растворимого белкового носителя в любом из описанных выше предпочтительных вариантов реализации (за исключением внутривенного введенияе).

В качестве растворимого белкового носителя в любом из описанных выше предпочтительных вариантов реализации можно применять разветвленный полиэтиленгликоль (PEG) или любой другой биосовместимый полимер.

В любом из описанных выше предпочтительных вариантов реализации фактор свертывания крови может быть иммобилизован на носителе при условии, что если предшественники связывающих фибриноген групп иммобилизованы на носителе, фактор свертывания крови не превращает предшественники связывающих фибриноген групп в связывающие фибриноген группы.

Носитель может дополнительно включать агент, способствующий заживлению раны (например, фактор роста, такой как фактор роста тромбоцитов) в любом из описанных выше предпочтительных вариантов реализации.

Дополнительные предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения описаны в следующих примерах со ссылками на прилагаемые фигуры, в которых:

На Фигуре 1 схематически показаны: (а) альбуминовый носитель, включающий множество связывающих фибриноген пептидов, иммобилизованных на носителе; (b) молекула фибриногена; и (с) биогель, в котором молекулы фибриногена связаны друг с другом через носители нековалентными связями между связывающими фибриноген пептидами и молекулами фибриногена;

На Фигуре 2 показан график динамического модуля упругости (квадраты) и модуля потерь (треугольники) в зависимости от процента деформации в смеси 25 мкл модифицированного пептидами сывороточного альбумина человека (ЧСА) и фибриногена при 32 мг/мл при 20°С (А) и 37°С (В);

На Фигуре 3 показаны динамический модуль упругости (квадраты) и комплексная вязкость (треугольники) в зависимости от частоты при 20°С (с 1% амплитудой относительной деформации), для 25 мкл модифицированного пептидами ЧСА, смешанного с фибриногеном при 32 мг/мл; и

На Фигуре 4 показаны фотографии раствора фибриногена до (а) и после (b) добавления модифицированного пептидами ЧСА.

Пример 1

Формирование биогеля или тканевого клея с применением фибриногена и связывающих фибриноген пептидов, иммобилизованных на носителе, включающем сывороточный альбумин человека

Сывороточный альбумин человека (ЧСА) приводили в контакт с 40-кратным молярным избытком линкера сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)цикпогексан-1-карбоксилата (SMCC) при рН 7.4. Модифицированный белок (ЧCA-SMCC) очистили и определили, что в среднем один моль ЧСА был модифицирован 18 молями SMCC. К ЧСА-SMCC добавляли либо пептид GPRPGGGGGGC (B10; SEQ ID NO:24), либо пептид LVPRGPRPGGGGGGC (TC-15; SEQ ID NO:25) при 1.5-молярном избытке по отношению к молекулам малеимида. Модифицированный пептидами белок ЧСА затем очищали от непрореагировавшего пептида и хранили при -80°С при концентрации 7 мг/мл. Лиофилизированный фибриноген человека растворяли в воде до 16 мг/мл, согласно рекомендации поставщика (Scottish National Blood Transfusion service).

Модифицированный пептидами ЧСА (5 мкл) добавляли к 0.3 мл раствора фибриногена, образование быстрорастворимого геля наблюдали для В10-ЧСА, но для ТС-15 не наблюдали образования геля. Известно, что открытая последовательность пептида GPRP связывается с карманом "а" в карбонильном участке двух дистальных доменов (D) фибриногена (Фигура 1b). Полагают, что ЧСА, модифицированный множеством открытых последовательностей GPRP (B10), действует как точка ветвления при полимеризации фибриногена (Фигура 1с). Описанный гель получен в отсутствие тромбина.

Способы для Примеров 2-5

Синтез модифицированного пептидами ЧСА

Сывороточный альбумин человека (ЧСА) в концентрации 10 мг/мл приводили в контакт с 5, 10, 20 или 40-кратным молярным избытком линкера сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (сульфо-SMCC) при pH 7.4 в суммарном объеме, равном 0.7 мл. Модифицированный белок (ЧСА-SMCC) очищали с помощью центрифужной колонки Zebra™ Desalt Spin Column (Pierce, Рокфорд, Иллинойс), и определили, что в среднем один моль ЧСА был модифицирован 5, 8, 16 или 18 молями сульфо-SMCC, соответственно. Чтобы определить количество связавшихся малеимидных групп на 1 молекулу ЧСА, образец с 3 наномолями ЧСА инкубировали с известным количеством цистеина (100 наномолями) в буфере при комнатной температуре в течение 30 мин. Оставшийся цистеин затем приводили в контакт с 1 милимолем 5,5-дитиобис(2-нитробензоата) (DTNB) в течение 20 мин и измеряли A₄₁₂. Уровень малеимида рассчитывали путем сравнения абсорбции контрольного и белкового образцов. К ЧСА-SMCC добавляли либо пептид GPRPGGGGGGC (B10; SEQ ID NO:24), либо пептид LVPRGPRPGGGGGGC (ТС-15; SEQ ID NO:25) при 1.5-молярном избытке по отношению к молекулам малеимида. Модифицированный пептидами белок ЧСА затем очищали от непрореагировавшего пептида, применяя Zebra™ Desalt Spin Column (Pierce, Рокфорд, Иллинойс) и хранили при -80°С при концентрации 7 мг/мл. Лиофилизированный фибриноген человека (Scottish National Blood Transfusion service, Эдинбург, Шотландия) растворяли в воде до 8, 16, 32 и 64 мг/мл. Концентрацию фибриногена и альбумина определяли по абсорбции на 280 нм (A₂₈₀), применяя коэффициент пересчета для 1% Фибриногена Е₂₈₀=15 и 1% ЧСА Е₂₈₀=13.8.

Реологическое исследование

Для оценки вязкоупругих свойств гелей использовали динамические измерения колебаний. Смеси позволяли уравновеситься при комнатной температуре в течение ночи и гель переносили в нижнюю чашу реометра Physica MCR-501 (Anton Paar, Германия) с конусом и чашей, с диаметром чаши 25 мм и углом конуса 1°. Анализы выполняли либо при 20, либо при 37±°С в увлажненной атмосфере. Развертки по частоте выполняли между 0.01 и 50 Гц при постоянной амплитуде относительной деформации, равной 1%. Исследуемые реологические параметры обрабатывали с помощью специально разработанного программного обеспечения Anton Paar, поставляемого вместе с реометром.

Пример 2.

Влияние количества модифицированного пептидами ЧСА и концентрации фибриногена на образование геля

За полимеризацией фибриногена сначала наблюдали визуально после смешивания фибриногена с растворами ЧСА. Модифицированный пептидами ЧСА, модифицированный 5, 8, 16 или 18 молями связывающих фибриноген пептидов, конъюгировали с одним молем ЧСА. 25 мкл образца модифицированного пептидами ЧСА или немодифицированного ЧСА смешивали с 0.2 мл фибриногена при 8, 16, 32 или 64 мг/мл. Образование геля визуально обнаруживали через 0.5 ч при комнатной температуре. Для немодифицированного ЧСА или ЧСА, модифицированного 5 или 8 молями пептида, не наблюдали образования геля при всех тестируемых концентрациях фибриногена. Полимеризацию наблюдали лишь для 32 или 64 мг/мл фибриногена с модифицированным пептидами ЧСА с 16 или 18 молями связывающего пептида.

На Фигуре 4 показаны фотографии раствора фибриногена (0.2 мл 32 мг/мл фибриногена) перед (а) и после (b) добавления модифицированного пептидами ЧСА (25 мкл, 18 моль пептида). Биогель, полученный согласно настоящему изобретению, представлен на Фигуре 4 (b).

Пример 3.

Влияние количества модифицированного пептидами ЧСА

Для определения влияния количества модифицированного пептидами ЧСА и фибриногена на реологические свойства смесей, определяли меру сопротивления сдвигу для 25 или 50 мкл модифицированного пептидами ЧСА с фибриногеном при 32 и 64 мг/мл. В этом эксперименте использовали модифицированный пептидами ЧСА, который был модифицирован 16 молями связывающего пептида на 1 моль ЧСА. Чтобы обеспечить проведение экспериментов по динамическому измерению колебаний в пределах линейной вязкоупругой деформации геля, осуществляли исследование диапазона напряжений (деформаций). На Фигуре 2 показаны развертки по напряжению при 20 и 37°С для 25 мкл модифицированного пептидами ЧСА, смешанного с фибриногеном при 32 мг/мл. Как динамический модуль упругости (G'), так и модуль потерь (G') были очевидно стабильны на всем диапазоне и постоянную деформацию, равную 1%, выбирали в рамках этого диапазона линейной вязкоупругой деформации. Развертки по частоте показали значение G', которое было больше, чем G", что свидетельствует о наличии поперечно сшитой сети (Таблица 1). Значения, показанные в этой Таблице, были получены при частоте, равной 1 Гц. Тангенс дельта представляет собой отношение модуля потерь к динамическому модулю упругости. Следовательно, он представляет собой количественное выражение вкладов упругой и вязкой компонент, при этом значение выше 1 свидетельствует о вязком поведении, близком к жидкости, а ниже 1 указывает на упругое поведение. Комплексную вязкость η*, определенную как комплексный модуль G*, поделенный на круговую частоту (ω), определяли при тех же условиях. Видимо, при этих условиях количество как ЧСА, модифицированного пептидами, так и фибриногена не оказывает существенного влияния на механическую прочность геля.

Таблица 1 Фибриноген (мг/мл) 32 64 Модифицированный пептидами ЧСА (мкл) 25 50 25 50 Динамический модуль упругости (G') 432 439 421 588 Комплексная вязкость (η*) 88 70 77 94 Тангенс дельта 0.22 0.11 0.24 0.2

Для другой партии модифицированного пептидами ЧСА с 18 пептидами, связанными с 1 молекулой ЧСА (25 мкл), с 32 мг/мл фибриногена показали G', равную 5200, комплексную вязкость, равную 820, и тангенс дельта, равный 0.105.

Пример 4.

Влияние температуры на реологические свойства

Исследования влияния температуры на гель важны для применений данного продукта при хирургической температуре тела или при топическом нанесении. Мы оценили механическую прочность геля при 20 и 37°С, и значения, приведенные в Таблице 2, были получены для частоты, равной 1 Гц. Повышение температуры геля, полученного из фибриногена в концентрации 32 мг/мл и 25 мкл ЧСА, модифицированного 16 молями пептида, приводило к уменьшению как G, так и комплексной вязкости (Таблица 2). Для обеих температур 20 и 37°С тангенс дельта был ниже 1, следовательно, связанная поперечными (нековалентными) связями сетчатая структура сохранялась при 37°С.

Таблица 2 Температура (°С) 20 37 Динамический модуль упругости (G') 432 109 Комплексная вязкость (η*) 88 21 Тангенс дельта 0.22 0.72

Пример 5

Формирование геля в плазме крови человека

Исследование того, может ли модифицированный пептидами ЧСА полимеризовать фибриноген в плазме человека, важно для применения данного продукта в качестве хирургического клея/адгезива. Модифицированный пептидами ЧСА (75 мкл), модифицированный 18 молями пептида, смешивали с 0.8 мл смешанной плазмы человека. Реологическое исследование геля, полученного в плазме, выполняли при 37°C и получили значение G', равное 6100, и тангенс дельта, равный 0.104. Из этого результата заключили, что модифицированный пептидами ЧСА может полимеризовать фибриноген в плазме человека с образованием связанной поперечными (нековалентными) связями сетчатой структуры при 37°C.

Группа изобретений относится к области фармацевтики. Созданы агент для формирования биогеля, биогели для гемостаза, закрытия ран, тканевой инженерии или направленной доставки лекарственных средств. Агент содержит растворимый носитель, на котором иммобилизированно множество связывающих фибриноген групп. Биогель, который содержит молекулы фибриногена и множество растворимых носителей, подходящих для внутривенного и/или для местного введения, причем каждый носитель содержит множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, и каждая молекула фибриногена связана с по меньшей мере двумя связывающими фибриноген группами таким образом, что молекулы фибриногена оказываются связанными друг с другом через носители посредством нековалентных связей между связывающими фибриноген группами и молекулами фибриногена. Биогель, содержащий мономеры фибрина и множество растворимых носителей, подходящих для внутривенного и/или для местного введения, в котором каждый носитель содержит множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, а мономеры фибрина связаны друг с другом через носители посредством нековалентных связей между связывающими фибриноген группами и мономерами фибрина. Биогель, содержащий фибрин и множество растворимых носителей, подходящих для внутривенного и/или для местного введения, в котором каждый носитель содержит множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, и при этом мономеры фибрина в фибрине ковалентно связаны друг с другом пептидными связями, и мономеры фибрина в фибрине связаны друг с другом через носители нековалентными связями между связывающими фибриноген группами и мономерами фибрина. Способ формирования биогеля, включающий осуществление контакта молекул фибриногена с множеством растворимых носителей. Способ остановки кровотечения путем топического введения биогеля в месте кровотечения или раны. Применение множества растворимых носителей, подходящих для внутривенного и/или для местного введения. Фармацевтический состав для топического введения, содержащий биогель, агент или множество растворимых носителей. Использование заявленного изобретения позволяет получить средства, которые не требуют использования токсических реагентов, имеют минимальный риск аллергических реакций, и которые с легкостью можно получить и использовать. 11 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 ил., 5 пр.

1. Агент для формирования биогеля для гемостаза, закрытия ран, тканевой инженерии или направленной доставки лекарственных средств, содержащий растворимый носитель, подходящий для внутривенного и/или для местного введения, причем на каждом носителе иммобилизовано множество связывающих фибриноген групп, таким образом, что при осуществлении контакта с фибриногеном, каждая молекула фибриногена связывается по меньшей мере с двумя указанными связывающими фибриноген группами, что приводит к образованию биогеля, в котором молекулы фибриногена связаны друг с другом через носители, посредством образования нековалентных связей между молекулами фибриногена и указанными связывающими фибриноген группами.

2. Агент по п.1 для применения в качестве медикамента.

3. Биогель для гемостаза, закрытия ран, тканевой инженерии или направленной доставки лекарственных средств, содержащий молекулы фибриногена и множество растворимых носителей, подходящих для внутривенного и/или для местного введения, причем каждый носитель содержит множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, и каждая молекула фибриногена связана с по меньшей мере двумя связывающими фибриноген группами таким образом, что молекулы фибриногена оказываются связанными друг с другом через носители посредством нековалентных связей между связывающими фибриноген группами и молекулами фибриногена.

4. Биогель для гемостаза, закрытия ран, тканевой инженерии или направленной доставки лекарственных средств, содержащий мономеры фибрина и множество растворимых носителей, подходящих для внутривенного и/или для местного введения, в котором каждый носитель содержит множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, а мономеры фибрина связаны друг с другом через носители посредством нековалентных связей между связывающими фибриноген группами и мономерами фибрина.

5. Биогель для гемостаза, закрытия ран, тканевой инженерии или направленной доставки лекарственных средств, содержащий фибрин и множество растворимых носителей, подходящих для внутривенного и/или для местного введения, в котором каждый носитель содержит множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, и при этом мономеры фибрина в фибрине ковалентно связаны друг с другом пептидными связями, и мономеры фибрина в фибрине связаны друг с другом через носители нековалентными связями между связывающими фибриноген группами и мономерами фибрина.

6. Биогель по любому из пп.3-5 для применения в качестве медикамента.

7. Способ формирования биогеля, включающий осуществление контакта молекул фибриногена с множеством растворимых носителей подходящих для внутривенного и/или для местного введения, причем каждый носитель содержит множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, и каждая молекула фибриногена может связывать по меньшей мере две связывающие фибриноген группы таким образом, что происходит связывание молекул фибриногена друг с другом через носители путем образования нековалентных связей между связывающими фибриноген группами и молекулами фибриногена.

8. Способ формирования биогеля, включающий осуществление контакта молекул фибриногена с агентом для формирования биогеля по п.1.

9. Способ остановки кровотечения, или лечения или изолирования раны, включающий топическое введение в месте кровотечения или раны биогеля по любому из пп.3-5 или множества растворимых носителей, подходящих для внутривенного и/или для местного введения, при этом каждый носитель содержит множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, а переносящие фибриноген молекулы в указанном месте могут связывать по меньшей мере две связывающие фибриноген группы.

10. Применение множества растворимых носителей, подходящих для внутривенного и/или для местного введения, где каждый носитель содержит множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на носителе, для формирования биогеля или для получения медикамента, содержащего биогель, для остановки кровотечения или для лечения или изолирования раны.

11. Применение по п.10 для формирования биогеля, применяемого для гемостаза, в качестве изолирующего покрытия, для направленной доставки лекарственных средств или для тканевой инженерии.

12. Применение биогеля по любому из пп.3-5 для гемостаза, в качестве изолирующего покрытия, для направленной доставки лекарственных средств или для тканевой инженерии, или для получения лекарственного средства для остановки кровотечения или лечения или изолирования раны.

13. Применение агента по п.1 для гемостаза, в качестве изолирующего покрытия, для направленной доставки лекарственных средств или для тканевой инженерии, или для получения лекарственного средства для остановки кровотечения или лечения или изолирования раны.

14. Фармацевтический состав для топического введения, содержащий биогель по любому из пп.3-5, агент по п.1, или множество растворимых носителей, подходящих для внутривенного и/или для местного введения, где каждый носитель содержит множество связывающих фибриноген групп, иммобилизованных на указанном носителе.