СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИПА ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО РЕВМАТИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНОВИАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/68 

Артрит представляет собой воспаление суставов, которое характеризуется следующими симптомами: боль, опухание, гипертермия, ограничение подвижности, выпот в полость суставов, эмфизема суставов, иногда эритема. При хроническом развитии заболевания возможно также возникновение эрозий, которые могут приводить к изменению и разрушению сустава. Прогрессирование заболевания может приводить к нарушениям осанки, укорочению мышц и ригидности, часто поражающим прежде всего небольшие суставы ног и рук.

Существует очень много различных форм артрита, которые можно классифицировать согласно различным критериям. С позиций прогноза и терапии артритного заболевания важно, чтобы тип артрита и причину этого артрита можно было диагностировать как можно легче, раньше и надежнее для того, чтобы иметь возможность как можно раньше выбрать наиболее эффективную терапию. Примерно у половины пациентов, страдающих недифференцированным артритом, в течение последующих 5 лет развивается существенное ограничение функции пораженных суставов, в то время как у остальных наблюдается слабое развитие заболевания, иногда даже при отсутствии терапии. Таким образом, желательно иметь возможность прогнозирования дальнейшего развития заболевания.

При создании настоящего изобретения было установлено, что определенный белок, обозначенный как Hdj2, который в здоровом организме присутствует только внутри клетки, часто и в значительных количествах встречается у пациентов, страдающих ревматоидным артритом (ниже в настоящем описании обозначен как РА), на ранней стадии заболевания в синовиальных жидкостях, что позволяет отличать пациентов с ревматоидным артритом от остальных пациентов, которые также страдают воспалительным ревматическим заболеванием (но другого типа).

Hdj2, представляющий собой в здоровом организме внутриклеточный J-белок, встречается в виде внеклеточной молекулы в синовиальных жидкостях у пациентов, страдающих ревматоидным артритом (РА), существенно чаще, чем в синовиальных жидкостях у пациентов, страдающих другими артритидами (не-РА-пациенты). Присутствие Hdj2 в синовиальных жидкостях достоверно коррелирует с возникновением двух аутоантител, ассоциированных с РА (ревматоидный фактор, антитело к циклическому цитруллиновому пептиду (ССР)). Установлено, что у страдающих РА пациентов (РА-пациенты) уровень Hdj2 положительно коррелирует со степенью воспаления, оцениваемой по количеству инфильтрующих лейкоцитов. Выраженная сверхэкспрессия Hdj2 имеет место в клетках синовиальной выстилки у пациентов, страдающих РА, но не в синовиальной ткани у пациентов, страдающих остеоартритом.

J-белок Hdj2 (DNAJA1, Hsj2, Hsdj, dj-2) представляет собой один из примерно 40 известных человеческих J-белков. J-белки характеризуются наличием высококонсервативного J-домена, который обладает высокой степенью гомологии с DnaJ E.coli (поэтому их называют также DnaJ-подобными белками). J-белки рассматриваются в качестве ко-шаперонов представителей семейства HSP70, с которыми они взаимодействуют посредством J-домена, и функционируют по типу механизма действия шаперонов. Уже известная матричная РНК представлена в перечне последовательностей в виде последовательности ДНК под номером SEQ ID NO:1.

Нуклеиновая кислота кодирует белок Hdj2. Уже известная аминокислотная последовательность представлена в перечне последовательностей в виде SEQ ID NO:2.

При создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что Hdj2 можно применять в качестве раннего маркера для установления диагноза ревматоидного артрита, поскольку именно на ранних стадиях заболевания выявляют повышенное содержание Hdj2 в синовиальной жидкости пациентов, у которых в дальнейшем развивается ревматоидный артрит. Это является неожиданным, поскольку в проведенных ранее исследованиях было установлено, что Hdj2 выявляют также в синовиальной жидкости пациентов, у которых развиваются различные формы ревматического заболевания. В данном случае важной особенностью настоящего изобретения является то, что Hdj2 появляется в синовиальной жидкости на ранних стадиях заболевания у тех пациентов, у которых позднее развивается ревматоидный артрит. В отличие от этого у пациентов, у которых развиваются другие формы воспалительного ревматического заболевания, указанный маркер в синовиальной жидкости не появляется совсем или появляется лишь в очень малых количествах.

Воспалительные ревматические заболевания часто начинаются с болезненного опухания суставов. При РА еще одним ранним признаком является так называемая утренняя скованность, которая продолжается в течение более 1 ч. Воспалительный полиартрит, при котором поражаются более трех областей суставов, которые включают суставы кисти и пальцев и которые имеют симметричное расположение, может представлять собой ранний РА. Клинические признаки раннего РА должны сохраняться в течение по меньшей мере 6 недель для того, чтобы можно было установить диагноз. В крови можно обнаружить аутоантитела, такие как ревматоидный фактор и антитело к ССР. Эти аутоантитела иногда предшествуют появлению симптомов, но могут также возникать и позднее. В отличие от этого эрозии и ревматоидные узлы развиваются только при дальнейшем развитии заболевания. Степень опуханий, утренняя скованность и боль могут сильно варьироваться в процессе развития заболевания. Недифференцированный артрит все еще остается неизученным и не классифицированным. При установлении диагноза в течение первых 2-3 лет его все еще можно рассматривать как ранний (ревматоидный) артрит. У пациентов, страдающих недифференцированным артритом, часто можно выявить только 2-3 из ACR-критериев (критерии, разработанные Специальным Комитетом Американского Колледжа Ревматологии (ACR)), и клинические признаки артрита часто сохраняются лишь в течение 4 недель. Таким образом, с помощью ACR-критериев нельзя классифицировать пациентов как страдающих РА пациентов.

В контексте настоящего описания понятие «ранняя стадия заболевания» относится к интервалу времени, который начинается с момента возникновения ревматоидных состояний и продолжается в течение периода времени, составляющего вплоть до трех лет, предпочтительно вплоть до двух лет, более предпочтительно вплоть до одного года и наиболее предпочтительно вплоть до шести месяцев. Под началом воспалительного ревматического состояния подразумевают возникновение первых симптомов. К первым симптомам относятся утренняя скованность, продолжающаяся в течение более одного часа, и возникновение опуханий суставов. При прогрессировании воспалительного ревматического заболевания возникает артрит в двух или большем количестве областей суставов, прежде всего артрит суставов рук и пальцев. Ревматоидные узлы, как правило, появляются намного позже.

Другим симптомом начала воспалительного ревматического заболевания может быть опухание более двух суставов, продолжающееся в течение более шести недель. Истинный момент возникновения воспалительного ревматического состояния очень трудно определить точно. Первые симптомы оцениваются пациентами субъективно и только очень в редких случаях можно указать точную дату. Таким образом, в этих случаях момент установления первого диагноза воспалительного ревматического заболевания определяют как момент времени, когда начинается ранняя фаза заболевания.

Hdj2 можно применять в качестве раннего маркера РА, поскольку его оказалось возможным обнаружить в синовиальной ткани (одна пациентка, см. пример 1) и в синовиальной жидкости (несколько пациентов, см. таблицу 1) до установления диагноза указанного заболевания. Его можно применять в качестве маркера для дифференциальной диагностики РА, поскольку он присутствовал у индивидуумов со спорными диагнозами, у которых позднее действительно был подтвержден диагноз РА или он был установлен вместо первоначального диагноза (таблица 1). Hdj2 был выявлен в момент установления диагноза в синовиальной жидкости пациентов, страдающих РА, которые, поскольку их симптомы удовлетворяли ≥4 из 7 критериев ACR, были уверенно классифицированы как страдающие РА (таблица 2). Кроме того, в момент установления диагноза Hdj2 не был выявлен в синовиальной жидкости пациентов, которые не были классифицированы как страдающие РА (таблица 2). Для синовиальных жидкостей пациентов, находящихся на ранней стадии артрита (не более чем 2 года после первого установления диагноза), была выявлена аналогичная картина, а именно, Hdj2 присутствовал у пациентов с РА, но отсутствовал у пациентов с другим диагнозом (соответствующие данные обобщены в таблице 3).

Ревматоидный артрит представляет собой заболевание не только одного или нескольких суставов, он представляет собой заболевание, поражающее весь организм. Ревматоидный артрит представляет собой наиболее часто встречающуюся форму воспаления суставов, которое при отсутствии лечения приводит к разрушению суставов, преждевременной потере работоспособности и, поскольку оно является системным заболеванием и поражает также внутренние органы, например, в результате эндотелиальной дисфункции, к повышенной заболеваемости.

При ревматоидном артрите происходит нарушение нормальных воспалительных процессов в суставах. Истинный причинный фактор, инициирующий это заболевание, до сих пор не идентифицирован, однако ревматоидный артрит относят к аутоиммунным заболеваниям. Патогенез заболевания еще не изучен. Предполагается, что в данном случае играют роль, как генетические факторы, так и факторы окружающей среды; заболевание может быть обусловлено также многими факторами. Поскольку родственники пациента, как правило, имеют повышенный риск того, что они также заболеют ревматоидным артритом, предполагается, что он может иметь генетические основы. Однако, в настоящее время известно лишь небольшое количество генов или аллелей, которые ассоциированы с ревматоидным артритом и встречаются у более крупной группы пациентов.

Согласно современным данным наиболее важной с точки зрения генетической ассоциации является ассоциация ревматоидного артрита с характеризующимся очень большой степенью полиморфности комплексом HLA. Индивидуумы, в организме которых присутствует(ют) один или два аллеля HLA-DRBI, имеющий(е) аминокислотный мотив, известный как «наследуемый эпитоп» (shared epitope, SE), имеют более высокий риск возникновения заболевания, чем индивидуумы, в организме которых отсутствует такой мотив, однако имеется также большое количество здоровых индивидуумов, имеющих «наследуемый эпитоп» (SE). Указанный мотив состоит из 5 аминокислот и с помощью однобуквенного кода он может быть представлен как QKRAA, QRRAA или RRRAA. Среди кавказской популяции в Европе и Северной Америке наиболее часто встречающимся SE является QKRAA.

HLA-DRB1-гены кодируют молекулы HLA-DR, которые играют важную роль в качестве молекул ГКГ класса II в иммунном ответе. Указанные молекулы презентируют на поверхности антигенпрезентирующих клеток пептиды, которые могут происходить из антигенов (например, в случае инфекции) или из аутоантигенов (например, в случае аутоиммунного заболевания). После этого может происходить активация Т-лимфоцитов, которые в свою очередь помогают В-лимфоцитам синтезировать антитела к антигенам или аутоантигенам. Образование аутоантител, которые взаимодействуют с аутоантигенами, представляет собой характерную особенность аутоиммунного ответа. Таким образом, РА можно рассматривать также как аутоиммунное заболевание, поскольку имеет место генетическая ассоциация с аллелями HLA-DRB1 и образование аутоантител (ревматоидный фактор, который распознает человеческий IgG, и обнаруженный в последние годы еще один класс аутоантител к цитруллинированным белкам, которые в совокупности можно обозначить в настоящем описании как антитела к ССР).

Кроме того, важно отметить, что «наследуемый эпитоп» был выявлен не только на молекулах HLA-DR; последовательность QKRAA встречается также у многих бактерий. Примером может служить Е. coli (кишечная бактерия) и ее белок DnaJ. Он несет J-домен, в котором локализован мотив SE QKRAA. Кроме того, было установлено, что SE, присутствующий в DnaJ, имеет важное значение для взаимодействия с молекулой-партнером DnaJ, а именно DnaK (E. coli). DnaK представляет собой белок теплового шока (HSP), относящийся к семейству HSP70. Белки семейства HSP70 присутствуют во всех организмах, подобно взаимодействующим с ними J-белкам (название происходит от J-домена DnaJ). Белки семейства HSP70 и J-белки вместе образуют структуру шаперонов (в переводе шаперон - «пожилая дама, сопровождающая молодую девушку»). Так, они участвуют в правильной укладке других белков, что, например, оказывается необходимым для выживания клетки после того, как она была подвергнута тепловому шоку.

У человека имеется примерно 12 генов, кодирующих белки семейства HSP70, и >40 генов, кодирующих J-белки. Для многих из них известны лишь нуклеотидные последовательности. Структуры шаперонов, соответствующие разнообразным комбинациям HSP70/J-6enoK, которые присутствуют внутри клеток, участвуют во многих функциях клеток не только в стрессовых ситуациях, но также, например, и в транспорте или синтезе белков. Они могут участвовать также и презентации антигенов. Мотив «наследуемого эпитопа» не обнаружен в более детально изученных человеческих J-белках.

В синовиальной ткани пациентов, страдающих РА, имеет место очень сильная сверхэкспрессия по меньшей мере одной молекулы белка семейства HSP70 (Hsc70) и одного J-белка (Hdj2). Известно, что они оба функционируют совместно друг с другом и что Hsc70 играет очень важную роль в аллель-специфической презентации антигенов в организме DRB1*0401-позитивных индивидуумов.

Не ограничиваясь какой-либо одной конкретной теорией можно считать, что в контексте настоящего изобретения аллель-специфическая презентация антигенов происходит при начале заболевания. Следовательно участвующие в этом молекулы, к которым может принадлежать также Hdj2, можно применять в качестве маркера возникновения и развития ревматоидного артрита. Указанный маркер можно использовать в качестве маркера для дифференциального диагноза с целью распределения пациентов на подгруппы, для мониторинга прогрессирования заболевания, прогноза и также для проверки эффективности терапии. При создании изобретения неожиданно было установлено, что белок Hdj2, т.е. белок, который в здоровом организме имеет внутриклеточную локализацию, появляется вне клетки в синовиальной жидкости и вследствие наличия прямой корреляции позволяет осуществлять классификацию воспалительного ревматического заболевания. Наиболее неожиданным является то, что указанное появление имеет место на относительно ранней стадии заболевания, что позволяет устанавливать ранний диагноз.

При возникновении артрита суставы часто опухают и после этого такие суставы подвергают пункции в качестве терапевтической меры. Взятую при этом синовиальную жидкость анализируют для выяснения причины локального состояния и для получения информации о рассматриваемом заболевании. Проводят изучение физических и химических свойств, воспалительных маркеров (С-реактивный белок; присутствие лейкоцитов), можно выявлять также присутствие кристаллов (подагра) или антител (таких, например, как ревматоидный фактор). Пункцию осуществляют при очень многих воспалительных, а также невоспалительных заболеваниях.

При возникновении артрита часто не удается определить, к какому типу артрита он относится (недифференцированный артрит). Существует много различных форм, РА представляет собой лишь одну из них. Желательно иметь надежный прогноз дальнейшего развития заболевания для того, чтобы можно было предупреждать серьезные последствия.

В настоящее время для диагностики РА применяют так называемые критерии ACR, при этом для того, чтобы заболевание было классифицировано как РА, требуется, чтобы были удовлетворены по меньшей мере 4 из 7 возможных критериев. Однако часто это оказывается невозможным при начале заболевания. Еще более трудно сделать ранний прогноз о дальнейшем развитии РА, который имеет очень важное значение для выбора терапии. Среди 7 критериев ACR имеется лишь один лабораторный параметр (ревматоидный фактор: антитело к IgG). В последние годы выявлено второе антитело (антитело к ССР, антитело к цитруллинированному фибриногену и другим цитруллинированным белкам или пептидам), которое также приобретает большую важность для установления диагноза РА. Оба аутоантитела в основном присутствуют вместе; однако существуют также страдающие РА пациенты, у которых вырабатывается только одно из двух антител или не вырабатывается ни одно из них. Оба аутоантитела встречаются в определенном количестве также у других пациентов и у здоровых индивидуумов. Хотя главным образом антитела к ССР обладают выраженной специфичностью и встречаются на относительно ранней стадии, их следует рассматривать как реакцию на произошедшие ранее изменения в организме индивидуума. Поэтому желательно выявить другие параметры или маркеры, которые непосредственно ассоциированы с такими ранними измерениями и поэтому позволяют очень рано и надежно устанавливать диагноз и осуществлять прогноз.

Подобно многим другим ревматическим заболеваниям РА представляет собой заболевание, которое проявляется во многих различных формах. В настоящее время их в основном разделяют на серопозитивную и серонегативную форму на основе присутствия или отсутствия ревматоидного фактора. В настоящее время начинают определять также позитивную в отношении антитела к ССР и негативную в отношении антитела к ССР форму. Возможно, что можно будет осуществлять и другие классификации, когда можно будет применять другие маркеры и возможно также комбинации нескольких маркеров. В настоящее время совсем не применяют генетические маркеры.

Для мониторинга развития заболевания и для оценки индивидуального риска также желательно располагать новыми маркерами, прежде всего также такими, которые можно обнаруживать на очень ранней стадии, т.е. предпочтительно еще до образования антител.

Поскольку пункции осуществляют исключительно в клинических целях, то синовиальную жидкость можно рассматривать в качестве «побочного продукта», который можно успешно использовать в методах диагностики.

Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ классификации и прогноза in vitro ревматического воспалительного заболевания, в котором определяют присутствие или отсутствие белка Hdj2 в синовиальной жидкости.

С помощью указанного способа ревматоидный артрит можно отличать на ранней стадии от других ревматических заболеваний, таких, например, как: инфекционный или септический артрит, артрит при ревматических заболеваниях позвоночника; артрит при воспалительных заболеваниях кишечника, юношеский (ювенильный) хронический артрит, артрит при воспалительных заболеваниях соединительной ткани; аллергический артрит; артрит, вызываемый метаболическими заболеваниями, подагрой, артрит при эндокринных нарушениях, таких как гипертиреоидит, гипотиреоидит, гиперпаратиреоидит, гипопаратиреоидит, сахарный диабет, синдром Кушинга, акромегалия, феохромоцитома; артрит при гранулематозных заболеваниях; артрит при кровотечениях в суставах в результате нарушений свертываемости крови, артрит при заболеваниях гематопоэтической системы, неопластический артрит, паранеопластический артрит, остеоартрит, артрит после повреждений; артрит при заболеваниях суставного хряща, артрит при невропатиях, артрит при кожных заболеваниях, более конкретно псориатическая артропатия.

Кроме того, можно отличать слабопрогрессирующие формы воспалительного полиартрита от ревматоидного артрита.

Способы, предлагаемые в изобретении, в предпочтительном варианте осуществления изобретения представляют собой иммунологические способы. В них проводят иммунологическое исследование белка Hdj2 в синовиальной жидкости, полученной из организма пациентов, у которых проявляется ранняя форма ревматического заболевания.

Обнаружение белка Hdj2 в синовиальной жидкости предпочтительно осуществляют с помощью антитела, при этом в принципе можно применять как поликлональные, так и моноклональные антитела. Поскольку аминокислотная последовательность является известной (SEQ ID NO:2), то можно легко создавать антитела к ней. Для этого можно, например, иммунизировать кроликов, мышей или крыс человеческим белком Hdj2, при необходимости с добавлением адъювантов. Антисыворотку этих животных, предпочтительно в очищенной форме, можно использовать для обнаружения Hdj2. В альтернативном варианте можно осуществлять слияние клеток селезенки иммунизированных животных с опухолевыми клетками и выделять и размножать иммортализованные продуцирующие моноклональные антитела линии клеток. После характеризации эпитопов, с которыми могут связываться конкретные моноклональные антитела, проводят отбор тех моноклональных антител, которые обеспечивают получение наилучших результатов в иммунологических тестах. В альтернативном варианте для этой цели можно применять также поступающие в продажу моноклональные и поликлональные антитела.

Иммунологическую характеризацию синовиальной жидкости можно осуществлять, разделяя белки, присутствующие в синовиальной жидкости, на электрофоретическом геле (ДСН-ПААГ) и затем переносить белки на пригодную мембрану (нитроцеллюлозную или нейлоновую). Затем эти мембраны приводят в контакт с антителами к Hdj2 и выявляют связанные антитела с помощью антиантител, при этом антиантитела, как правило, представляют собой антитела к Fc-области специфического в отношении Hdj2 антитела. Антиантитела, как правило, связывают с вызывающим окрашивание или генерирующим свет ферментом, который катализирует цветную реакцию или почернение фотопленки.

В альтернативном варианте иммунологическое обнаружение для рассматриваемой цели можно осуществлять с помощью тестов на основе ELISA. Для этого можно, например, прикреплять пригодные антитела, предпочтительно моноклональные антитела, к стенке титрационных микропланшетов. Затем добавляют синовиальную жидкость и осуществляют отмывку. Если белок Hdj2 присутствует, то он связывается с планшетами для ELISA. После этого осуществляют обнаружение белка Hdj2 с использованием антител к определенным эпитопам Hdj2, связанных с вызывающим окрашивание компонентом.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к наборам для тестирования (тест-наборам), с помощью которых можно осуществлять способ, предлагаемый в изобретении. Такие наборы для тестирования содержат в качестве компонента иммунологический реагент, позволяющий осуществлять специфическое обнаружение белка Hdj2 в синовиальной жидкости. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные иммунологические реагенты представляют собой моноклональные антитела, специфически и с достаточной чувствительностью связывающиеся с соответствующими эпитопами белка Hdj2.

Кроме того, тест-наборы включают обычные вспомогательные вещества и добавки, необходимые для осуществления способа, предлагаемого в изобретении. Они могут представлять собой предварительно сенсибилизированные планшеты или мембраны, а также реагенты, необходимые для осуществления способа тестирования.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитела к белку Hdj2 применяют для дифференциального диагноза воспалительного ревматического заболевания на ранней фазе заболевания.

Следует иметь в виду, что в контексте настоящего изобретения понятие «антитело» или «моноклональное антитело» относится также к соответствующим связывающим областям антитела. Установлено, что в методах, основанных на применении антител, целесообразно применять также фрагменты моноспецифического антитела, которые связываются с требуемыми эпитопами, вместо полных антител. В контексте настоящего описания понятие «антитело» можно заменять такими понятиями, как Fab-фрагменты, Fv-фрагменты, одноцепочечные фрагменты антител (scFv), стабилизированные дисульфидной связью Fv-фрагменты, V_H и верблюжьи антитела; мультивалентные фрагменты антител, бифункциональные антитела и биспецифические антитела.

Образцы синовиальной жидкости (СЖ) разделяли с помощью ДСН-ПААГ и окрашивали в иммуноблоте специфическими антителами. Применяли согласно изобретению антитела к Hdj2 (КА2А5.6). С помощью такого иммуноблота часто выявляли полосы, соответствующие ожидаемой молекулярной массе.

Осуществляли также другие иммуногистохимические анализы синовиальных тканей (замороженные срезы), взятых из организма страдающих РА пациентов, а также контрольных индивидуумов, с различными формами остеоартрита (ОА), включая карпальный туннельный синдром. Для этой цели применяли антитело к Hdj2 и антитела, с помощью которых можно было характеризовать клетки, экспрессирующие Hdj2.

Исследовали специфичность антитела. Было установлено, что антитело окрашивает только те клетки, которые содержат также транскрипты Hdj2 (мРНК гена DNAJA1). Было установлено, что транскрипты Hdj2 присутствовали в синовиальной ткани страдающих РА пациентов.

Сопоставляли друг с другом точные диагнозы и все прочие документы, касающиеся пациентов. Сначала пациентов разделяли на два класса, а именно, пациентов, которые гарантированно имели РА (установленный диагноз, было установлено, что удовлетворялись>4 критериев ACR), и пациентов, которые гарантированно имели другой диагноз (например, реактивный артрит, псориатический артрит и т.д.). Из общего количества 130 пациентов 50 имели РА и 80 не имели РА.

Неожиданно Hdj2 был обнаружен во многих пунктах.

Затем проверяли диагнозы и проводили исследование других образцов СЖ. В процессе исследования была выявлена выраженная корреляция между появлением Hdj2 в СЖ и диагнозом РА (р=0,021). Оказалось возможным также установить с помощью иммуногистохимического анализа, что сверхэкспрессия Hdj2 имела место только в срезах синовиальных тканей, взятых из организма пациентов, страдающих РА, но не ОА.

Оказалось возможным осуществить полуколичественную классификацию уровня Hdj2 (0, 1, 2, 3, 4) в образцах СЖ. На основе этой классификации и данных о встречаемости как таковой была предпринята попытка найти корреляцию с другими параметрами. У пациентов, страдающих РА, была выявлена позитивная корреляция со степенью воспаления, которую оценивали по количеству лейкоцитов, инфильтрующих сустав. Перед этим во многих образцах СЖ при проведении стандартных лабораторных анализов уже был обнаружен ревматоидный фактор. В ходе данного исследования дополнительно выявляли антитела к ССР во всех образцах СЖ. Для обоих антител была выявлена корреляция с диагнозом РА (в каждом случае с р<0,001). Была выявлена также корреляция между присутствием Hdj2 и обоих антител (ревматоидный фактор: р=0,038, и антитело к ССР: р=0,016). Однако не было выявлено полного перекрытия. Таким образом, присутствие Hdj2 в СЖ, по-видимому, может служить в качестве дополнительного маркера, например, при разделении пациентов на подгруппы.

Важным также является вопрос о том, можно ли обнаружить присутствие внеклеточного Hdj2 в крови у пациентов, страдающих РА. Поэтому было проведено исследование 14 образцов плазмы, взятых у страдающих РА пациентов, у которых в то же самое время в СЖ присутствовали относительно высокие уровни Hdj2. При анализе этих иммуноблотов не было обнаружено присутствия Hdj2 в образцах плазмы.

Hdj2, присутствующий в синовиальной жидкости, представляет собой ранний маркер РА. Результат анализа ткани, взятой у пациентки с карпальным туннельным синдромом, который служил в качестве контроля отсутствия РА, сначала был неясным. Однако при более глубоком изучении истории болезни было установлено, что у этой пациентки по прошествии более чем одного года развился РА. Это указывает на то, что у пациентов с карпальным туннельным синдромом достаточно часто развивается РА. Таким образом, наличие сверхэкспрессии Hdj2 является ранним признаком начинающегося и еще не диагностированного РА.

Поэтому были проанализированы также образцы СЖ, взятые из организма пациентов с неясным диагнозом. Во многих случаях, в которых Hdj2 уже оказалось возможным обнаружить в СЖ, был идентифицирован РА до того, как оказывалось возможным диагностировать РА согласно соответствующим критериям. Следовательно, Hdj2 можно использовать в качестве маркера для раннего распознавания РА, а также в качестве маркера для дифференциального диагноза.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах.

Пример 1

Пациентка возрастом 53 года имела жалобы на полиартралгию позвоночника и тупые боли в области кистевых суставов. Она прошла терапевтическое, неврологическое и ревматологическое обследование. Результаты проведенных применяющихся в настоящее время клинических, а также серологических анализов не позволили сделать заключение о наличии воспалительного состояния суставов (не был выявлен даже ревматоидный фактор). Было четко установлено, что, хотя пациентка была HLA-B27-позитивной, у ней не было болезни Бехтерева. Пациентка подвергалась значительным физическим нагрузкам вследствие необходимости осуществлять уход за практически недееспособной дочерью. На основе ортопедического обследования ей был установлен диагноз слабого вторичного карпального туннельного синдрома, обусловленного позвоночником.

Спустя 7 месяцев ей была проведена операция по поводу карпального туннельного синдрома. Замороженные срезы взятой при этом синовиальной ткани подвергли исследованию в отношении наличия экспрессии Hdj2 (и Hsc70). Оказалось, что в тканях этой пациентки можно было обнаружить очень высокие уровни обеих молекул, что ранее наблюдалось только у пациентов с развитым PA, при этом для контрольных индивидуумов с различными другими диагнозами (ОА) результаты были отрицательными.

Спустя один год пациента прошла обследование у другого ревматолога с подозрением на хронический полиартрит. Этот диагноз был установлен в первый раз двумя месяцами раньше, когда она находилась на курорте. Были выявлены утренняя скованность продолжительностью 3 ч, поражение суставов пальцев, симметричное, а также получены положительные результаты рентгеноскопии. После этого был установлен диагноз серонегативного, ana-позитивного (позитивного в отношении антинуклеарных (ANA) антител) ревматоидного артрита (в данном случае удовлетворялись ≥4 критериев ACR).

Этот пример демонстрирует возможность раннего распознавания РА у пациентки с симптомами воспалительного ревматического заболевания.

Пример 2

Брали образцы синовиальной жидкости в общей сложности у шести пациентов, у которых диагноз ревматоидного артрита был четко подтвержден только после появления симптомов ревматического заболевания.

Синовиальную жидкость разделяли с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза и белковые полосы блотировали на нитроцеллюлозу. После блокирования сайтов неспецифического связывания осуществляли в течение ночи при 4°С в буфере взаимодействие нитроцеллюлозы с первичным антителом к Hdj2. После этого нитроцеллюлозу трижды отмывали и проводили обнаружение антитела к Hdj2 с помощью антимышиного антитела, полученного в организме козы. Затем пленку проявляли и полуколичественно оценивали уровень связывания. Результаты обобщены в таблице 1.

Пример 3

Для того, чтобы документировать временную зависимость появления Hdj2 в синовиальной жидкости, проводили обнаружение Hdj2 в синовиальной жидкости, взятой у пациентов, которым впервые осуществляли пункцию и которым вскоре после этого впервые был установлен точный диагноз, в течение периода от нескольких недель до нескольких месяцев после появления первых симптомов. При этом Hdj2 был обнаружен у пациентов, которые уже к этому раннему моменту времени удовлетворяли ≥4 критериям ACR. У пациентов с другими четко установленными диагнозами Hdj2 не был обнаружен (пациенты с недифференцированным артритом или неясным диагнозом не были включены в данное исследованием). Измерения проводили на более поздней стадии заболевания по истечении периода времени, составлявшего примерно 0,5 и 1 год после, появления первых симптомов (или установления первого диагноза). Полученные данные представлены в таблице 2.

Пример 4

Присутствие белка Hdj2 в синовиальной жидкости оценивали также в более поздние моменты времени после появления первых симптомов. В представленной таблице 3 обобщены данные, полученные для пациентов, у которых измерения Hdj2 в синовиальной жидкости проводили в течение первых двух лет после появления симптомов. Определение уровней Hdj2 проводили также в течение периода времени вплоть до 2 лет после появления первых симптомов (или установления первого диагноза). Данные, представленные в таблице 3, демонстрируют, что у всех пациентов, которым был установлено диагноз ревматоидного артрита (РА), был обнаружен также белок Hdj2 в синовиальной жидкости. У пациентов, страдающих другими заболеваниями ревматоидного типа, белок Hdj2 не был обнаружен.

Необходимо отметить, что во всех рассматриваемых случаях пациенты являлись серонегативными. У подвергнутых обследованию пациентов не обнаружено антител к ССР в СЖ.

Изобретение относится к медицине и описывает способ определения in vitro типа воспалительного ревматического заболевания, а именно дифференциации ревматоидного артрита от реактивного артрита и артрита при кожных заболеваниях, где определяют присутствие или отсутствие белка Hdj2 в синовиальной жидкости на ранней стадии заболевания, т.е. в течение времени, составляющего вплоть до двух лет от появления первых симптомов воспалительного ревматоидного артрита. Также описано применение моноклональных антител к белку Hdj2 для осуществления дифференциальной диагностики in vitro воспалительного ревматического заболевания. Изобретение обеспечивает возможность ранней диагностики ревматоидного артрита. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 пр., 3 табл.

1. Способ определения in vitro типа воспалительного ревматического заболевания, а именно дифференциации ревматоидного артрита от реактивного артрита и артрита при кожных заболеваниях, отличающийся тем, что определяют присутствие или отсутствие белка Hdj2 в синовиальной жидкости на ранней стадии заболевания, т.е. в течение времени, составляющего вплоть до двух лет от появления первых симптомов воспалительного ревматоидного артрита.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в иммунологическом методе обнаружения применяют по меньшей мере одно антитело, которое специфически связывается с эпитопом белка Hdj2.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что метод представляет собой ELISA.

4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что метод представляет собой вестерн-блоттинг.

5. Применение моноклональных антител к белку Hdj2 для осуществления дифференциальной диагностики in vitro воспалительного ревматического заболевания, а именно дифференциации ревматоидного артрита от реактивного артрита и артрита при кожных заболеваниях на ранней стадии воспалительного ревматического заболевания, т.е. в течение времени, составляющего вплоть до двух лет от появления первых симптомов воспалительного ревматоидного артрита.