СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ СОСТОЯНИЙ АНТИТЕЛАМИ, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТ РЕЦЕПТОР КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА 1 (CSF1R) Российский патент 2018 года по МПК C07K16/28 A61P37/00 

Область техники

[001] Предложены способы лечения состояний антителами, которые связывают рецептор колониестимулирующего фактора 1 (CSF1R). Такие способы включают, но не ограничиваются способами лечения ревматоидного артрита, рассеянного склероза и системной красной волчанки.

Предпосылки создания изобретения

[002] Рецептор колониестимулирующего фактора 1 (в данном документе обозначатся как CSF1R; также упоминается в данной области как FMS, FIM2, C-FMS, рецептор M-CSF и CD115) является передающим сигналы трансмембранным рецептором с N-концевым внеклеточным доменом (ECD) и С-концевым внутриклеточным доменом с активностью тирозинкиназы. Связывание лиганда CSF1 или лиганда интерлейкина 34 (в данном документе обозначается как IL-34; Lin et al., Science 320: 807-11 (2008)) с CSF1R приводит к димеризации рецептора, повышению регуляции тирозинкиназной активности CSF1R, фосфорилированию тирозиновых остатков CSF1R и нисходящей передаче сигнала. И CSF1, и IL-34 стимулируют выживаемость моноцитов, пролиферацию и дифференцировку в макрофаги, так же как и других линий моноцитов, таких как остеокласты, дендроциты и микроглий.

[003] Было обнаружено, что большинство опухолевых клеток секретируют CSF1, который активирует моноциты/макрофаги через CSF1R. Было показано, что уровень CSF1 в опухолях коррелирует с уровнем опухоль-ассоциированных макрофагов (ТАМ) в опухоли. Было обнаружено, что высокие уровни ТАМ коррелируют с плохими прогнозами для пациента. Кроме того, было установлено, что CSF1 способствует росту опухоли и развитию метастазов, например, у мышей с ксенотрансплантатами человеческого рака молочной железы. См., например, Paulus et al., Cancer Res. 66: 4349-56 (2006). Кроме того, CSF1R играет определенную роль в остеолитическом разрушении костей при метастазах в кости. См., например, Ohno et al., Mol. Cancer Ther. 5: 2634-43 (2006).

[004] Также было найдено, что CSF1 и его рецептор вовлечены в разные воспалительные и аутоиммунные заболевания. См., например, Hamilton, Nat. Rev. 8: 533-44 (2008). Например, было найдено, что синовиальные эндотелиальные клетки из суставов, пораженных ревматоидным артритом, продуцируют CSF1, что указывает на роль CSF1 и его рецептора в этом заболевании. Блокировка активности CSF1R с применением антитела приводит к положительным клиническим результатам в моделях артрита у мышей, включая уменьшение разрушения костей и хряща и уменьшение количества макрофагов. См., например, Kitaura et al., J. Clin. Invest. 115: 3418-3427 (2005).

[005] Зрелые дифференцированные миелоидные клетки, такие как макрофаги, микроглиальные клетки и остеокласты вносят вклад в патологию различных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, рассеянный склероз и заболевания с потерей костной массы. Дифференцированные миелоидные клетки происходят от промежуточных моноцитов периферической крови. Стимулирование CSF1R способствует развитию моноцитов из предшественников костного мозга, пролиферации моноцитов и выживаемости и дифференцировке моноцитов периферической крови в дифференцированные миелоидные клетки, такие как макрофаги, микроглиальные клетки и остеокласты. Таким образом, стимуляция CSF1R способствует пролиферации, выживаемости, активации и развитию дифференцированных миелоидных клеток, а в патологических условиях стимуляция CSF1R вносит вклад в способность дифференцированных миелоидных клеток опосредовать патологию, связанную с заболеванием.

Краткое описание сущности изобретения

[006] В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения состояния, связанного с ревматоидным артритом. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего рецептор колониестимулирующего фактора 1 (CSF1R), где антитело блокирует связывание колониестимулирующего фактора 1 (CSF1) с CSF1R и блокирует связывание IL-34 с CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения лечение состояния, связанного с ревматоидным артритом, включает по меньшей мере один эффект, выбранный из уменьшения воспаления, уменьшения образования паннуса, уменьшения повреждения хряща, уменьшения резорбции костей, уменьшения количества макрофагов в по меньшей мере одном суставе, пораженном ревматоидным артритом, уменьшения уровней аутоантител и уменьшения потери костной массы. В некоторых вариантах реализации изобретения лечение состояния, связанного с ревматоидным артритом, включает уменьшение воспаления. В некоторых вариантах реализации изобретения способ уменьшения воспаления связанного с ревматоидным артритом включает определение скорости оседания эритроцитов, где уменьшение скорости оседания эритроцитов указывает на уменьшение воспаления.

[007] В некоторых вариантах реализации изобретения способ лечения состояния, связанного с ревматоидным артритом, включает по меньшей мере один эффект, выбранный из уменьшения образования паннуса, уменьшения резорбции костей и уменьшения потери костной массы. В некоторых вариантах реализации изобретения лечение состояния, связанного с ревматоидным артритом, включает уменьшение резорбции костей. В некоторых таких вариантах реализации уменьшается уровень по меньшей мере одного маркера резорбции костей. В некоторых вариантах реализации изобретения маркер резорбции костей выбирают из устойчивой к тартрату кислой фосфатазы 5b (TRAP5b), общего пиридинолина мочи, общего деоксипиридинолина мочи, свободного пиридинолина мочи, сывороточного поперечносшитого N-телопептида коллагена типа I, поперечносшитого N-телопептида коллагена типа I мочи и карбокситерминального телопептида коллагена типа I сыворотки.

[008] В некоторых вариантах реализации изобретения лечение состояния, связанного с ревматоидным артритом, включает по меньшей мере один эффект, выбранный из уменьшения образования паннуса и уменьшения потери костной массы. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере одно проявление измеряют, используя способ получения изображения. В некоторых таких вариантах реализации способ получения изображения включает способ, выбираемый из рентгенографии, получения изображения методом магнитного резонанса, компьютерной томографии (СТ), артроскопии, сцинтиграфии, ультрасонографии, костной денситометрии, однофотонной абсорбциометрии (SPA), двухфотонной абсорбциометрии (DPA), одноэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (SXA), двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DXA), сцинтиграфии, ультрасонографии, дуплексной ультрасонографии и энергетической доплерографии.

[009] В некоторых вариантах реализации способа лечения состояния, связанного с ревматоидным артритом, количество CD16+ моноцитов уменьшается по меньшей мере на 30%. В некоторых вариантах реализации способа, количество CD16-моноцитов не уменьшается или уменьшается менее чем на 20%. В некоторых вариантах реализации изобретения CD16+ моноцитами являются CD16+ моноциты периферической крови.

[010] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения ревматоидного артрита, включающий введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего CSF1R, где антитело блокирует связывание CSF1 с CSF1R и блокирует связывание IL-34 с CSF1R, и при этом антитело уменьшает количество CD16+ моноцитов у субъекта по меньшей мере на 30%, и при этом количество CD16- моноцитов не уменьшается или уменьшается менее чем на 20%. В некоторых вариантах реализации изобретения CD16+ моноцитами являются CD16+ моноциты периферической крови.

[011] В некоторых вариантах реализации способа лечения ревматоидного артрита способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, выбранного из метотрексата, анти-TNF, глюкокортикоида, циклоспорина, лефлуномида, азатиоприна, ингибитора JAK, ингибитора SYK, антитела анти-IL-6, антитела анти-IL-6R, антитела анти-CD-20, антитела анти-CD19, антитела анти-GM-CSF, антагониста рецептора IL-1, антагониста CTLA-4 и антитела анти-GM-CSF-R.

[012] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены способы лечения повреждений кожи, связанных с волчанкой. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает введение субъекту с волчанкой антитела, связывающего CSF1R, где антитело блокирует связывание CSF1 с CSF1R и блокирует связывание IL-34 с CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения лечение повреждений кожи, связанных с волчанкой, включает по меньшей мере один эффект, выбранный из уменьшения количества повреждений кожи, уменьшения скорости образования повреждений кожи и уменьшения тяжести повреждений кожи.

[013] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены способы лечения волчаночного нефрита. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает введение субъекту с волчаночным нефритом антитела, связывающего CSF1R, где антитело блокирует связывание CSF1 с CSF1R и блокирует связывание IL-34 с CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения у субъекта улучшается функция почек. В некоторых вариантах реализации изобретения у субъекта уменьшается протеинурия. В некоторых вариантах реализации изобретения у субъекта улучшается уровень клубочковой фильтрации.

[014] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены способы лечения волчанки. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает введение субъекту с волчанкой антитела, связывающего CSF1R, где антитело блокирует связывание CSF1 с CSF1R и блокирует связывание IL-34 с CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело уменьшает количество CD16+ моноцитов у субъекта по меньшей мере на 30%, и количество CD16- моноцитов не уменьшается или уменьшается менее чем на 20%. В некоторых вариантах реализации изобретения количество CD16+ моноцитов уменьшается по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения CD16+ моноцитами являются CD16+ моноциты периферической крови.

[015] В некоторых вариантах реализации изобретения способ лечения волчанки, волчаночного нефрита или повреждений кожи, связанных с волчанкой, дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, выбранного из гидроксихлороквина (Plaquenil), кортикостероидов, циклофосфамида (Cytoxan), азатиоприна (Imuran, Azasan), микофенолата (Cellcept), лефлуномида (Arava) и метотрексата (Trexall) и белимумаба (Benlysta).

[016] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены способы лечения воспалений. В некоторых таких вариантах реализации способ включает введение субъекту с воспалением антитела, связывающего CSF1R, где антитело блокирует связывание CSF1 с CSF1R и блокирует связывание IL-34 с CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело уменьшает количество CD16+ моноцитов по меньшей мере на 30%, и количество CD 16- моноцитов не уменьшается или уменьшается менее чем на 20%. В некоторых вариантах реализации изобретения количество CD16+ моноцитов уменьшается по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения CD16+ моноцитами являются CD16+ моноциты периферической крови.

[017] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены способы лечения CD16+ расстройств. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает введение субъекту с CD16+ расстройством антитела, связывающего CSF1R, где антитело блокирует связывание CSF1 с CSF1R и блокирует связывание IL-34 с CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело уменьшает количество CD16+ моноцитов по меньшей мере на 30%, и количество CD 16-моноцитов не уменьшается или уменьшается менее чем на 20%. В некоторых вариантах реализации изобретения количество CD16+ моноцитов уменьшается по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения CD16+ моноцитами являются CD16+ моноциты периферической крови.

[018] В некоторых вариантах реализации изобретения способ лечения, обсуждаемый в настоящем документе, включает лечение состояния, не чувствительного к метотрексату.

[019] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены способы уменьшения количества CD16+ моноцитов. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает введение субъекту антитела, связывающего CSF1R, где антитело блокирует связывание CSF1 с CSF1R и блокирует связывание IL-34 с CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело уменьшает количество CD16+ моноцитов по меньшей мере на 30%, и количество CD 16- моноцитов не уменьшается или уменьшается менее чем на 20%. В некоторых вариантах реализации изобретения количество CD16+ моноцитов уменьшается по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах реализации изобретения CD16+ моноцитами являются CD16+ моноциты периферической крови.

[020] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены способы замедления прогрессирования заболевания почек, связанного с волчанкой. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает введение субъекту антитела, связывающего CSF1R, где антитело блокирует связывание CSF1 с CSF1R и блокирует связывание IL-34 с CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения протеинурия не увеличивается у субъекта или не увеличивается у субъекта с такой скоростью, как у субъектов, не получающих антитело. В некоторых вариантах реализации изобретения уровень клубочковой фильтрации не уменьшается у субъекта или не уменьшается у субъекта с такой скоростью, как у субъектов, не получающих антитело.

[021] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены способы замедления прогрессирования образования паннуса у субъекта с ревматоидным артритом. В некоторых таких вариантах реализации способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего CSF1R, где антитело блокирует связывание CSF1 с CSF1R и блокирует связывание IL-34 с CSF1R.

[022] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены способы замедления развития потери костной массы у субъекта с ревматоидным артритом. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего рецептор колониестимулирующего фактора 1 (CSF1R), где антитело блокирует связывание колониестимулирующего фактора 1 (CSF1) с CSF1R и блокирует связывание IL-34 с CSF1R.

[023] В некоторых вариантах реализации способов описанных в данном документе, тяжелая цепь антитела и/или легкая цепь антитела имеет следующую структуру.

[024] В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь включает последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 39-45. В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь включает последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 46-52. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь включает последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 39-45, и легкая цепь включает последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%о, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 46-52.

[025] В некоторых вариантах реализации изобретения НС CDR1 (участок CDR1 тяжелой цепи), НС CDR2 и НС CDR3 включают последовательность, выбранную из: (a) SEQ ID NO: 15, 16 и 17; (b) SEQ ID NO: 21, 22 и 23; и (с) SEQ ID NO: 27, 28 и 29. В некоторых вариантах реализации изобретения LC CDR1 (участок CDR1 легкой цепи), LC CDR2 и LC CDR3 включают последовательность, выбранную из: (a) SEQ ID NO: 18, 19 и 20; (b) SEQ ID NO: 24, 25 и 26; и (с) SEQ ID NO: 30, 31 и 32.

[026] В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь включает НС CDR1, НС CDR2 и НС CDR3, где НС CDR1, НС CDR2 и НС CDR3 включают набор последовательностей, выбранных из: (a) SEQ ID NO: 15, 16 и 17; (b) SEQ ID NO: 21, 22 и 23; и (с) SEQ ID NO: 27, 28 и 29; и легкая цепь включает LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3, где LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3 включают набор последовательностей, выбранных из: (a) SEQ ID NO: 18, 19 и 20; (b) SEQ ID NO: 24, 25 и 26; и (с) SEQ ID NO: 30,31 и 32.

[027] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен выделенное антитело, где антитело включает тяжелую цепь и легкую цепь, и при этом антитело включает: (а) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%), по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 9, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 10; (b) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере, на 97% по меньшей мере, на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 11, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 12; (с) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 14; (d) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 39, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 46; (е) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 40 и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 46; (f) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95% по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 41 и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95% по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 46; (g) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 39, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 47; (h) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 47; (i) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 41, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 47; и (j) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 42, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95% по меньшей мере на 97% по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 48; (k) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 42, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 49; (l) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 42, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 50; (m) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 43, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 48; (n) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 43, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 49; (о) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 43, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 50; (p) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 44, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 51; (q) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 44, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 52; (r) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 45, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 51; или (s) тяжелую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 45, и легкую цепь, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 52.

[028] В некоторых вариантах реализации изобретения предложено антитело, где антитело включает тяжелую цепь и легкую цепь, причем антитело включает: (а) тяжелую цепь, включающую CDR1 тяжелой цепи (НС CDR1), имеющий последовательность SEQ ID NO: 15, НС CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 16, и НС CDR3, имеющую последовательность SEQ ID NO: 17, и легкую цепь, включающую CDR1 легкой цепи (LC CDR1), имеющий последовательность SEQ ID NO: 18, LC CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 19, и LC CDR3, имеющую последовательность SEQ ID NO: 20; (b) тяжелую цепь, включающую CDR1 тяжелой цепи (НС CDR1), имеющий последовательность SEQ ID NO: 21, НС CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 22, и НС CDR3, имеющую последовательность SEQ ID NO: 23, и легкую цепь, включающую CDR1 легкой цепи (LC CDR1), имеющий последовательность SEQ ID NO: 24, LC CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 25, и LC CDR3, имеющую последовательность SEQ ID NO: 26; или (с) тяжелую цепь, включающую CDR1 тяжелой цепи (НС CDR1), имеющий последовательность SEQ ID NO: 27, НС CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 28, и НС CDR3, имеющую последовательность SEQ ID NO: 29, и легкую цепь, включающую CDR1 легкой цепи (LC CDR1), имеющий последовательность SEQ ID NO: 30, LC CDR2, имеющий последовательность SEQ ID NO: 31, и LC CDR3, имеющую последовательность SEQ ID NO: 32.

[029] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело включает тяжелую цепь и легкую цепь, где антитело включает: (а) тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 53, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 60; (b) тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 53, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 61; или (с) тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 58, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело включает тяжелую цепь и легкую цепь, причем антитело включает: (а) тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 53, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 60; (b) тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 53, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 61; или (с) тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 58, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 65.

[030] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело является гуманизированным антителом. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело выбирают из Fab, Fv, scFv, Fab' и (Fab')₂. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело является химерным антителом. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело выбирают из IgA, IgG и IgD. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой IgG. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой IgG4. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой IgG4, включающий мутацию S241P в по меньшей мере одной константной области тяжелой цепи IgG4.

[031] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело связывает человеческий CSF1R и/или связывает CSF1R яванского макака. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело блокирует связывание лиганда с CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело блокирует связывание CSF1 и/или IL-34 с CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело блокирует связывание и CSF1 и IL-34 с CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело ингибирует лиганд-индуцированное фосфорилирование CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело ингибирует CSF1- и/или IL-34-индуцированное фосфорилирование CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело связывает человеческий CSF1R с аффинyостью (K_D) ниже 1 нМ. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело ингибирует реакции пролиферации и/или выживания моноцитов в присутствии CSF1 или IL-34.

[032] В некоторых вариантах реализации изобретения предложена фармацевтическая композиция, включающая антитело, связывающее CSF1R.

[033] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены композиции, включающие антитела, связывающие CSF1R, для применения в способах лечения человека или животных. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены антитела, связывающие CSF1R, и композиции, включающие антитела, связывающие CSF1R, для применения в способе лечения состояний, связанных с ревматоидным артритом у человека или животного. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены антитела, связывающие CSF1R, и композиции, включающие антитела, связывающие CSF1R, для применения в способе лечения рассеянного склероза у человека или животного. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены антитела, связывающие CSF1R, и композиции, включающие антитела, связывающие CSF1R, для применения в способе лечения состояний, связанных с системной красной волчанкой.

Краткое описание фигур

[034] фиг. 1A-C показывают выравнивание гуманизированных вариабельных областей тяжелой цепи для каждого гуманизированного антитела huAb1-huAb16, как обсуждается в Примере 1. Остатки в рамках являются аминокислотами в последовательности акцептора человека, которые были заменены на соответствующий мышиный остаток.

[035] фиг. 2A-C показывают выравнивание гуманизированных вариабельных областей легкой цепи для каждого гуманизированного антитела huAb1-huAb16, как обсуждается в Примере 1. Остатки в рамках являются аминокислотами в последовательности акцептора человека, которые были заменены на соответствующий мышиный остаток.

[036] фиг. 3 показывает уменьшение количества CD16+ моноцитов у яванских макак, получивших huAb1, как описано в Примере 2.

[037] фиг. 4 показывает дозозависимое связывание суррогатного антитела cAb1 с мышиным CSF1R, как описано в Примере 3.

[038] фиг. 5 показывает дозозависимое ингибирование CSF1- и IL-34-индуцированной пролиферации в клетках mNFS60, как описано в Примере 4.

[039] фиг. 6 показывает подавление клинических признаков заболевания в мышиной модели ревматоидного артрита после введения cAb1, как описано в Примере 5.

[040] фиг. 7 показывает подавление потери костной массы, показателем которого являются уровни TRAP5b в плазме, в мышиной модели ревматоидного артрита после введения cAb1, как описано в Примере 6.

[041] фиг. 8 показывает подавление воспаления, образования паннуса, повреждения хряща и повреждения кости в мышиной модели ревматоидного артрита после введения cAb1, как описано в Примере 7.

[042] фиг. 9 показывает подавление количества макрофагов в суставах лап и суставах колен в мышиной модели ревматоидного артрита после введения cAb1, как описано в Примере 8.

[043] фиг. 10 показывает подавление образования аутоантитела в мышиной модели ревматоидного артрита после введения cAb1, как описано в Примере 9.

[044] фиг. 11 показывает подавление потери костной массы в мышиной модели установленного ревматоидного артрита после введения cAb1, как описано в Примере 10.

[045] фиг. 12 показывает подавление образования паннуса и разрушения кости в мышиной модели установленного ревматоидного артрита после введения cAb1, как описано в Примере 11.

[046] фиг. 13 показывает подавление гломерулонефрита, интерстициального нефрита и периваскулярных инфильтратов в мышиной модели системной красной волчанки после введения cAb1, как описано в Примере 12.

[047] фиг. 14 показывает уменьшение повреждений кожи на мышиной модели системной красной волчанки после введения cAb1, как описано в Примере 13.

[048] фиг. 15 показывает подавление клинических признаков заболевания на мышиной модели рассеянного склероза после введения cAb1, как описано в Примере 14.

Подробное описание изобретения

[049] Предложены способы лечения состояний, включающие введение антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34. Как обсуждается в настоящем документе, антитела, связывающие CSF1R и блокирующие связывание лиганда CSF1 и IL-34, эффективны при лечении ревматоидного артрита, системной красной волчанки и рассеянного склероза. Изобретателями было найдено, что введение такого антитела яванским макакам, уменьшает количество CD16+ моноцитов в периферической крови яванских макак, но не влияет на количество CD 16- моноцитов в периферической крови, где CD16+ моноциты периферической крови являются моноцитами воспаления. См., например, Ziegler-Heitbrock, J. Leukocyte Biol, 2007, 81: 584-592. Кроме того, применение такого антитела на мышиной модели ревматоидного артрита подавляет клинические проявления заболевания, включая подавление эритемы и отека; подавляет потерю костной массы, что определяется по снижению уровней устойчивой к тартрату кислой фосфатазы 5b (TRAP5b); и подавляет воспаление, разрушения хряща, образования паннуса и разрушения кости. В частности, когда антитело вводили после появления клинических признаков ревматоидного артрита, уменьшалась потеря костной массы (что определено по снижению уровней TRAP5b), уменьшилось образование паннуса и разрушения кости. Введение такого антитела в мышиной модели ревматоидного артрита также уменьшает количество макрофагов в суставе и образование аутоантител.

[050] Введение антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, в мышиной модели системной красной волчанки подавляет гломерулонефрит, интерстициальный нефрит и периваскулярные инфильтраты. Кроме того, введение такого антитела в мышиной модели системной красной волчанки подавляет повреждение кожи. В конечном счете, введение антитела в мышиной модели рассеянного склероза подавляет клинические проявления рассеянного склероза.

[051] Заголовки разделов, используемые здесь, предназначены только для организационных целей и не должны истолковываться как ограничивающие сущность изобретения. Все источники, цитируемые в данном документе, включая патентные заявки и публикации, включены посредством ссылки во всей своей полноте.

Определения

[052] Если не указано иное, научные и технические термины, использованные в связи с настоящим изобретением будут иметь значения, которые обычно известны среднему специалисту в данной области техники. Кроме того, если иное не требуется по контексту, термины в единственном числе включают множественное число и термины во множественном числе включают единственное число.

[053] Примеры методик, использованные в связи с рекомбинантной ДНК, синтезом олигонуклеотидов, культурой тканей и трансформацией (например, электропорация, липофекция), ферментными реакциями и способами очистки, известны в технике. Многие из таких методик и процедур описаны, например, в Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), наряду с другими источниками. Дополнительно в данной области техники также известны примеры способов для химического синтеза, химического анализа, фармацевтических композиций, рецептур и доставки, и лечения пациентов.

[054] В этой заявке, применение "или" означает "и/или", если не указано иное. В контексте пункта с множественной зависимостью, применение "или" касается отсылки к более чем одному из предшествующих независимых или зависимых пунктов исключительно в качестве альтернативы. Также, термины, такие как "элемент" или "компонент" охватывают как элементы и компоненты, включающие одну единицу, так и элементы и компоненты, включающие больше одной субъединицы, если специально не указано иное.

[055] В соответствии с настоящим описанием следующие термины, если не указанно иное, должны пониматься в следующем значении:

[056] Термины "молекула нуклеиновой кислоты" и "полинуклеотид" могут использоваться взаимозаменяемо и относятся к полимерам из нуклеотидов. Такие полимеры из нуклеотидов могут содержать природные и/или неприродные нуклеотиды и включают, но не ограничиваются, ДНК, РНК и ПНК. "Последовательность нуклеиновой кислоты" относится к линейной последовательности нуклеотидов, включающей молекулу нуклеиновой кислоты или полинуклеотид.

[057] Термины "полипептид" и "белок" используются взаимозаменяемо и относятся к полимеру, состоящему из аминокислотных остатков и не ограниченного минимальной длинной. Такие полимеры из аминокислотных остатков могут включать природные или неприродные аминокислотные остатки и включают, но не ограничиваются, пептиды, олигопептиды, димеры, тримеры и мультимеры из аминокислотных остатков. Определением охватываются полноразмерные белки и их фрагменты. Термины также включают постэкспрессионные модификации полипептидов, например, гликозилированние, сиалилированние, ацетилированние, фосфорилированние и т.д. Кроме того, для целей настоящего изобретения "полипептид" относится к белку, который включает модификации, такие как делеции, добавления и замены (обычно консервативного характера), природной последовательности, при условии, что белок сохраняет желаемую активность. Эти модификации могут быть направленными, как например, сайт-специфический мутагенез, или могут быть случайными, такими как мутации хозяев, которые дают белки или ошибки в результате ПЦР-амплификации.

[058] Термин "CSF1R" относится в данном документе к полноразмерному CSF1R, который включает N-терминальный ECD, трансмембранный домен и домен внутриклеточной тирозинкиназы с или без N-концевой лидерной последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения CSF1R является человеческой CSF1R, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

[059] Термин "внеклеточный домен CSF1R" ("CSF1R ECD") в настоящем документе относится к CSF1R полипептиду, лишенному внутриклеточного и трансмембранного доменов. CSF1R ECD включают полноразмерный CSF1R ECD и фрагменты CSF1R ECD, способные связывать CSF1R и/или IL-34. Человеческий полноразмерный CSF1R ECD определяется в данном документе как включающий или аминокислоты 1-512 (то есть включающий лидерную последовательность), или аминокислоты 20-512 (то есть без лидерной последовательности) SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент человеческого CSF1R ECD включает аминокислоты 20-506 из SEQ ID NO: 2 (смотри SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент человеческого CSF1R заканчивается аминокислотой 507, 508, 509, 510 или 511. В некоторых вариантах реализации изобретения CSF1R ECD макаки включает последовательность SEQ ID NO: 7 (с лидерной последовательностью) или аминокислоты 20-506 из SEQ ID NO: 7 (без лидерной последовательности).

[060] Применительно к анти-CSF1R антителу термины "активность" или "функция" и их грамматические варианты относятся к способности ингибировать (блокировать антитела или выступать антагонистом антител) или имитировать (агонист антитела) по меньшей мере одну из упомянутых выше активностей. Антитела и фрагменты антител, называемые "функциональными", характеризуются наличием таких свойств.

[061] "Иммунологическая" активность относится только к способности вызывать продуцирование антитела против антигенного эпитопа, обладающего нативным или природным полипептидом CSF1R.

[062] Термин "антитело" в настоящем документе относится к молекуле, включающей по меньшей мере гипервариабельный участок (CDR) 1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и по меньшей мере CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, причем молекула способна связываться с антигеном. Термин антитело включает, но не ограничивается, фрагментами, способными связывать антиген, такими как Fv, одноцепочечный Fv (scFv), Fab, Fab' и (Fab')₂. Термин антитело также включает, химерное антитело, гуманизированное антитело и антитела разных видов, такие как мышиное, человеческое, яванского макака и т.д., но не ограничивается ими.

[063] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело включает вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело включает по меньшей мере одну тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере часть константной области тяжелой цепи, и по меньшей мере одну легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи и по меньшей мере часть константной области легкой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело включает две тяжелые цепи, где каждая тяжелая цепь включает вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере часть константной области тяжелой цепи, и две легкие цепи, где каждая легкая цепь включает вариабельную область легкой цепи и по меньшей мере часть константной области легкой цепи. В настоящем документе считается, что одноцепочечное Fv (scFv) или любое другое антитело, включающее, например, одну полипептидную цепь, включающую все шесть CDR (три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи), имеет тяжелую цепь и легкую цепь. В некоторых таких вариантах реализации тяжелая цепь является областью антитела, включающей три CDR тяжелой цепи, и легкая цепь является областью антитела, включающей три CDR легкой цепи.

[064] Термин "вариабельная область тяжелой цепи" в настоящем документе относится к области, включающей CDR1, каркасный участок (FR) 2, CDR2, FR3 и CDR3 тяжелой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения вариабельная область тяжелой цепи также включает по меньшей мере часть FR1 и/или по меньшей мере часть FR4. В некоторых вариантах реализации изобретения CDR1 тяжелой цепи соответствует остаткам по Kabat 26-35; CDR2 тяжелой цепи соответствует остаткам по Kabat 50-65; и CDR3 тяжелой цепи соответствует остаткам по Kabat 95-102. См., например, Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 и 1991, NIH, Bethesda, Md.); и Фиг. 1. В некоторых вариантах реализации изобретения CDR1 тяжелой цепи соответствует остаткам по Kabat 31-35; CDR2 тяжелой цепи соответствует остаткам по Kabat 50-65; и CDR3 тяжелой цепи соответствует остаткам по Kabat 95-102. Смотри там же.

[065] Термин "константная область тяжелой цепи" в настоящем документе относится к области, включающей по меньшей мере три константных домена тяжелой цепи, C_H1, C_H2, и C_H3. Неограничивающими примерами константных областей тяжелой цепи являются γ, δ, и α. Неограничивающими примерами константных областей тяжелой цепи также являются ε и μ. Каждая тяжелая константная область соответствует изотипу антитела. Например, антитело, включающее γ-константную область, является антителом IgG, антитело, включающее δ-константную область, является антителом IgD, и антитело, включающее α-константную область, является антителом IgA. Кроме того, антитело, включающее μ-константную область, является антителом и IgM антитело, включающее ε-константную область, является антителом IgE. Кроме того, некоторые изотипы могут быть разделены на подклассы. Например, IgG антитела включают, но не ограничиваются, IgG1 (включает γ₁-константную область), IgG2 (включает γ₂-константную область), IgG3 (включает γ₃-константную область) и IgG4 (включает γ₄-константную область) антитела; антитела IgA включают, но не ограничиваются, IgA1 (включает α₁-константную область) и IgA2 (включает α₂-константную область) антитела; и антитела IgM включают, но не ограничиваются, IgM1 и IgM2.

[066] В некоторых вариантах реализации изобретения константная область тяжелой цепи включает одну или более мутаций (или замен), добавлений или делеций, которые придают антителу желаемое свойство. Неограничивающим примером мутации является мутация S241P в шарнирной области IgG4 (между константными доменами C_H1 и C_H2), которая изменяет IgG4-mothb CPSCP на СРРСР, и которая подобна соответствующему мотиву в IgG1. Эта мутация, В некоторых вариантах реализации изобретения дает более стабильное антитело IgG4. См., например, Angal et al., Mol. Immunol. 30: 105-108 (1993); Bloom et al., Prot. Sel 6: 407-415 (1997); Schuurman et al., Mol. Immunol. 38: 1-8 (2001).

[067] Термин "тяжелая цепь" в настоящем документе относится к полипептиду, включающему по меньшей мере вариабельную область тяжелой цепи с лидерной последовательностью или без лидерной последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь включает по меньшей мере часть константной области тяжелой цепи. Термин "полноразмерная тяжелая цепь" в настоящем документе относится к полипептиду, включающему вариабельную область тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи с лидерной последовательностью или без лидерной последовательности.

[068] Термин "вариабельная область легкой цепи" в настоящем документе относится к области, включающей CDR1, каркасный участок (FR) 2, CDR2, FR3 и CDR3 легкой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения вариабельная область легкой цепи также включает FR1 и/или FR4. В некоторых вариантах реализации изобретения CDR1 легкой цепи соответствует остаткам по Kabat 24-34; CDR2 легкой цепи соответствует остаткам по Kabat 50-56; и CDR3 легкой цепи соответствует остаткам по Kabat 89-97. См., например, Kabat Sequences of proteins of Immunological Interest (1987 и 1991, NIH, Bethesda, Md.); и Фиг. 1.

[069] Термин "константная область легкой цепи" в настоящем документе относится к области, включающей константный домен легкой цепи, C_L. Неограничивающий пример константных областей легкой цепи включает λ и κ.

[070] Термин "легкая цепь" в настоящем документе относится к полипептиду, включающему по меньшей мере вариабельную область легкой цепи с лидерной последовательностью или без лидерной последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь включает по меньшей мере часть константной области легкой цепи. Термин "полноразмерная легкая цепь" в настоящем документе относится к полипептиду, включающему вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи с лидерной последовательностью или без лидерной последовательности.

[071] "Химерное антитело" в настоящем документе относится к антителу, включающему по меньшей мере одну вариабельную область из первого вида (такого как мышь, крыса, яванский макак, и т.д.) и по меньшей мере одну константную область из второго вида (такого как человек, яванская макака и т.д.). В некоторых вариантах реализации изобретения химерное антитело включает по меньшей мере одну мышиную вариабельную область и по меньшей мере одну человеческую константную область. В некоторых вариантах реализации изобретения химерное антитело включает по меньшей мере одну вариабельную область яванской макаки и по меньшей мере одну человеческую константную область. В некоторых вариантах реализации изобретения химерное антитело включает по меньшей мере одну крысиную вариабельную область и по меньшей мере одну мышиную константную область. В некоторых вариантах реализации изобретения все вариабельные области химерного антитела происходят из первого вида и все константные области химерного антитела происходят из второго вида.

[072] "Гуманизированное антитело" в настоящем документе относится к антителу, в котором по меньшей мере одна аминокислота в каркасной области нечеловеческой вариабельной области заменена соответствующей аминокислотой из человеческой вариабельной области. В некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное антитело включает по меньшей мере одну человеческую константную область или ее фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное антитело представляет собой Fab, scFv, (Fab')₂ и т.д.

[073] "CDR-привитое антитело" в настоящем документе относится к гуманизированному антителу, в котором гипервариабельные участки (CDR) первого вида (отличного от человека) привиты к каркасным областям (FR) второго (человек) вида.

[074] "Человеческое антитело" в настоящем документе относится к антителу, продуцируемому в организме человека, антителам, продуцируемым в организме животного, имеющих человеческие гены иммуноглобулинов, такого как XenoMouse®, и антителам, отобранным с использованием in vitro способов, таким как фаговыйдисплей, где состав антитела основан на последовательностях иммуноглобулинов человека.

[075] Термин "лидерная последовательность" относится к последовательности аминокислотных остатков расположенных на N-конце полипептида, которая облегчает секрецию полипептида из клетки млекопитающего. Лидерная последовательность может быть отщеплена при экспорте полипептида из клетки млекопитающего, с образованием зрелого белка. Лидерные последовательности могут быть природными или синтетическими и они могут быть гетерологичными или гомологичными белку, к которому они присоединены. Примерами лидерных последовательностей являются, без ограничения, лидерные последовательности антитела, такие как, например, аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3 и 4, которые соответствуют человеческим лидерным последовательностям легкой и тяжелой цепи, соответственно. Неограничивающие примеры лидерных последовательностей также включают лидерные последовательности гетерологичных белков. В некоторых вариантах реализации изобретения в антителе отсутствует лидерная последовательность. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело включает по меньшей мере одну лидерную последовательность, которая может быть выбрана из лидерных последовательностей нативного антитела и гетерологичных лидерных последовательностей.

[076] Термин "вектор" используется для описания полинуклеотида, который может быть сконструирован и может содержать клонированный полинуклеотид или полинуклеотиды, которые могут быть размножены в клетке-хозяине. Вектор может включать один или более следующих элементов: ориджин репликации, одну или большее число регуляторных последовательностей (таких как, например, промоторы и/или энхансеры), которые регулируют экспрессию интересующего полипептида и/или один или более генов селектируемых маркеров (таких как, например, гены устойчивости к антибиотикам и гены, которые могут быть использованы в колориметрических исследованиях, например, β-галактозидаза). Термин "экспрессионный вектор" касается вектора, который используется для экспрессии целевого полипептида в клетке-хозяине.

[077] "Клетка-хозяин" относится к клетке, которая может быть или является реципиентом вектора или выделенного полинуклеотида. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими клетками или эукариотическими клетками. Примерами эукариотических клеток являются клетки млекопитающих, такие как клетки приматов или клетки животных, не являющихся приматами; клетки грибов, такие как дрожжи; клетки растений и клетки насекомых. Неограничивающий примеры клеток млекопитающих включают, но не ограничиваются перечисленными: клетки NSO, клетки PER.C6® (Crucell), и клетки 293 и СНО и их производные, такие как клетки 293-6Е и DG44, соответственно.

[078] Термин "выделенный" (изолированный) в настоящем документе относится к молекуле, которая была изолирована от по меньшей мере нескольких компонентов, с которыми она обычно встречается в природе. Например, полипептид называется "выделенным", если он изолирован от по меньшей мере нескольких компонентов клетки, в которой продуцируется. Когда полипептид секретируется клеткой после экспрессии, физически отделенная надосадочная жидкость из клетки, которая содержит полипептид, считается "выделенным" полипептидом. Аналогично, полинуклеотид называется "выделенным", когда он не является частью большего полинуклеотида (такого как, например, геномная ДНК или митохондриальная ДНК, в случае ДНК полинуклеотида), в котором он обычно встречается в природе, или изолирован от по меньшей мере нескольких компонентов клетки, в которой продуцируется, например, в случае РНК полинуклеотида. Таким образом, ДНК полинуклеотид, который содержится в векторе внутри клетки-хозяина может называться "выделенным", при условии, что полинуклеотид находится в этом векторе в природных условиях.

[079] Термины "субъект" и "пациент" используются здесь взаимозаменяемо применительно к человеку. В некоторых вариантах реализации изобретения также предложены способы лечения других млекопитающих, включая, но не ограничиваясь такими как: грызуны, обезьяны, кошачьи, собачьи, лошади, крупный рогатый скот, свиньи, овцы, козы, лабораторные млекопитающие, сельскохозяйственные млекопитающие, спортивные млекопитающие и домашние питомцы.

[080] В настоящем документе "ревматоидный артрит" или "РА" относится к признанному болезненному состоянию, которое может быть диагностировано согласно критериям Американской Ревматоидной Ассоциации для классификации РА в редакции 2000 г или любому аналогичному критерию. В некоторых вариантах реализации изобретения термин "ревматоидный артрит" относится к хроническому аутоиммунному заболеванию, характеризующемуся, в первую очередь, воспалением выстилки (синовиальной оболочки) суставов, которое может приводить к повреждению сустава, хронической боли, потере функциональности и нетрудоспособности. Поскольку РА может поражать многие органы тела, включая кожу, легкие и глаза, он относится к системному заболеванию.

[081] Термин "ревматоидный артрит" включает не только активный и ранний РА, но также начальный РА, как определено ниже. Физиологическими индикаторами РА являются симметричный отек сустава, который является характеристическим в случае РА. Веретеноподобный отек проксимальных межфаланговых (МФ) суставов на руках, так же как и пястно-фаланговых (МСР), запястных, локтевых, коленных, лодыжек и плюснефаланговых (МТР) суставов, является обычным поражением, и отек легко определяется. Боль при пассивных движениях является наиболее чувствительным тестом воспаления сустава, воспаление и структурные деформации часто ограничивают диапазон движений пораженного сустава. Типичными видимыми изменениями являются локтевой сдвиг пальцами в МСР суставах, переразгибание или гиперфлексия МСР и МФ суставов, сгибательные контрактуры локтей и подвывих костей запястья и пальцев ног.Субъект с РА может быть нечувствителен к антиревматоидным лекарственным средствам, модифицирующим заболевание (DMARD) и/или нестероидным противовоспалительным средствам (NSAID, НСПВП). Неограничивающие примеры "DMARD" включают гидроксиклороквин, сульфасалазин, метотрексат (МТХ), лефлуномид, этанерцепт, инфликсимаб (плюс орально и подкожно МТХ), азатиоприн, D-пеницилламин, соли золота (перорально), соли золота (внутримышечно), миноклин, циклоспорин, включая циклоспорин А и местный циклоспорин, стафилококальный белок A (Goodyear and Silverman, J. Exp. Med., 197(9): 1125-1139 (2003)), включая их соли и производные и т.д. Другие кандидаты для лечения согласно этому изобретению включают соединения, у которых наблюдалась неадекватная реакция на предшествующее или текущее лечение с использованием ингибиторов ФНО, таких как этанерцепт, инфликсимаб и/или адалимумаб, вследствие токсичности или неадекватной эффективности.

[082] Пациент с "активным ревматоидным артритом" обозначает пациента с активными и нелатентными симптомами РА. Субъектами с "ранним активным ревматоидным артритом" являются субъекты с активным РА, диагностированным по меньшей мере 8 недель, но не ранее чем четыре года назад, согласно пересмотренным в 1987 критериям ACR для классификации РА.

[083] Субъектами с "ранним ревматоидным артритом" являются субъекты РА с диагностированным по меньшей мере восемь недель назад, но не более чем четыре года, согласно пересмотренным в 1987 критериям ACR для классификации РА. РА включает, например, например, юношеский РА, юношеский идиопатический артрит (ЛА) или ювенильный РА (ЮРА).

[084] У пациентов с "начальным РА" сначала возникает полиартрит, который не полностью соответствует критериям ACR для диагностирования РА, в связи с присутствием ΡΑ-специфических прогностических биомаркеров, таких как анти-ССР и общий эпитоп.Они включают пациентов с полиартритов, у которых обнаруживают положительные анти-ССР антитела, но у них еще не диагностирован РА, а также у них высок риск развития в будущем истинных критериев РА согласно ACR (вероятность 95%).

[085] "Повреждение сустава" используется в широком смысле и касается повреждения или частичного или полного разрушения любой части одного или большего числа суставов, включая соединительную ткань и хрящ, где повреждение включает структурное и/или функциональное повреждение по любой причине и может или вызывать боль/артралгию в суставе или не вызывать такой боли. Повреждение включает, без ограничения, повреждение сустава, связанное с или являющееся результатом воспалительного заболевания сустава, а также невоспалительного заболевания сустава. Это повреждение может быть вызвано любым состоянием, таким как аутоиммунное заболевание, особенно артрит, и особенно это касается РА. Примерами таких состояний являются острый и хронический артрит, ревматоидный артрит (включая юношеский РА, юношеский идиопатический артрит (ЮИА) или ювенильный РА (ЮРА)), и стадии, такие как ревматоидный синовит, подагра или подагрический артрит, острый иммунологический артрит, хронический воспалительный артрит, дегенеративный артрит, индуцированный коллагеном II типа, инфекционный артрит, септический артрит, артрит Лайма, пролиферативный артрит, псориатический артрит, болезнь Стилла, спинной артрит, остеоартрит, прогредиентный хронический артрит, деформирующий артрит, первичный хронический полиартрит, реактивный артрит, менопаузальный артрит, артрит с истощением эстрогена и анкилозирующий спондилит/ревматоидный спондилит), ревматоидное аутоиммунное заболевание, отличное от РА, и значительные системные вторичные поражения РА (включая, васкулит, легочный фиброз или синдром Фелти, но не ограничиваясь ими). Для целей данного описания суставы являются точками контакта между элементами скелета (у позвоночного, такого как животное) с частями, которые их окружают и поддерживают, и включают, но не ограничиваются, например, бедра, суставы между позвонками спины, суставы между спиной и тазом (крестцово-подвздошные суставы), суставы, где сухожилия и связки присоединены к костям, суставы между ребрами и спиной, плечи, колени, ступни, локти, кисти, пальцы, лодыжки и пальцы ног, но особенно суставы в кистях и ступнях.

[086] Термин "волчанка" в настоящем документе обозначает аутоиммунное заболевание или расстройство, которое обычно включает антитела, атакующие соединительную ткань. Основной формой волчанки является системная волчанка, системная красная волчанка (СКВ), включая кожную СКВ и подкожную СКВ, также как и другие типы волчанки (включая нефрит, внепочечную, энцефалит, педиатрическую, непочечную, дискоидальную и алопецию). В некоторых вариантах реализации данного изобретения термин "системная эритематозная волчанка" относится к хроническому аутоиммунному заболеванию, приводящему к повреждениям кожи, боли в суставе и отеку, заболеваниям почек (волчаночному нефриту), накоплению жидкости вокруг сердца и/или легких, воспалению сердца и разным другим системным состояниям. В некоторых вариантах реализации данного изобретения термин "волчаночный нефрит" касается воспаления почек, имеющего место у пациентов с СКВ. Волчаночный нефрит может включать, например, гломерулонефрит и/или интерстициальный нефрит, и может приводить к гипертензии, протеинурии и почечной недостаточности. Волчаночный нефрит можно классифицировать на основе тяжести и длительности заболевания, например, согласно определению Международного общества нефрологии/почек/патологии (International Nephrology/Renal/Pathology Society). Классы волчаночного нефрита включают класс I (минимальный мезангиальный волчаночный нефрит), класс II (мезангиальный пролиферативный волчаночный нефрит), класс III (фокальный волчаночный нефрит), класс IV (диффузный сегментальный (IV-S) или диффузный глобальный (IV-G) волчаночный нефрит), класс V (мембранный волчаночный нефрит) и класс VI (развитый склерозирующий волчаночный нефрит). Термин "волчаночный нефрит" охватывает все классы.

[087] Термин "рассеянный склероз" ("PC", «MS») относится к хроническому и часто приводящему к нетрудоспособности заболеванию центральной нервной системы, характеризующемуся прогрессирующим разрушением миелина. "Дамиелинизация" происходит, когда миелиновая оболочка воспаляется, повреждена и отделяется от нервного волокна. Существуют четыре международно признанные формы PC, а именно, первичный прогрессирующий рассеянный склероз (PPMS), возвратно-реммитирующий рассеянный склероз (ВРРС), вторичный прогрессирующий рассеянный склероз (SPMS, ВПРС) и прогрессивный рецидивирующий рассеянный склероз (PRMS, ПРРС).

[088] "Первичный прогрессирующий рассеянный склероз" или "ППРС" характеризуется постепенным развитием заболевания от его начала совершенно без перекрывания рецидивов и ремиссий. Могут существовать периоды стабилизации активности заболевания и могут быть хорошие и плохие дни и недели. ППРС отличается от ВРРС и ВПРС тем, что обычно возникает у в позднем тридцатилетнем или раннем сорокалетнем возрасте, у мужчин и женщин с равной вероятностью, и начальная активность заболевания часто проявляется в спинном мозге и не проявляется в головном мозге. ППРС часто мигрирует в головной мозг, но повреждение мозга менее возможно, нежели в случае ВРРС или ВПРС; например, люди с ППРС менее подвержены развитию когнитивных проблем. ППРС является подтипом MS, при котором наименее вероятно появление воспалительных (усиливающих сигнал гадолиния) повреждений при ЯМР-сканированиях. Первичная прогрессирующая форма заболевания проявляется у 10-15% всех людей с рассеянным склерозом. ППРС может быть определен согласно критериям, приведенным McDonald et al. Ann Neurol 50:121-7 (2001). Субъектом с ППРС, которого лечат как описано здесь, обычно является субъект с возможным ППРС или определенным диагнозом ППРС.

[089] "Возвратный реммитирующий рассеянный склероз" или "ВРРС" характеризуется рецидивами (также известными как обострения), во время которых могут проявляться новые симптомы, а старые симптомы появляются вновь или ухудшаются. Рецидивы следуют за периодами ремиссии, во время которых субъект полностью или частично восстанавливается от нарушений, имевших место во время рецидива. Рецидивы могут длиться несколько дней, недель или месяцев, и восстановление может быть медленным и постепенным или почти мгновенным. У подавляющего большинства людей с PC первоначально был диагностирован ВРРС. Это типично, когда это заболевание наблюдается у двадцатилетних или тридцатилетних, хотя известны случаи более раннего или позднего диагностирования. Женщин с диагнозом этого подтипа МС в два раза больше, чем мужчин. Во время рецидивов миелин, защитная изолирующая оболочка вокруг нервных волокон (нейронов) в областях белого вещества центральной нервной системы (ЦНС), может повреждаться при воспалительном ответе собственной иммунной системы тела. Это вызывает широкий спектр неврологических симптомов, которые значительно варьируют в зависимости от того, какие участки ЦНС повреждены. Немедленно после рецидива, воспалительный ответ затухает и специальный тип глиальных клеток в ЦНС (называемых олигодендроцитами) способствует ремиелинизвации - процессу, в котором миелиновая оболочка вокруг аксона может быть восстановлена. Эта ремиелинизация также может отвечать за ремиссию. У приблизительно 50% пациентов ВРРС превращается в ВПРС в течение 10 лет после появления заболевания. Через 30 лет это значение достигает 90%. В любой момент времени возвратно-реммитирующая форма заболевания встречается у приблизительно 55% всех людей с МС.

[090] "Вторичный прогрессирующий рассеянный склероз" или "ВПРС" характеризуется устойчивым прогрессированием клинических неврологических повреждений с наложением рецидивов, незначительных ремиссий и стабилизации, или без них. Люди с ВПРС вначале страдают ВРРС в течение некоторого периода, который может длиться от двух до сорока лет или более. Все наложенные рецидивы и ремиссии как правило затухают со временем. С началом вторичной прогрессирующей фазы заболевания нетрудоспособность начинает развиваться гораздо быстрее, чем в случае с ВРРС, хотя развитие может быть все же более медленным у некоторых лиц. ВПРС связывают с более низкими уровнями образования воспалительных повреждений, чем в случае с ВРРС, но общее бремя заболевания продолжает расти. В любой момент времени ВПРС встречается у приблизительно 30% всех людей с рассеянным склерозом.

[091] "Прогрессивный рецидивирующий рассеянный склероз" или "ПРРС" характеризуется устойчивым развитием клинических неврологических повреждений с наложением рецидивов и ремиссий. Имеет место значительное восстановление сразу после рецидива, но между рецидивами происходит постепенное ухудшение симптомов. ПРРС встречается у 5% всех людей с рассеянным склерозом. Некоторые неврологи считают ПРРС вариантом ППРС.

[092] Термин "CD16+ расстройства" обозначает заболевание, при котором CD16+ моноциты млекопитающего являются причиной, выступают посредником или иным образом влияют на заболевание у млекопитающего. Также включены заболевания, при которых уменьшение количества CD16+ моноцитов оказывает облегчающий эффект на развитие заболевания. В объем данного термина включены CD16+ воспалительные заболевания, инфекционные заболевания, иммунодефицитные заболевания, неоплазия и т.д. В некоторых вариантах реализации данного изобретения CD16+ воспалительное заболевание включает воспалительные заболевания, которые не чувствительны к лечению метотрексатом. В некоторых вариантах реализации данного изобретения CD16+ воспалительные заболевания включают метотрексат-резистентный ревматоидный артрит, метотрексат-резистентный рассеянный склероз, метотрексат-резистентную волчанку, метотрексат-резистентное воспалительное заболевание кишечника, метотрексат-резистентную болезнь Крона, метотрексат-резистентную астму и метотрексат-резистентный псориаз. В некоторых вариантах реализации данного изобретения пациенты с метотрексат-резистентными заболеваниями, такими как метотрексат-резистентный ревматоидный артрит, называются пациентами с неполным ответом на метотрексат или неадекватным ответом на метотрексат.

[093] Примерами CD16+ нарущений, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются следующими: системная эритематозная волчанка, ревматоидный артрит, ювенильный хронический артрит, спондилоартропатия, системный склероз (склеродерма), идиопатическая воспалительная миопатия (дерматомиозит, полимиозит), синдром Шегрена, системный васкулит, саркоидоз, аутоиммунная гемолитическая анемия (иммунная панцитопения, ночная пароксизмальная гемоглобинурия), аутоиммунная тромбоцитопения (идиопатическая тромбоцитопения пурпура, иммуноопосредованная тромбоцитопения), тиреоидит (болезнь Грейва, тиреоидит Хашимото, ювенильный лимфоцитный тиреоидит, атрофичный тиреоидит), сахарный диабет, иммуноопосредованное заболевание почек (гломерулонефрит, тубулоинтерстициальный нефрит), демиелинизирующие заболевания центральной и периферической нервной системы, такое как рассеянный склероз, идиопатическая демиелинизирующая полинейропатия или синдром Гийена-Барре, хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, гепатобилиарное заболевание, такое как инфекционный гепатит (гепатит А, В, С, D, Ε и другие негепатотропные вирусы), аутоиммунный хронический активный гепатит, первичный цилиарный цирроз, грануломатозный гепатит и склерозирующий холангит, воспалительная болезнь кишечника (IBD), включая язвенный колит: болезнь Крона, глютенчувствительная энтеропатия и болезнь Уиппла, аутоиммунные или иммуноопосредованные заболевания кожи, включая буллезное заболевание кожи, экссудативную многоформную эритема и контактный дерматит, псориаз, аллергическое заболевание, такое как астма, аллергический ринит, атопический дерматит, пищевая гиперчувствительность и крапивница, иммунологическое заболевание легких, такое как эозинофильная пневмония, идиопатический легочный фиброз и гиперчувствительная пневмония, заболевание связанное с трансплантацией, включая отторжение трансплантата и реакция трансплантат против хозяина; фиброз, включая фиброз почек и фиброз печени, сердечнососудистое заболевание, включая атеросклероз и заболевание коронарной артерии, сердечнососудистые проявления связанный с хронической болезнью почек, инфаркт миокарда и застойная сердечная недостаточность, диабет, включая диабет типа II, облитерирующий бронхиолит с организующейся пневмонией (ВООР), гемафагоцитный синдром, синдром активации макрофагов, саркоидоз и периодонтит.Инфекционные заболевания, включая вирусные заболевания, такие как СПИД (ВИЧ инфекция), гепатит А, В, С, D и Е, герпес и т.д., бактериальные инфекции, грибковые инфекции, протозойные инфекции и паразитарные инфекции.

[094] "Лечение" в настоящем документе относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным метам, целью которых является предотвращение или замедление (уменьшение) целевого патологического состояния или расстройства. В некоторых вариантах реализации данного изобретения термин "лечение" охватыввет любое назначение или применение терапевтических средств к заболеванию у млекопитающего, включая человека, и включает подавление или замедление заболевания или прогрессирования заболевания; частичное или полное освобождения от заболевания, например, обеспечивая обратное развитие или восстановление или возврат утраченных, сниженных или нарушенных функций; стимулирование слабого процесса; или выведения заболевания на плато со снижением тяжести. Термин "лечение" также включает уменьшение тяжести любых фенотипических признаков и/или уменьшение числа эпизодов, степени или частоты встречаемости таких признаков. Те, кто нуждаются в лечении, включают тех, у кого уже есть данное нарушение, а также тех, кто склонен к появлению нарушения или тех, у кого необходимо предотвратить нарушение.

[095] "Хроническое" введение относится к введению агента непрерывно, в отличие от ударного режима, для поддержания начального терапевтического эффекта (активноста) на протяжении длительного периода времени. "Прерывистое" введение является лечением, при котором введение не является постоянным без перерывов, а имеет периодический характер.

[096] Термин "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" относится к количеству лекарственного средства, эффективному для лечения заболевания или нарушения у субъекта. В некоторых вариантах реализации данного изобретения эффективное количество относится к эффективному количеству, в дозах и на протяжении времени, необходимох для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата. Терапевтически эффективное количество анти-CSF1R антитела согласно изобретению может изменяться в зависимости от факторов, таких как состояние заболевания, возраст, пол и масса индивида, и способности анти-CSF1R антитела вызывать желаемый ответ у индивида. Терапевтически эффективное количество включает количество, при котором любое токсическое или нежелательное действие анти-CSF1R антитела перевешивается терапевтическими полезными эффектами.

[097] "Профилактически эффективное количество" относится к эффективному количеству, дозам и периодом времени, необходимым для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, но не обязательно, поскольку профилактическая доза вводится субъектам до заболевания или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.

[098] Введение "в комбинации с" одним или большим числом дополнительных терапевтических агентов включает одновременное (сопутствующее) и введение последовательно в любом порядке.

[099] "Фармацевтически приемлемый носитель" относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу, вспомогательному веществу или носителю, обычным в этой области для использования с терапевтическим агентом, вместе с которым они составляют "фармацевтическую композицию" для введения субъекту. Фармацевтически приемлемый носитель является нетоксичным для реципиента в используемых дозах и концентрациях, и совместим с другими ингредиентами данной формы. Фармацевтически приемлемый носитель приемлем для используемой формы. Например, если терапевтический агент вводят перорально, носитель может быть гелем для капсул. Если терапевтический агент вводят подкожно, носитель в идеале не раздражает кожу и не вызывает реакции в месте инъекции.

Анти-CSF1R Антитела

[0100] Анти-CSF1R антитела включают гуманизированные антитела, химерные антитела, мышиные антитела, человеческие антитела и антитела, включающие CDR тяжелой цепи и/или легкой цепи, обсуждаемые в настоящем документе, но не ограничивается ими.

Примеры гуманизированных антител

[0101] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены гуманизированные антитела, связывающие CSF1R. Гуманизированные антитела полезны в качестве терапевтических молекул, поскольку гуманизированные антитела уменьшают или устраняют иммунный ответ человека на нечеловеческие антитела (такие как ответ антител человека на мышиные антитела (НАМА)), которые могут вызывать иммунный ответ к терапевтическим антителам и уменьшать эффективность лечения.

[0102] Неограничивающими примерами гуманизированных антител являются huAb1-huAb16, описанные в данном документе. Неограничивающими примерами гуманизированных антител также являются антитела, включающие вариабельную область тяжелой цепи антитела, выбранного из huAb1-huAb16, и/или вариабельную область легкой цепи антитела, выбранного из huAb1-huAb16. Неограничивающими примерами гуманизированных антител являются антитела, включающие вариабельную область тяжелой цепи, выбираемую из SEQ ID NO: 39-45, и/или вариабельную область легкой цепи, выбираемую из SEQ ID NO: 46-52. Примерами гуманизированных антител также являются, но не ограничиваются, гуманизированные антитела, включающие CDR1 тяжелой цепи, CDR2 и CDR3 и/или легкую цепь CDR1, CDR2 и CDR3 антитела, выбранного из 0301, 0302 и 0311.

[0103] В некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное анти-CSF1R антитело включает CDR1 тяжелой цепи, CDR2 и CDR3 и/или легкую цепь CDR1, CDR2 и CDR3 антитела, выбранного из 0301, 0302 и 0311. Неограничивающими примерами гуманизированных анти-CSF1R антител являются антитела, включающие наборы тяжелых цепей CDR1, CDR2 и CDR3, выбираемых из: SEQ ID NO: 15, 16 и 17; SEQ ID NO: 21, 22 и 23; и SEQ ID NO: 27,28 и 29. Неограничивающими примерами гуманизированных анти-CSF1R антител также являются антитела включающие наборы легких цепей CDR1, CDR2 и CDR3, выбираемых из: SEQ ID NO: 18, 19 и 20; SEQ ID NO: 24, 25 и 26; и SEQ ID NO: 30, 31 и 32.

[0104] Неограничивающими примерами гуманизированных анти-CSF1R антител являются антитела, включающие наборы тяжелых цепей CDR1, CDR2 и CDR3 и легких цепей CDR1, CDR2 и CDR3 в Таблице 1 (показаны SEQ ID NO; смотрите Таблицу 8 с последовательностями). Каждый ряд в Таблице 1 показывает CDR1 тяжелой цепи, CDR2 и CDR3 и легкую цепь CDR1, CDR2 и CDR3 примерного антитела.

Дополнительные примеры гуманизированных антител

[0105] В некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное анти-CSF1R антитело включает тяжелую цепь, включающую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 39-45,и при этом антитело связывает CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное анти-CSF1R антитело включает легкую цепь, включающую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 46-52, причем антитело связывает CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное анти-CSF1R антитело включает тяжелую цепь, включающую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%,по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 39-45; и легкую цепь, включающую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 46-52; где антитело связывает CSF1R.

[0106] В настоящем документе конкретный полипептид, характеризующийся, например, по меньшей мере 95% идентичностью аминокислотной последовательности, может быть определен с использованием, например, компьютерной программы. При определении, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной контрольной последовательности, процент идентичности рассчитывается по всей длине контрольной аминокислотной последовательности.

[0107] В некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное анти-CSF1R антитело включает по меньшей мере один из CDR, описанных в настоящем документе. То есть, в некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное анти-CSF1R антитело включает по меньшей мере один CDR, выбранный из CDR1 тяжелой цепи, описанного в настоящем документе, CDR2 тяжелой цепи, описанного в настоящем документе, CDR3 тяжелой цепи, описанного в настоящем документе, CDR1 легкой цепи, описанного в настоящем документе, CDR2 легкой цепи, описанного в настоящем документе, и CDR3 легкой цепи, описанного в настоящем документе. Кроме того, в некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное анти-CSF1R антитело включает по меньшей мере один мутированный CDR на основе CDR, описанного в настоящем документе, где мутированный CDR включает 1, 2, 3 или 4 аминокислотных замены относительно CDR, описанного в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более аминокислотных замен являются консервативными аминокислотными заменами. Специалист в этой области может выбрать одну или более пригодных консервативных аминокислотных замен для конкретной последовательности CDR, причем не ожидается, что пригодные консервативные аминокислотные замены приведут к значительному изменению связывающих свойств антитела, включающего мутированный CDR.

[0108] Примерами гуманизированных анти-CSF1R антител также являются антитела, которые конкурируют за связывание с CSF1R с антителами, описанными в данном документе. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения предложено гуманизированное анти-CSF1R антитело, которое конкурирует за связывание с CSF1R с антителами, выбранными из Fab 0301, 0302 и 0311 и бивалентных вариантов этих Fab (то есть, имеющих две тяжелые цепи и две легкие цепи).

Примеры константных областей гуманизированного антитела

[0109] В некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное антитело, описанное в данном документе, включает одну или более константных областей человека. В некоторых вариантах реализации изобретения константная область тяжелой цепи человека относится к изотипу, выбранному из IgA, IgG и IgD. В некоторых вариантах реализации изобретения константная область легкой цепи человека относится к изотипу, выбранному из κ и λ. В некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное антитело, описанное в данном документе, включает константную область IgG человека. В некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное антитело, описанное в данном документе, включает константную область тяжелой цепи IgG4 человека. В некоторых таких вариантах реализации гуманизированное антитело, описанное в данном документе, включает S241P мутацию в константной области IgG4 человека. В некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное антитело, описанное в данном документе, включает константную область IgG4 человека и человеческую легкую цепь κ.

[0110] Выбор константной области тяжелой цепи может определить, будет ли антитело иметь эффекторную функцию in vivo. Такая эффекторная функция, в некоторых вариантах реализации изобретения включает антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC, АЗКЦ) и/или комплементзависимую цитотоксичность (CDC, КЦЗТ) и может приводить к смерти клетки, с которой связывается антитело. В некоторых способах лечения, включая способы лечения некоторых видов рака, гибель клетки может быть желательной, например, когда антитело связывает клетку, поддерживающую существование или рост опухоли. Примерами клеток, которые могут поддерживать существование или рост опухоли, являются, но не ограничиваются ими, сами клетки опухоли, клетки, помогающие образованию сосудистой сети в опухоли, и клетки, обеспечивающие лиганды, факторы роста или контррецепторы, поддерживающие или ускоряющие рост опухоли или выживание опухоли. В некоторых вариантах реализации изобретения, когда желательной является эффекторная функция, анти-CSF1R антитело включает тяжелую цепь IgG1 человека или тяжелую цепь IgG3 человека.

[0111] В некоторых способах лечения эффекторная функция может быть нежелательной. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения может быть желательно, что бы антитела, используемые при лечении волчанки, и/или PC, и/или РА, и/или остеолиза, не имели эффекторной функции. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитела, созданные для лечения рака, могут быть непригодны для применения при лечении волчанки, и/или PC, и/или РА, и/или остеолиза. Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения при лечении волчанки, и/или МС, и/или РА, и/или остеолиза применяют анти-CSF1R антитело без значительной эффекторной функции. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело для лечения волчанки, и/или MS, и/или РА, и/или остеолиза включает константную область тяжелой цепи IgG4 или IgG2 человека. В некоторых вариантах реализации изобретения константная область IgG4 включает мутацию S241P.

[0112] Антитела могут быть гуманизированы любым способом. Неограничивающими примерами способов гуманизации являются способы описанные, например, в патентах США 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 6,180,370; Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-27 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-36 (1988); и публикации US 2009/0136500.

[0113] Как отмечено выше, гуманизированное антитело является антителом, в котором по меньшей мере одна аминокислота в каркасной области не-человеческой вариабельной области заменена аминокислотой из соответствующего положения человеческой каркасной области. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере две по меньшей мере три по меньшей мере четыре по меньшей мере пять по меньшей мере шесть по меньшей мере семь по меньшей мере восемь по меньшей мере девять по меньшей мере 10 по меньшей мере 11 по меньшей мере 12 по меньшей мере 15, или по меньшей мере 20 аминокислот в каркасных областях нечеловеческой вариабельной области заменены аминокислотами из одного или более соответствующих положений в одной или более человеческих каркасных областей.

[0114] В некоторых вариантах реализации изобретения некоторые соответствующие человеческие аминокислоты, используемые для замены, происходят из каркасных областей разных генов иммуноглобулинов человека. То есть, в некоторых таких вариантах реализации настоящего изобретения одна или более «нечеловеческих» аминокислот могут быть заменены соответствующими аминокислотами из человеческой каркасной области первого антитела человека или кодированы первым геном иммуноглобулина человека, одна или более «нечеловеческих» аминокислот могут быть заменены соответствующими аминокислотами из человеческой каркасной области второго антитела человека или кодированы вторым геном иммуноглобулина человека, одна или более «нечеловеческих» аминокислот могут быть заменены соответствующими аминокислотами из человеческий каркасной области третьего антитела человека или кодированы третьим геном иммуноглобулина человека, и т.д. Кроме того, в некоторых вариантах реализации изобретения все соответствующие человеческие аминокислоты, используемые для замены в отдельной каркасной области, например, FR2, необязательно происходят из одной каркасной области человека. Однако, в некоторых вариантах реализации изобретения все соответствующие человеческие аминокислоты, используемые для замены, происходят из того же самого антитела человека или кодируются одним геном иммуноглобулина человека.

[0115] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело гуманизируют путем замены одной или более полных каркасных областей соответствующими человеческими каркасными областями. В некоторых вариантах реализации изобретения человеческую каркасную область выбирают таким образом, чтобы она имела максимальный уровень гомологии с заменяемой нечеловеческой каркасной областью. В некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное таким образом антитело представляет собой CDR-привитое антитело.

[0116] В некоторых вариантах реализации изобретения после привития CDR одну или более аминокислот в каркасной области заменяют обратно на соответствующие аминокислоты мышиной каркасной области. Такие "обратные мутации" делаю, в некоторых вариантах реализации изобретения для сохранения одной или более аминокислот мышиных каркасных областей, которые, по-видимому, влияют на структуру одного или более CDR и/или которые могут быть вовлечены в контакты антигена и/или, по-видимому, имеют значение для общей структурной целостности антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения делают десять или менее, девять или менее, восемь или менее, семь или менее, шесть или менее, пять или менее, четыре или менее, три или менее, две или менее, одну или ноль обратных мутаций в каркасных областях антитела после привития CDR.

[0117] В некоторых вариантах реализации изобретения гуманизированное антитело также включает человеческую константную область тяжелой цепи и/или человеческую константную область легкой цепи.

Примеры химерных антител

[0118] В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело представляет собой химерное антитело. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает по меньшей мере одну нечеловеческую вариабельную область и по меньшей мере одну человеческую константную область. В некоторых таких вариантах реализации настоящего изобретения все вариабельные области анти-CSF1R антитела являются «нечеловеческими» (не характерными для антител человека) вариабельными областями и все константные области анти-CSF1R антитела являются человеческими константными областями. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более вариабельных областей химерного антитела являются мышиными вариабельными областями. Человеческая константная область химерного антитела не обязательно имеет тот же изотип, что нечеловеческая константная область, которую она, если это имеет место, она заменяет. Химерные антитела обсуждаются, например, в патенте США 4,816,567; и Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-55 (1984).

[0119] Неограничивающие примеры химерных антител включают химерные антитела, включающие вариабельные области тяжелой и/или легкой цепей антитела, выбранного из 0301, 0302 и 0311. Дополнительные неограничивающие примеры химерных антител включают химерные антитела, включающие CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и/или CDR1, CDR2 и CDR3 легкой антитела, выбранного из 0301, 0302 и 0311.

[0120] Неограничивающие примеры химерных анти-CSF1R антител включают антитела, включающие следующие пары вариабельных областей тяжелых и легких цепей: SEQ ID NO: 9 и 10; SEQ ID NO: 11 и 12; и SEQ ID NO: 13 и 14.

[0121] Неограничивающие примеры химерных анти-CSF1R антител включают антитела, включающие набор CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, как показано выше в Таблице 1.

Дополнительные примеры химерных антител

[0122] В некоторых вариантах реализации изобретения химерное анти-CSF1R антитело включает тяжелую цепь, включающую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 9,11, 13 и 39-45, где антитело связывает CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения химерное анти-CSF1R антитело включает легкую цепь, включающую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 46-52, где антитело связывает CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения химерное анти-CSF1R антитело включает тяжелую цепь, включающую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 39-45;и легкую цепь, включающую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 46-52; где антитело связывает CSF1R.

[0123] В некоторых вариантах реализации изобретения химерное анти-CSF1R антитело включает по меньшей мере один из CDR, описанных в настоящем документе. То есть, в некоторых вариантах реализации изобретения химерное анти-CSF1R антитело включает по меньшей мере один CDR, выбранный из CDR1 тяжелой цепи, описанного в настоящем документе, CDR2 тяжелой цепи, описанного в настоящем документе, CDR3 тяжелой цепи, описанного в настоящем документе, легкой цепи CDR1, описанного в настоящем документе, легкой цепи CDR2, описанного в настоящем документе, и легкой цепи CDR3, описанного в настоящем документе. Кроме того, в некоторых вариантах реализации изобретения химерное анти-CSF1R антитело включает по меньшей мере один мутированный CDR на основе CDR, описанного в настоящем документе, где мутированный CDR включает 1, 2, 3 или 4 аминокислотных замены, по сравнению с CDR, описанным в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более аминокислотных замен являются консервативными аминокислотными заменами. Специалист в данной области может выбрать одну или более пригодных консервативных аминокислотных замен для определенной последовательности CDR, где не ожидается, что пригодные консервативные аминокислотные замены приведут к существенному изменению свойств антитела, включающего мутированный CDR.

[0124] Примерами химерных анти-CSF1R антител также являются химерные антитела, которые конкурируют за связывание CSF1R с антителами, описанными в данном документе. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения предложено химерное анти-CSF1R антитело, которое конкурирует за связывание с CSF1R с антителом, выбранным из Fab 0301, 0302 и 0311; и бивалетных (то есть имеющих две тяжелых цепи и две легких цепи) вариантов этих Fab.

Примеры константных областей химерных антител

[0125] В некоторых вариантах реализации изобретения химерное антитело, описанное в данном документе, включает одну или более человеческих константных областей. В некоторых вариантах реализации изобретения человеческая константная область тяжелой цепи относится к изотипу, выбранному из IgA, IgG, и IgD. В некоторых вариантах реализации изобретения человеческая константная область легкой цепи относится к изотипу, выбранному из κ и λ. В некоторых вариантах реализации изобретения химерное антитело, описанное в данном документе, включает константную область IgG человека. В некоторых вариантах реализации изобретения химерное антитело, описанное в данном документе, включает константную область тяжелой цепи IgG4 человека. В некоторых таких вариантах реализации химерное антитело, описанное в данном документе, включает мутацию S241P в константной области IgG4 человека. В некоторых вариантах реализации изобретения химерное антитело, описанное в данном документе, включает константную область IgG4 человека и человеческую легкую цепь κ.

[0126] Как отмечалось выше, в любом случае желаемая эффекторная функция может зависеть от определенного способа лечения, для которого предназначено антитело. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения, когда эффекторная функция желательно, химерное анти-CSF1R антитело включает константную область тяжелой цепи IgG1 человека или константную область тяжелой цепи IgG3 человека. В некоторых вариантах реализации изобретения, когда эффекторная функция является нежелательной, химерное анти-CSF1R антитело включает человеческую константную область тяжелой цепи IgG4 или IgG2.

Примеры человеческих антител

[0127] Человеческие антитела можно получить любым пригодным способом. Неограничивающими примерами способов является получение человеческих антител в трансгенных мышах, которые содержат локус человеческого иммуноглобулина. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-55 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-8 (1993); Lonberg et al., Nature 368: 856-9 (1994); и патенты US 5,545,807; 6,713,610; 6,673,986; 6,162,963; 5,545,807; 6,300,129; 6,255,458; 5,877,397; 5,874,299; и 5,545,806.

[0128] Неограничивающие примеры способов также включают получение антитела человека с помощью библиотек на фаговых дисплеях. См., например, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227: 381-8 (1992); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-97 (1991); и PCT публикацию WO 99/10494.

[0129] В некоторых вариантах реализации изобретения человеческое анти-CSF1R антитело связывает полипептид, имеющую последовательность SEQ ID NO: 1. Примеры человеческих анти-CSF1R антител также включают антитела, которые конкурируют за связывание с CSF1R с антителами, описанными в данном документе. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения предложено человеческое анти-CSF1R антитело, которое конкурирует за связывание CSF1R с антителами, выбранными из Fab 0301, 0302 и 0311, и бивалентными (то есть, имеющие две тяжелые цепи и две легкие цепи) вариантами этих Fab антител.

[0130] В некоторых вариантах реализации изобретения человеческое анти-CSF1R антитело включает одну или более человеческих константных областей. В некоторых вариантах реализации изобретения человеческая константная область относится к изотипу, выбранному из IgA, IgG, и IgD. В некоторых вариантах реализации изобретения человеческая константная область легкой цепи относится к изотипу, выбранному из κ и λ. В некоторых вариантах реализации изобретения человеческие антитела, описанные в данном документе, включают человеческую константную область IgG. В некоторых вариантах реализации изобретения человеческие антитела, описанные в данном документе, включают человеческую константную область тяжелой цепи IgG4. В некоторых таких вариантах реализации настоящего изобретения человеческие антитела, описанные в данном документе, включают мутацию S241P в константной области IgG4 человека. В некоторых вариантах реализации изобретения человеческие антитела, описанные в данном документе, включают константную область IgG4 человека и человеческую легкую цепь κ.

[0131] В некоторых вариантах реализации изобретения, когда эффекторная функция желательна, человеческое анти-CSF1R антитело включает человеческую константную область тяжелой цепи IgG1 или человеческую константную область тяжелой цепи IgG3. В некоторых вариантах реализации изобретения, когда эффекторная функция является нежелательной, химерное анти-CSF1R антитело включает человеческую константную область тяжелой цепи IgG4 или IgG2.

Дополнительные примеры анти-CSF1R антител

[0132] Примеры анти-CSF1R антител также включают, но не ограничиваются следующими: мышиные, гуманизированные, человеческие, химерные и рекомбинатные антитела, включающие, например, одну или более последовательностей CDR, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, описанную в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает вариабельную область легкой цепи, описанную в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, описанную в данном документе, и вариабельную область легкой цепи, описанную в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает CDR1 тяжелой цепи, CDR2 и CDR3, описанную в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает легкую цепь CDR1, CDR2 и CDR3, описанную в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, описанные в данном документе, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, описанные в данном документе.

[0133] В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает вариабельную область тяжелой цепи антитела, выбранного из Fab 0301, 0302 и 0311. Неограничивающие примеры анти-CSF1R антител также включают антитела, включающие вариабельную область тяжелой цепи антитела, выбранного из гуманизированного антитела huAb1-huAb16. Неограничивающими примерами анти-CSF1R антител являются антитела, включающие вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность, выбираемую из SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 39-45.

[0134] В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает вариабельную область легкой цепи антитела, выбранного из Fab 0301, 0302, и 311. Неограничивающие примеры анти-CSF1R антител также включают антитела, включающие вариабельную область легкой цепи антитела, выбранного из гуманизированного антитела huAb1-huAb16. Неограничивающими примерами анти-CSF1R антител являются антитела, включающие вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность, выбираемую из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 46-52.

[0135] В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела, выбранного из Fab 0301, 0302 и 0311. Неограничивающие примеры анти-CSF1R антител также включают антитела, включающие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела, выбранного из гуманизированного антитела huAb1-huAb16. Неограничивающие примеры анти-CSF1R антител включают антитела, включающие следующие пары вариабельных областей тяжелой и легкой цепей: SEQ ID NO: 9 и 10; SEQ ID NO: 11 и 12; и SEQ ID NO: 13 и 14; SEQ ID NO: 39 и 40; SEQ ID NO: 41 и 42; SEQ ID NO: 43 и 44; SEQ ID NO: 45 и 46; SEQ ID NO: 47 и 48; SEQ ID NO: 49 и 50; и SEQ ID NO: 51 и 52. Неограничивающие примеры анти-CSF1R антител также включают антитела, включающие следующие пары тяжелых и легких цепей: SEQ ID NO: 33 и 34; SEQ ID NO: 35 и 36; и SEQ ID NO: 37 и 38.

[0136] В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи антитела, выбранного из Fab 0301, 0302 и 0311. Неограничивающие примеры анти-CSF1R антител включают антитела, включающие наборы CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, выбранные из: SEQ ID NO: 15, 16 и 17; SEQ ID NO: 21, 22 и 23; и SEQ ID NO: 27, 28 и 29.

[0137] В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи антитела, выбранного из Fab 0301, 0302 и 0311. Неограничивающие примеры анти-CSF1R антител включают антитела, включающие наборы CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, выбранных из: SEQ ID NO: 18, 19 и 20; SEQ ID NO: 24, 25 и 26; и SEQ ID NO: 30, 31 и 32.

[0138] В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи антитела, выбранного из Fab 0301, 0302 и 0311.

[0139] Неограничивающие примеры анти-CSF1R антител включают антитела, включающие наборы тяжелых цепей CDR1, CDR2 и CDR3 и легких цепей CDR1, CDR2 и CDR3, показанных выше в Таблице 1.

Дополнительные примеры антител

[0140] В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает тяжелую цепь, включающую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 39-45, где антитело связывает CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает легкую цепь, включающую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 46-52, где антитело связывает CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает тяжелую цепь, включающую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%,по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 39-45;и легкую цепь, включающую последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%,по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 46-52; где антитело связывает CSF1R.

[0141] В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает по меньшей мере один из CDR, описанных в настоящем документе. То есть в некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает по меньшей мере один CDR, выбранный из CDR1 тяжелой цепи, описанного в настоящем документе, CDR2 тяжелой цепи, описанного в настоящем документе, CDR3 тяжелой цепи, описанного в настоящем документе, CDR1 легкой цепи, описанного в настоящем документе, CDR2 легкой цепи, описанного в настоящем документе, и CDR3 легкой цепи, описанного в настоящем документе. Кроме того, в некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело включает по меньшей мере один мутированный CDR на основе CDR, описанного в настоящем документе, где мутированный CDR включает 1, 2, 3 или 4 аминокислотных замены по сравнению с CDR, описанным в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более аминокислотных замен являются консервативными аминокислотными заменами. Специалист в этой области может выбрать одну или более пригодных консервативных аминокислотных замен для конкретной последовательности CDR, причем не ожидается, что пригодные аминокислотные замены приведут к значительному изменению связывающих свойств антитела, включающего мутированную CDR.

[0142] Примеры анти-CSF1R антител также включают антитела, которые конкурируют за связывание с CSF1R с антителами, описанными в данном документе. Таким образом, В некоторых вариантах реализации изобретения предложен анти-CSF1R антитело, которое конкурирует за связывание с CSF1R с антителами, выбираемыми из Fab 0301, 0302 и 0311, и бивалентными (то есть, имеющие две тяжелые цепи и две легкие цепи) версиями этих Fab антител.

Примеры константных областей антител

[0143] В некоторых вариантах реализации изобретения антитела, описанные в данном документе включают одну или более человеческих константных областей. В некоторых вариантах реализации изобретения человеческая константная область относится к изотипу, выбранному из IgA, IgG, и IgD. В некоторых вариантах реализации изобретения человеческая константная область легкой цепи относится к изотипу, выбранному из κ и λ. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела, описанные в данном документе, включают константную область IgG человека. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела, описанные в данном документе, включают константную область тяжелой цепи IgG4 человека. В некоторых таких вариантах реализации предложенного изобретения антитела, описанные в данном документе, включают мутацию S241P в константной области IgG4 человека. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела, описанные в данном документе, включают константную область IgG4 человека и человеческую легкую цепь κ.

[0144] Как отмечалось выше, в любом случае желаемая эффекторная функция может зависеть от определенного способа лечения, для которого предназначено антитело. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения, когда желаемой является эффекторная функция, анти-CSF1R антитело включает константную область тяжелой цепи IgG1 человека или константную область тяжелой цепи IgG3 человека. В некоторых вариантах реализации изобретения, когда эффекторная функция является нежелательной, анти-CSF1R антитело включает константную область тяжелой цепи IgG4 или IgG2 человека.

Примеры вариабельных областей тяжелых цепей анти-CSF1R

[0145] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены вариабельные области тяжелых цепей анти-CSF1R антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения вариабельная область тяжелой цепи анти-CSF1R антитела является мышиной вариабельной областью, человеческой вариабельной областью или гуманизированной вариабельной областью.

[0146] Вариабельная область тяжелой цепи анти-CSF1R антитела включает CDR1, FR2, CDR2, FR3 и CDR3 тяжелой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения вариабельная область тяжелой цепи анти-CSF1R антитела дополнительно включает тяжелую цепь FR1 и/или FR4. Неограничивающие примеры вариабельных областей тяжелых цепей включают, но не ограничиваются ими: вариабельные области тяжелых цепей, имеющих аминокислотную последовательность, выбираемую из SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 39-45.

[0147] В некоторых вариантах реализации изобретения вариабельная область тяжелой цепи анти-CSF1R антитела включает CDR1, включающий последовательность, выбираемую из SEQ ID NO: 15, 21 и 27.

[0148] В некоторых вариантах реализации изобретения вариабельная область тяжелой цепи анти-CSF1R антитела включает CDR2, включающий последовательность, выбираемую из SEQ ID NO: 16, 22 и 28.

[0149] В некоторых вариантах реализации изобретения вариабельная область тяжелой цепи анти-CSF1R антитела включает CDR3, включающий последовательность, выбираемую из SEQ ID NO: 17, 23 и 29.

[0150] Неограничивающие примеры вариабельных областей тяжелых цепей включают, но не ограничиваются ими вариабельные области тяжелых цепей, включающих наборы CDR1, CDR2 и CDR3, выбранных из: SEQ ID NO: 15, 16 и 17; SEQ ID NO: 21, 22 и 23; и SEQ ID NO: 27, 28 и 29.

[0151] В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь анти-CSF1R антитела включает последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 9, 11, 13 и 39-45, где тяжелая цепь, вместе с легкой цепью, способна образовывать антитело, связывающее CSF1R.

[0152] В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь анти-CSF1R антитела включает по меньшей мере один из CDR, описанных в настоящем документе. То есть, в некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь анти-CSF1R антитела включает по меньшей мере один CDR, выбранный из CDR1 тяжелой цепи, описанный в настоящем документе, CDR2 тяжелой цепи, описанный в настоящем документе, и CDR3 тяжелой цепи, описанный в настоящем документе. Кроме того, в некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь анти-CSF1R антитела включает по меньшей мере одну мутированную CDR на основе CDR, описанной в настоящем документе, где мутированный CDR включает 1, 2, 3, или 4 аминокислотных замены по сравнению с CDR, описанным в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более аминокислотных замен являются консервативными аминокислотными заменами. Специалист в этой области может выбрать одну или более пригодных консервативных аминокислотных замен для конкретной последовательности CDR, причем не ожидается, что пригодные аминокислотные замены приведут к значительному изменению связывающих свойств тяжелой цепи, включающей мутированную CDR.

[0153] В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь включает константную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь включает человеческую константную область тяжелой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения человеческая константная область относится к изотипу, выбранному из IgA, IgG, и IgD. В некоторых вариантах реализации изобретения человеческая константная область тяжелой цепи является константной областью IgG. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь включает константную область тяжелой цепи IgG4 человека. В некоторых таких вариантах реализации предложенного изобретения человеческая константная область тяжелой цепи IgG4 включает мутацию S241P.

[0154] В некоторых вариантах реализации изобретения, когда эффекторная функция желательна, тяжелая цепь включает константную область тяжелой цепи IgG1 или IgG3 человека. В некоторых вариантах реализации изобретения, когда эффекторная функция менее желательна, тяжелая цепь включает константную область тяжелой цепи IgG4 или IgG2 человека.

Примеры вариабельных областей легких цепей анти-CSF1R

[0155] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены вариабельные области легких цепей анти-CSF1R антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения вариабельной областью легкой цепи анти-CSF1R антитела является мышиная вариабельная область, человеческая вариабельная область или гуманизированная вариабельная область.

[0156] Вариабельная область легкой цепи анти-CSF1R антитела включает CDR1, FR2, CDR2, FR3 и CDR3 легкой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения вариабельная область легкой цепи анти-CSF1R антитела дополнительно включает FR1 и/или FR4 легкой цепи. Неограничивающие примеры вариабельных областей легких цепей включают вариабельные области легких цепей, имеющих аминокислотную последовательность, выбираемую из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 46-52.

[0157] В некоторых вариантах реализации изобретения вариабельная область легкой цепи анти-CSF1R антитела включает CDR1, включающий последовательность, выбираемую из SEQ ID NO: 18, 24 и 30.

[0158] В некоторых вариантах реализации изобретения вариабельная область легкой цепи анти-CSF1R антитела включает CDR2, включающий последовательность, выбираемую из SEQ ID NO: 19, 25 и 31.

[0159] В некоторых вариантах реализации изобретения вариабельная область легкой цепи анти-CSF1R антитела включает CDR3, включающий последовательность, выбираемую из SEQ ID NO: 20, 26 и 32.

[0160] Неограничивающие примеры вариабельных областей легких цепей включают, но не ограничиваются, вариабельные области легких цепей, включающих наборы CDR1, CDR2 и CDR3, выбираемых из: SEQ ID NO: 18, 19 и 20; SEQ ID NO: 24, 25 и 26; и SEQ ID NO: 30, 31 и 32.

[0161] В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь анти-CSF1R антитела включает последовательность вариабельной области, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 10, 12, 14 и 46-52, где легкая цепь, вместе с тяжелой цепью, способна образовывать антитело, связывающее CSF1R.

[0162] В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь анти-CSF1R антитела включает по меньшей мере один из CDR, описанных в настоящем документе. То есть, В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь анти-CSF1R антитела включает по меньшей мере один CDR, выбранный из CDR1 легкой цепи, описанного в настоящем документе, CDR2 легкой цепи, описанного в настоящем документе, и CDR3 легкой цепи, описанного в настоящем документе. Кроме того, в некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь анти-CSF1R антитела включает по меньшей мере один мутированный CDR на основе CDR, описанного в настоящем документе, где мутированный CDR включает 1, 2, 3, или 4 аминокислотных замены по сравнению с CDR, описанным в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более аминокислотных замен являются консервативными аминокислотными заменами. Специалист в этой области может выбрать одну или более пригодных консервативных аминокислотных замен для конкретной последовательности CDR, причем не ожидается, что пригодные аминокислотные замены приведут к значительному изменению связывающих свойств легкой цепи, включающей мутированный CDR.

[0163] В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь включает человеческую константную область легкой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения человеческую константную область легкой цепи выбирают из человеческой константной области легкой цепи κ и человеческой константной области легкой цепи λ.

Примеры дополнительных молекул, связывающих CSF1R

[0164] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены дополнительные молекулы, связывающие CSF1R. Такими молекулами являются, но не ограничиваются, неканонические остовы, такие как анти-калины, аднектины, повторы анкиринов и т.д. См., например, Hosse et al., Prof. Sci. 15:14 (2006); Fiedler, M. и Skerra, Α., "Non-Antybody Scaffolds," pp.467-499 in Handbook of Therapeutic Antybodys, Dubel, S., ed., Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2007. Примеры свойств анти-CSF1R антител

[0165] В некоторых вариантах реализации изобретения антитела, имеющие структуру описанную выше, связывают CSF1R с аффинностью связывания (К_D) менее чем 1 нМ, блокируют связывание CSF1 и/или IL-34 с CSF1R, и ингибируют фосфорилирование CSF1R, индуцированное CSF1 и/или IL-34.

[0166] В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело связывает внеклеточный домен CSF1R (CSF1R-ECD). В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело имеет аффинность связывания (К_D) CSF1R менее чем 1 нМ, менее чем 0,5 нМ, менее чем 0,1 нМ или менее чем 0,05 нМ. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело имеет К_D от 0,01 до 1 нМ, от 0,01 до 0,5 нМ, от 0,01 до 0,1 нМ, от 0,01 до 0,05 нМ или от 0,02 до 0,05 нМ.

[0167] В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело блокирует связывание лиганда с CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело блокирует связывание CSF1 с CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело блокирует связывание IL-34 с CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело блокирует связывание и CSF1 и IL-34 с CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела, блокирующие связывающий лиганд, связывают внеклеточный домен CSF1R. Антитело считается "блокирующим лиганд, связывающийся с CSF1R", когда оно уменьшает количество детектируемого связывания лиганда с CSF1R по меньшей мере на 50% по результатам исследования, описанного в Примере 7. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела уменьшают количество детектируемого связывания лиганда с CSF1R по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90% по результатам исследования, описанного в Примере 7. В некоторых таких вариантах реализации настоящего изобретения снижает значение детектируемого связывания лиганда по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70% и т.д.

[0168] В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело ингибирует лиганд-индуцированное фосфорилирование CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело ингибирует CSF1-индуцированное фосфорилирование CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело ингибирует IL-34- индуцированное фосфорилирование CSF1R. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело ингибирует и CSF1-индуцированное вызванное, и IL-34-индуцированное фосфорилирование CSF1R. Антителом считается "ингибирующим лиганд-индуцированное фосфорилирование CSF1R", если оно уменьшает количество детектируемого лиганд-индуцированного фосфорилирования CSF1R по меньшей мере на 50% по результатам исследования, описанного в Примере 6. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела уменьшают количество детектируемого лиганд-индуцированного фосфорилирования CSF1R по меньшей мере на 60% по меньшей мере на 70% по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90% по результатам исследования, описанного в Примере 6. В некоторых таких вариантах реализации антитело упоминается как ингибирующее лиганд-индуцированное фосфорилирование CSF1R по меньшей мере на 50% по меньшей мере на 60%» по меньшей мере на 70%, и т.д.

[0169] В некоторых вариантах реализации изобретения антитела ингибируют реакции пролиферации и/или выживаемости моноцитов в присутствии CSF1 и/или IL-34. Антитело считается "ингибирующим реакции пролиферации и/или выживаемости моноцитов", когда оно уменьшает значение реакций пролиферации и/или выживаемости моноцитов в присутствии CSF1 и/или IL-34 по меньшей мере на 50% по результатам исследования, описанного в Примере 10. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела уменьшают значение реакций пролиферации и/или выживаемости моноцитов в присутствии CSF1 и/или IL-34 по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90% по результатам исследования, описанного в Примере 10. В некоторых таких вариантах реализации антитело называют ингибирующим реакции пролиферации и/или выживаемости моноцитов по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, и т.д. Примеры конъюгатов антител

[0170] В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело конъюгировано с меткой и/или цитотоксическим агентом. В настоящем документе метка является группой, облегчающей детектирование антитела и/или облегчающее детектирование молекулы, с которой связано антитело. Неограничивающими примерами меток являются, без ограничения перечисленными: радиоизотопы, флуоресцирующие группы, ферментные группы, хемилюминесцентные группы, биотин, эпитопные метки, металл-связывающие метки и т.д. Специалист в этой области может выбрать пригодную метку, соответствующую предполагаемому применению.

[0171] В настоящем документе цитотоксический агент является группой, которая уменьшает пролиферативную способность одной или более клеток. Клетка обладает меньшей пролиферативной способностью, если клетка становится менее способной к пролиферации, например, из-за того, что клетка гибнет в по механизму апоптоз или иным образом, клетка не продвигается по клеточному циклу и/или перестает делиться, клетка дифференцируется и т.д. Неограничивающими примерами цитотоксических агентов являются, но не ограничиваются перечисленными: радиоизотопы, токсины и химиотерапевтические агенты. Специалист в этой области может выбрать пригодный цитотоксический агент в соответствии с предполагаемым применением.

[0172] В некоторых вариантах реализации изобретения метка и/или цитотоксический агент конъюгированы с антителами с использованием химических способов in vitro. Неограничивающие примерами химических способов конъюгирования известны в этой области и включают услуги, способы и/или реагенты, которые можно приобрести в, например Thermo Scientific Life Science Research Produces (раньше Pierce; Rockford, IL), Prozyme (Hayward, CA), SACRI Antybody Services (Calgary, Canada), AbD Serotec (Raleigh, NC), и т.д. В некоторых вариантах реализации изобретения, когда метка и/или цитотоксический агент являются полипептидом, метка и/или цитотоксический агент могут экспрессироваться с того же вектора экспрессии, что и по меньшей мере одна цепь антитела, с получением полипептида, включающего метку и/или цитотоксический агент, конденсированный с цепью антитела. Специалист в этой области может выбрать пригодный способ конъюгирования метки и/или цитотоксического агента с антителом согласно предполагаемому применению.

Примеры лидерных последовательностей

[0173] Для того чтобы некоторые секретируемые белки экспрессировались и секретировались в больших количествах, желательной может быть лидерная последовательность из гетерологического белка. В некоторых вариантах реализации изобретения лидерную последовательность выбирают из SEQ ID NO: 3 и 4, которые являются последовательностями легкой цепи и тяжелой цепи лидерной последовательности, соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения используемые гетерологические лидерные последовательности могут быть выгодны в том плане, что в результате зрелый полипептид может оставаться неизменным после удаления лидерной последовательности в эндоплазматическом ритикулуме в процессе секретирования. Добавление гетерологической лидерной последовательности может быть необходимым для экспрессии и секретирования некоторых белков.

[0174] Некоторые примеры лидерных последовательностей описаны, например, в онлайн базе данных Leader sequence Database, поддерживаемой Факультетом биохимии Национального Сингапурского Университета. См., Choo et al., ВМС Bioinformatics, 6: 249 (2005); и РСТ публикации WO 2006/081430.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие анти-CSF1R антитела

[0175] Предложены молекулы нуклеиновых кислот, включающие полинуклеотиды, которые кодируют одну или более цепей анти-CSF1R антител. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула нуклеиновой кислоты включает полинуклеотид, который кодирует тяжелую цепь или легкую цепь анти-CSF1R антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула нуклеиновой кислоты включает и полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, и полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, анти-CSF1R антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения первая молекула нуклеиновой кислоты включает первый полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, и вторая молекула нуклеиновой кислоты включает второй полинуклеотид, кодирующий легкую цепь.

[0176] В некоторых таких вариантах реализации тяжелая цепь и легкая цепь экспрессируются с одной молекулы нуклеиновой кислоты или с двух отдельных молекул нуклеиновых кислот, как два отдельных полипептида. В некоторых вариантах реализации изобретения, например, когда антитело представляет собой scFv, один полинуклеотид кодирует один полипептид, включающий и тяжелую цепь, и легкую цепь, связанные вместе.

[0177] В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь или легкую цепь анти-CSF1R антитела, включает нуклеотидную последовательность, кодирующую лидерную последовательность, которая, когда транслирована, располагается на N конце тяжелой цепи или легкой цепи. Как обсуждалось выше, лидерная последовательность может быть нативной тяжелой или легкой цепью лидерной последовательности или может быть другой гетерологичной лидерной последовательностью.

[0178] Молекулы нуклеиновых кислот могут быть сконструированы с помощью методик рекомбинантной ДНК, обычных в этой области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула нуклеиновой кислоты является вектором экспрессии, пригодным для экспрессии в выбранной клетке хозяине.

Экспрессия и продуцирование анти-CSF1R антитела

Векторы

[0179] Предложены векторы, включающие полинуклеотиды, которые кодируют тяжелые цепи анти-CSF1R и/или легкие цепи анти-CSF1R. Также предложены векторы, включающие полинуклеотиды, которые кодируют тяжелые цепи анти-CSF1R и/или легкие цепи анти-CSF1R. Такие векторы включают, но не ограничиваются следующими: ДНК векторы, фаговые векторы, вирусные векторы, ретровирусные векторы и т.д. В некоторых вариантах реализации изобретения вектор включает первую полинуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, и вторую полинуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь и легкая цепь экспрессируются вектором, как два отдельных полипептида. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь и легкая цепь экспрессируются как часть одного полипептида, в случае когда, например, антитело представляет собой scFv.

[0180] В некоторых вариантах реализации изобретения первый вектор включает полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, и второй вектор включает полинуклеотид, кодирующий легкую цепь. В некоторых вариантах реализации изобретения первый вектор и второй вектор трансфецированы в клетки-хозяева в близких количествах (таких как близкие молярные количества или близкие массовые количества). В некоторых вариантах реализации изобретения молярное или массовое соотношение составляет от 5:1 до 1:5 первого вектора ко второму вектору, трансфектированных в клетки хозяева. В некоторых вариантах реализации изобретения используемое массовое соотношение составляет от 1:1 до 1:5 для вектора, кодирующего тяжелую цепь, и вектора, кодирующего легкую цепь. В некоторых вариантах реализации изобретения используемое массовое соотношение составляет 1:2 для вектора, кодирующего тяжелую цепь, и вектора, кодирующего легкую цепь.

[0181] В некоторых вариантах реализации изобретения вектор выбирают таким образом, чтобы оптимизировать экспрессию полипептидов в СНО или производным от СНО клетках или в клетках NSO. Примеры таких векторов описаны, например, в Running Deer et al., Biotechnol. Prog. 20:880-889 (2004).

[0182] В некоторых вариантах реализации изобретения вектор выбирают для экспрессии in vivo тяжелых цепей анти-CSF1R и/или легких цепей анти-CSF1R в организме животных, включая людей. В некоторых таких вариантах реализации экспрессия полипептида происходит под контролем промотора, функционирующего тканеспецифическим образом. Например, описаны печеночноспецифические промоторы, например, в РСТ публикации № WO 2006/076288.

Клетки-хозяева

[0183] В различных вариантах реализации тяжелые цепи анти-CSF1R и/или легкие цепи анти-CSF1R могут экспрессироваться в прокариотических клетках, таких как бактериальные клетки; или в эукариотических клетках, таких как клетки грибов (такие как дрожжи), растительные клетки, клетки насекомых и клетки млекопитающих. Такую экспрессию можно осуществить, например, в соответствии с методиками, известными в этой области. Примерами эукариотических клеток, которые могут быть использованы для экспрессии полипептидов, являются, без ограничения перечисленными: клетки COS, включая клетки COS 7; клетки 293, включая клетки 293-6Е; клетки СНО, включая клетки CHO-S и DG44; клетки PER.C6® (Crucell); и клетки NSO. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелые цепи анти-CSF1R и/или легкие цепи анти-CSF1R могут быть экспрессированы в дрожжах. См., например, публикацию США 2006/0270045 A1. В некоторых вариантах реализации изобретения конкретную эукариотическую клетку-хозяина выбирают, на основании ее способности осуществлять желаемые посттрансляционные модификации в тяжелых цепях анти-CSF1R и/или легких цепях анти-CSF1R. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения Клетки СНО продуцируют полипептиды, имеющие более высокий уровень сиалирования, по сравнению с тем же самым полипептидом, продуцируемым в клетках 293.

[0184] Введение одной или более нуклеиновых кислот в желаемые клетки-хозяева можно осуществить с помощью любого способа, включая, но не ограничиваясь следующими: трансфекция фосфатом кальция, DEAE-декстран-опосредованная трансфекция, опосредованная катионными липидами трансфекция, электропорация, трансдукция, инфицирование и т.д. Неограничивающие примеры способов описаны, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3^rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). Нуклеиновые кислоты могут быть временно или стабильно трансфецированы в желаемые клетки-хозяева, в соответствии с любым пригодным способом.

[0185] В некоторых вариантах реализации изобретения один или более полипептидов можно получать in vivo в животном, которое может быть модифицировано или трансфецровано одной или большим числом молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды в соответствии с любым пригодным способом.

Очистка анти-CSF1R антител

[0186] Анти-CSF1R антитела можно очистить любым пригодным способом. Такие способы включают, но не ограничиваются перечисленными: применение аффинных носителей или гидрофобной хроматографии. Пригодными аффинными лигандами являются CSF1R ECD и лиганды, связывающие константные области антител. Например, Белок А, Белок G, Белок A/G или колонка с аффинностью к антителу может быть использована для связывания константной области и очистки анти-CSF1R антитела. Гидрофобная хроматография, например, бутиловая или фениловая колонка, также может быть пригодна для очистки некоторых полипептидов. Многие способы очистки полипептидов известны в этой области техники.

Бесклеточное получение анти-CSF1R антител

[0187] В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитело получают в бесклеточной системе. Неограничивающие примеры бесклеточных систем описаны, например, в Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003).

Терапевтические композиции и способы

Способы лечения заболеваний с применением анти-CSF1R антител

[0188] В данном документе предложены способы лечения системной красной волчанки (СКВ), ревматоидного артрита и рассеянного склероза с применением антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34.

[0189] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения СКВ. В некоторых таких вариантах реализации способ включает введение субъекту с СКВ антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. Лечение СКВ в некоторых вариантах реализации изобретения обозначает уменьшение клинических применений и/или тяжести повреждений кожи связанных с СКВ и/или уменьшения заболевания почек, выбранного из гломерулонефрита, интерстициального нефрита и периваскулярных инфильтратов. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения волчаночного нефрита, где способ включает введение антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитела, выбранного из huAb1-huAb16, субъекту с волчаночным нефритом. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения волчаночного нефрита класса, выбранного из волчаночного нефрита класса I, класса II, класса III, класса IV, класса V и класса VI, где способ включает введение субъекту с волчаночным нефритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитела, выбранного из huAb1-huAb16. Класс III и класс IV волчаночного нефрита имеют значительно более высокое количество CD16+ моноцитов, нежели другие классы волчаночного нефрита. См., Yoshimoto et al., Am. J. Kidney Dis. 50: 47-58 (2007). Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения волчаночного нефрита класса III или класса IV, где способ включает введение субъекту с волчаночным нефритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитела, выбранного из huAb1-huAb16. В некоторых таких вариантах реализации способ включает введение субъекту huAb1.

[0190] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения повреждений кожи, связанных с СКВ, где способ включает введение субъекту с СКВ антитела, связывающего CSF1R, такого как антитело, выбираемое из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения способ лечения повреждений кожи, связанных с СКВ, включает введение субъекту с СКВ huAb1. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения количества, тяжести и/или скорости образования повреждений кожи, связанных с СКВ, где способ включает введение субъекту с СКВ антитела, связывающего CSF1R, такого как антитело, выбираемое из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения способ уменьшения количества, тяжести и/или скорости образования повреждений кожи, связанных с СКВ, включает введение субъекту с СКВ huAb1. Уменьшения количества, тяжести и/или скорости образования повреждений кожи можно определить, В некоторых вариантах реализации изобретения при визуальном осмотре. Такой визуальный осмотр может быть проведен, например, врачом или субъектом (например, самостоятельный визуальный осмотр).

[0191] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения заболевания почек, связанного с СКВ. В некоторых таких вариантах реализации способ включает введение субъекту с заболеванием почек, связанным с СКВ, антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитела, выбранного из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения субъекту вводится антитело huAb1. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание почек выбирают из гломерулонефрита, интерстициального нефрита и периваскулярных инфильтратов. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения волчаночного нефрита, где способ включает введение субъекту с волчаночным нефритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения способ лечения волчаночного нефрита включает введение субъекту с волчаночным нефритом антитела huAb1. Степень повреждения почки при волчаночном нефрите может быть определена, в некоторых вариантах реализации изобретения, с помощью ультрасонографии, сцинтиграфии, пиелографии или пункционной биопсии. Степень повреждения почки при волчаночном нефрите может быть определена, в некоторых вариантах реализации изобретения, путем измерения функции почки, например, путем измерения протеинурии и/или уровня клубочковой фильтрации.

[0192] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения протеинурии, связанной с волчаночным нефритом, включающий введение субъекту с протеинурией антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. Протеинурия может быть определена с помощью любого способа, известного в этой области техники, включая, но не ограничиваясь такими как, экспресс-проба с импрегнированным субстратом, соотношение белок/креатинин, соотношение сывороточный альбумин/креатинин и электрофорез белка. Уровни белка в моче могут быть использоваться в качестве показателей, в некоторых вариантах реализации изобретения, исходя из следующей шкалы: следы (5-20 мг/дл), 1+(30 мг/дл), 2+(100 мг/дл), 3+(300 мг/дл), и 4+(>2000 мг/дл). Соотношение белок/креатинин <200 мг/г считается нормальным. Соотношение сывороточный альбумин/креатинин <17 мг/г и <25 мг/г считается нормальным для мужчин и женщин, соответственно. Протеинурия определяется Инициативой Качества Лечения Заболевания Почек Национального почечного фонда (National Kidney Foundation Kidney Disease Outcome Quality Initiative) как присутствие >300 мг/д общего белка или альбумина в моче после 24 часов выделения; как >30 мг/дл общего белка в разовой порции мочи в экспресс-пробе с импрегнированным субстратом (то есть, 1+ или выше по шкале описанной выше); как >200 мг/г общего соотношения белок-креатинин; как >300 мг/г соотношения альбумин-креатинин в разовой порции мочи (или >250 мг/г соотношение альбумин-креатинин в разовой порции мочи для мужчин; и >355 мг/г соотношения альбумин-креатинин в разовой порции мочи для женщин).

[0193] В некоторых вариантах реализации изобретения введение субъекту антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, снижает протеинурию по меньшей мере на одну позицию или по меньшей мере две позиции в шкале "следовые количества, 1+, 2+, 3+, 4+". Другими словами, в некоторых вариантах реализации изобретения введение субъекту с 3+ протеинурией антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, снижает протеинурию до уровня 2+или ниже, или уровня 1+ или ниже. В некоторых вариантах реализации изобретения введение субъекту антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, снижает соотношение белок/креатинин и/или соотношение альбумин/креатинин по меньшей мере на 50 мг/г по меньшей мере на 100 мг/г по меньшей мере на 150 мг/г по меньшей мере на 200 мг/г по меньшей мере на 250 мг/г или по меньшей мере на 300 мг/г. В некоторых вариантах реализации изобретения введение субъекту антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, снижает соотношение белок/креатинин и/или соотношение альбумин/креатинин до ниже 250 мг/г, ниже 200 мг/г, ниже 150 мг/г или ниже 100 мг/г. В некоторых вариантах реализации изобретения введение субъекту антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, снижает соотношение белок/креатинин и/или соотношение альбумин/креатинин до 2 раз, до 3 раз, до 4 раз, до 5 раз от нормального соотношения. В некоторых вариантах реализации изобретения уменьшение протеинурии определяется на первой неделе, на первых двух неделях, в первый месяц, в первые два месяца, в первые три месяца, в первые 4 месяца или в первые шесть месяцев после начала лечение. В некоторых вариантах реализации изобретения у субъекта наблюдается постоянное уменьшение протеинурии во время лечения антителом, связывающим CSF1R и блокирующим связывание лиганда CSF1 и IL-34.

[0194] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ улучшения уровня клубочковой фильтрации у субъекта с волчаночным нефритом, включающий введение субъекту с волчаночным нефритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитела, выбранного из huAb1-huAb16. Уровень клубочковой фильтрации можно определить с помощью любого способа, известного в этой области техники, включая, но не ограничиваясь такими как, уровни инсулина в сыворотке или моче (В некоторых вариантах реализации изобретения перед анализом делают инъекцию инсулина или синистрина), клиренс креатинина оценивается по концентрации креатинина при суточном сборе мочи и сыворотки и уровням цистатина С в сыворотке. Нормальные уровни клубочковой фильтрации у взрослых находятся в интервале 90-130 мл/мин/1,73 м². Уровни клубочковой фильтрации ниже 90 мл/мин/1,73 м², ниже 80 мл/мин/1,73 м², ниже 70 мл/мин/1,73² м, или ниже 60 мл/мин/1,73 м² являются, в некоторых вариантах реализации изобретения показателем хронического заболевания почек, в то время как значения ниже 15 мл/мин/1,73 м² указывают на почечную недостаточность. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ улучшения уровня клубочковой фильтрации у субъекта с волчаночным нефритом, включающий введение субъекту с волчаночным нефритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения после введения антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, уровень клубочковой фильтрации у субъекта улучшается по меньшей мере на 10 мл/мин/1,73 м², по меньшей мере на 15 мл/мин/1,73 м², по меньшей мере на 20 мл/мин/1,73 м², по меньшей мере на 25 мл/мин/1,73 м², по меньшей мере на 30 мл/мин/1,73 м², по меньшей мере на 40 мл/мин/1,73 м² или по меньшей мере на 50 мл/мин/1,73 м². В некоторых вариантах реализации изобретения после введения антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, уровень клубочковой фильтрации у субъекта составляет по меньшей мере 60 мл/мин/1,73 м², по меньшей мере 70 мл/мин/1,73 м², по меньшей мере 80 мл/мин/1,73 м², или по меньшей мере 90 мл/мин/1,73 м². В некоторых вариантах реализации изобретения восстановление уровня клубочковой фильтрации определяется на первой неделе, на первых двух неделях, в первый месяц, в первые два месяца, в первые три месяца, в первые 4 месяца или в первые шесть месяцев после начала лечение. В некоторых вариантах реализации изобретения у субъекта наблюдается постоянное улучшение уровня клубочковой фильтрации, во время лечения антителом, связывающим CSF1R и блокирующим связывание лиганда CSF1 и IL-34.

[0195] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения волчаночного нефрита, включающий введение субъекту с волчаночным нефритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16, где введение антитела замедляет или предупреждает развитие заболевания почек связанного с волчаночным нефритом. В некоторых таких вариантах реализации протеинурия и/или уровень клубочковой фильтрации у субъекта не ухудшается (то есть протеинурия не увеличивается и/или уровень клубочковой фильтрации не уменьшается) после введения антитела и/или на протяжении определенного интервала времени, во время которого субъекта подвергают лечению с использованием антитела. Лечение может предусматривать введение одной дозы или множества доз.

[0196] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены способы лечения ревматоидного артрита, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены способы лечения ревматоидного артрита, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела huAb1. Лечение ревматоидного артрита, в некоторых вариантах реализации изобретения, означает уменьшение клинических признаков заболевания, которые могут быть измерены, например, путем измерения эритемы и отека в суставах, пораженных ревматоидным артритом. Лечение ревматоидного артрита в некоторых вариантах реализации изобретения означает уменьшение воспаления, уменьшение образования паннуса, уменьшение повреждения хряща, уменьшение резорбции костей, уменьшения количества макрофагов в суставах, уменьшение образования аутоантитела и/или уменьшение потери костной массы.

[0197] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения воспаления, связанного с ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения воспаления, связанного с ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела huAb1. Уменьшение воспаления в некоторых вариантах реализации изобретения включает уменьшение скорости осаждения эритроцитов и/или уменьшения уровней С-реактивных белков в крови. Когда у субъекта присутствует воспаление, скорость осаждения эритроцитов увеличивается, возможно, вследствие увеличения уровней фибриногена в крови. Скорость осаждения эритроцитов можно определить с помощью любого способа, известного в этой области техники, включая, но не ограничиваясь такими как, путем расчета скорости через измерение разницы высоты антикоагулированных эритроцитов за один час в пробирке Вестергрена. Смотрите также Procedures for the Erythrocyte Sedimentation Rate Test; Approved Standard-Fifth Edition. CLSI document H02-A5. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2011. Уровни С-реактивного белка в крови можно определить с помощью любого способа, известного в этой области техники, включая, но не ограничиваясь такими, используя тестовый набор PAPITEX® CRP (Siemens).

[0198] Уменьшение воспаления. В некоторых вариантах реализации изобретения включает уменьшение периферического отека, который присутствует в отекшей ткани вследствие накопления жидкостей. Периферический отек может иметь место, в некоторых случаях, в лодыжках, ступнях, ногах и/или икрах субъекта с ревматоидным артритом. Уменьшения воспаления, В некоторых вариантах реализации изобретения включает уменьшение воспаления воспаленных клеток в синовиальном слое одного или более пораженных суставов. Синовиальную жидкость можно собрать, В некоторых вариантах реализации изобретения с помощью атроцентеза.

[0199] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения образования паннуса связанного с ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитела, выбранного из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения образования паннуса, связанного с ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела huAb1. Уменьшение образования паннуса в некоторых вариантах реализации изобретения включает уменьшение инфильтрации паннуса в хрящ и/или субхондриальную кость, и/или уменьшения разрушения твердой ткани в результате инфильтрации паннуса. Образование паннуса можно измерить с помощью любого способа, известного в этой области техники, включая, но не ограничиваясь такими как, визуализация одного или более пораженных суставов. Неограничивающими примерами методик визуализации для определения образования паннуса являются визуализация методом магнитного резонанса (MRI), компьютерная томография (СТ), артроскопия, ультрасонография, дуплексная ультрасонография и энергетическая доплерография.

[0200] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ замедления прогрессирования образования паннуса, связанного с ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой huAb1. В некоторых вариантах реализации изобретения образование паннуса замедляется после введения антитела и/или во время определенного интервалав течение которого субъект подвергается лечению с использованием антитела. Лечение может предусматривать введение одной дозы или множества доз.

[0201] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения повреждения хряща связанного с ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитела, выбранного из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения повреждения хряща, связанного с ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела huAb1. Уменьшения повреждения хряща в некоторых вариантах реализации изобретения включает уменьшение потери хондроцитов, уменьшение разрушения коллагена и/или уменьшение потери хряща. Повреждение хряща можно измерять с помощью любого способа, известного в этой области техники, включая, но не ограничиваясь такими как: визуализация одного или более пораженных суставов. Неограничивающими примерами методик визуализации для определения повреждения хряща являются MRI, СТ, артроскопия и рентгенография.

[0202] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ замедления развития повреждения хряща, связанного с ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой huAb1. В некоторых вариантах реализации изобретения прогрессирование повреждения хряща снижается после введения антитела и/или в течение определенного интервала, во время которого субъект подвергается лечению с использованием антитела. Лечение может предусматривать введение одной дозы или множества доз.

[0203] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения резорбции костей, связанной с ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения резорбции костей, связанной с ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела huAb1. Уменьшение резорбции костей в некоторых вариантах реализации изобретения включает уменьшение количества остеокластов в суставах пораженных ревматоидным артритом.

[0204] В некоторых вариантах реализации изобретения резорбцию кости можно измерять путем определения уровня TPAP5b в плазме субъекта, где повышенный уровень TPAP5b указывает на повышенную резорбцию кости у субъекта. Таким образом в некоторых вариантах реализации изобретения пониженный уровень TPAP5b указывает на уменьшение резорбции кости. TPAP5b уровни можно измерять, в некоторых случаях, до и после лечения с применением антитела, связывающего CSF1R, и/или можно определять периодически во время курса лечения, для контроля эффективности лечения по снижению потери костной массы. Уровни TPAP5b можно определить с помощью любого способа, известного в этой области техники, включая, но не ограничивается ими, твердофазный иммуноферментный анализ ELISA (включая FAICEA (твердофазный иммуноферментный анализ фрагментов); См., например, Quidel® TPAP5b assay, TECOmedical Group, Sissach, Switzerland).

[0205] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения потери костной массы, связанной с ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения потери костной массы, связанной с ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела huAb1. Потерю костной массы можно определить с помощью любого способа, известного в этой области техники, включая, но не ограничиваясь такими как: рентгенография, MRI, СТ, костная денситометрия, одно и двухфотонная абсорбциометрия (SPA, DPА), одно и двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия (SXA, DXA), ультрасонография, сцинтиграфия и путем измерения уровней сывороточных маркеров образования и резорбции костей. Неограничивающие примеры сывороточных маркеров образования и резорбции костей показаны в Таблице 2.

[0206] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ замедления развития потери костной массы, связанной с ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой huAb1. В некоторых вариантах реализации изобретения потеря костной массы снижается после введения антитела и/или в течение определенного интервала, во время которого субъект подвергается лечению с использованием антитела. Лечение может предусматривать введение одной дозы или множества доз.

[0207] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения количества моноцитов, таких как макрофаги и/или CD16+ моноциты, в суставах, пораженных ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения количества моноцитов, таких как макрофаги и/или CD16+ моноциты, в суставах, пораженных ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела huAb1. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения количества моноцитов, таких как макрофаги и/или CD16+ моноциты, в синовиальной жидкости суставов, пораженных ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения количества моноцитов, таких как макрофаги и/или CD16+ моноциты, в синовиальной жидкости суставов, пораженных ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела huAb1.

[0208] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения уровней аутоантител у субъекта с ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения уровней аутоантител у субъекта с ревматоидным артритом, где способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом антитела huAb1.

[0209] В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения уровней аутоантител у субъекта с ревматоидным артритом, включающий введение субъекту с ревматоидным артритом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитела, выбранного из huAb1-huAb16. В некоторых таких вариантах реализации способ включает введение субъекту с ревматоидным артритом huAb1. Уровни аутоантител можно определить с помощью любого способа, известного в этой области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения уровни аутоантител определяют по уровню ревматоидного фактора (RF) и/или антител к цитруллированному белку (АСРА) и/или антител к ядрам (ANA).

[0210] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены способы лечения рассеянного склероза, где способ включает введение субъекту с рассеянным склерозом антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. Лечение рассеянного склероза в некоторых вариантах реализации изобретения означает уменьшение клинических признаков заболевания.

[0211] В некоторых вариантах реализации изобретения предложены способы снижения количества CD16+ моноцитов, где способы включают введение субъекту с повышенными уровнями CD16+ моноцитов антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, такого как антитело, выбранное из huAb1-huAb16. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект страдает аутоиммунным состоянием, выбранным из ревматоидного артрита и СКВ. В некоторых вариантах реализации изобретения введение антитела, связывающего CSF1R и блокирующего связывание лиганда CSF1 и IL-34, не уменьшает количество CD16- моноцитов. В некоторых вариантах реализации изобретения количество CD16+ моноцитов уменьшается в большей степени, нежели уменьшается количество CD 16-моноцитов, когда субъекту вводятся антитело, связывающее CSF1R и блокирующее связывание лиганда CSF1 и IL-34. В некоторых вариантах реализации изобретения количество CD16+ моноцитов уменьшается по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 90%. В некоторых вариантах реализации изобретения количество CD16- моноцитов уменьшается менее чем на 30%, менее чем на 20% или менее чем на 10%. В некоторых вариантах реализации изобретения CD16+ моноцитами являются CD16+ моноциты периферической крови. В некоторых вариантах реализации изобретения CD16- моноцитами являются моноциты CD16- периферической крови.

Пути введения и носители

[0212] В разных вариантах реализации анти-CSF1R антитела можно вводить in vivo с помощью разных путей, включая, но не ограничиваясь следующими: пероральный, внутриартериальный, парентеральный, интраназальный, внутримышечный, внутрисердечный, внутрижелудочковый, внутритрахеальный, букальный, ректальный, внутрибрюшинный, внутрикожный, местный, трансдермальный и интратекальный или другие пути с помощью имплантации или ингаляции. Целевые композиции могут быть изготовлены в твердой, полутвердой, жидкой или газообразной форме, включая, но не ограничиваясь следующими: таблетки, капсулы, порошки, гранулы, мази, растворы, суппозитории, клизмы, инъекции, ингалянты и аэрозоли. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая анти-CSF1R антитело, может быть нанесена на золотые микрочастицы и введена внутрикожным путем при помощи устройства для бомбардировки частицами, или с помощью "генной пушки", как описано в литературе (См., например, Tang et al., Nature 356:152-154 (1992)). Приемлемые рецептуры и пути введения могут быть выбраны согласно с планируемым способом применения.

[0213] В разных вариантах реализации предложены композиции, включающие анти-CSF1R антитела, в составе с различными фармацевтически приемлемыми носителями (См., например, Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed. (2003); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7^th ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd ed., Pharmaceutical Press (2000)). Доступны различные фармацевтически приемлемые носители, которые включают растворители, адъюванты и разбавители. Однако, также доступны различные фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как корректирующие рН и буферные агенты, агенты, корректирующие тоничность, стабилизаторы, смачивающие агенты и тому подобное. Неограничивающими примерами носителей являются солевой раствор, буферный солевой раствор, декстроза, вода, глицерин, этанол и их комбинации.

[0214] В разных вариантах реализации композиции, включающие анти-CSF1R антитела, могут быть изготовлены в форме для инъекции, включая подкожное введение, путем растворения, суспендирования или эмульгирования их в водном или неводном растворителе, таком как растительные или другие масла, синтетические глицериды алифатических кислот, эфиры высших алифатических кислот или пропиленгликоль; и при желании, с обычными добавками, такими как солюбилизаторы, изотонические агенты, суспендирующие агенты, эмульгаторы, стабилизаторы и консерванты. В разных вариантах реализации композиции могут быть изготовлены в форме для ингаляции, например, с использованием приемлемых сжатых пропеллентов, таких как дихлордифторметан, пропан, азот и тому подобное. Композиции могут быть включены в состав, в разных вариантах реализации, в микрокапсулы замедленного высвобождения, такие как микрокапсулы из биодеградируемых или небиодеградируемыхо полимеров. Неограничивающий пример биодеградируемой формы включает полимер молочной кислоты-гликолевой кислоты. Неограничивающий пример небиодеградируемой рецептуры включает сложный полиглицериновый эфир жирной кислоты. Некоторые способы получения таких рецептур описаны, например, в ЕР 1125584 A1.

[0215] Также предложены фармацевтические упаковки и наборы, включающие один или более контейнеров, причем каждый содержит одну или больше доз анти-CSF1R антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения предложена дозированная форма, где дозированная форма содержит установленное количество композиции, включающей анти-CSF1R антитело, с одним или большим числом дополнительных агентов или без них. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая единица дозы поставляется в одноразовом предварительно наполненном шприце для инъекции. В разных вариантах реализации композиция, содержащаяся в дозированной форме, может включать солевой раствор, сахарозу или тому подобное; буфер, такой как фосфат или тому подобное; и/или быть сформулирована в рамках стабильного и эффективного рН интервала. В альтернативном варианте в некоторых вариантах реализации изобретения композиция может быть получена в форме лиофилизированного порошка, который может быть восстановлен путем добавления приемлемой жидкости, например, стерильной воды. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция включает одно или более веществ, ингибирующих агрегацию белка, включая, сахарозу и аргинин, но не ограничиваясь ими. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция изобретения включает гепарин и/или протеогликан.

[0216] Фармацевтические композиции вводятся в количестве, эффективном для лечения или профилактики определенных симптомов. Терапевтически эффективное количество обычно зависит от массы субъекта, которого лечат, его или ее физического состояния или состояния здоровья, степени выраженности симптомов, которые лечат, или возраста субъекта лечения. Обычно анти-CSF1R антитела вводят в количестве, лежащем в диапазоне от приблизительно 10 мкг/кг массы тела до приблизительно 100 мг/кг массы тела на дозу. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитела вводят в количестве, лежащем в диапазоне от приблизительно 50 мкг/кг массы тела до приблизительно 5 мг/кг массы тела на дозу. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитела вводят в количестве, лежащем в диапазоне от приблизительно 100 мкг/кг массы тела до приблизительно 10 мг/кг массы тела на дозу. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитела вводят в количестве, лежащем в диапазоне от приблизительно 100 мкг/кг массы тела до приблизительно 20 мг/кг массы тела на дозу. В некоторых вариантах реализации изобретения анти-CSF1R антитела вводят в количестве, лежащем в диапазоне от приблизительно 0,5 мг/кг массы тела до приблизительно 20 мг/кг массы тела на дозу.

[0217] Композиции анти-CSF1R антитела вводят субъектам по мере необходимости. Определение частоты введений может быть сделано средним специалистом в этой области, таким как лечащий врач с учетом состояния, которое лечат, возраста субъекта, которого лечат, тяжести состояния, которое лечат, общего состояния здоровья субъекта, которого лечат, и тому подобное. В некоторых вариантах реализации изобретения эффективную дозу анти-CSF1R антитела вводят субъекту один или более раз. В разных вариантах реализации эффективную дозу анти-CSF1R антитела вводят субъекту один раз в месяц, менее одного раза в месяц, например, каждые два месяца или каждые три месяца. В других вариантах реализации эффективную дозу анти-CSF1R антитела вводятся более одного раза в месяц, например, каждые три недели, каждые две недели или каждую неделю. Эффективную дозу анти-CSF1R антитела вводят субъекту по меньшей мере один раз. В некоторых вариантах реализации изобретения эффективную дозу анти-CSF1R антитела вводят несколько раз, включая, на протяжении периодов по меньшей мере месяц по меньшей мере шесть месяцев или по меньшей мере год.

Комбинированная терапия

[0218] Анти-CSF1R антитела можно вводить отдельно или с другими способами лечения. Они могут применяться до, по существу, одновременно с или после других средств лечения, например, хирургического, химиотерапии, радиационной терапии или введения биологического объекта, такого как другое терапевтическое антитело. Для лечения ревматоидного артрита анти-CSF1R антитела можно вводить с другими терапевтическими агентами, например, метотрексатом, анти-TNF агентами, такими как Ремикад (инфликсимаб), Хумира (адалимумаб), Симпони (голимумаб) и Энбрел (этанерцепт); глюкокортикоидами, такими как преднизон; лефлуномид; азотиоприн; ингибиторами JAK, такими как CP 590690; ингибиторами SYK, такими как R788; анти-IL-6 антителами; анти-IL-6R антителами, такими как тоцилизумаб; анти-CD-20 антителами, такими как ритуксимаб; анти-CD19 антителами; анти-GM-CSF антителами; анти-GM-CSF-R антителами; антагонистами рецептора IL-1, такими как анакинра; антагонистами CTLA-4, такими как абатасепт; иммуносупресантами, такими как циклоспорин.

[0219] Для лечения системной красной волчанки анти-CSF1R антитела можно вводить с другими терапевтическими агентами, например, гидроксихлороквином (Плаквенил); кортикостероидами, такими как преднизон, метилпреднизон и преднизолон; иммуносупрессантами, такими как циклофосфамид (Цитоксан), азатиоприн (Имуран, Азасан), микофенолат (Целлцепт), лефлуномид (Арава) и метотрексат (Трексалл) и белимумаба (Бенлиста).

[0220] Для лечения рассеянного склероза анти-CSF1R антитела можно вводить с другими терапевтическими агентами, например, интерфероном альфа; интерфероном бета; преднизоном; анти-альфа4 интегрин антителами, такими как Тисабри; анти-CD20 антителами, такими как Ритуксимаб; FTY720 (Финголимод); и Кладрибин (Леустатин).

ПРИМЕРЫ

[0221] Примеры, приведенные ниже, предназначены исключительно для раскрытия изобретения и не должны считаться ограничивающими изобретение каким-либо путем. Примеры не предназначены для демонстрации того, что приведенные ниже эксперименты являются исчерпывающими или единственными экспериментами. Были предприняты усилия для обеспечения точности использованных чисел (например, количества, температуры и т.д.), но должны учитываться некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указное иное, части являются массовыми частями, молекулярная масса является средней молекулярной массой, температура приведена в градусах Цельсия, а давление приближается или соответствует атмосферному.

Пример 1: Гуманизированные анти-CSF1R антитела

[0222] Ранее были получены различные гуманизированные анти-CSF1R антитела. См., например, РСТ публикацию № WO 2011/140249.

[0223] Последовательности каждой из гуманизированных вариабельных областей тяжелых цепей и гуманизированных вариабельных областей легких цепей, которые выравнивались с последовательностями вариабельных областей родительских химерных антител и последовательностями вариабельных каркасных областей человеческих акцепторов, показаны на Фиг. 1 (тяжелые цепи) и 2 (легкие цепи). Изменения в последовательностях гуманизированных вариабельных областей по сравнению с последовательностями вариабельных каркасных областей человеческих акцептором заключены в рамку. Каждый из CDR для каждой из вариабельных областей показан в области, обведенной рамкой, и помечен сверху последовательностей в рамках как "CDR".

[0224] Таблица 5 ниже показывает полные последовательности гуманизированных тяжелых цепей и гуманизированных легких цепей антител huAb1-huAb16. Название и SEQ ID NO гуманизированной тяжелой цепи и гуманизированной легкой цепи каждого из этих антител показано в Таблице 3.

[0225] Исследовали связывание 16 гуманизированных антител с CSF1R ECD человека, яванского макака и мыши, как описано ранее. См., например, РСТ публикацию № WO 2011/140249. Были установлены антитела, связывающие CSF1R ECD и человека, и яванского макака, но не мышиное CSF1R ECD. Также было обнаружено, что гуманизированные антитела блокируют связывание CSF1 и IL-34 и с человеческим, и с мышиным CSF1R и ингибируют CSF1-индуцированное и IL-34-индуцированное фосфорилирование человеческого CSF1R, экспрессируемого в СНО клетках. См., например, РСТ публикацию № WO 2011/140249.

[0226] k_a, k_d, и K_D связывания с человеческим CSF1R ECD были определены ранее и показаны в Таблице 4. См., например, РСТ публикацию № WO 2011/140249.

Пример 2: HuAb1 снижает CD16+, но не CD16- моноциты в периферической крови у яванского макака

[0227] Яванским макакам (2 обезьяны в группе) внутривенно вводили 0 мг/кг, 3 мг/кг, 10 мг/кг или 30 мг/кг huAb1. Через 14 дней отбирали периферическую кровь и определяли количество CD16+ или CD16- моноцитов с помощью проточной цитометрии. Коротко, 0,2 мл периферической крови метили 20 мкл анти-CD16-РЕ (Becton-Dickenson) на протяжении 30 минут при комнатной температуре в темноте. Эритроциты лизировали путем инкубации с 2 мл 1 × BD PharmLyse (Becton-Dickenson) на протяжении 20 мин и клетки промывали 1 мл FACS буфера (ФБР/0,1% БСА) перед анализом. Данные получали на проточном цитометре, LSRII используя программное обеспечение Diva (Becton-Dickenson) и результаты анализировали с помощью программы анализа данных FloJo (Tree Star).

[0228] На Фиг. 3 показано, что лечение обезьян huAb1 приводит к зависимому от дозы уменьшению количества CD16+ , но не CD16- моноцитов в периферической крови, по сравнению с животными, не получавшими лечения. Эти данные показывают, что huAb1 может уменьшать количество моноцитов, что в основном является ответом на аутоиммунные расстройства, и в тоже время сохраняет не поврежденными другие субпопуляции моноцитов, которые отвечают за удаление патогенов. Это указывает на то, что антитела, связывающие CSF1R и блокирующие связывание лиганда, такие как huAb1, могут быть эффективны при лечении аутоиммунных расстройств, и в то же время поддерживать хороший профиль безопасности в отношении инфекций.

Пример 3: Описание суррогатного антитела к мышиному CSF1R

[0229] Поскольку гуманизированные антитела huAb1-huAb16 не связывают мышиное CSF1R, отбирали химерное антитело к мышиному CSF1R ("cAb1") в качестве суррогатного антитела для применения на мышиных моделях. Антитело включает крысиные вариабельные области и мышиные константные области. Для получения cAb1, крыс иммунизировали мышиным гибридным белком CSF1R-ECD-Fc и идентифицировали гибридомы, секретирующие антитела, которые блокируют связывание мышиного CSF1 и мышиного IL-34 с мышиным CSF1R, с помощью с использованием ELISA-анализа. Вариабельные области одного из таких блокирующих антител вводили в мышиные константные области IgG, используя стандартные методики молекулярной биологии (Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, CSH Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001). Рекомбинатное химерное антитело cAb1 затем экспрессировали в СНО клетках, используя стандартные методики (Sambrook and Russell, Ibid.).

[0230] Определяли связывание cAb1 с мышиным CSF1R следующим образом. В 96-лучные планшеты для ELISA с прозрачным дном вносили 1 мкг/мл рекомбинатного мышиного CSF1R ECD-Fc Chimera (R&D Systems) в ФБР и оставляли на ночь. На следующее утро лунки промывали четыре раза 0,05% Tween20 в ФБР (PBST) и блокировали Blocker-Blotto (Pierce). В CSF1R-содержащие лунки добавляли пятьдесят мкл 0,5 × серийных разведений cAb1, начиная с концентрации 2,6 мкг/мл, разбавленных в 1:1 в Blocker-Blotto. После инкубации при комнатной температуре (КТ) на протяжении 90 мин лунки промывали четыре раза PBST и в каждую лунку добавляли 1:5000 разведение пероксидаза-конъюгированного антитела козы к IgG мыши, конъюгированного с пероксидазой (Sigma) в Blocker-Blotto. После инкубации при КТ на протяжении 60 мин лунки промывали четыре раза PBST и в каждую лунку добавляли 50 мкл субстрата пероксидазы о-фенилендиаминдигидрохлорида (Sigma). После инкубации при КТ на протяжении 30 мин значения А450 каждой лунки считывали непосредственно на спектрофотометре SpectraMaxPlus с программным обеспечением SoftMaxPro (Molecular Devices).

[0231] Результаты эксперимента показаны на Фиг. 4. cAb1 связывает мышиный CSF1R ECD зависимым от дозы образом.

Пример 4: cAb1 блокирует лиганд-индуцированную пролиферацию факторзависимой линии клеток

[0232] cAb1 исследовали на способность блокировать лиганд-индуцированную пролиферацию факторзависимой мышиной линии клеток mNFS60 следующим образом. mNFS60 клетки стимулировали 10 нг/мл рекомбинантного мышиного CSF1 или 100 нг/мл рекомбинантного мышиного IL-34 (оба от R&D Systems) в присутствии или в отсутствии серийных разведений cAb1. После инкубации при 37°С на протяжении 48 часов определяли относительное содержание АТФ в клетках каждой культуры, используя реагент Cell Titer Glo (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. В этом исследовании относительное содержание АТФ в клетке прямо пропорционально количеству жизнеспособных клеток в культуре и, соответственно, отражает клеточную пролиферацию mNFS60.

[0233] Результаты этого эксперимента показаны на Фиг. 5. cAb1 блокирует CSF1- или IL-34-индуцированную пролиферацию mNFS60 клеток зависимым от дозы образом.

Пример 5: cAb1 подавляет клинические проявления заболевания в модели ревматоидного артрита на мышах

[0234] У самцов мышей DBA/1 провоцировали возникновения артрита с помощью внутрикожной инъекции 150 мкл 2 мг/мл коровьего коллагена типа II (Elastin Products, Owensville, МО) в полном адъюванте Фрейнда (Sigma) в день исследования 0 и снова в день исследования 21. Мышей разделяли случайным образом на группы лечения в день исследования 0 и начинали лечение. Мышам внутрибрюшинно 3 раза в неделю (3×/нед) вводили нейтральную среду или cAb1 (3, 6, 10, или 30 мг/кг) вплоть до дня исследования 32 и измеряли клинические проявления заболевания на каждой лапе с 18 дня исследования по 35 день. Клинические проявления заболевания оценивали следующим образом:

0 = Норма

1 = 1 сустав задней или передней лапы поражен или минимальная диффазоная эритема и отек

2 = 2 сустава задней или передней лапы поражены или легкая диффузная эритема и отек

3 = 3 сустава задней или передней лапы поражены или умеренная диффузная эритема и отек

4 = 4 сустава задней или передней лапы поражены или выраженная диффузная эритема и отек

5 = все лапы поражены, сильная диффузная эритема и сильный отек, неспособность сгибать пальцы

[0235] Результаты этого эксперимента показаны на Фиг. 6. cAb1 подавляет клинические проявления заболевания в модели спровоцированного коллагеном ревматоидного артрита. Эти данные указывают на то, что и у людей антитела, связывающие CSF1R и блокирующие связывание лиганда, такие как huAb1, могут быть эффективны для снижения признаков и симптомов ревматоидного артрита.

Пример 6: cAb1 подавляет потерю костной массы на мышиной модели ревматоидного артрита

[0236] Высокие уровни устойчивой к тартрату кислой фосфатазы 5b (TPAP5b) связывают с ремоделированием костей и они наблюдаются при различных состояниях, характеризующихся увеличением резорбции костей. Кроме того, уровни TPAP5b могут быть использованы как маркеры резорбции костей (то есть потери костной массы).

[0237] У мышей провоцировали появление артрита и мышей лечили cAb1 как описано в Примере 5. На 35 день отбирали кровь и определяли уровни TPAP5b (устойчивая к тартрату кислая фосфатаза 5b) в плазме, используя коммерческий набор для твердофазного иммуноферментного анализа для определения остеокласт-производного TPAP5b в мышиной сыворотке (Immunodiagnostics Systems) в соответствии с инструкциями производителя. TPAP5b является маркером обмена веществ в кости.

[0238] Результаты этого эксперимента показаны на Фиг. 7. cAb1 подавляет потерю костной массы в модели спровоцированного коллагеном ревматоидного артрита, как измерено по подавлению маркера обмена кости TPAP5b. Эти данные указывают на то, что и у людей антитела, связывающие CSF1R и блокирующие связывание лиганда, такие как huAb1, могут подавлять эрозию костей и разрушение суставов при ревматоидном артрите.

Пример 7: cAb1 подавляет воспаление, повреждение хряща, образование паннуса и разрушения кости в мышиной модели ревматоидного артрита

[0239] У мышей провоцировали появление артрита и мышей лечили cAb1, как описано в Примере 5. В конце исследования собирали лапы и колени и помещали на ночь в нейтральный забуференный формалин (NBF; доступный в Sigma-Aldrich, cat # НТ-501128) и затем переносили в 70% этанол для гистопатологического и гистохимического исследования.

[0240] Шесть суставов каждого животного подвергали гистопатологической оценке. Затем суставы оценивали по следующей шкале:

Воспаление

0 = Норма

1 = Минимальная инфильтрация клеток воспаления в синовиальный слой и вокругсуставную ткань пораженных суставов

2 = Умеренная инфильтрация клетками воспаления. В отношении лап, в основном ограничена пораженными суставами (1-3 поражены)

3 = Средняя инфильтрация со средним отеком. В отношении лап ограничена пораженными суставами, в основном 3-4 сустава, включая по меньшей мере одно запястье или лодыжку сустава

4 = Заметная инфильтрация затрагивает большинство областей с заметным отеком, могут присутствовать 1 или 2 непораженных сустава

5 = Сильная диффузная инфильтрация с сильным отеком, поразившим все суставы и вокругсуставные ткани

Паннус

0 = Норма

1 = Минимальная инфильтрация паннуса в хрящ и субхондральные костные краевые зоны

2 = Умеренная инфильтрация с разрушением краевой зоны твердой ткани в пораженных суставах

3 = Средняя инфильтрация со средним разрушением твердой ткани в пораженных суставах

4 = Заметная инфильтрация с заметным разрушением архитектуры сустава, поражающая большинство суставов

5 = Сильная инфильтрация, связанная с полным или почти полным разрушением архитектуры сустава, поражающая все суставы

Повреждение хряща

0 = Норма

1 = Минимальное = обычно потеря окраски толуидинового синего от минимальной до умеренной с неочевидной утратой хондроцита или разрушением коллагена в пораженных суставах

2 = Умеренное = обычно умеренная потеря окраски толуидинового синего с очаговыми участками потери хондроцита и/или разрушением коллагена в некоторых пораженных суставах

3 = Среднее = обычно средняя потеря окраски толуидинового синего с мультиочаговыми участками потери хондроцита и/или разрушением коллагена в пораженных суставах, некоторые матриксы остаются на любой пораженной поверхности с участками сильной потери матрикса

4 = Заметное = заметная потеря окраски толуидинового синего с мультиочаговыми заметными участками (от глубинных до глубоких зон) потери хондроцита и/или разрушением коллагена в большинстве суставов, если колено, одна поверхность с полной до почти полной утратой хряща

5 = Сильное = сильная рассеянная потеря окраски толуидинового синего с мультиочаговой сильной (от глубинных до отметки прилива) утратой хондроцита и/или разрушением коллагена во всех суставах, если колено, 2 или более поверхностей с полной до почти полной утратой хряща

Резорбция кости

0 = Норма

1 = Минимальная = маленькие области резорбции, не очевидны при малом увеличении, редкие остеокласты в пораженных суставах, ограничена краевыми зонами

2 = Умеренная = более многочисленные области резорбции, не очевидны при малом увеличении, большее количество остеокластов в пораженных суставах, ограничена краевыми зонами

3 = Средняя = очевидная резорбции медуллярно трабекулярной и кортикальной частей кости без дефектов по всей толщине в коре, потеря некоторых медуллярных трабекул, поражение хорошо видно при малом увеличении, большее количество остеокластов в пораженных суставах

4 = Заметная = Дефекты по всей толщине в кортикальной части кости, часто с искажением профиля оставшейся кортикальной поверхности, заметная потеря медуллярной части кости, ряд остеокластов, поражение большинства суставов

5 = Сильная = Дефекты по всей толщине в кортикальной части кости и разрушение архитектуры сустава во всех суставах

Рассчитывали общую сумму гистологических показателей для каждого параметра для всех шести суставов.

[0241] Результаты этого эксперимента показаны на Фиг. 8. cAb1 подавляет воспаление, повреждение хряща, образование паннуса и разрушения кости на модели, спровоцированного коллагеном ревматоидного артрита.

Пример 8: cAb1 подавляет количество макрофагов в лапе и коленном суставе в мышиной модели ревматоидного артрита

[0242] У мышей провоцировали появление артрита и мышей лечили cAb1 как описано в Примере 5. Получали части лап и коленных суставов как описано в Примере 7. Части лап и коленных суставов окрашивали анти-Р4/80 антителом, конъюгированным с пероксидазой, и определяли количество макрофагов путем подсчета положительно окрашенных клеток под микроскопом. Срезы тканей и окрашивание проводили согласно Histotox Labs, Boulder, CO. F4/80 является маркером мышиных макрофагов (Leenen et al., J. Immunol. Способы, 1994, 174: 5-19).

[0243] Результаты этого эксперимента показаны на Фиг. 9. cAb1 уменьшает количество макрофагов и в лапах, и в коленных суставах в модели спровоцированного коллагеном ревматоидного артрита.

Пример 9: cAb1 подавляет образование аутоантитела на мышиной модели ревматоидного артрита

[0244] У мышей провоцировали появление артрита и мышей лечили антителами cAb1 как описано в Примере 5. На 35 день отбирали кровь и определяли уровни антител мыши к коллагену II в плазме, используя набор для исследования мышиный IgG к колагену типа 1 и типа 2 (Chondrex) в соответствии с инструкциями производителя.

[0245] Результаты этого эксперимента показаны на Фиг. 10. cAb1 подавляет образование анти-мышиного коллаген II аутоантитела на модели, спровоцированного коллагеном, ревматоидного артрита. Эти данные указывают на то, что и у людей, антитела, связывающие CSF1R и блокирующие связывание лиганда, такие как huAb1, могут уменьшить важный спусковой механизм воспаления сустава, а именно образование аутоантитела. В дополнение аутоантитела, такие как RF и АСРА, могут, в некоторых вариантах реализации изобретения быть использованы для контроля действия лекарственного средства.

Пример 10: cAb1 подавляет потерю костной массы на мышиной модели устоявшегося ревматоидного артрита

[0246] У мышей провоцировали появление артрита как описано в Примере 5. Мышам внутрибрюшинно 3×/неделю вводили 30 мг/кг cAb1, начиная с того момента, когда клинические проявления заболевания достигали 0,05-1,0. На 23 день после начала лечения с использованием cAb1 отбирали кровь и определяли уровни TPAP5b (Устойчивая к тартрату кислая фосфатаза 5b) в плазме, используя коммерческий набор для определения остеокласт-производного TPAP5b в мышиной сыворотке методом твердофазного ИФА (Immunodiagnostics Systems) в соответствии с инструкциями производителя. TPAP5b является маркером обмена кости.

[0247] Результаты этого эксперимента показаны на Фиг. 11. cAb1, вводимое после развития клинических признаков заболевания, подавляет потерю костной массы на модели, спровоцированного коллагеном ревматоидного артрита, как измерено через подавление маркера обмена кости TPAP5b. Эти данные указывают на то, что и у людей, антитела, связывающие CSF1R и блокирующие связывание лиганда, такие как huAbl, могут подавлять эрозию костей и разрушение суставов при ревматоидном артрите.

Пример 11: cAb1 подавляет образования паннуса и разрушение кости на мышиной модели установленного ревматоидного артрита

[0248] У мышей провоцировали появление артрита и мышей лечили с помощью cAb1 как описано в Примере 10. В конце исследования собирали лапы и колени и помещали на ночь в нейтральный забуференный формалин (NBF), а затем переносили в 70% этанол для гистопатологического и иммуногистохимического исследования.

[0249] Шесть суставов каждого животного подвергали гистопатологической оценке и рассчитывали общую сумму гистологических показателей для каждого параметра для всех шести суставов. Суставы оценивали, как описано в Примере 7.

[0250] Результаты этого эксперимента показаны на Фиг. 12. cAb1, вводимое после развития клинических признаков заболевания, подавляет образования паннуса и разрушения кости в модели спровоцированного коллагеном ревматоидного артрита. Гистологические показатели воспаления и повреждения хряща показали, что хрящи не поражены. Эти данные указывают на то, что и у людей антитела, связывающие CSF1R и блокирующие связывание лиганда, такие как huAb1, могут подавлять эрозию костей и разрушение суставов при ревматоидном артрите.

Пример 12: cAb1 подавляет гломерулонефрит, интерстициальный нефрит и периваскулярные инфильтраты на мышиной модели системной красной волчанки

[0251] У субпопуляции пациентов с волчанкой развивается волчаночный нефрит, который включает воспаление в одной или большем числе структур почек и может приводить к почечной недостаточности. Волчаночный нефрит может быть диагностирован у пациентов, тяжесть заболевания оценивается, например, путем измерения протеинурии, или белка в моче, и/или определения уровня клубочковой фильтрации, который измеряется по тому, насколько много жидкости фильтруется почками за единицу времени. Волчаночный нефрит также может быть диагностирован гистологически с использованием биопсии почек или с использованием методик визуализации, таких как ультрасонография (Hahn et al., Arthr. Care Res., 2012, 64: 797-808).

[0252] У мышей линии MRL/MpJ-Fas^lpr/J спонтанно развиваются подобные волчанке симптомы, включая гломерулярные, тубулоинтерстициальные и периваскулярные заболевания почек, лимфаденопатия, спленомегалия,; циркулирующие аутоантитела и повреждения кожи. Самкам MRL/MpJ-Fas^lpr/J мышей внутрибрюшинно каждый день на протяжении 10 недель в возрасте от 10 недели до 20 недели вводили растворитель или 50 мг/кг cAb1. В конце исследования (возраст мышей 20 недель), удаляли почки, взвешивали и помещали в 10% нейтральный забуференный формалин (NBF) для гистологической оценки. Почки оценивали согласно следующей системе:

Гломерулонефрит

0 = Норма.

1 = Очаговый или мультиочаговый, от минимального до легкого, начальная пролиферация.

2 = Мультиочаговый от легкого до умеренного или легкая диффузная пролиферация.

3 = Диффузная умеренная пролиферация с фокальным участками тажелого поражения или без них.

4 = Заметная диффузная пролиферация, с полумесяцами/склероз, присутствие мультиочаговых белковых цилиндров.

5 = Сильная рассеянная пролиферация, с полумесяцами/склероз, присутствие диффузных белковых цилиндров.

Тяжесть белковых цилиндров

0 = Нормальные канальцы.

1 = Минимальная = От одного до 5 профилей каналец с белковыми цилиндрами.

2 = Умеренная = Мультиочаговые канальцы с белковыми цилиндрами (6-20).

3 = Средняя = Мультиочаговые канальцы с белковыми цилиндрами (21-40).

4 = Заметная = Мультиочаговые канальцы с белковыми цилиндрами (>40, но поражено менее 50% всех канальцев).

5 = Сильная = Рассеянные канальцы с белковыми цилиндрами, поражено более чем 50% всех канальцево.

Интерстициальный нефрит (воспаление, не очевидно связано с сосудами)

0 = Норма.

0,5 = Очень Минимальный = Маленькая очаговая область МНК (мононуклеарные клетки) только в почечной лоханке.

1 = Минимальный = Иногда небольшой очаг, скопление МНК: поражено менее 10% от общей интерстициальной ткани и обычно локализовано вокруг почечной лоханки.

2 = Легкий = Инфильтраты от мультиочаговых малых до больших, расположенные вокруг почечной лоханки и кортикального слоя: поражено 10-25% площади коры.

3 = Умеренный = Инфильтраты от мультиочаговыех малых до обширных в почечной лоханке и кортикальном слое: поражено 26-50% площади коры.

4 = Заметный = Инфильтрация от мультиочаговой до рассеянной: поражено 51-75% почечной лоханки и площади коры.

5 = Тяжелый = диффузная инфильтрация: поражено 76-100% почечной лоханки и площади коры.

Сосуды

0 = Норма.

0,5 = Очень минимально = Один сосуд с минимальным периваскулярным инфильтратом.

1 = Минимально = Мало, но ясные периваскулярные инфильтраты (1-2).

2 = Легкое поражение = Несколько (3-4) очаговых периваскулярных инфильтратов, без некроза.

3 = Умеренное поражение = Мультиочаговые (5-6) периваскулярные инфильтраты, более обширные, может присутствовать несколько некрозов на стенках сосуда.

4 = Легкое поражение = Мультиочаговые (7-8) периваскулярные инфильтраты, обширные с некрозом.

5 = Тяжелое поражение = Мультиочаговые (>8) периваскулярные инфильтраты, обширные с некрозом.

[0253] Результаты этого эксперимента показаны на Фиг. 13. cAb1 подавляет гломерулонефрит, интерстициальный нефрит и периваскулярные инфильтраты в MRL/lpr модели волчанки. Гистологические оценки тяжести белковых цилиндров указывали на отсутствие поражения. Эти данные указывают на то, что и у людей антитела, связывающие CSF1R и блокирующие связывание лиганда, такие как huAb1, могут уменьшать воспаление почек, связанное с системной красной волчанкой, и восстанавливать функцию почек.

Пример 13: cAb1 подавляет повреждений кожи на мышиной модели системной красной волчанки

[0254] Самкам мышей MRL/MpJ-Fas^lpr/J вводили cAb1 как описано в Примере 12. Мышей исследовали на наличие и тяжесть повреждений кожи от возраста 10 недель до возраста 20 недель. Повреждения кожи оценивали следующим образом:

0 = нет

1 = легкие (мордочка и уши)

2 = умеренные (<2 см мордочка, уши и между лопатками)

3 = тяжелые (>2 см мордочка, уши и между лопатками)

[0255] Результаты этого эксперимента показаны на Фиг. 14. cAb1 подавляет возникновение и снижает тяжесть повреждений кожи в MRL/lpr модели волчанки. Эти данные указывают на то, что и у людей антитела, связывающие CSF1R и блокирующие связывание лиганда, такие как huAb1, могут уменьшать системные проявления СКВ, включая воспаление кожи, высыпание и дисковидные поражения.

Пример 14: cAb1 подавляет клинические проявления заболевания на мышиной модели рассеянного склероза

[0256] У самок мышей С57В1/6 вызвали экспериментальный аутоиммунный энцефалит (ЕАЕ) с помощью подкожной инъекции 300 нг миелинового олигодендроцитного гликопротеинового пептида 35-55 (MOG 35-55, Sigma-Aldrich, Cat # М4939) в полном адъюванте Фрейнда в день исследования 0 и снова в день исследования 7. Для повышения развития и соответствия ЕАЕ в день 0 и 2 внутрибрюшинно вводили 500 нг токсина коклюша (List Biological Laboratories, Cat # 180). ЕАЕ является моделью рассеянного склероза. Мышей случайным образом делили на группы для лечения в день исследования 0 и начинали лечение. Мышам внутрибрюшинно 3 раза в неделю (3×/нед) вводили нейтральную среду или 30 мг/кг cAb1 в течение 15 дней исследования. Измеряли клинические проявления заболевания в дни исследования 6-15. Клинические проявления заболевания оценивали следующим образом:

0,0 = Отсутствуют клинические признаки

0,5 = Частичная вялость хвоста

1,0 = Парализованный хвост

2,0 = Потеря координации движений; полупаралич задней конечности

2,5 = Она из задних конечностей парализована

3,0 = Обе задние конечности парализованы

3,5 = Задние конечности парализованы; слабость в передних

4,0 = Передние конечности и задние конечности парализованы

5,0 = Агония

[0257] Результаты этого эксперимента показаны на Фиг. 15. cAb1 подавляет клинические проявления заболевания на экспериментальной аутоиммунной энцефалитной модели рассеянного склероза. Эти данные указывают на то, что и у людей антитела, связывающие CSF1R и блокирующие связывание лиганда, такие как huAb1, могут уменьшать воспаление в ЦНС, связанное с рассеянным склерозом, и могут ослаблять паралич, вызванный MS-связанным демиелинированием и повреждением нейронов.

Таблица последовательностей

[0258] В Таблице 5 приведены некоторые последовательности, обсуждаемые в данном документе. Все последовательности полипептидов и антител показаны без лидерных последовательностей, если не указанно иное.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения неоплазии у субъекта. Для этого субъекту с неоплазией вводят антитело, связывающее рецептор колониестимулирующего фактора 1 (CSF1R) человека. При этом антитело блокирует связывание колониестимулирующего фактора 1 (CSF1) человека с CSF1R человека в такой дозе, что количество CD16+ моноцитов уменьшается по меньшей мере на 30%. Изобретение обеспечивает лечение неоплазии у субъекта. 7 з.п. ф-лы, 5 табл., 15 ил., 14 пр.

1. Способ лечения неоплазии, включающий введение субъекту с неоплазией антитела, связывающего рецептор колониестимулирующего фактора 1 (CSF1R) человека, характеризующийся тем, что антитело блокирует связывание колониестимулирующего фактора 1 (CSF1) человека с CSF1R человека в такой дозе, что количество CD16+ моноцитов уменьшается по меньшей мере на 30%, где указанное антитело выбрано из:

a) антитела, включающего тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 39, и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 46;

b) антитела, включающего тяжелую цепь, включающую CDR1 тяжелой цепи (HC), имеющий последовательность SEQ ID NO: 15, CDR2 тяжелой цепи, имеющий последовательность SEQ ID NO: 16, и CDR3 тяжелой цепи, имеющей последовательность SEQ ID NO: 17, и легкую цепь, включающую CDR1 легкой цепи (LC), имеющий последовательность SEQ ID NO: 18, CDR2 легкой цепи, имеющий последовательность SEQ ID NO: 19, и CDR3 легкой цепи, имеющий последовательность SEQ ID NO: 20; и

c) антитела, включающего тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 53, и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 60.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что количество CD16- моноцитов не уменьшается или уменьшается менее чем на 20%.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что этот способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, выбранного из анти-CD-20 антитела, анти-CD19 антитела, анти-GM-CSF антитела, антагониста рецептора IL-1, антагониста CTLA-4 и анти-GM-CSF-R антитела.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что этот способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, выбранного из анти-CD-20 антитела, анти-CD19 антитела, анти-GM-CSF антитела, антагониста рецептора IL-1, антагониста CTLA-4 и анти-GM-CSF-R антитела.

5. Способ по любому из пп. 1, 2, 3 или 4, отличающийся тем, что антитело вводят в такой дозе, что количество CD16+ моноцитов уменьшается по меньшей мере на 50%.

6. Способ по любому из пп. 1, 2, 3 или 4, отличающийся тем, что CD16+ моноциты являются CD16+ моноцитами периферической крови.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что антитело является гуманизированным антителом.

8. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что антитело выбирают из Fab, Fv, scFv, Fab’ и (Fab’)₂.