ЦЕПЬ С1 БЕЛКА 2 ПРОМЕЖУТОЧНОГО СЛОЯ ХРЯЩА И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОСТЕОАРТРИТА ОТ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА И НЕПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/68 C07K14/47 C07K16/18 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способу определения остеоартрита (OA). Способ, в частности, можно использовать для оценки наличия или отсутствия остеоартрита. Способ, например, осуществляется путем анализа биохимических маркеров, включающего измерение в образце концентрации белка 2 промежуточного слоя хряща (CILP-2) человека в жидкостях организма и соотношения полученных концентраций с отсутствием или наличием остеоартрита. Более конкретно, изобретение относится к N-концевой части или цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща или их фрагментам. Изобретение также описывает разработку диагностических и прогностических анализов дифференциации остеоартрита от ревматоидного артрита (RA) и непатологических состояний.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Артрит представляет собой группу состояний, которые поражают суставы организма, включая ревматоидный артрит и псориатический артрит, которые являются аутоиммунными заболеваниями; септический артрит, вызываемый инфекцией суставов; и наиболее частый остеоартрит. В отличие от аутоиммунных заболеваний, остеоартрит в основном поражает пожилых людей и является следствием дегенерации хрящевой ткани суставов.

Остеоартрит представляет собой наиболее частую форму артрита, поражающую большую часть популяции. Хотя остеоартрит может воздействовать почти на любой сустав, наиболее часто поражаются суставы рук, колен, бедра и позвоночника. Обычные симптомы включают боль, ригидность, утрату подвижности в суставе и изменения формы пораженных суставов. Как правило, такое нарушение называют дегенеративной болезнью суставов или артритом "износа". Хотя он может появиться внезапно вследствие травмы, в целом, он развивается постепенно; с возрастом возникает разрушение в хрящевой ткани, а боль постепенно становится все сильнее, хотя на ранних стадиях покой может давать облегчение. Для остеоартрита характерна тупая пульсирующая боль по ночам, и эта боль может сопровождаться мышечной слабостью или ухудшением функции. Симптомы обычно возникают после 50 лет и медленно прогрессируют. Начинаясь с боли в суставе, состояние прогрессирует и, в конце концов, суставы деформируются, ограничивая подвижность. По мере разрушения хрящевой ткани происходит воздействие на кость, это изменяет походку. На поздних стадиях заболевания отмечают присоединение воспалительного компонента, причем процесс в хрящевой ткани может играть роль в стимуляции этого воспаления. Полагают, что это состояние запускается избыточной или необычной нагрузкой на сустав, причем избыточная нагрузка, неудобная поза, повторяющаяся физическая нагрузка, травма, спортивная травма или сочетание этих факторов, как известно, увеличивают риск.

Остеоартрит также включает формирование новых тканевых структур, особенно явных в форме так называемых остеофитов, которые представляют собой новообразованные структуры, возникшие за счет эндохондрального формирования кости. Хотя механические факторы по-видимому имеют значение для запуска и развития заболевания, о таких специфических факторах мало что известно, в частности, из-за отсутствия диагностических процедур, способных идентифицировать заболевание на ранних стадиях. Пациенты обычно обращаются по поводу боли и нарушения функции суставов на поздних стадиях развития заболевания, когда разрушение хрящевой ткани уже значительно прогрессировало.

В настоящее время не существует единственного признака, симптома или результата теста, который позволил бы однозначно диагностировать остеоартрит. Вместо этого диагноз основывается на оценке нескольких факторов, включая наличие характерных признаков и симптомов остеоартрита и результаты лабораторных тестов и рентгенографии, критериев, установленных American College of Rheumatology (ACR).

Данные рентгенограммы обычно могут подтвердить диагноз остеоартрита, хотя они и не являются специфичными. Основными рентгенографическими признаками заболевания являются отсутствие суставной щели и наличие костных новообразований или остеофитов. Связь между болью в суставах и рентгенографическими признаками остеоартрита не является точной, так что сустав с патологическими или рентгенографическими признаками заболевания может не давать симптомов. Еще одним недостатком применения рентгенографии для представления уровня деструкции хрящевой ткани при OA, в частности в колене, является необходимость установить точный угол прохождения рентгеновских лучей для точного измерения суставной щели. Диагностика с применением рентгенографии может использоваться несколько лет после появления повреждения, тогда как биомаркеры, такие как цепь С1 белка 2 промежуточного слоя хряща и их фрагменты могут использоваться гораздо ранее для точного диагностирования.

Неясно, какой процесс лежит в основе прогрессивной деструкции ткани при остеоартрите, но очевидо, что при этом происходит разрушение основных макромолекул ткани, вызванное усиленной протеолитической активностью. Было показано, что при таком прогрессивном разрушении ткани сначала происходит деградация аггрекана (протеогликана, который является основным структурным компонентом хрящевой ткани), и пять специфических сайтов в молекуле могут быть расщеплены так называемыми аггреканазами (ADAMTS-4 и 5). Однако нормальный уровень аггрекана приспосабливается, например, к измененной механической нагрузке на хрящевую ткань за счет процесса, который включает расщепление молекулы по тем же характерным сайтам теми же ферментами ADAMTS. Фрагментация коллагена, осуществляемая специфическими коллагеназами и другими ферментами, которые разрушают крупные молекулы, такие как олигомерный белок матрикса (COMP).

В процессе [развития] остеоартрита некоторые образующиеся фрагменты не остаются в ткани и высвобождаются в окружающие жидкости организма и, в конце концов, могут попадать в кровоток. Новая технология основана на измерении таких фрагментов в жидкостях организма в качестве индикатора активного процесса, приводящего к деструкции ткани. Эта технология молекулярного маркера предоставляет возможности для новых диагностических процедур. С ее помощью можно обнаруживать признаки на более ранних этапах развития деструкции ткани, чем это возможно с помощью существующих подходов. Было обнаружено, что при повышении уровня фрагментов СОМР, высвободившихся в синовиальную жидкость, а затем достигающих кровотока, их можно использовать в качестве прогностического индикатора процесса, который приводит к деструкции суставной хрящевой ткани, что видно на рентгенограмме. Хотя патологические процессы остеоартрита и ревматоидного артрита различны, по-видимому уровни COMP в сыворотке являются прогностическими в обоих случаях.

Одним из ограничений при оценке значимости изменения уровней COMP в жидкостях организма является сложность отличить, является ли большая часть обнаруживаемого СОМР следствием нормального обмена или развития заболевания. Другие индикаторы, которые использовались, включают C-концевой телопептид, высвобождающийся при расщеплении коллагена типа II (обозначенный как CTX-II). Другие анализы непосредственно измеряют новые концевые участки исходной полипептидной цепи, которые образуются, если коллаген типа II расщепляется коллагеназами. В анализе, направленном на фазу восстановления, используется высвобожденный C-концевой пропептид коллагена типа II (CP-II), когда проколлаген преобразуется в ходе формирования коллагеновых фибрилл. Этот пропептид, очевидно, не сохраняется в хрящевой ткани. Методики измерения выделения фрагментов аггрекана имеют ограниченное применение, так как крупные фрагменты, содержащие отрицательно заряженные цепи хондроитинсульфата, вероятно, в основном уничтожаются в лимфатических узлах, не достигая кровотока (Frazer, Heinegård, Saxne, unpublished data). Однако измерение фрагментов аггрекана в синовиальной жидкости пациентов с начальными стадиями ревматоидного артрита проведено для идентификации пациентов, у которых в течение более 10 лет развилась обширная деструкция хрящевой ткани (1).

Одним из очевидных недостатков всех этих маркеров является отсутствие специфичности для данного заболевания суставов и перекрытие измеряемых уровней между образцами, полученными у здоровых индивидов, и индивидов с заболеваниями суставов. Кроме того, при использовании любого из этих индикаторов разница между ревматоидным артритом и остеоартритом минимальна или отсутствует. Только у части пациентов были отмечены значительно повышенные значения, четко отличающие их от значений здоровых индивидов (2).

Одной из причин отсутствия такой специфичности является постоянный обмен структурных молекул ткани в ответ на регулярную и обычную нагрузку. Это приводит к адаптации функции ткани к новым требованиям, включая устранение изношенных элементов ткани. Одним из последствий такого обмена является постоянное высвобождение фрагментов, образующихся в результате нормального расщепления. В применяемых в настоящее время анализах фрагментов в качестве молекулярных индикаторов существует лишь небольшое различие между фрагментами, образующимися в ходе нормального обмена веществ и образующимися в результате патологических процессов. Таким образом, существует высокий уровень фона, который затрудняет обнаружение повышенного патологического молекулярного процесса. Однако возможно, что некоторые продукты распада коллагена типа II (коллаген, присутствующий в хрящевой ткани суставов в избыточных количествах) могут более точно различаться при нормальном и патологическом состоянии, даже если процесс может быть индуцирован одним и тем же ферментом. Это возможно, так как нормальный обмен коллагена, как показано для хрящевой ткани суставов, на несколько порядков медленнее обмена других компонентов матрикса.

Как используется в настоящем документе, белки для предшественника белка промежуточного слоя хряща обозначены как CILP-1 и CILP-2, соответственно. N-концевая часть, которую исследовали авторы изобретения, обозначена как цепь С1 белка 2 промежуточного слоя хряща, которая отличается от цепи С2 белка 2 промежуточного слоя хряща.

Белок промежуточного слоя хряща (CILP), крупный секретируемый гликопротеин (3-6), как полагают, играет роль в образовании хрящевого каркаса (7), и, как сообщалось, имеет нуклеозидтрифосфатпирофосфогидролазную [NTPPPH] активность (8-11). Экспрессия CILP, по-видимому, в основном ограничена хрящевой тканью (3, 4, 9, 11, 12). Количество белка CILP с возрастом в хрящевой ткани человека увеличивается, и CILP является одним из нескольких белков матрикса хрящевой ткани, чья экспрессия значительно усиливается на ранних стадиях остеоартрита (4). В нормальных культивируемых хондроцитах свиньи трансформирующий фактор роста β1 (TGFβ1) индуцирует экспрессию CILP, тогда как инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) подавляет экспрессию CILP (10). Первоначально обнаруженный CILP в настоящее время обозначен как цепь С1 белка 1 промежуточного слоя хряща (UniProtKB/Swiss-Prot, номер 075339).

Нуклеотидная последовательность белка 2 промежуточного слоя хрящевой ткани (CILP-2) депонирована в Genbank, содержащий последовательности (номер доступа AF542080, 2002). Первое исследование белка CILP-2 было проведено в 2003 (13), и было обнаружено, что он не обладает нуклеотидпирофосфатазафосфодиэстеразной (NPP) активностью (13).

CILP-2 на 50% гомологичен CILP-1, и данные (Lorenzo and Heinegård, не опубликовано) показывают, что он сходным образом расщепляется на соответствующие цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща и цепь С2 белка 2 промежуточного слоя хряща (UniProtKB/Swiss-Prot, номер Q8IUL8). На основании протеомных подходов оба белка были обнаружены в экстрактах хряща (Önnerfjord and Heinegård, не опубликовано).

В недавно проведенных исследованиях авторами изобретения было показано усиление на ранних и поздних стадиях остеоартрита продукции СОМР, фибронектина и в то же время нового белка, который был охарактеризован и обозначен как CILP, теперь обозначаемый как цепь С1 белка 1 промежуточного слоя хряща (3,4,16).

Неожиданно авторами изобретения было обнаружено, что пептид, охватывающий аминокислоты 21-709 (SEQ ID NO: 1), CILP-2 человека является маркером, который может быть использован для дифференциальной диагностики остеоартрита от ревматоидного артрита и непатологических состояний.

Исследования показали вовлеченность CILP (цепь С1 белка 1 промежуточного слоя хряща) в качестве аутоантигена у пациентов с остеоартритом (14,15). Нет сведений об исследованиях, указывающих, что цепь С1 белка 2 промежуточного слоя хряща может быть изменена при остеоартрите. Не обнаружено публикаций или патентов, описывающих или предполагающих, что цепь С1 белка 2 промежуточного слоя хряща или ее фрагменты могут быть использованы для диагностики остеоартрита.

В работе Du et al. 2005 (14) представлены данные о том, что у небольшой части пациентов с остеоартритом колена присутствуют аутоантитела к CILP (цепь С1 белка 1 промежуточного слоя хряща). Антитела обнаружены лишь у 25/136 пациентов с остеоартритом. Аналогично в статье Tsuruha et al. 2001 (7) показано только 8-10,5% антител к различным участкам CILP (цепь С1 белка 1 промежуточного слоя хряща). Не сообщалось об исследованиях, показывающих на наличие антител к цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща или к ее фрагментам, белку, который является объектом изобретения.

В патенте США № 6124095 и патенте США № 6251389, принадлежащих фирме Incyte, описаны CILP-2 и полинуклеотид, кодирующий CILP-2. В этих патентах белок обозначен как нуклеотидпирофосфогидролаза-2 человека (NTPPH-2), однако последовательность NTPPH-2 идентична CILP-2. Авторы отметили экспрессию NTPPH-2 в синовиальной капсуле при ревматоидном и остеоартрите. В этом патенте не описана возможность использования NTPPH-2 для селективной идентификации пациентов с остеоартритом. Тому же заявителю был выдан патент (патент США № 5876963) на CILP-1 (NTPPH-1) и полинуклеотид, кодирующий NTPPH-1.

В DE 10328033 (S. Blaess) описан чип, несущий последовательности ДНК, связанные с остеоартритом и ревматоидным артритом, например, для диагностики, контроля и разработки лекарственных средств. В документе не упоминается цепь С1 белка 2 промежуточного слоя хряща.

В WO03/054166 (Incyte) описаны способы определения подверженности индивидов, предпочтительно, страдающих остеоартритом, к сужению суставной щели и/или развитию остеофитов и/или суставным болям, включающие идентификацию того, обладает ли индивид по меньшей мере одним полиморфизмом в полинуклеотиде, кодирующем белок, один из множества которых является CILP. Однако авторы не упоминали цепь С1 белка 2 промежуточного слоя хряща.

В обеих заявках WO02/095415 и WO01/38872 (Osteometer Biotech) описан анализ диагностики тяжести остеоартрита или ревматоидного артрита, включающий определение изомеризованного или оптически инвертированного белка или фрагмента белка в образце. Ни фрагмент, описанный в WO02/095415, ни белок, описанный в WO01/38872, не являются цепью С1 белка 2 промежуточного слоя хряща.

В WO01/20018 (Univ. of California) описан способ идентификации риска развития артрита, например остеоартрита, включающий сравнение уровня по меньшей мере одного индикатора, например NTPPH, измененной функции митохондрий в биологическом образце в сравнении с контрольным образцом.

Точный диагноз остеоартрита в настоящее время возможен только на поздних стадиях заболевания и зависит от рентгенографических и клинических исследований. В случае ревматоидного артрита разрушение хрящевой ткани сустава может быть определено только на поздних стадиях с помощью рентгенографии.

Прогрессия ревматоидного артрита на ранних стадиях RA может быть очень быстрой, и серьезные повреждения суставов могут проявиться в течение короткого времени, например за 24 месяца. Если современное эффективное лечение ревматоидного артрита, такое как блокирование активности TNF-α, начать как можно раньше, то симптомы могут уменьшиться, а деструкция суставов замедлиться, что препятствует ранней инвалидизации.

Не существует описанных коррегирующих способов лечения остеоартрита. В настоящее время нет средств лечения, а лечение направлено на облегчение боли. Обычные методы лечения включают использование нестероидных противовоспалительных препаратов (NSAID), которые как правило используют для облегчения боли. Полагают, что такие соединения, как хондроитин и глюкозамин, улучшают состояние собственно хрящевой ткани, однако подробный анализ до сих пор остается важным направлением.

В тяжелых случаях зачастую необходима замена сустава. В небольшом количестве случаев суставы могут подвергаться сращению. Эта процедура устраняет боль, но приводит к постоянной утрате функции сустава. Другой вид лечения, пока не используемый при полностью развившемся остеоартрите, включает трансплантацию культивированных аутологических хондроцитов. Если болезненное состояние не корригируется и/или не подвергается лечению, то сустав разрушается, что приводит к необходимости хирургического вмешательства с полным протезированием или к инвалидности.

Таким образом, для внедрения новых терапевтических схем лечения, которые могут остановить заболевание на ранних стадиях его развития, важны новые, ранние и точные средства диагностики, которые могли бы обеспечить успех. По этой причине авторы изобретения попытались разработать анализ, который мог бы использоваться в качестве индикатора развития остеоартрита, а также для дифференциальной диагностики остеоартрита от ревматоидного артрита и от здорового состояния сустава.

Начальные эксперименты авторов изобретения показали, что цепь С1 белка 1 промежуточного слоя хряща, несмотря на то, что его продукция усиливается при остеоартрите, включая как ранние, так и поздние стадии, незначительно повышена в синовиальной жидкости пациентов, страдающих остеоартритом, и существенно не отличается от уровня в жидкости пациентов с ревматоидным артритом. По мере разработки анализа цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща авторы изобретения неожиданно показали, что этот белок действует в качестве индикатора, демонстрирующего неожиданный и уникально повышенный уровень при остеоартрите. Уровни в сыворотке и синовиальной жидкости сильно повышены и не перекрываются с образцами, взятыми у пациентов, страдающих ревматоидным артритом, и нормальных индивидов. Это первый случай, когда анализ на какой-либо белок, выделяемый из ткани, показал такое различие между образцами, представляющими различные формы заболеваний суставов. В данном документе представлено изобретение, относящееся к новому диагностическому и прогностическому анализу для обнаружения процесса остеоартрита до установления диагноза или одновременно. Другие объекты настоящего изобретения и его преимущества будут более ясны из нижеследующего описания и приложенной формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу дифференциации остеоартрита от ревматоидного артрита и непатологических состояний в образце, включающему измерение в образце концентрации цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща или его фрагментов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой график, показывающий данные образцов сыворотки пациентов, описанных в ПРИМЕРЕ 4. Образцы анализировали ELISA на цепь С1 белка 2 промежуточного слоя хряща.

Фиг.2 представляет собой график, показывающий данные образцов синовиальной жидкости коленного сустава пациентов, описанных в примере 4. Образцы анализировали ELISA на цепь С1 белка 2 промежуточного слоя хряща.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ И ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение, описанное в настоящем документе, основано на начальных данных о цепи С1 белка 1 промежуточного слоя хряща, который авторы изобретения идентифицировали как один из немногих белков, демонстрирующих значительный прогресс остеоартрита. Первая попытка применения авторами изобретения полученных ими антител против белка, очищенного из ткани, дала обнадеживающие результаты того, что белок высвобождался у больных остеоартритом в синовиальную жидкость, и его наивысший уровень был обнаружен в образцах больных, страдающих остеоартритом.

Работа с рекомбинантным белком цепи С1 белка 1 промежуточного слоя хряща, полученным в фибробластах EBNA 293, к сожалению, неожиданно показала, что этот чистый белок, используемый в качестве покрывающего антигена в анализе ELISA, не дает удовлетворительного ингибирования уровня в образцах синовиальной жидкости. В это же время в базах данных появился белок 2 промежуточного слоя хряща, и у авторов данного изобретения возникло предположение, что в их препаратах имело место загрязнение антителами к этому белку. Поэтому авторы разработали специфические антитела к цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща и в настоящее время использовали их для разработки анализа на фрагменты этого белка в синовиальной жидкости и сыворотке. Этот анализ оказался очень многообещающим, и анализы образцов сыворотки здоровых индивидов, а также от пациентов, страдающих ревматоидным артритом и остеоартритом, дали результаты, представленные на фиг.1.

Результаты показали, что уровень цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща был намного выше при остеоартрите по сравнению и с ревматоидным артритом и нормальным состоянием, без наложения. Это первый случай, когда анализ демонстрирует такое различие между образцами различных заболеваний суставов для какого-либо белка, выделенного из ткани.

Образцы сыворотки и синовиальной жидкости двенадцати пациентов с клинически установленным диагнозом ревматоидного артрита в соответствии с критериями ACR (все касаются артрита коленного сустава), двенадцати пациентов с клинически установленным в соответствии с клиническими и рентгенографическими критериями ACR остеоартритом коленного сустава и двенадцати контрольных образцов здоровых индивидов из крови доноров анализировали в соответствии с установленной методикой ELISA. Основное наблюдение состояло в том, что уровень цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща или его фрагменты были заметно выше в образцах, взятых у больных остеоартритом, без существенного перекрытия с уровнями здоровых индивидов, образцы которых, в свою очередь, показали уровень, сходный с уровнем образцов больных ревматоидным артритом. У пациентов с остеоартритом был показан широкий диапазон значительно более высоких уровней, что указывает на то, что выделение повышенного уровня цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща является общей особенностью этой группы.

Результаты показали уникальное отличие уровней молекулярного маркера между различными состояниями, поражающими суставы. Интересно, что многочисленные данные показывают, что уровень COMP в сыворотке является значительно повышенным как при ревматоидном артрите, так и при остеоартрите. Следовательно, соотношение COMP и цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща отличается у индивидов с ревматоидным артритом и здоровых, в частности у подгруппы пациентов с субнормальным уровнем цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща или его фрагментов.

Результаты показали, что получен новый молекулярный маркер, который возможно может служить для диагностики состояний, связанных с остеоартритом. Уровень цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща заметно выше по сравнению со здоровыми индивидами и пациентами с ревматоидным артритом. Различие уровней здоровых индивидов и больных остеоартритом показывает, что анализ цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща также является индикатором существующей патологической активности. Широкий диапазон значений образцов, взятых у пациентов, показывает, что уровень коррелирует с интенсивностью процесса. Образцы, которые могут быть проанализированы способом по изобретению, включают синовиальную жидкость, кровь, плазму, сыворотку и мочу.

Настоящее изобретение также относится к набору для анализа, содержащему антитела, иммунореактивные к пептиду, содержащему аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:1) и/или ее фрагменты, и инструкцию по применению при проведению анализа.

ПРИМЕР 1

Получение антигена и антисыворотки

Синтетический пептид в пределах аминокислот 21-709 (SEQ ID NO:1) CILP-2 человека (GeneBank, номер доступа Q8IUL8) использовали в качестве иммуногена. На аминоконцы добавляли дополнительные остатки цистеина, чтобы обеспечить селективное связывание с различными субстратами. Последовательность пептида (SEQ1) использовали в качестве иммуногена после конъюгации на N-конце через дополнительный цистеин к http://www.multitran.ru/c/m.exe?t=2747086_1_2гемоцианину лимфы улитки (KLH) с получением поликлональных антител в соответствии со стандартными протоколами. Любой фрагмент в диапазоне аминокислот 21-709 цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща человека может быть использован в качестве иммуногена.

Коммерческий источник (Innovagen AB, Lund, Швеция) использовали для синтеза пептида, конъюгации с носителем, получения антигена для иммунизации, включая инъекцию кролику и получение антисыворотки.

ПРИМЕР 2

Очистка антител к пептиду из неочищенной антисыворотки

Полученную антисыворотку очищали на аффинной колонке с иммобилизованным пептидом цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща (Innovagen AB, Lund, Швеция). Колонку (1,5 мл геля) уравновешивали фосфатным буфером (PBS, 0,1 M фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, pH 7,5) и наносили 5 мл сыворотки и инкубировали в перевернутом состоянии в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем дополнительно инкубировали в течение 1 ч без перемешивания. Колонку промывали 15 мл, а затем 10 мл PBS, содержащего 1M NaCl. Колонку поэтапно элюировали 1,5 мл 100 мМ глицина pH 2,7. Собирали десять фракций и немедленно нейтрализовали 50 мкл 1M Tris pH 9,5. Фракции с наивысшей абсорбцией объединяли и диализировали против PBS, содержащего 0,05% азида натрия. После диализа измеряли объем и определяли концентрацию иммуноглобулина IgG по его оптической плотности (OD) при длине волны 280 нм. Аффинно очищенные антитела хранили замороженными при -20°С в 200-мкл аликвотах и использовали во всех анализах.

ПРИМЕР 3

Конкурентный иммуноферментный анализ (ELISA) цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща

Специфический конкурентный ELISA был разработан для измерения цепи С1 промежуточного слоя хряща в жидкостях организма.

1. Биотинилирование пептидов: пептиды биотинилировали через концевой цистеин с помощью EZ-Link^®Maleimide PEO₂-Biotin, как описано производителем (PIERCE).

2. Предобработка антител: аффинно очищенные антитела против пептида разводили 1:50 фосфатным буфером (PBS), pH 7,4, содержащем 5% n,n-диметилформамида (Sigma-Aldrich). После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре антитела разбавляли 1:2000 с помощью 4% Triton в 10 мМ фосфате (NaH₂PO₄) pH 7,5.

3. Предобработка стандарта и образцов: Стандарт (от 1 до 125 нг/мл) в 1% (вес/объем) http://www.multitran.ru/c/m.exe?a=110&t=4291762_1_2&sc=37додецилбензолсульфонате натрия (SDBS, Sigma-Aldrich) в 0,1 M хлористого натрия, 0,05 M фосфата натрия при pH 7,5, содержащий 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma-Aldrich) и подходящее разбавление синовиальной жидкости или сыворотки в 1% (вес/объем) растворе SDBS без BSA инкубировали в течение ночи при комнатной температуре.

4. Анализ: 96-луночный микротитровальный планшет (Nunc-Immunoplates, Maxisorp, Nunc Intermed Ltd, Копенгаген, Дания) в течение ночи при комнатной температуре во влажной камере покрывали 50 мкл стрептавидина (ImmunoPure ® Streptavidin, PIERCE) в фосфатном буфере (PBS) pH 7,4. После промывки планшета 0,15 M хлоридом натрия и 0,05% (вес/объем) Tween 20 свободные сайты связывания поверхности полистирола блокировали 80 мкл 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich) в PBS при pH 7,4 в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем добавляли биотинилированный пептид, разбавленный 1:10000, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре.

Тридцать микролитров предобработанного стандарта (от 1 до 125 нг/мл) и образцы синовиальной жидкости или сыворотки (полученные обычной пункцией) смешивали с 30 мкл разбавленных антител. После преинкубации в течение 1 ч при комнатной температуре 50 мкл смеси добавляли в покрытые [стрептавидином] лунки микротитровального планшета и снова инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты ополаскивали, как указано выше, и связанные антитела обнаруживали путем добавления 50 мкл разбавленного анти-свиного иммуноглобулина IgG кролика, конъюгированного со щелочной фосфатазой (DAKO A/S, Дания) в 0,1M хлориде натрия, 0,05 M фосфата натрия, 0,05% Tween 20, pH 7,5, содержащего 2 мг/мл BSA. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре планшеты ополаскивали, как указано выше, и добавляли 50 мкл субстрата (1 мг/мл п-нитрофенилфосфата в 1M диэтаноламине при pH 9,8, содержащем 0,5 M MgCl₂).

Измеряли абсорбцию в каждом образце и стандарте на длине волны 405 нм в дублетах с помощью считывающего устройства для микропланшетов (Expert96, AsysHitech, Австрия). Программное обеспечение Mikrowin 200 (AsysHitech, Австрия) использовали для нанесения калибровочной кривой и расчета содержания CILP-2 в анализируемых образцах.

ПРИМЕР 4

Схема исследования

Двенадцать пациентов с клинически установленным в соответствии с критериями ACR ревматоидным артритом коленного сустава, 12 пациентов с клинически установленным в соответствии с критериями ACR остеоартритом и 12 нормальных образцов сыворотки от доноров крови анализировали в соответствии с установленной процедурой иммуноферментного анализа (ELISA), результаты представлены на фиг.1.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Saxne T., Wollheim F., Pettersson H., Heinegård D. Brit. Proteoglycan concentration in synovial fluid: predictor of future cartilage destruction in rheumatoid arthritis. Med. J. (1987), 295, 1447-1448).

2. Lindqvist E., Eberhardt K., Bendtzen K., Heinegård D., Saxne T. Ann. Rheum. Dis. Prognostic laboratory markers of joint damage in rheumatoid arthritis. (2005) 64, 196-201.

3. Lorenzo P., Neame P., Sommarin Y., Heinegård D. Cloning and deduced amino acid sequence of a novel cartilage protein (CILP) identifies a proform including a nucleotide pyrophosphohydrolase. J. Biol. Chem. 1998; 273: 23469-75.

4. Lorenzo P., Bayliss M.T., Heinegård D. A novel cartilage protein (CILP) present in the mid-zone of human articular cartilage increases with age. J. Biol. Chem. 1998; 273: 23463-8.

5. Lorenzo P., Aman P., Sommarin Y., Heinegård D. The human CILP gene: exon/intron organization and chromosomal mapping. Matrix Biol. 1999; 18: 445-54.

6. Nakamura I., Okawa A., Ikegawa S., Takaoka K., Nakamura Y. Genomic organization, mapping, and polymorphisms of the gene encoding human cartilage intermediate layer protein. J. Hum. Genet. 1999; 44: 203-5.

7. Tsuruha J., Masuko-Hongo K., Kato T., Sakata M., Nakamura H., Nishioka K. Implication of cartilage intermediate layer protein in cartilage destruction in subsets of patients with osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2001; 44: 838-45.

8. Masuda I., Hamada J-I., Haas A., Ryan L., McCarty D. A unique ectonucleotide pyrophosphohydrolase associated with porcine chondrocyte-derived vesicles. J. Clin. Invest. 1995; 95: 699-704.

9. Masuda I., Halligan B.D., Barbieri J.T., Haas A.L., Ryan L.M., McCarty D.J. Molecular cloning and expression of a porcine chondrocyte nucleotide pyrophosphohydrolase. Gene 1997; 197: 277-87.

10. Hirose J., Masuda I., Ryan L.M. Expression of cartilage intermediate layer protein/nucleotide pyrophosphohydrolase parallels the production of extracellular inorganic pyrophosphate in response to growth factors and with aging. Arthritis Rheum. 2000; 43: 2703-11.

11. Masuda I., Iyama K-I, Halligan B.D., Barbieri J.T., Haas A.L., McCarty D.J., et al. Variations in site and levels of expression of chondrocyte nucleotide pyrophosphohydrolase with aging. J. Bone Miner Res. 2001; 16: 868-75.

12. Johnson K., Hashimoto S., Lotz M., Pritzker K., Goding J., Terkeltaub R. Up-regulated expression of the phosphodiesterase nucleotide pyrophosphatase family member PC-1 is a marker and pathogenic factor for knee meniscal cartilage matrix calcification. Arthritis Rheum 2001; 44: 1071-81.

13. Johnson K. Farley D., Hu S., Terkeltaub R. One of Two Chondrocyte-Expressed Isoforms of Cartilage Intermediate-Layer Protein Functions as an Insulin-Like Growth Factor 1 Antagonist. Arthritis Rheum Vol. 48, No. 5, May 2003, pp. 1302-1314.

14. Du H., Masuko-Hongo K., Nakamura H., Xiang Y., Bao C-D., Wang X-D., Chen S-L., Nishioka K., Kato T. The prevalence of autoantibodies against cartilage intermediate layer protein, YKL-39, osteopontin, and cyclic citrullinated peptide in patients with early-stage knee osteoarthritis: evidence of a variety of autoimmune processes. Rheumatology international, (2005 Nov) Vol. 26, No. 1, pp.35-41. Electronic Publication: 2004-09-18.

15. Kato Tomohiro; Xiang Yang; Nakamura Hiroshi; Nishioka Kusuki. Neoantigens in osteoarthritic cartilage. Current opinion in rheumatology, (2004 Sep) Vol. 16, No. 5, pp.604-8.

16. Lorenzo P., Bayliss M., Heinegård D. Altered patterns and synthesis of extracellular matrix macromolecules in early osteoarthritis. Matrix Biol. (2004) 23, 381-91).

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ дифференциации остеоартрита от ревматоидного артрита и непатологических состояний в образце, включающий измерение концентрации пептида цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща (CILP-2). Увеличенный уровень цепи С1 белка CILP-2 по сравнению с ревматоидным артритом и нормальным состоянием свидетельствует о наличии у пациента остеоартрита. Предложен пептид для дифференциации остеоартрита от ревматоидного артрита и непатологических состояний, содержащий SEQ ID NO: 1. Предложены антитела, иммунореактивные к указанному пептиду, и набор, содержащий антитела и инструкцию по проведению анализа. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективные средства и методы для дифференциации остеоартрита от ревматоидного артрита и непатологических состояний по увеличению концентрации цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща в образце. 5 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 пр.

1. Способ дифференциации остеоартрита от ревматоидного артрита и непатологических состояний в образце, включающий измерение в образце концентрации пептида цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща (SEQ ID NO: 1), причем уровень цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща намного выше при остеоартрите по сравнению с ревматоидным артритом и нормальным состоянием.

2. Способ по п.1, в котором образец выбран из группы, включающей синовиальную жидкость, кровь, плазму, сыворотку и мочу.

3. Пептид для дифференциации остеоартрита от ревматоидного артрита и непатологических состояний, содержащий SEQ ID NO: 1.

4. Антитела, иммунореактивные к пептиду по п.3 или его фрагментам.

5. Способ дифференциации остеоартрита от ревматоидного артрита и непатологических состояний, включающий анализ образца на пептид по п.3 с использованием антител, иммунореактивных к указанному пептиду, причем уровень цепи С1 белка 2 промежуточного слоя хряща, выявляемый с помощью указанных антител, намного выше при остеоартрите по сравнению с ревматоидным артритом и нормальным состоянием.

6. Способ по п.5, в котором указанный анализ представляет собой иммуноферментный анализ.

7. Набор для дифферециации остеоартрита от ревматоидного артрита и непатологических состояний по любому из пп.1 или 2, включающий а) антитела, иммунореактивные к указанному пептиду, и b) инструкцию по проведению анализа.